JPH07506479A - 第ｘ３因子の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 第Ｘｍ因子の精製 技歪旬韮 本発明は、一般にタンパク質精製方法、特定的には精製された第Ｘｍ因子及びさ まざまな生物学的流体から第Ｘｍ因子を精製するための方法に関する。 又里Ω宜量 第Ｘｍ因子（フィブリン安定化因子、フィブリノリガーゼ又番よ血漿トランスグ ルタミナーゼとしても知られてし）る）番よ、フイブＩＪノーゲンと複合された チモーゲン（Ｍｒ＝−３２０にＤ）として血液中を循環する血漿糖タンパク質で ある（Ｇｒｅｅｎｋｅｒｇ及びＳｈｕｍａｎ、ム」圏ＬＣｈｅｗ、　２５７　： 　６９０６−６１０１．１９８２）、血漿第ｘｍ因子チモーゲン番よ、ａｔ　Ｉ ｇと呼称される全体構造をもつ２つのａサブユニット（Ｍｒ＝〜７５ＫＤ）と２ つのｂサブユニット（計−〜８０ＫＤ）力）ら成る四量体（Ｃｈｕｎｇ　ａｔ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４９　：　９４０−９５０．１９ ７４）である。 ａサブユニットは酵素の触媒部位を含み、一方りサフ゛ユニット（よ、ａサブユ ニットを安定化させるか又は第Ｘｍ因子の活性イヒを調節すると考えられている （Ｆｏｌｋ及びＦｉｎｌａｙｓｏｎ、　Ａｄｖ、ヱｒｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　３１ 　：１−１３３＋　１９７７　；　Ｌｏｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅ ｓ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｎｒｍ、５６　：９１４−９２２．１９７４ ）、　ａ及びｂサブユニットのアミノ酸配Ｊ１４よ、すでに知られている（Ｉｃ ｈｉｎｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒ　（生イヒ学）益：６ ９００−６９０６＋　１９８６　：　ｒｃｈｉｎｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒ　２５　：　４６３３−４６３８゜１９８６）　、第Ｘｍ因子 は、胎盤及び血小板の中でａｔホモタ′イマーとして発生する。 インビボ（生体内）で、活性化された第Ｘｍ因子（第Ｘ１ｌｌａ因子）は、その 他のタンパク質分子の間での架橋結合反応に触媒として作用する。血液凝固の最 終段階の間に、トロンビンは、第Ｘｍ因子チモーゲンを中間形態Ｃａ’ｔｂｘ　 ）に変換し、次にこれがカルシウムイオンの存在下で解離してａ′サブユニット のホモタイマーである第Ｘｎ１ａ因子を産生ずる。胎盤の第Ｘｍ因子は、トロン ビンの分割時点で活性化される。第Ｘ１ｌｌａ因子は、分子間ε（Ｔ−グルタミ ル）リジン結合の形態を通してフィブリン重合体の架橋結合を触媒し、かくして 血塊強度を増大させるトランスグルタミナーゼである（　Ｃｈｅｎ及びＤｏｏｌ ｆｔｔｌｅ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６６ 　：　４７２−４７９＋１９７０　：　Ｐｉｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ　 Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、２０２　：　９８−１１３゜１９７２）　、この架 橋結合反応にはカルシウム　イオンの存在が必要である　（Ｌｏｒａｎｄ　ｅｔ 　ａｌ、＋　Ｐｒｏ　、Ｈｅｍｏｓｔ、Ｔｈｒｏｗ、５　；　２４５−２９０＋ 　１９８０　；Ｆｏｌｋ及びＦｉｎｌａｙｓｍ、　Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈ ｅ＋ｍ、　３１　：　１−１３３＋　１９７７Ｌ第ｘｍａ因子は又α２−プラス ミン阻害剤及びフィブロネクチンに対するフィブリンのγ饋の架橋結合ならびに 創傷治癒に関連づけできるコラーゲンとフィブリネクチンの架橋結合をも触媒す る（Ｓａｋａｔａ及びＡｏｋｉ、　Ｊ、　ｃｌｉｎ、　Ｉｎｕｅｓｔ、　６５　 ：　２９０−２９７．１９８０　；　Ｍｏ５ｈｅｒ、　Ｊ、　Ｂｔｏｌ。 Ｃｈｅｗ、　２５０　Ｆ　６６１４−６６２１＋　１９７５　；　Ｍｏ５ｈｅｒ 　ａｎｄ　Ｃｈａｄ、　Ｊ、　Ｃ１ｕｉｎＩｎｖｅｓｔ、　６４　：　７８１− ７８７．１９７９　；　Ｆｏｌｋ及びＰｉｎｌａｙｓｏｎ　、同書；Ｌｏｒａｎ ｄ　ｅｔ　ａｌ、、同書）。フィブリン網内へのαｇ−プラスミン阻害剤の共有 結合形の取り込みは、溶菌に対する血塊の耐性を増大する可能性がある（Ｌｏｒ ａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、同書）。 第Ｘｍ因子の欠損は「出血遅延」という結果をもたらすが、−次止血に影響を及 ぼさない（Ｌｏｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、＋同書）、第Ｘｍ因子の欠損した患者に 対する現行の治療実線には、一般に血漿又は血漿誘導物質又は粗胎盤第ＸＩ［ｌ 因子濃縮物での置換療法が関与している（Ｌｏｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、同書； 　Ｆｏｒｋｉｓｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｄｔｓｃｈ　ｍｅｄＪｏｃｈｅｎｓ劇「 より７　：　４４９−５０２＋　１９７２　：　ＫｕｒａｔｓｕＪｉ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉａ　（止血）、Ｕ；２２９−２３４．１９８２） 第Ｘｍ因子は同様に、術後創傷治癒における障害（Ｍｉｓｈｉｍａ　ｅｔａｌ− ＋　Ｃｈｉｒｕｒ　５５　：　８０３−８０８．　１９Ｂ４　；　Ｂａｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、ＺｅｎｔｒａｂＪ二　Ｃｈｉｒ工匡：　６４２−６５１．１９８０ ）、強皮症（Ｄｅｌ　ｂａｒｒｅ　ａｔ　ａｌ、、　ｋ匹■」：２０４．１９８ ４　；　Ｇｕｉｌｌｅｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｌａ　Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄｉ ｃａｌｅ　７４　：　２３２７−２３２９＋　１９８５　；　Ｇｕｉｌｌｅｖｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｈａｒｍ旦ｈｅｒａ　ｅｎｔｉｃａ　４　：　７６−８ （Ｌ１９８５　：及びＧｒｉｖａｕｘ及びＰｉｅｒｏｎ＋　Ｒｅｖ、　Ｐｎｅｍ ｎｏｌ、　Ｃｌ１ｎ、　４３　；　１０２−１０３、１９８７）、潰瘍性大腸炎 （Ｓｕｚｕｋｉ及びＴａｋａｓｕｒａ、　Ｔｈｒｖｓ　Ｈａｅａｏｓｌａｓ。 ５８　ｉ　５０９．１９８７）、偽膜性全腸炎（Ｋｕｒａｔｓｕｊｉ　ａｔ　ａ ｌ、＋■ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ１１　：　２２９−２３４．１９８２）をもつ患 者の治療において、又クモ膜下出血患者の再出血予防薬として（Ｔｈｒｏｓ＋ｂ 　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　５８　：　５１３．１９８７）も有用である。さらに 第Ｘｍ因子は、組織接着剤の一成分としても使用されてきた（米国特許４，４１ ４，９７６号；　４４５３９３９号？　４３７７５７２号；４３６２５６７号； ４２９Ｂ５９８号ｉ　４２６５２３３号及び英国特許２１０２８１１Ｂ号）。 第Ｘｍ因子のための数多くの精製計画が記述されてきた。　Ｃｈｕｎｇ及びＦｏ ｌｋ　（Ｊ、旧ｏ１．　Ｃｈｅ−、２４７：　２７９Ｂ−２８０７，１９７２） は、血小板濃縮血漿又はフィブリノーゲン調製物から第Ｘｍ因子を調製した。 Ｃｏｏｋｅ及びＨｏ１ｂｒｏｏｋ　（Ｂｉｏｃｈｅ曽、　Ｊ、　１４１　：　７ ９−８４．１９７４）は、Ｃｏｈｕ−１分画からの第Ｘｍ因子の精製を記述して いる。 この方法には、血漿から第Ｘｍ因子を精製するため多数の硫酸アンモニウム沈降 段階及びＤＥＡＲセルロースクロマトグラフィ上での分別が関与している。　５ ｋｒｚｙｎｉａ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｂｌｏｏｄ　６０　：　１０８９−１０９５ ＋１９８５）は、第Ｘｍ因子のａサブユニットをクロマトグラフィ及び硫酸アン モニウム沈降により胎盤濃縮物から精製した。　Ｚｗｉｓｌａｒ　ｅｔ　ａｌ。 （米国特許３９０４．７５１号）及びＢｏｈｒ　ｅｔ　ａｌ、　（米国特許３９ ３１３９９号）は、第Ｘｍ因子を沈降させるのにジアミノ−エトキシ−アクリジ ン乳酸塩の使用に依存する多段階式分離手順を記述している。この沈降作用物質 は、治療用化合物の中で受諾できない汚染物となるａ　Ｆａｌｋｅ（米国特許第 ４．５９７．８９９号）は、アルコール沈降による胎盤抽出物からの第Ｘｍ因子 の分離を記述している。 第Ｘｍ因子を精製するためのこれまでに記述されてきた方法の多くが、それを血 漿、血清又はその分画から分離することに向けられてきた。これらの出発材料は すでに第Ｘｍ因子について富化されており、汚染性タンパク質はすでに充分特徴 づけされており既知の方法で除去可能である。その上、既知の第Ｘ■因子ベース の治療用化合物の多くは、第Ｘｍ因子について富化された血漿分画であり、フィ ブリノーゲン及びフィブリネクチンといったその他の血漿タンパク質を含んでい る。従って、これまでに記述されてきた精製又は富化計画は、汚染性あるタンパ ク質分解活性が高く受諾できない汚染物質が存在する可能性のある粗細胞すゼイ トを含む不均質な出発材料から高度に精製された第Ｘｍ因子を調製するのにはあ まり通していない、その上、これらの方法の多くは、実験室規模の精製のために 開発されたものであり、第Ｘｍ因子を治療向けの量だけ経済的に調製するために スケールアップすることは困難である。 