JPH07506566A - 炎症性胃腸病の処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 炎症性胃腸病の処置 ル■匹艮亘ユ１ 本発明は炎症性腸病（ＩＢＤ）の処置に関するものである。より詳細には本発明 は、ＩＢＤの処置に際しインテグリンＶＬＡ−４（ｖｅ　ｒｙ　土ａｔｅ　ａｎ ｔｉｇｅｎ−４）を認識する抗体の使用に関するものである。

ル匪旦１遣 炎症性腸病（すなわちＩＢＤ）は潰瘍性大腸炎およびクローン氏病（Ｃｒｏｈｎ ’　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）（回腸炎）を包含する総合的な名称であり、これらは 胃腸管の慢性炎症障害である。潰瘍性大腸炎は大腸（結腸）および直腸に限られ 、腸壁部の内表層のみに関係する。クローン氏病は胃腸管の任意の部分（すなわ ち口、食道、胃、小腸、大腸、直腸および肛門）に影響を与え、腸壁部の全層に 関与する。これら両病気は腹痛、並びに痙申、下痢、直腸出血および発熱を特徴 とする。これら病気の徴候は一般に進行性であって、罹患者は典型的には寛解期 の後に重大な再発を受ける。

ＩＢＤは米国だけでも２００万人が推定される。ＩＢＤは致命的な病気でないと 考えられるが、長期間にわたる病気は生長に影響を及ぼす重大な栄養障害をもた らし或いは膿瘍または腸搬痕組織を形成して感染もしくは腸障害を引き起こす。

ＩＢＤは療法がなく、正確なＩＢＤの原因はまだ知られていない。慣用のＩＢＤ 処置は抗炎症剤、免疫抑制剤および外科手術を含む。生物活性の５−アミノ−サ リチル酸（５−Ａ　Ｓ　Ａ）成分を含有するサルファサラジンおよび関連薬剤が 、軽度のＩＢＤ＠候を抑制すると共に寛解傾向を維持すべく使用される。しばし ば、重度の炎症は強力なコルチコステロイドおよびしばしばＡＣＴＨにより或い はたとえば６−メルカプトプリンおよびアザチオプリンのような免疫抑制剤で処 置される。重度の慢性ＩＢＤに最も一般的な外科処置は腸切除および最終的に結 腸切除術であるが、潰瘍性大腸炎についてのみ完全な療法である。

ＩＢＤにつき一般的に処方される薬物については嘔気、眩量、血液化学変化（貧 血および白血球減少症を含む）、皮膚発疹および薬物依存症を含め重大な副作用 が伴う。

さらに外科処置は、しばしば患者の日常生活を顕著に変化させるような急激な手 法である。したがって、有効であって副作用が少なく、ＩＢＤ患者の人体および 生活面を大して侵害しないようなＩＢＤの処置が極めて必要になる。

ＩＢＤの原因およびより効果的な処置に関する探求は、多くの研究者を発病およ び正常な組織につき細胞レベルで研究するに至らしめた。これは腸内ムチンの正 常な含有量の変化に関する観察（ボトルスキー、１９８８［１］）をもたらし、 さらに結腸糖蛋白が発病組織にのみ生ずるという観察（ボトルスキーおよびフー ルニエール、１９８８ａ［２コ、１９８８ｂ　［３］　）をもたらした。研究者 等は、ＩＢＤ組織にて細胞付着分子ＩＣＡＭ−１が高レベルで発現されることを 観察した（マリチア等、１９９１　［４））。この分子は全ゆる白血球における 白血球表面リガンド、ｔなわちＬＦＡ−１（ＣＤ１１　ａ／ＣＤ１８複合体）お よび大食細胞におけるＭａｃ−１（ＣＤｉ　ｌ　ｂ／ＣＤＩ　８）に対する付着 を介し、炎症部位への白血球補充を媒介すると思われる（たとえばスブリンガー 、１９９０［５］参照）。ＩＢＤの再発はしばしば腸粘膜化組織における好中球 およびリンパ球の濃度増大を伴うので、内皮細胞リセブタ（たとえばＩＣＡＭ− １）とその白血球リガンド（たとえばＬＦＡ−１、Ｍａ　ｃ−１）との間の相互 作用を阻止することがＩＢＤの処置として提案されている。