従って、第Ｘｍ因子を精製するための単純で経済的な方法に対する必要性が当該 分野において存在する。低レベルの第ＸＩ［［ａ因子をもつ第Ｘ■因子調製物を 提供する精製方法に対する必要性も当該技術分野において存在する。このような 方法は、組換え型細胞のリゼイトといった粗出発細胞からの高度に精製された第 Ｘｍ因子の大規模産生に役立たなくてはならない０本発明は、その他の関連する 利点と共にこのような方法を提供するものである。 ２３μΣ４示 本発明は、高度に精製された第Ｘ■因子化合物及び高度に精製された第Ｘｍ因子 を産生ずるための方法を提供する。開示されている方法を用いると、汚染性タン パク質との関係において少なくとも９９％純粋なものである第Ｘｍ因子を得るこ とができる。これらの方法は、酵母産生された組換え型ヒト第Ｘｍ因子を含む組 換え型第Ｘ■因子の精製に特に通している。１つの実施態様の範囲内では、１１ ００ｐｐ未満の酵母タンパク質を含む酵母産生された組換え型第Ｘ■因子の化合 物が得られる。関連する実施態様においては、５ｏｐｐ−未満、２０ｐｐ−未満 、１０ｐｐ−未満及び１９９８未満の酵母タンパク質を含む化合物が得られる。 付加的な実施態様においては、第Ｘｍ因子の１％以下が第ＸＩＩ［ａ因子である 化合物、ならびに第Ｘｍ因子の０．５％以下が第Ｘｍａ因子である化合物が得ら れる。これらの高度に精製された第Ｘ■因子化合物は、組織接着剤といった薬品 化合物の中で使用するのに適している。 本発明の方法は、一般に、後に回収される結晶質第Ｘ■因子沈降物の形成を通し て生物学的流体から第Ｘｍ因子が分離される単数又は複数の結晶化段階の使用に よって特徴づけされる。１つの実施態様においては、精製には、（ａ）第Ｘｍ因 子について富化された一分画を生成するため陰イオン交換クロマトグラフィによ り生物学的流体を分別する段階、（ｂ）富化された分画に酢酸Ｎａを付加して結 晶質沈降物を形成する段階、（ｃ）沈降物を溶解させて溶液を形成する段階、（ ｄ）第Ｘｍ因子について富化された第２の分画を生成するため疎水的相互作用ク ロマトグラフィにより溶液を分別する段階、（ｅ）第Ｘｍ因子について富化され た第３の分画を生成するため陰イオン交換クロマトグラフィにより第２の富化分 画を分別する段階、（ｆ）第Ｘｍ因子を含む沈降物を生成するため第３の富化分 画のｐＨをｐＨ５，２〜６．５に調製する段階；　（ｇ）この沈降物を回収する 段階；（ｈ）沈降物を溶解させて溶液を形成する段階；　（ｉ）ゲルろ過により 溶液を分別し、第Ｘ■因子を含むピーク分画を収集する段階が含まれている。好 ましい一実施態様においては、ｐ■調製段階は富化された分画に対するコハク酸 の付加を含んでいる。関連する実施！ａ様においては、（ａ）第ｘ■因子につい て富化された分画を生成するため陰イオン交換クロマトグラフィにより生物学的 流体を分別する段階、（ｂ）富化された分画に酢酸ナトリウムを付加して結晶質 沈降物を形成する段階；　（Ｃ）沈降物を溶解させて溶液を形成する段階；　（ ｄ）第Ｘ■因子について富化された第２の分画を生成するため陰イオン交換クロ マトグラフィにより溶液を分別する段階；　（ｅ）第Ｘ■因子について富化され た第３の分画を生成するため疎水的相互作用クロマトグラフィにより第２の富化 分画を分別する段階；（ｆ）第Ｘ■因子について富化された第４の分画を生成す るため疎水的相互作用クロマトグラフィにより第３の富化分画を分別する段階； 及び（ｇ）ゲルろ過により第４の富化分画を分別し、第Ｘ■因子を含むピーク分 画を収集する段階、を含む方法といったものによって、生物学的流体から第Ｘ■ 因子が精製される。 本発明のこれらの及びその他の様相は、以下の詳細説明及び添付図面を参照する ことにより明らかになるだろう。 区皿五呈単星脱所 図１は、プラスミドＰＤ１６を例示している。 図２は、酵母細胞内で産生された組換え型第Ｘ■因子のための精製プロトコルを まとめた流れ図である。 図３は、ＤＥＡＥ高速流セファデックスからの第Ｘ■因子の標準的溶離グラフを 示す、棒は、その後続くピペリジン沈降のために溜められた分画を表わしている 。 見皿坐韮豊星脱里 本発明を規定するに先立ち、その理解のために、以下で使用するいくつかの語い を定義づけしておくことが有利であるかもしれない。 ｗ：　ｒ第Ｘ■因子」という語には、第Ｘ■因子チモーゲン四置体、ａ′□ｂ８ 中間体及び第ＸＩ［［ａ因子、ならびにａサブユニット、ａ°サブユニット及び ａ３３量体を含むそのサブユニットが含まれる。 生立主麹後生：細胞、細胞構成要素又は細胞産物から誘導されたか或いは又これ を含むあらゆる流体、生物学的流体には、細胞培養上清、細胞リゼイト、清澄細 胞リゼイト、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清及びその分画が含まれ るが、これらに制限されるわけではない。 抜延作ｍ：溶液に付加されたとき、もう１つの化合物をその溶液から沈降させる ことになるような化合物、この沈降は、沈降作用物質とその他の化合物の間の錯 体の形成又は結果として不溶性をもたらす位相変化によるものと考えられる。沈 降作用物質には、エタノール、プロパツール、ポリエチレングリコール及び硫酸 アンモニウムなどの塩が含まれる。 ！ＬＪＩＬ！Ｌ：少量の酸又は塩基が付加される溶液中の著しいｐｏ変化を防ぐ 物質、緩衝液には、一般に、弱酸又は弱塩基の陽子供与体及び陽子受容体形態の 組合せが含まれる。緩衝された溶液に対して少量の酸又は塩基を付加することに より、陽子供与体と陽子受容体の間の平衡は移動する。この平衡の移動は、ｐＨ を安定化させる。 本発明は、汚染性タンパク質との関係において９９％以上純粋である第Ｘ■因子 の化合物を提供する０本発明に従うと、第Ｘ■因子は、胎盤細胞ならびに血液及 び血液分画といった天然に第Ｘ■因子を回収可能な量で産生ずる細胞のリゼイト 又は抽出物を含むさまざまな生物学的流体から精製される。このような細胞及び 組織のリゼイト及び抽出物は、当該技術分野において既知のさまざまな手順によ り調製されうる。しかしながら、血液及び組織のウィルス感染の危険性のため、 第Ｘ■因子を産生ずるべく遺伝学的に変更されたウィルスを含まない細胞又は細 胞系統から誘導された流体が好ましい供給源である。この点に関して特に好まし い生物学的流体としては、第Ｘ■因子を産生ずるように形質転換された酵母細胞 のリゼイト及び清澄リゼイトがあるが、原則として、クローニングされたＤＮＡ 配列を発現することのできるあらゆる細胞型が使用可能である０例えば、本発明 に基づく方法は、調製物が１０ｐｐｍをはるかに下回る酵母タンパク質を含んで いる酵母細胞リゼイトからの組換え型第Ｘ■因子の調製物を産生ずるのに使用す ることができる。このような汚染物質レベルは、ヒト用薬剤について設定された 限界の中に入る。汚染性タンパク質のレベルは、従来の技術（例えばＥＬＩＳＡ ）によって検定される。かくして本発明の方法は、薬品調製物において利用する ための第Ｘ■因子の調製に特に適している。 本発明の精製方法は、活性化された第Ｘ■因子（第ＸＩ［［ａ因子）を除去する という付加的な利点を提供する０発明人の研究所において、５〜６％の第ＸＩ［ ｌａ因子を含む第Ｘ■因子の調製物は、実験用動物に注射した場合致死量である ことが判明した。従って全身的療法のための第Ｘ■因子の調製物は、１％以下好 ましくは０．５％以下しか第Ｘｎ１ａ因子を含んでいないということが重要であ る。このような化合物は、患者に対する長期にわたる高い用量での全身的投与に 遺している。 本発明の範囲内では、第Ｘ■因子は、その等電点（すなわち約５．８）の又はそ の前後のｐＨをもつ低いイオン強度の溶液中で低い可溶性を有し、かくして沈降 作用物質の必要無く溶液から第Ｘ■因子を分離することを可能にしているという ことがわかっている。従って、本発明に従うと、第Ｘ■因子は、結晶質沈降物を 形成するため、緩衝液交換又は酸性化などによって約ｐｕｓ、ｚ〜６．５に流体 のｐＨを調整することにより生物学的試料から分離される。このような沈降段階 は、驚くほど高い第Ｘ■因子精製レベルを提供することがわかっている。単数又 は複数のクロマトグラフィ分離段階と組合わせて使用すると、等電点又はその前 後での沈降は、９９％以上純粋である第Ｘ■因子調製物を結果としてもたらすこ とがわかった。 好ましい実施態様においては、前述の沈降段階は結晶化段階と組み合わされ、こ こでは第Ｘ■因子を含む溶液に酢酸ナトリウムが付加されて第Ｘ■因子の結晶化 がひき起こされる。結晶は、遠心分離又はろ過といった従来の手段によって回収 される。 上述のように、組換え型細胞及び細胞系統が第Ｘ■因子の好ましい供給源である 。細菌、酵母及び培養した哺乳動物細胞を含む組換え型細胞内での第Ｘ■因子の 産生及びヒト及びウシの第Ｘ■因子とＤＮＡクローンについては、本書に参考と して内含されているＧｒｕｎｄｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（公示済みのオースト ラリア特許出願６９８９６／８７号）及びＤａｖｉｅ　ｅｔ　ａｌ、　（米国特 許出願筒０７／１７４．２８７号：　ＥＰ２６８，７７２号）により記述されて いる。組換え型第Ｘ■因子を産生ずるための特に好ましい宿主細胞としては、パ ン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＰｉｃｈｉ ａ及び（１■μｍジ１野一種といったような酵母がある。クローニングされたＤ ＮＡ配列を発現させるための方法は、当該技術分野において周知のものである。 簡単に言うと、第Ｘ■因子をコードするＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞と相 客性あるベクター内で適切なプロモータ及びターミネータ配列に作動的に結合さ せる。次にこのベクターを宿主細胞内に挿入し、結果として得られた組換え型細 胞を培養して第ＸＮ因子を産生ずる。利用される特定の宿主細胞及び発現ユニッ トに応じて、第Ｘ■因子を細胞から分泌させるか又は細胞質内に保持することも できる。 第Ｘ■因子を分泌しない細胞を使用する場合、細胞に培地から（例えば遠心分離 によって取り出され、処理を受けてリゼートを生成する。標準的には、酵母細胞 は、粗すゼイトを生成するべくガラス玉を用いた機械的分断によって処理させる 。好ましくは、粗すゼイトを遠心分離に付し上清分画を回収する。上清は、緩速 度（例えば１００００　ｘｇ）での遠心分離又は高分子量の遮断膜を通してのろ 過により、清澄したリゼイトを生成するため処理される。 高レベルのタンパク質分解酵素を含む可能性の高い粗細胞すゼイトを用いて作業 する場合には、リゼイトが濃縮形態にある時間を最小限におさえることが好まし い、これは、リゼイトを好ましくは冷水（２−５℃）中ですばやく希釈させるこ とによって容易に達成できる。一般に、リゼイトは、出発細胞スラリーとの関係 において約３倍から１０倍まで希釈されることになる。第Ｘ■因子は、培地内に それを分泌する細胞から得ることもできる。細胞は、宿主細胞の分泌経路を移行 するにつれてタンパク質分解により第Ｘ１ｌｌ囚子クンバク質から除去される付 着した分泌シグナル配列を伴う第Ｘ■因子サブユニットを発現するように形質転 換させられる。第Ｘ■因子の精製のためには、細胞を遠心分離によって除去し、 培地を分別し、第Ｘ■因子を回収する。 タンパク質の複合混合物を含む生物学的流体を用いて作業する場合には、まず富 化された分画を生成すべく陰イオン交換クロマトグラフィにより生物学的流体を 分別することが好ましい、標準的には、清澄した生物学的流体を中性乃至弱アル カリ性のｐＨで陰イオン交換培地のカラム上に通過させ、適切な溶離緩衝液を用 いて溶離させる。 適切な陰イオン交換培地としては、誘導体化されたデキストラン、アガロース、 セルロース、ポリアクリルアミド、高付加価値シリカなどがある。　ＰＥＩ、　 ＤＥＡＥ、　ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましく、特にＤＩ！ＡＥ高速流セファロー ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｃａｔａｗａｙ＋　ＮＪ）が好ましい、当業者 であればわかるように、分別はバッチプロセスにおいて行なうこともできる。そ の後に続く第Ｘ■因子の沈降のため、ピーク分画（２８Ｏｎ−での溶離物の吸収 度を監視することによって決定される）をプールしてお（。 陰イオン交換クロマトグラフィ段階からの富化分画をｐＨ５，２〜６．５で沈降 に付すこともできるが、結晶化、疎水的相互作用クロマトグラフィ及び第２の陰 イオン交換クロマトグラフィ段階を含む複数の介入精製段階を適用することが好 ましい、結晶化は、約６．２〜約７．５のｐＨで９〜１８重量％好ましくは約１ １重量％の濃度まで酢酸ナトリウムを付加することによって上述のとおり行なわ れる。結晶化は４〜２５℃好ましくは約１５℃の温度で行なわれる。結晶質沈降 物を回収し、弱アルカリ性緩衝液内で溶解させ、疎水的相互作用クロマトグラフ ィにより分別する。この点に関する適切なりロマトグラフィ培地としては、フェ ニル−セフ１０−ズ　ＦＦ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。 Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　ブチル６５０　（Ｔｏｓｏ■ａａｓ＋　Ｍｏｎｔｇｏｍｅ ｒｙｖｉｌｌｅ、　Ｐ＾）、オクチル−セファロース（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ） などのフェニル、ブチル又はオクチル基で誘導体化された培地；又はＡｍｂｅｒ ｃｈｒｏｓ　ＣＧ７１　（Ｔｏｓｏ■ａａｓ）などのポリアクリル樹脂が含まれ る。標準的な精製プロトコルにおいては、第Ｘ■因子溶液を、フェニルセファロ ーズＦＰカラムに適用し、このカラムを、６０ｓＳ／ｃｍのＮａＣｌ及び２ｍＭ のＥＤＴＡを含むｐＨ７，４の２０−Ｈのリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄する。 　１０ｍＭのグリシン、１ｗＭのＥＤＴＡ、　ｐｌ＋７．４へ向う下降塩勾配で 、カラムから第Ｘ■因子を溶離させる。ピーク分画を回収し、プールし、陰イオ ン交換カラムに適用する。さまざまな陰イオン交換培地を使用することができる が、Ｑ型樹脂が好まれる。標準的な手順においては、Ｑ−セファローズＦＦのカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対して疎水的相互作用クロマＩ・グラフィ段階か らのピーク分画が適用される。カラムをｌｏ＋Ｈのグリシン、２０ｄのリン酸ナ トリウム、１＋ｗＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，４，ＮａＣ１最高１ｂ＋Ｓ／ｃｍ、 を用いて洗浄する。第ｘ■因子を、ｌＯ園Ｈのグリシン、２０−Ｍのリン酸ナト リウム、ＩｓＨのＥＤＴＡ、　０．２５ＭのＮａＣ１，ｐｔ＋　７．４に向かう 塩勾配を用いて溶離させる。 次に上述のとおり第Ｘ■因子調製物のｐｌ＋を調整することによって第Ｘ■因子 を沈降させる。好ましい一実施態様においては、第Ｘ■因子の調製物は、コハク 酸、クエン酸、リン酸又は酢酸といった酸を付加することにより５．２〜６．５ のｐＨ５好ましくはｐＨ約５．４〜６．２、最も好ましくは約ｐ１１５．８まで 酸性化される。０．２〜０．５Ｍのコハク酸が特に好ましい０次に沈降物をＰＨ ５，２〜６．５好ましくは約ｐＨ５，４〜６．２最も好ましくは約ｐ）１５．８ で次に続く遠心分離で又は０．５＋ｗ−の中空Ｉ＃＋ｉＩ！フィルタを用いてｐ Ｈ５，２〜６．５に対するダイヤフィルトレージョンによって洗浄される（？原 文不明瞭）、好ましい緩衝液は２０〜５５０１１Ｍのコハク酸アンモニウム溶液 を含む、この段階で緩衝液中にＥＤＴＡを含み入れることが好ましい、好ましい 緩衝液には、０．０５Ｍのコハク酸アンモニウムｐＨ５，８，１，０％のポリエ チレングリコール（ＰＥＧ）８０００ＵＳＰ、　０．００５ＭのＥＤＴＡ、５１ Ｍのアスコルビン酸ナトリウム、ｐｔ１５．８が含まれる。緩衝液は一般に、酸 性化段階で使用される酸と対応することになる（例えばコハク酸−コハク酸塩緩 衝液、クエン酸−クエン酸塩緩衝液）。 一変形実施態様においては、陰イオン交換クロマトグラフィからの富化分画は、 ４０％の飽和（Ｎｕｎ）　ｔｓＯａでの沈降により濃縮される。 沈降物は、約７．０〜８．０の間のｐＨで少量の緩衝液内で溶解させられる０次 に、結果として得られた溶液をｐＨ５，２〜６．５で低イオン強度の緩衝液に対 して透析し、結晶質沈降物を生成する。緩衝液は一般に、約１０ｍ１Ｍ〜４００ 　ａＭ好ましくは約５０ｍＭの濃度で使用される。この点において適切な緩衝液 には、ピペリジン、スペルミジン、カダベリン及びその誘導体といったヘテロ環 式ポリアミンの低イオン強度溶液ならびに望ましいｐＨに調整されたｌｌＥｓ　 、リン酸塩、ＡＤＡ及びＢｉａ−トリス緩衝液が含まれる。ここで用いる「低イ オン強度」という語は、約２００　ｍＭ未満のＮａＣｌを含む溶液を内含してい る。沈降物は、遠心分離により回収され、再溶解させられ、沈降緩衝液に対して 二回目の透析を受ける。 ｐＨ５，２〜６．５での第Ｘ■因子の沈降は、まず溶液を濃縮することによって 容易になる。最適な濃度は、成る程度緩衝液システムによって左右されるが、一 般に少なくとも０．２−ｇ／ｍｌ好ましくは０．５■ｇ／＋ｓ１以上、さらに好 ましくは２〜２５５ｇ　／■ｌの第Ｘ■因子溶液を用いて作業することが望まし い。 当業者にとっては明白であるように、その他の生物学的流体からの第Ｘ■因子の 沈降は実質的に同じ要領で、すなわち沈降物を生成すべく沈降緩衝液に対して流 体を透析するか又は酸性化によって行なわれる。 付加的な精製は、イオン交換クロマトグラフィ、疎水的相互作用クロマトグラフ ィ、固定化金属クロマトグラフィ及びゲルろ過を含む従来のクロマトグラフィ分 離技術を使用することにより達成される。好ましい一実施態様においては、沈降 した第Ｘ■因子は、溶液を生成するための緩衝液内、標準的には弱アルカリ性ｐ Ｈで低イオン強度の緩衝液内で溶解され、次にセファクリルＳ−２００（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）などの上でのゲルろ過などといったゲルろ過により溶液を分別す る。 標準的なプロトコルでは、１０ｓｔＨのグリシン、２０■門のリン酸ナトリウム 、１−一のＨＤＴＡ、　１０曽ＭのＮａＣｌ内の第Ｘ■因子の２０ｇ／ｌ溶液が 、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラム上に装荷される。第Ｘ■因子は、０． １ＭのＮａＣｌに調整された同じ緩衝液を用いてカラムから溶離させられる。 ピーク分画を収集し、濃縮しく例えばダイアフィルトレーシランによる）、滅菌 し、凍結乾燥させる。凍結乾燥に先立って、約１０■Ｈのグリシン又はアルギニ ン、０．１■ＨのＨＤＴＡ及び２重量％のスクロース、マンノース又はその他の 非還元糖を含み、再構成の時点で約７，８のｐＨを提供するリン酸緩衝溶液の中 で第Ｘ■因子を処方することが好ましい、このようにして調製された第Ｘ■因子 は、標準的に９９％以上純粋で発熱物質を含まない。 変形態様としては、ＰＨ５，２〜６．５の沈降段階を疎水的相互作用段階で置換 することができる。この点において適切なりロマトグラフィ培地には、フェニル 、ブチル、又はオクチル基で誘導体化された培地及びアクリル樹脂が含まれる。 好ましい一実施態様においては、第Ｘ■因子は、陰イオン交換クロマトグラフィ 、酢酸ナトリウム結晶化、第２の陰イオン交換クロマトグラフィ段階、及び疎水 的相互作用クロマトグラフィの組合せを用いて、上述のものに似た要領で部分的 に精製される。疎水的相互作用クロマトグラフィ段階からのピーク分画はプール され、＾−ｂｅｒｃｈｒｏｓ　ＣＧ　７１　（Ｔｏｓｏ　Ｈａａｓ）又はそれに 類するカラムといった第２の疎水的相互作用クロマトグラフィカラム上で分別さ れる。下降塩勾配を用いてカラムから第Ｘ■因子を溶離する。ピーク分画を上述 のとおり、プールし、ゲルろ過し、濃縮し、凍結乾燥させる。このようにして調 製された第Ｘ■因子化合物は、標準的に第Ｘ■因子合計の０．３％未満の最少量 の第ＸＩ［Ｉａ因子を含んでいる。 上述の方法においては、さまざまなりロマトグラフィ段階の各々に先立って第Ｘ ■因子溶液をろ過することが好ましい、ろ過は、０．４５μｍ又は０．２μｍの フィルタを用いて行なわれる。 本発明に従って調製された第χｍ因子化合物の純度は、従来の方法によって監視 されている０個々の分離段階の後、ピーク分画を２８ｏｎ−での喋収度によって 固定することができる。精製された第Ｘ■因子はアミノ酸分析、活性検定などに よって測定することができる。トロンビン処理を伴って及びこの処理無しで活性 検定を行なうことにより、第ＸＩ［Ｉａ因子含有量を測定することができる。酵 素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）といった免疫学的方法によって、宿主細胞タンパ ク譬による組換え型巣Ｘ■因子調製物の汚染を検定することができる。このよう な検定は、薬学的技術の範囲内で使用するのに適した感度レベルで設計される０ 例えば、高感度のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ検定を抗体産生及び検定条件の最適 化によって開発することが可能である０組換え型タンパク質内に存在する宿主抗 原といった異種抗原について試験する場合、ポリクローナル抗血清を使用するこ とが好ましい、抗原は、未形質転換細胞の発酵及び抗原の回収により宿主産生生 体から調製される。標準的には、第Ｘ■因子の産生に用いられるものと同じ菌株 の未形質転換細胞を発酵することによって、酵母菌抗原を調製する。細胞は第Ｘ ■因子の分離の場合と同様に収穫、溶菌され、リゼイトは雌ウサギにおいて免疫 原として用いられる０次に、抗血清を回収しプールする。純粋な抗原汚染物質に ついて試験する場合、モノクローナル抗体が好ましい、抗血清又は抗体は、タン パク質Ａ上での精製とそれに続く抗原カラム（望ましい抗体を保持するため）又 は産物カラム（交叉反応する抗体を除去するため）のいずれかの上での精製など によって精製される０次に抗体又は抗血清をスクリーニングし、力価及び選択性 について特徴づけする。検定の範囲内でシグナル対バックグラウンド比を最適化 するためには、検定のさまざまな構成要素及び条件を調査する。これらの構成要 素及び条件には、使用すべきプレートのタイプ；抗血清のためのコーティング条 件；コーティングを受けたプレートの保管条件；遮断剤、遮断時間及び洗剤を含 む遮断及び洗浄条件；ｐｉｔ、イオン強度、温度、インキュベージテン時間及び 緩衝液を含む試料捕獲条件；標識、インキュベージジン時間、ｐｉ及びイオン強 度を含む第２の抗体利用条件；発育用作用物質のタイプ（例えばホース　ラディ ッシュベルオキシダーゼ又はアルカリ性ペルオキシダーゼ）、温度、時間、最適 ０．Ｄ、を含む発育条件；及びその他の洗浄段階及び条件が含まれる。条件がひ とたび開発されると、結果の精度を確認するため試料のスパイク回復研究を用い て方法を有効化する。適切な検定の選択及び設計は、当業者の技術レベルの範囲 内にある。 本書に記述する方法によって調製された第Ｘ■因子は、当該技術分野において既 知の方法に従って組織接着剤といった薬品調製物を生成するのに利用できる。こ のような調製物は、例えば、本書に参考として内含されている米国特許４．２６ ５．２３３号及び公示済みオーストラリア特許出願７５０９７／８７の中で記述 されている。 以下の実施例は例示を目的として提供されるものであり、制限的意味をもたない ものである。 裏層■ 以前に記述されている通りに（本書に参考として内含されているＩｃｈｉｎｏｓ ｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ　１生化学’）　２５　：　 ６９００−６９０６．１９８６　。 Ｄａｖｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許出願第０７’／１７４，２８７号）、ヒト 第ｘｍ因子のａサブユニットをコードするｃＤＮＡをクローニングした。酵母菌 発現ベクターｐＤ１６を構築するためこのａサブユニットｃＤＮＡを使用した（ 図１）、簡単に言うと、ＰＤ１６は、本書に参考として内含されている米国特許 出願第０７１５２５，５５６号の中で開示されているように、ｐｃ　ｐｏＴ（Ａ ＴＣＣＮｏ、３９６８５＞から誘導されたＳ、　ｃｅｒｅ−ｖｉｓｉａｅ−２ミ クロンプラスミド−ベースのベクターである。これには、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　ＡＤ股」虹プロモータ（公示済み欧州特許出願ＥＰ２８４．０４４）及 びＴＰＩＩターミネータ（米国特許４９３１．３７３号）及びグルコース含有培 地内でのプラスミド選択を可能にするＰＯＴＩ選択可能マーカー（米国特許４， ９３１，３７３号）を含む発現ユニットが含まれる。第Ｘ■因子及び皿配列は、 相対する転写の向きでベクター内に挿入される（図１）±上 Ａ１発酵及び上流処理 組換え型酵母細胞から第Ｘ■因子を精製するための方法例は、図２に要約されて いる。簡単に言うと、細胞は収穫され溶菌され、リゼイトが清澄される。清澄さ れたリゼイトは次に濃縮されクロマトグラフィによって分別される。第ＸＩ［Ｉ 因子を、ピペリジンを用いて第Ｘ■因子含有分画から沈降させ、微量汚染物質を 除去するため最終的研磨段階を用いる。 ５ａｅｃｈａｒｏ＋＊　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ土軸菌種ＺＭ１１８　（１ｅｕ ２−３　１１２　ｕｒａ３　ｔ　ｉｌ、；狽Ｖ影二叫ドＬ１擾Ａ−−貼八ξ−［ ｃｔｒｌ）に対し同型接合のＭＡＴａ／Ｍ＾Ｔα二倍体）を、ｐｏｔｓで形質転 換した。形質転換された細胞を約０．１ｇ／ｌで接種し、０〜２４又は４０時間 のグルコース供給及びθ〜１２又は２０時間のエタノール供給で、２５ｇ／ｌの 酵母エキス、２２．５　ｇ　／　１（ＮＨ４）ｚｓＯａ、６．５　ｇ　／　１の Ｋｌｌ！ＰＯ４，３ｇ／　ｌのＭｇ５ｏａ及び０．５％のグルコースを含むｐｏ ｓ、ｓの培地内で培養した。培養（１０〜６０リツトル）を、約６０ｇ／ｌとい う最終細胞密度まで３０°Ｃで成長させた。 細胞培養を、０．２μのセルロースエステル中空繊維カートリッジ（Ｍｉｃｒｏ ｇｅｎ＋　Ｌａｇｕｎａ　Ｈｉｌｌｓ、　ＣＡ）を用いて濃縮により収穫した。 最終濃縮物は標準的に、脱イオン水ＬＯ内で湿潤重量６００〜３０００　ｇの酵 母細胞（ｆｉ度＞５０湿潤重量％）を含んでいた。 次に濃縮細胞を溶菌させた。溶菌緩衝液（５０■ｈのトリスｌｌＣｌ、　ｐＨ７ ，４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、　１５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−ＭＰ、１　 ｍＨのＰＭＳＦ　）中４０湿潤重量％まで、最大４００　ｇ　（湿潤重量）の細 胞を希釈した。細胞を、連続流モードでＤｙｎｏｓｉｌｌ　（Ｇｌｅｎ　Ｍｉｌ ｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｍａｙｗｏｏｄ、　ＮＪ）を用いて溶菌した。細胞懸濁液 を０．６リツトル入り容器内で酸洗いした５００μのガラス玉０．５リットルを 組合せ、６０〜１００ｓ＋ｌ／分の流速を用いて３０００ｒｐ■で溶菌して３〜 ５分の平均滞留時間を得た。さらに１リツトルの緩衝液を容器中を通してポンプ 送りした。 次にリゼイトを遠心分離によって清澄した。１５分間）１−６００ＯＡローター 内で５０００ｒｐ−で５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ遠心分離機内にて１リットル 入りびんのリゼイトを遠心分離し、ペレットは廃棄した０次に、１■阿及び０． ３体積の７％硫酸ストレプトマイシンという最終濃度までＰＭＳＦを付加するこ とによって、上清分画を条件づけした０次に４　’Ｃで１２２時間混物を放置し た。９０分間７５００ｒｐｍでＧ５−３１：ｌ−ター内で５００　ｍ１入りびん 及び／又は６０分間１２０００　ｒｐ＠でＧＳＡローター内で２５０　ｍｌ入り びんを用いて５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機内で遠心分離により最終清 澄を達成した。結果として得られた清澄リゼイトはこのとき、下流処理のために いつでも利用できる状態にあった。 Ｂ、下流処理 最終濃度１２％までポリ　エチレングリコール１０００　（ＰＥＧ４０００）を 又は８％の濃度までＰＥＧ−８０００を付加することによって、清澄リゼイトを 分別した。４°Ｃで１時間混合物をインキュベートし、次に９０分間７５００ｒ ｐ−で５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ５−３０−ター内で５００　ｍｌ入りびんを用いて及 び／又は６０分間１２０００　ｒｐｍでＧＳＡローター内で２５０　ｍｌのびん を用いて遠心分離した。沈降物を回収した。 ＰＥＧ沈降物を出発緩衝液（５抛−のトリス−）ＩＣＩ、　ｐＨ７，８，５ｍＭ のＥＤＴＡ、５ｍＭの２−ＭＥ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）内で溶解させ、ＤＥＡ Ｅ高速流セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の６　Ｘ２７ｃｓ＋　（５００ ｍｌ）カラム上に、結果として得られた溶液を装荷した。１１の出発緩衝液でカ ラムを洗浄し、緩衝液Ａ　（５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６，３，５ｍＭのＥ ＤＴＡ、５−Ｈの２−？ｌＥ）及び緩衝液Ｂ　（１５０ｅ＋ＭのＮａＣ１を含む 緩衝液Ａ）が各々１１の線形勾配を用いて、第Ｘ■因子を溶離した。標準的な溶 離グラフが図３に示されている。　Ｎ、　Ｎ−ジメチルカゼイン内への８Ｈ−ヒ スタミンの取込みを測定することによって又はＥＬＩＳＡによって分画を検定し た。飽和７０％まで（ＮＨ４）　ｔｓＯ４を付加することにより、プールしてお いた第Ｘ■因子含有分画を沈降させた。 次に、ピペラジン緩衝液を用いて第Ｘ■因子を沈降させた。 （ＮＩＩ４）オＳＯ，混合物を遠心分離し、上滑分画を廃棄した。５０ｍＭのト リス、　ｐ）１Ｂ、　０　、２００　ｍｌのＮａＣｌ、　′２．．５ｍＨのＥＤ ＴＡ、１　ｗＭの２−ＭＥの中でペレットを溶解させ、約５〜１２時間４℃で５ ０−■のピペラジン、ｐＨ６，０゜５＋ＭのＥＤＴＡ、５−Ｍの２−ＭＥ、　０ ．０２％のＮａＮ　３の中で透析した０次に５Ｓ−３４０−ターを用いて５ｏｒ ｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機の中で５分間、５０００ｒｐ−で遠心分離させ た。結果として得られたペレットは、新鮮なピペラジン緩衝液の中で数回洗浄し た。 ゲルろ過により最終的精製を達成した。　２０ｍ１の緩衝液あたり１００−８未 満の沈降物という濃度で、ピペラジンペレットを流れる緩衝液（５０１１Ｍのト リスＨＣ１，ｐＨ８，０、２００ｍＭのＮａＣ１，２，５ｓ＋ＭのＥＤＴＡ、ｌ 　ｍＭの２−ＭＥりの中で再懸濁させた。４゛Ｃで５時間、流れる緩衝液中で溶 液を透析し、あらゆる残渣を除去するべく遠心分離に付した。透析を受けた溶液 を次に４．５　Ｘ８０ｃ■（１２７０ｍｌ　）のセファデックスΩ２００カラム 上に装荷した。カラムを０．１７ｍ１／分の速さで流れる緩衝液で溶離させた。 第ｘ■因子のピーク分画をプールした。 表１は、上述の精製段階を要約している。収量は、胎盤の第Ｘ■因子に対するマ ウスのモノクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体を用いてサンドイッチ ＥＬＩＳＡにより測定した。収量は過小評価されている可能性がある。活性は３ Ｈ−ヒスタミンの取り込みによって決定された。 粗すゼイト　６５　８５　１゜３　１００　１００清澄リゼイト　３４　９１　 ２．７　’１０７　１０７ＰＥＧ　ｐｐｔ　５．６　５２　９．２　５７　６１ ピペラジン　ｐｐｔ　０．３１　４７　１５０　１３８　５５Ｓ−２００１６８ ７６８３置 ＩＳＡによる粗すゼイト・・・４８ｃ■ｇの合計ＦＸＩ［Ｉピペラジン緩衝液で の合計収量・・・６５％■又 上述のように精製した第Ｘ■因子を、約５．８＋＊ｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭの トリス−ＨＣｌ、ｐ）１Ｂ、　０　、２００　ｍＭのＮａＣ１，２，５ｍＭのＥ ＤＴＡ、１＋Ｍの２＝肝の中で熔解させた。結果として得られた溶液の０．５＝ 肝のアリコートを透析用バッグ内にピペットで移し、２日間４°Ｃで以下の緩衝 液中で透析した： ５０ｍＭの阿ε５（２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルフォン酸ＬｐＨ６，１ ， ５０ｍＭのＰＩＦ（ピペラジン）、ｐＨ６，２，５０ｗＭのリン酸塩、ｐｎ６． ｏ、 ５０ＳＭの八〇Ａ（Ｎ−（２−アセタミド〕−２−イミノジ酢酸）、ｐＨ６，０ ，５０１Ｍのビス−トリス（ビス〔２−ヒドロキシエチル〕−イミノートリス− 〔ヒドロキシメチルコメタン）、ｐＨ６，１、緩衝液は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　Ｍ、Ｏ）から入手した。 透析後、透析用バッグの中味を遠心分離に付し、メーカーが記述している通りに タンパク質検定試薬２３２００　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、） を用いてブラッドフォード方法により第Ｘ■因子についてペレット及び上清を検 定した０表２に要約された結果は、第Ｘ■因子がその等電点及びその前後でさま ざまな緩衝液中で不溶性であることを示氾 ４に０互印且ジμ本」徂μｍロ１胡−菌株ＺＭ１１８をｐＨ１６で形質転換した 。 形質転換した細胞を約０．１ｇ／ｌで接種し、３９時間のグルコース供給を伴っ て２２．７ｇ／］の酵母エキス、２２．５ｇ／ｌの（ＮＨｎ）＊ＳＯ，。 ６．５ｇ／ｌのＫｌｌ□ＰＯ４，３ｇ／　ＩのＭｇＳＯ４・７Ｈ！０，０．５％ のグルコース、微量元素及びビタミンを含むｐＨ５，５の培地内で培養した。３ ９時間後、１時間にわたり３．７５　ｇ　／　ｌのエタノールを付加し、続いて エタノール供給を２．５ｇ／］／時から始め２３時間にわたってこれを増大し最 終的に３．７５　ｇ　／　１　／時の速度に達した。２ＭのＮａＯＨを付加する ことによって、培養のｐｎを約５．５で維持した。約５０ｇ／ｌの最終細胞密度 まで６３時間３０°Ｃで培養（約６０リツトル）を成長させた。 ０．２μのセルロースエステル中空繊維カートリッジ（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ。 Ｌａｇｕｎａ　Ｈｉｌｌｓ、　ＣＡ）を用いて濃縮により、細胞培養を収穫した 。最終濃縮物は標準的に、脱イオン水！Ｉ□Ｏ内に湿潤重量で６００〜３０００ 　ｇの酵母細胞（１度〉５０湿潤重量％）を含んでいた。 次に、濃縮細胞を溶菌させた。溶菌緩衝液（５０１Ｈのトリス−ＨＣｌ。 ｐＨ７，０、１５０ｗＭのＮａＣｌ、５　ｍＭのＥＤＴＡ、　１０ｍＭの２−Ｍ Ｅ）内で４０湿潤重量％まで、最大４００　ｇ　（湿潤重量１°）細胞を希釈さ せた。１■門の最終濃度まで細胞スラリー・に対して無水エタノール内の０．５ ＭのＰＭＳＦを付加した。連続流モードでＤｙｎｏｗｉｌｌ　（Ｇｌｅｎ　Ｍｉ ｌｌｓ、　Ｉｎｃ、＋　Ｍａｙｗｏｏｄ＋ＮＪ）を用いて細胞を溶菌した。　Ｄ ｙｎｏｍｉｌｌは０°Ｃ以下で予冷されて、全ての溶液は０〜８０℃であった。 細胞懸濁液を０．６リツトル入り容器内で酸洗いされた５００μのガラス球０． ５リツトルと組合わせ、１５０ｍ１／分の流量を用いて３０００ｒｐ−で溶菌さ せた。容器中を通って、さらに１りントルの溶菌緩衝液をポンプ送りし、細胞リ ゼイトに付加した。１−門の最終濃度まで０．５　ＭのＰＭＳＦを付加し、リゼ イトのｐＨを２ＭのＮａＯＨで７．８に調整した。 次にリゼイトを、遠心分離により清澄させた。ｐＨは２ＭのＨＣＩで７．０に調 整した０次に４０分以上の間４°Ｃで３８９５ｘｇでリゼイトを遠心分離に付し 、ペレットを廃棄した。次に上清分画を濃縮し、１００　ＫＤの公称分子量の遮 断で１０平方フイートのポリスルフォン膜（ＰＴＨＫ。 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び接線流システム（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ、　Ｍｉｌｌｉｐ ｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ。 ＨＡ）を用いて、５＋ｗＳ／ｃｍ未満の伝導率まで、１×平衡緩衝液（５０ｍＭ のトリスｐＨ７，４、１０ｍＭの２−ＭＥ、５−門のＥＤＴＡ）　３体積に対し て遮断した。透析は２０〜２５ｐｓｉの入口圧力、４ｐｓｉの平均膜内外圧力、 ４００〜５０（１＋＋Ｉ／分の流束及び約２０リンドル／分の交叉法流量を用い て、１０°Ｃで行なわれた。 次にＦａ縮され透析されたリゼイトをＤＥＡＥセファロースカラム上でクロマト グラフィにより分別した。高さ２３．５ｃｍＸ半径５．２５ｃ■（２，０リツト ル）のＤＥＡＥカラムを、約４５ｍ１／分の流量を用いて伝導率が４．５ｍＳ／ ｃ−となるまで平衡緩衝液で平衡化した。　１６ｓ＋１／分の流量でカラム上に 試料を装荷し、次に、２８０　ｎｍでの溶離物の吸収度がフルスケール（フルス ケール＝０．５Ａ［Ｉ）での吸収度の１０％未満となるまで平衡緩衝液でカラム を洗浄した。５■門のＰＭＳＦ、　１０ｍＭの２−Ｍ［！及び５ＭＭのＥＤＴＡ を含むｐＨ５，ｓの０．１２Ｍのイミダゾールでカラムから第Ｘ■因子を溶離し た。ピーク分画をプールし、５０■台のＰＭＳＦに調整し、４℃に保った。飽和 ４０％まで、（ＮＨａ）　ｚｓＯａを付加することによって、プールしておいた 第ＸＩ因子含有分画を沈降させた。 次に、ピペラジン緩衝液を用いて第Ｘ■因子を沈降させた。　３９５８ｘｇで（ Ｎ）＋４）　ｚｓＯａ混合物を遠心分離し、上清分画を廃棄した。ｊ！小体積の 低温の２５−門のトリスｐＨ７，４、１００ｓ＋ＭのＮａＣ１，５ｍＭのＥＤＴ Ａ、　１０ｍＭの２−ＭＥ、　０．１９Ｍのグリシン、　０．０２％のＮａＮ５ 　（ＴＡＧＳ）の中でペレットを溶解させた。溶液のｐＨは、２ＭのｐＨ７，５ のトリスを付加することにより、７．０から８．０の間に維持した。不溶性材料 を除去するため溶液を７６４９ｘｇで遠心分離した０次に、５００００　ＫＤの 分子量の遮断透析チュービング（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐａｒ）を用いて４°Ｃで一 晩、上清を、５抛台のピペラジンｐＨ５，８，５ｍ−のＥＤＴＡ、　１０ｍＭの ２−−Ｅ、　０．０２％のＮａＮ５に対し透析した０次に、透析した溶液を３０ 分間、７６４９ｘｇで遠心分離した。結果として得られたペレットを、ｐＨ７， ８の２Ｍのトリスを付加することにより必要に応じてｐＨを維持しながら、最小 体積の低温ＴＡＧＳ内で再度溶解させた。溶液を再び遠心分離し、結果として得 られた上清を回収し、４°Ｃで一晩ピペラジン緩衝液に対して透析した。 溶液を再び遠心分離、ペレットを上述のとおり最小量のＴＡＧＳ内で熔解させた 。 最終的精製は、ゲルろ過により達成した。　ＴＡＧＳ内の第Ｘ■因子（３０ｍｌ ）を１．５リツトル（高さ９５ｃｍ　ｘ半径２．２５ｃｍ）のセファクリルＳ− ４００（Ｐｈａｒ＊ａｃｉａ）カラム上に装荷した。３．０腸１／分の流量で流 れる緩衝液としてＴＡＧＳを用いて分離を達成した。カラム溶離物の吸収度を２ ８０　ｎｍで監視した。主要な第Ｘ■因子のピークは、１１００〜１３５０ｍｌ の間で溶離した。ピーク分画をプールし、約２０ｉ＋ｇ／ｍｌの最終濃度まで膜 濃縮装置ｆ　（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ、＾５ｉｃｏｎ＋　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍ Ａ）内での多重遠心分離により濃縮した０次に、５００００　ＫＤの分子量の遮 断透析チュービング（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）を用いて２％のスクロースを含 むＰ）１７．４の０．１９Ｍのグリシンに対し４°Ｃで一晩、濃縮物を透析した 。 保管のため、透析された材料を０．２μのフィルターに通し、バイアル内に等分 してアリコートにした。試料を１枚のドライアイスのシート上で急速に凍結させ 、−８０°Ｃで保管した。凍結試料の凍結乾燥を、４８時間−２０゛Ｃで行なっ た。凍結乾燥させた第Ｘ■因子をアルコン下で密封し、−２０°Ｃで乾燥状態で 保管した。 撚↓ ２１のアリコート中の凍結した種子ストンクとしてＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＺＭ　１１Ｂ／ｐＤ１６形質転換体菌株を保管した。１つのアリコートを、０． ７１のＦＸＩ［ＩＳの接種のために用いた（表３）、３００ｒｐＩ１１で撹拌し ながら３０°Ｃで２６時間培養を成長させた。 、表−」− 第Ｘ■因子発酵のための培地 ＸＩ［Ｉ　Ｓ　ｆ　のためのロイシン′　立■（ＮＦＩ４）　ｚｓｏ、　１０． ０　ｇ　／　ＩＫＨｔＰＣｈ　５．Ｏｇ　／　ｌ Ｍｇ５ｏ、　ｓ、ｏ　ｇ　／　ｌ ＮａＣ１１，Ｏｇ　／　ｌ ＣａＣ１ｚ　０．５　ｇ　、１ アミノ酸１　３．６８ｇ／ｌ アミノ酸ＩＩ　３．６８　ｇ／　１ クエン酸　４．２９ｇ／ｌ 微量金属　１０．０　ｍｌ／　Ｉ ＰＰＧ−２０２５０，１ｍｌ／　１ ｐＨを５．０に調整し滅菌する：使用前に５ｍｌ／１のビタミンＧを付加する。 発琵暗廼 酵母エキス　６０ｇ／ｌ ｐＨを５．０に調整し１２１°Ｃで３０分間滅菌する二滅菌及び冷却後衣のもの を付加する： 塩　１０ｍ１／１ 微量金属　１０■ｌ／１ ビタミンＧ１０１Ｉｌ／１ ＰＰＧ−２０２５０，１ｍ１７１ 源二ＵＬ アミノ＃Ｉ アデニン　４．０ｇ ウラシル　３．０ｇ Ｌ−）リブトファン　２．０ｇ Ｌ−ヒスチジン　８．０ｇ Ｌ−アルギニン　２．０ｇ Ｌ−メチオニン　２．０ｇ Ｌ−チロシン　３．０ｇ Ｌ−リジン　３．０ｇ Ｌ−フェニルアラニン　５．０ｇ 粉末として組合わせる。 アミノ酸■ 次のしアミノ酸を各々５．Ｏｇづつ： アラニン・アスパラギン、アスパラギン酸、システィン、グルタミン、グルタミ ン酸、グリシン、イソロイシン、プロリン、セゾン、トレオニン、バリン粉末と して組合わせる。 微量金属 ＺｎＣＩｍ　３．４０ｇ ＦｅＣｌ５６Ｂｇ０　２７．００　ｇ ＭｎＣＩｘ　４ＨｚＯ９，５５ｇ Ｃｕ５Ｏ４ｓｕｆｆｉｏ　１．１０ｇ ＣｏＣＩｇ　１．２９ｇ １（ＪＯｚ　Ｏ，３１ｇ （Ｎ）Ｉ４）　ＪｏｔＯ□４０．０１　ｇＫｌ　Ｏ，０１ｇ ４１の精製水内に溶解させ５０１の濃１（ＣＩを付加し水で５．００１となるま で調整する。 ビタミンＧ ｄ−ゼオチン　５−ｇ チアミレ　８０ｍｇ ピリドキシン　８抛ｇ メゾーイソシトール　１５００ｍｇ パントテン酸カルシウム　１５００ｍｇナイアシンアミド　６０−８ 葉酸　１０−ｇ リボフラビン　２０−ｇ コリン　ｉｏｏ−ｇ ２００　ｍｌの精製水ＰＨ５，０中に溶解させる。 塩 ｌｔｇｃｌｔ　６１ｂ０　２５０ｇ ＣａＣＩｇ　２Ｈｚ０　１００　ｇ ＭＣＩ　１００　ｇ ｌｏｏｏｍｌになるまで２Ｍのクエン酸内に溶解させる。 接種物培養を用いて、発酵培地（表３）７１（公称体積）に接種した。グルコー ス供給（１９時間、５０％のグルコース１５％の（ＮＨ４）　ｘＳ０４を一時間 につき２１ｍ１．その後７時間にわたり１４２．６　ｍｌ／時まで増大させる） そしてそれに続いて３１時間目に始まるエタノール供給（９５％ＥｔｏＨを一時 間につき５８．７ｍ１）を用いて、６３．５時間発酵を行なった。ｐＨは、４Ｍ のＮＨ４０）１を付加することによって５．５に維持した。ＰＰＧ−２０００（ Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｋｉｄｅ）で、発泡を制御した。　５５０〜６００　ｒｐｍ で培養を撹拌した。容器を７．５ｐｓｉ　、　４０％の最大Ｏｔ部分圧、００ｇ ＞ｔＳ％に維持した。 培養を２０℃まで冷却し、例３に記されているように収穫した。 ３．３７５　ｋｇの湿バック細胞を回収した。 次に、濃縮した細胞を溶菌した。ｆＡ縮物を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ１ ，０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、　１０５Ｍの２−ＭＥ内で４ ０湿潤重量に調整した０次に、基本的に例３に記されているようにＤｙｎｏ＊１ ｌｌ（Ｇｌｅｎ　Ｍｉｌｌｓ、　Ｉｎｃ、）内で細胞を溶菌させた０次にリゼイ トを、脱イオン水で１＝５に希釈し、５ｈａｒｐｌｅｓ　Ａ３遠心分離機内で９ ５００ｘｇでの遠心分離により清澄した。 最初の分別は、ＤＥＡ　Ｅ高速流セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で行な われた。脱イオン水での希釈により、リゼイトを３ＩＩＳ／ｃｓ未満の伝導率及 びｐＦ１７．２に調整した。洗浄緩衝液（０，００５ＭのＨＤＴＡ、　０．０５ Ｍのトリス−１１ｃＩ　ｐ）１７．４　、０．０１Ｍの２−ＭＥ）でカラム（２ ，５１）を平衡化し、リゼイトをカラムに装荷し、カラムを洗浄緩衝液で洗浄し た。　０．００５　ＭのＥＤＴＡ、　０−０１Ｍの２−ＭＥ、　０．１２Ｍのイ ミダゾールｐ）Ｉ５．８でカラムを溶離させた。約７．０のｐＨで溶離した。　 ＤＥＡＥカラムからのピーク分画をプールした。自然発生的に形成した沈降物を 回収し、ＴＡＧＳ内で一２０ｍｇ／ｍｌまで再度懸濁させ、４°Ｃで一晩↑ＡＧ Ｓに対し透析した０次にこの材料を、４℃で１５分間１２０００　ｘｇで遠心分 離した。 前述のとおり、上清を回収しセファクリルＳ−４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カ ラム上で分別した。次に、保管のため、精製した第Ｘ■因子を凍結乾燥させた。 ２００　ｓＭのＮａＣｌ、　１０ｍＭのグリシン及び１０ｍＭの２−ＭＥを含む ｐＨ７，８の１０−門のリン酸カルシウム（緩衝液Ａ）１禦ｌの中に、凍結乾燥 された１０■ｇの第Ｘ■因子を熔解させた。１０−１のフェニルセファロース（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に溶液を装荷した。　１２分間、緩衝液Ａを用い てカラムを洗浄した。緩衝液Ａと緩衝液Ｂ　（１抛阿のグリシンｐ）１７．８゜ １０−Ｍの２−ＭＥ）の４０分の線形勾配でカラムからタンパク質を溶離させた ０分画（１，７５ｍ１）を収集した。第Ｘ■因子ピークは、分画３５〜３８内に 含まれていた０分画３６〜３Ｂ（５ｍｇの第ｘｍ因子を含む５．２５ｍ１）をプ ールした。　０．０５Ｍのｐｔ１５．８のコハク酸アンモニウム、１．５％のＰ ＥＧ　８０００．　５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム内での透析により、プー ル４１中の第Ｘ■因子を結晶化させた。第Ｘ■因子をペレット化し、ｐＨ８の１ ０−Ｈのグリシン１１にｐ）１Ｂの２Ｍ）リス２０μｍを加えたものの中で再度 溶解させた。 ■立 形質転換させた酵母細胞を、基本的に例４に記述されているとおりに発酵させる 。細胞を濃縮させ溶菌させ、リゼイトを遠心分離によって清澄させる。 最初の分別は、例４に記されているとおりにＤＥＡＥ高速流セファロース（Ｐｈ ａｒ＠ａｃｉａ）上で行なわれる。　（Ａｔｅ。によって決定されるような）ピ ーク分画をプールし、０．５　Ｍのコハク酸を付加することによりｐＨを５．８ に調整する。結果として得られる第Ｘ■因子沈降物を回収し、ｐｉ（５，８の０ ．０５Ｍのコハク酸アンモニウム、１．０％のＰＥＧ３０００　ＬＩＳＰ　（Ｕ ｎｉｏｎ　Ｃａｒｋｉｄｅ）、　０．００５　ＭのＥＤＴＡ、　０．０１Ｍの２ −ＭＥで洗浄し、混合物を均質化する０次に、混合物を、ＨＢ−４０−タの備わ った５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機内で１０５００　ｘｇにて遠心分離 する。 沈降物をｐＨ１，４の０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．３ＭのＮａＣ１内で溶解 させ、フェニルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に装荷する。同じ 緩衝液でカラムを洗浄し、ｐＨ７，４の０．ＯＩＭのグリシンで溶離させる。 フェニル−セファロースカラムからのＡｏ。ピークをプールし、ＴＡＧＳ内で透 析する０次に、透析された溶液を、上述のようにセファクリルＳ−４００（Ｐｈ ａｒｌＩａｃｉａ）上でのゲルろ過によってさらに精製する。 第Ｘ■因子を含むピーク分画を収集し、ブ・−ルし、濃縮し、例３に記述されて いるとおりにｐＨ７，４の０．ＱＩＭのグリシン、２％のスクロース、５ｓＨの ＥＤＴＡに対し透析する。試料を凍結させ、凍結乾燥させ、−２０°Ｃでアラボ ン下で乾燥状態にて保管する。ゲルろ過に続いて、酵母タンパク質汚染は標準的 に、ＥＬＩＳＡにより約３０ｐｐ働以下である。 肛 基本的に例４で記述されているように、１０００リツトルの５１ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　ＺＭ　１１８／ｐ［ｌＩ６の培養を発酵させる。 １１リットル／分の流量、８１５０ｒｐｍ　、そして約１５°Ｃの温度でＷｅｓ ｔｆａｌｉａＣＳ＾−１９連続流遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｔａ　５ｅｐａｒ ａｔｏｒ　ＡＧ、　０ｅｌｄｅ、ドイツ）を用いた遠心分離により、細胞を収穫 する。シュート間の時間は１８０秒である。容器ｔよ、各シュート前に純水で洗 浄される。 結果として得られた細胞スラリーを、純水で３５〜４０体積％の細胞に調整し、 次に３０−Ｍのリン酸ナトリウム、１５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　ＭのＮａ（： Ｉ、　ｐ）１７．８に調整する０次にスラリーを、０．５ｍｍの球を用いてＤｙ ｎｏｍｉｌｌにＤ２０Ｂホモジナイザー（Ｈｉｌｌｙ　Ａ、Ｂａｃｈｏｆｅｒ　 ＡＧ、　Ｂａ５ｅｌ）の中で溶菌する。このホモジナイザは、入口温度を１０’ Ｃ未満に保ちながら、４．８リットル／分の生成物流量で１２００ｒｐ議で作動 させられる。 ホモジナイザーからのリゼイトを、最終伝導率４．５＋／＝０．２ｍＳ／ａｍ、 ｐＨ７，２まで、予冷された（２〜５℃）純水に直接付加する。 希釈した細胞リゼイトを、７リツトル／分の流量、８１５Ｑｒｐｓ　、及び１５ °Ｃ未満の温度でＷｅｓｔｆａｌｉａ　Ｃ３Ａ−１９遠心分離機を用いて清澄さ せる。シュート間の時間は６００秒である。結果として得られた上清は、４５１ １５４２−５０５カートリツジの備わったＣｕｎｏ　１２２Ｐ　３型フイルター を通してろ遇する。 清澄されたリゼイトを次に、ＤＥＡＥセファローズＦＦ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 。 ＰｉｓｃａｔａｗａＶ＋　ＮＪ）　１００　リットル体積の１０ｃｍ＋の長さの カラムを用いて陰イオン交換クロマトグラフィにより分別する。カラムを６．５ りントル／分の流量で作動させる。装荷後、カラムを、２園ＨのＨＤＴＡを含む ｐｌ’１７．２の４．２　ｍｓ　／　ｃ請のリン酸ナトリウム緩衝液８００　リ ットルを用いて洗浄する。第ｘｍ因子を、６ｍｌ’ｌの［！ＩＩＴＡを含むｐＨ ６，３（７）Ｌｏｓｓ／　ｃｍのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてカラムから溶 離させる。　２８０　ｎ閣における溶離物の吸収度を監視し、ピーク分画をプー ルする。 ｐｆ（６，７で工２％　ｗ　／　ｖの固体酢酸ナトリウムを付加することにより 、プールされたピークから第Ｘ■因子を結晶化させる。溶液を１５１　〜２０℃ で５〜９時間放置する。結果として得れた結晶質沈降物を、２５〜４０リットル ／時の流量を用いて１５０００　ｒｐ−で５ｈａｒｐｌｅｓ　（Ａｌｆａ−Ｌａ ｖｅｌ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｗａｒ＋＊１ｎｉｓｔｅｒ、　 ＰＡ）　ＭＳ−１２Ｖ遠心分離機上での遠心分離により収集する。１時間１０ｓ ＨのｐＨ６，７のリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥ［ｌＴＡ、　１１％　Ｗ　／　 Ｖの酢酸ナトリウムの中で懸濁させることによって、沈降物を洗浄し、その後、 １５〜２５リフドル／時の流量及び１５０００　ｒｐｍで５ｈａｒｐｌｅｓ　Ａ Ｓ−１２Ｖ遠心分離機の中で遠心分離する。洗浄した沈降物を、少なくとも４時 間５°Ｃで、ｐＨ８，０の１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２１１ＭのＥＤＴＡ、 　１０＊＋Ｍのグリシン１００　リットルの中で溶解させる。 溶解され、結晶化された第Ｘ■因子を次に０，４５ミクロンのフィルターを用い てろ過し、２５ｃｍの長さの６０リツトルのフェニル−セフ１０−スＦＦ　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で分別する。カラムを、１８０リットル／時の流量 を用いて室温で作動させる。第Ｘ■因子の負荷の伝導率を、ＮａＣ１を負荷する ことによって６０ｍ５／ｃｍに調整し、ＨｉＰＯａの付加によってｐｌｌを７． ４に調整する。５力ラム体積の６０ｗ５／ｃ■のＮａＣ１゜２０ｍＭのリン酸ナ トリウム、２−ＭのＥＤＴＡ、　ｐ）１７．４で、カラムを洗浄する。　１０５ Ｍのグリシン、１ｅｚＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，４に向かい２４０　リットル以 上の勾配を用いて第Ｘ■因子を溶離させる。溶離物をＡ□。で監視する。 ０．２ミクロンのフィルターを用いてプールされたピーク分画をろ過し、次に９ ０リットル／時の流量を用いて長さ４０ｃｍ、　３０リツトルの（１−−セファ ロースＦＦ　（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ）上でのクロマトグラフィによりさらに分 別する。出発材料は、１１ｍ５／ｃｓ＋のＮａＣｌ、　ｐ）１７．４に調整され る。 １５０　リンドルの１０１門グリシン、　２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１１の ＥＤＴＡ、　１１ｗ５／ｃ−のＮａＣｌ、　ｐＨ７，４を用いてカラムを洗浄す る。　１０ｍＭのグリシン、　２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｓＨのＢＤＴＡ 、　０．２５ＭのＮａＣ１゜ｐＨ７，４に向って２４０リットル以上の勾配で、 第Ｘ■因子を溶離させる。溶離物をＡ、。で監視し、ピーク分画をプールする。 Ｑ−セファロースカラムからの溶離物ビークを、１０．０００公称分子量遮断（ ＮＭＷＣ）の中空繊維ＩＪＦフィルタ（ＡＧ　Ｔｅｃｈ、　Ｎｅｅｄｈａｍ、　 ＭＡ）上で１０〜１５ｇ／リットルの第Ｘ■因子まで濃縮させる。 ０．３Ｍのコハク酸を用いて溶液のｐｉを５．８に調整することにより、濃縮さ れた第ＸＩ［Ｉ因子を結晶化する。溶液を５°Ｃで一晩保存し、次にＪＡ−１０ ローター内で８０００ｒｐ−で２０分間Ｊ、２−Ｍ１遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａ ｎ　Ｉｕｓｔｒｕｒｎｅｒｔｓ＋　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）内で遠心分離 する。結晶を回収し、０．０５Ｍのコハク酸アンモニウム、２ｓＨのＥＤＴＡ、 ５ｄのアスコルビン酸ナトリウム、ｐＨ５，８の中で懸濁させる。上述のとおり 、Ｂｅｃｋ■ａｎＪ２−Ｍｌ遠心分離機の中で懸濁液を遠心分離させる。結晶質 沈降物を回収し、２０ｇ／リットルの第Ｘ■因子濃度まで１０ｍＭのグリシン、 ２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｓＨのＥＤＴＡ、　１０ｇＭのＮａＣ１，ｐＨ ７，８内で再度可溶化される。上述のとおりＢｅｃｋｓａｎ　Ｊ２−Ｍｌ遠心分 ＨＩｌの中で溶液を遠心分離し、上清を収集する。 ０、２ミクロンのフィルターを用いて第Ｘ■因子１１１縮物の３リツトル負荷を ろ過し、次に２０ｗＭのリン酸ナトリウム、１ｓＨのＥＤＴＡ、　１０ｗＭのグ リシン、０．１　Ｍ（ＤＮａＣＩ、　ｐＨ７，８を用いてセフアクリルＳ−２０ ０（５−２００（Ｐｈａｒ　１００　リットル（カラム長９０ｃｍ　）の上で分 別する。溶離物をＡ、。で監視する。 Ｓ−２００力ラムカラノピーク分画をプールシ、ＡＧ７１０．０００　Ｎｌ’ｌ ＷＣ中空繊維ＵＦフィルタを用いた限外ろ過及び１０体積の１０１グリジン、０ 、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％スクロース、ｐＨ７，４を用いたダイアフィルトレ ーシゴンによってリンドルあたり２５ｇの第Ｘ■因子になるまで濃縮する。ろ過 された溶液は次に、０，２ミクロンのフィルターを通してのろ過によって滅菌さ れ、凍結乾燥される。 基本的に上述のとおり調製された第Ｘ■因子を、精製プロセス中のさまざまな点 で試料採取し、第Ｘｆ［［ａ因子含有量及び酵母汚染について検定した。螢光光 度検定を用いて、第Ｘｍａ因子含有量を測定した２合計タンパク質を２０ｍｇ未 溝に保ちながら、試料１個あたり２００　ｕ　ｌの合計体積までｐＨ９，０の０ ．０５Ｍのとシン緩衝液内で希釈することによって、第Ｘ■因子試料を調製した 。試料は、１０　Ｘ　１０　Ｘ４８ｍｍのキュベント内で調製した。！ｌｌ製し たばかりの１　、２５ｍ　ｌの一〇Ｃ−ビオシンカクテル（０，５＋ｗｌの０． ０３ＭのＦＩＣＩ内で１．３４曽ｇのモノダンジルカダベリンを溶解し同量の０ ．１　ＭのｐＨ７，４のトリスと混合し次に２４．０ｅｌの０．０５Ｍビオシン 緩衝液ｐＨ９，０と０．４ｅｌの溶液を組合わせることによって調製された０、 ０５Ｍのビオシン（Ｎ、Ｎ−ビス〔２−ヒドロキシエチル〕グリシン；　Ｓｉｇ ｍａ）ｐＨ９，０内の０．０６３　ｓ＋Ｈのモノダンジルカダベリン（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　）及び５０μｌの０．４　ＭのＣａＣＩ　ｔ を、各キュベツトに付加した。溶液を混合し、１０分間３７°Ｃまで予熱した。 各キュベツトに対し５０μｍの１００　Ｎ１）ＩＩＩ／ｍｌ　）ロンビンを付加 し、溶液を穏やかに混合し、キュベツトを３７℃で１０分間インキュベートした 。穏やかに混合しながら各キュベツトに対して５０μｍの調製したばかりのジチ オトレイトールを付加した０次に、種やかに混合しながら各キュベツトに対し、 ２００　ｕ　１の２％のＮ、　Ｎ−ジメチルカゼインを付加し、３７°Ｃで１０ 分間キュベツトをインキュベートした０次に、穏やかに混合しながら各キュベツ トに対し５０μＩの停止試薬（１，６Ｍの硫酸アンモニウム、０．２ＭのＥＤＴ Ａ）を付加した。　３ｎ■のスリット幅及び３９°Ｃの水浴温度を用いて５００ 　ｎｗでの発出及び３６０　ｒｖでの励起で、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ −５Ｂ螢光光度計内で螢光を測定した。第Ｘ■因子の代りに２００μｌのビオシ ン緩衝液を用い停止試薬を削除して、ブランクをセットした。５０Ｍｇの組換え 型第Ｘ■因子標準を用い停止試薬を削除して、利得（１００％）をセットした。 アミノ酸分析により測定された組換え型筒Ｘ■因子の希釈により生成された５μ ｇ／ｍｌ、　１０Ｍｇ／ｍｌ及び２５μｇ／■１の第Ｘ■因子標準から作成され た標準曲線と、結果を比較した。プロセス試料の第ＸＩＩ＋ａ因子含有量を、ト ロンビンを伴って又は伴わずに試料を検定することによって決定した。セファク リルＳ−２００上でのゲルろ過の後、第ＸＩ［Ｉａ因子含有量を約０．３％まで 減少させた。溶解され凍結乾燥された材料の第Ｘｍａ因子含有量は約０．５％で あった。 ウサギ抗酵母菌抗体を用いたＥＬＩＳＡにより酵母菌汚染を検定した。 形質転換されていないＳ、　（Ｂｒｅｖｉｓ４ａｅ　Ｚ門１１８の１６の１リツ トル培養を収穫し、細胞を分断し、清澄リゼイトを調製した。この材料で１６匹 のウサギを免疫し、抗血清を調製しプールした。ＥＬＩＳＡ　ｍｌ衝液Ａ（０， １Ｍの炭酸ナトリウムｐＨ９，６）内で１０Ｍｇ／ｍｌとなるまで、プールした 抗血清を希釈した。９６ウエルのプレートの各ウェルに希釈された抗血清を１０ ０μｌずつ加え、プレートにブレートシーラーをかぶせて４°Ｃで一晩又は３７ °Ｃで２時間保管した。その後、プレートのカバーを取り、洗浄１回あたり２０ ０μｍの緩衝液Ｃ（０，１％のＴｗｅｅｎ　−２０を含むリン酸緩衝溶液）で５ 回洗浄した。緩衝液Ｃ内で２．８μｇ／ｖａｌとなるまで、１０μｌの酵母標準 （プールされた抗原）（２，８Ｂ／ｓｌ）を希釈した。希釈標準２８．６，１／ 　Ｉを２．０ｍｌの緩衝液Ｃに付加した。結果として得られた作業標準を階段希 釈して４０．２０゜１０、　５．２．５．１．２５及び０．６２ｎｇ／ｍｌの標 準曲線を得た。９６ウエルのプレートの列Ｂ−Ｈの各々の３つのカラムに対して １００マイクロリツトルの緩衝液Ｃを付加した。酵母抗原の作業標準１００マイ クロリツトルを列Ａ内の３つのウェルの各々に付加した。列Ｂ内の３つのウェル の各々に対して１００マイクロリツトルの作業標準を付加し、徹底的に混合した 後、各ウェルから１００μ！を列Ｃに移した０列Ｇまで３つのカラム内で階段希 釈を継続し、列Ｇにて、各ウェルから１００１の希釈標準を除去し廃棄した。１ ００μｌの緩衝液Ｃを、ブランクとして２つのカラムの各々に付加した。テスト 用試料を緩衝液Ｃ内で希釈し、１００μｌの希釈試料をウェルに３つ同様に付加 した。 プレートをプレートシーラーで覆い、室温で最低２４時間インキュベートした。 使用の直前に、ビオチニル化されたウサギ抗酵母抗体（０，５−ｇ／ｍｌのスト ック）を緩衝液Ｃ内で１：１００に希釈した。プレートをドレンし、緩衝液Ｃ（ ウェル１つあたり２００　、１　）で５回洗浄し、各ウェルに対して希釈されビ オチニル化された抗体を１００μｌずつ付加した。３７°Ｃで少なくとも１．５ 時間プレートをインキユベートし、次に２００　μｌ／ウェルの緩衝液Ｃで５回 洗浄した。各ウェルに対して、緩衝液Ｃ内で希釈されたばかりのストレプトアビ ジン／ＨＲＰ　（＾■ｅｒｓｈａｍ）　１００　μｌを付加した。プレートをブ レートシーラーで覆い、３０〜４５分間３７°Ｃでインキユベートし、次に２０ ０μｌ／ウエルの緩衝液Ｃで５回洗浄した。　１０＋ｍｌのＤＰＤ希釈液（０， １Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５，０）内で２錠（１３＋ｇ）のＯＰＤ基質（ ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を溶解させた。使用の直前に、１０ｍ１ のＯＰＤ基質溶液に対して１０μｍのＨ２Ｏ，を付加し、次に各ウェルに対して １００　ｕ　ｌの溶液を付加した。黄色が発達するまで（約０．６〜０．９０． Ｄ、単位）、プレートを室温でインキユベートし、次に各ウェルに対して１００ ｕｌの２ＭのＨｚＳＯａを付加して反応を停止させた。　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＤ ｅｕｊｃｅｓ　（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）のプレート読取り装置 の中で、４９０ｎ−でプレートを読みとった。１５％以下の変動係数及び４９０ 　ｎｍで０．０１５以上の０．Ｄ、をもつセグメントを用いた標準曲線と結果を 比較した。 酵母タンパク質含有量はｉ　ｐｐｍ未満まで減少された。 ［ 酢酸ナトリウムでの結晶化を通して基本的に例５に記されているとおりに、第Ｘ ■因子を調製した。溶解させた沈降物を、Ｈ３ＰＯ４でＰＨ７，４に調整し、Ｎ ａＣ１で１１．２＋ｍＳ／ｃｍの伝導率に調整した。 第ｘｍ因子溶液を次に１１ｃｍのＱ−セファロースＦＦ　（Ｐｈａｙｖａｃｉａ ）カラム上で分別させた。カラムに、樹脂１リツトルにつき９ｇの第Ｘ■因子を 装荷し、次にカラムを、５力ラム体積の１０５ＭのＮａＪＰＯａ　。 １０ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、ｐＨは８３ＰＯ４で７．４に 調整、ＮａＣｌで１１．２＋ｍｓ／ｃ■に調整した。第ｘｍ因子を、６力ラム体 積の１０ｍＭのＮａｚＨＰＯａ　、　１０ｍＭのグリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ、 　ｐｉはＨ３ＰＯ４で７．４゜０．２５ＭのＮａＣ１，を用いて溶離させた。 次に、Ｑ−セファロースカラムからのＡ、。ピークを、室温でＴｏｙｏｐｅａｒ ｌ　Ｂｕｔｙｌ　６５０の２３ｃｍカラム上でさらに分別させた。第ｘｍ因子の 溶液をＮａ、ＳＯ，で５ｈＳ／ｃｍ及びｐＨ７，４に調整し、カラム上に樹脂１ リツトルあたりＬｏｇの第Ｘ■因子を装荷した。次に力）ムを２０ｍＭのＮａｚ ＨＰＯａ　、　１０ｍＭのグリシン、］、ｗ＋ＭのＥＩＩＴＡで洗浄し、ｐＨを ＨｉＰＯａで７．５に、又ＮａｔＳＯ４で５２ｗ５／ｃｍにした。第ｘｍ因子を ＰＨ７，４に調整された同じ緩衝液１．５力ラム体積のＩＣＩあたり３６ｍ５ま での勾配で溶離させた。 ブチル６５０カラムからピーク分画を回収し、例５に記されているとおりに第Ｘ Ｉ［ｌａ因子分有量及び酵母タンパク質について検定した。 第ＸＩ［１ａ因子含有量は０．３７％であった。酵母タンパク質汚染は２ｏｐｐ ｍであった。 ブチル６５０カラムからのピーク分画をプールし、Ａ■ｋｅｒｃｈｒｏｍ　ＣＧ ７１樹脂の２５ｃ−カラム上でさらに分別した。カラムを室温で作動させた。 ブチル６５０カラムからの溶離液を１５ｍ５／ｃｍまで純水で希釈させ、９Ｈを ７．５に調整した。樹脂１リツトルにつき約１２グラムの第Ｘ■因子を装荷した 。カラムを４力ラム体積の１０■ＨのＮａＪＰＯｎ　、１ｋＭのグリシン、１ｓ ＋ＭのＥＤＴＡで洗浄し、ｐｌｌをＨ３ＰＯ４で７．５とし、伝導率はＮａＣ１ で５．８ｗｌ５／ｃｍに調整した。第ｘｍ因子を、０．５ｍＳ／ｃｍの伝導率ま で、の勾配で、カラムから溶離させた。 ＾ｍｂｅｒ　ｃｈｒｏ■カラムからのピーク分画を、第ＸＩ［［ａ因子について 検定し、これは０．０６％であった。酵母タンパク質は２．１ｐｐ−未満であっ た。 上述のことから、ここでは例示を目的として発明の特定の実施態様が記述されて いるものの、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな変更を行な うことができるということがわかるだろう。従って、本発明は、添付の請求の範 囲による以外に制限を受けるものではない。 ＃【（内容に変更なし〕 手続補正書（方式） 平成６年λ月２ユ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的流体から第ＸＩＩＩ因子を精製するための方法であって：ａ）第Ｘ ＩＩＩ因子について富化された分画を生成するため陰イオン交換クロマトグラフ ィにより生物学的流体を分別する段階、ｂ）富化された分画に酢酸ナトリウムを 付加して結晶質沈降物を形成する段階； ｃ）沈降物を溶解させて溶液を形成する段階；ｄ）第ＸＩＩＩ因子について富化 された第２の分画を生成するため疎水的相互作用クロマトグラフィにより溶液を 分別する段階、ｅ）第ＸＩＩＩ因子について富化された第３の分画を生成するた め陰イオン交換クロマトグラフィにより第２の富化分画を分別する段階；ｆ）第 ＸＩＩＩ因子を含む沈降物を生成するため第３の富化分画のｐＨをｐＨ５．２〜 ６．５に調整する段階；ｇ）前記沈降物を回収する段階； ｈ）沈降物を溶解させて溶液を形成する段階；及び、ｉ）ゲルろ過により溶液を 分別し、第ＸＩＩＩ因子を含むピーク分画を収集する段階、 を含む方法。 ２．ｐＨを調整する段階には、前記第３の富化分画にコハク酸を付加することが 含まれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．生物学的流体から第ＸＩＩＩ因子を精製するための方法であって：ａ）第Ｘ ＩＩＩ因子について富化された分画を生成するため陰イオン交換クロマトグラフ ィにより生物学的流体を分別する段階；ｂ）富化された分画に酢酸ナトリウムを 付加して結晶質沈降物を形成する段階； ｃ）沈降物を溶解させて溶液を形成する段階；ｄ）第ＸＩＩＩ因子について富化 された第２の分画を生成するため陰イオン交換クロマトグラフィにより溶液を分 別する段階；ｅ）第ＸＩＩＩ因子について冨化された第３の分画を生成するため 疎水的相互作用クロマトグラフィにより第２の富化分画を分別する段階、 ｆ）第ＸＩＩＩ因子について富化された第４の分画を生成するため疎水的相互作 用クロマトグラフィにより第３の富化分画を分別する段階；及び ｇ）ゲルろ過により第４の富化分画を分別し、第ＸＩＩＩ因子を含むピーク分画 を収集する段階、 を含む方法。 ４．前記生物学的流体が酵母細胞リゼイトである、請求の範囲第１項又は第３項 に記載の方法。 ５．前記第ＸＩＩＩ因子が組換え型ヒト第ＸＩＩＩ因子である、請求の範囲第１ 項又は第３項に記載の方法。 ６．汚染性タンパク質との関係において少なくとも９９％純粋である第ＸＩＩＩ 因子を含む物質の化合物。 ７．前記第ＸＩＩＩ因子が組換え型ヒト第ＸＩＩＩ因子である、請求の範囲第６ 項に記載の化合物。 ８．前記組換え型ヒト第ＸＩＩＩ因子が、酵母産生の組換え型ヒト第ＸＩＩＩ因 子である、請求の範囲第７項に記載の化合物。 ９．５０ｐｐｍ未満の酵母タンパク質を含む、請求の範囲第８項に記載の化合物 。 １０．２０ｐｐｍ未満の酵母タンパク質を含む、請求の範囲第８項に記載の化合 物。 １１．１０ｐｐｍ未満の酵母タンパク質を含む、請求の範囲第８項に記載の化合 物。 １２．１ｐｐｍ未満の酵母タンパク質を含む請求の範囲第８項に記載の化合物。 １３．前記第ＸＩＩＩ因子の０．５％以下が第ＸＩＩＩａ因子である、請求の範 囲第１２項に記載の化合物。 １４．前記第ＸＩＩＩ因子の１％以下が第ＸＩＩＩａ因子である、請求の範囲第 ６項に記載の化合物。 １５．前記第ＸＩＩＩ因子の０．５％以下が第ＸＩＩＩａ因子である、請求の範 囲第６項に記載の化合物。