他の細胞付着分子、すなわちＶＣＡＭ−１（ｖａ　ｓ　ｃｕ！ａｒ　ｃｅｌｌ　 ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕＩｅ−１）は炎症した内皮で発現され、好中球 以外の全白血球の表面で発現されるα４β１インテグリン、すなわちＶ　Ｌ　Ａ 　−４を認識することが示されている（スブリンガー、１９９０　［５］　）、 さらｌ：　Ｖ　ＣＡ　Ｍ　−１１；！、バイヤース斑小胞樹状細胞（Ｐｅｙｅｒ ’　ｓ　ｐａｔｃｈｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｅｅｌｌ）を 含め非炎症細胞で構成的に発現されることも判明している（フリートマン等、１ ９９０　［６］　；ライス等、１９９１　［７］）。さらに、細胞イ′−１着現 象を媒介する他、Ｖ　ＣＡ　Ｍ　−１はさらにＴ細胞活性化においてＶＬＡ−４ を介し重大な役割を演することも最近決定された（バークリ−等、１９９１　［ ８］　；ダムレおよびアルフオ、１９９１　［９］　；パン・セベンター等、１ ９９１［１，０］）。したがって、ＶＣＡＭ−１が免疫反応の調整剤として或い はインビボにおける付着の媒体として役割を演するかどうか検討すへ＜、ＶＣＡ Ｍ−１のさらなる検討が行われている。

驚くことに今回、抗−ＶＬＡ−４抗体を投与すればＩＢＤの霊長動物モデルにて 急性炎症を顕著に減少させることが突き止められた。抗−ＶＬＡ−４抗体（ＨＰ Ｉ／２）で処置された人間における潰瘍性大腸炎に匹敵する自然の腸炎症に罹患 した綿毛シシザルは、生検腸組織の炎症において顕著な減少を示した。

＆胛鬼１孟 したがって本発明はＩＢＤの新規な処置法を提供し、さらにＩＢＤの処置に有用 な新規な医薬組成物を提供する。特に本発明は、ＩＢＤ罹患者に対したとえば抗 体ＨＰ１／２のような抗−ＶＬＡ−４抗体を投与する工程からなる方法を提供す る。さらにＩＢＤの処置にて、抗−ＶＬＡ−４抗体の作用に類似する同様な抗体 、抗体断片、可溶性蛋白質および小分子の使用も考えられる。

日の古　な！■ モノクローナル抗体を産生ずる技術は周知されている。

要するに、不死細胞ライン（典型的には骨髄腫細胞）を所定の抗原（たとえばＶ ＬＡ−４）を発現する全細胞で免疫化された哺乳動物からのリンパ球（典型的に は牌細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上澄液を抗原に対す る抗体につきスクリーニングする（一般にコーラ−およびミルスタイン、１９７ ５　［１１］参照）。

免疫処理は標梨法を用いて行うことができる。単位投与量および免疫処方は免疫 処理する哺乳動物の種類、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。典型 的には免疫処理された哺乳動物を出血させ、各血液試料からの血清を適するスク リーニング分析により特定抗体につき分析する。たとえば、抗−ＶＬＡ−４抗体 はＶＬＡ−４−発現性細胞からの１２８１−標識細胞溶解物の免疫沈澱によって 同定することができる（サンチェズ・マドリード等、１９８６　［１３］および ヘムラー等、１９８７［１４］参照）。抗−ＶＬＡ−４抗体はさらにフロー・サ イトメトリーにより、たとえばＶＬＡ−４を認識すると思われる抗体と共にイン キュベートしたＲａｍｏｓ細胞の蛍光染色を測定して同定することもできる（エ リス等、１９９０　［１５］参照）。ハイブリドーマ細胞の産生に使用されるリ ンパ球は典型的には、血清が抗−ＶＬＡ−４抗体の存在につき上記スクリーニン グ分析により陽性と既に試験されている免疫処理された哺乳動物から分離される 。

典型的には、不死細胞系統（たとえば骨髄腫細胞系統）は同じ哺乳動物種からリ ンパ球として得られる。好適な不死細胞系統はマウス骨髄腫細胞系統であってヒ ボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（ｒＨＡＴ培地」 ）に対し感受性である。ＨＡＴ−感受性マウス骨髄腫細胞は、たとえば１５００ 分子量ポリエチレングリコール（ｒＰＥＧ１５００Ｊ）を用いてマウス牌細胞に 融合させることができる。融合から得られたハイブリドーマ細胞を、次いで未融 合および非産生的に融合した骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて選択す る（未融合の牌細胞は形質転換されないので数日間後に死滅する）。所望の抗体 を産生ずるハイブリドーマをハイブリドーマ培養上澄液のスクリーニングにより 検出する。たとえば抗−ＶＬＡ−４抗体を産生ずるよう作成したハイブリドーマ は、ハイブリドーマ培養上澄液をたとえばトランスフェクトされたに一５６２細 胞のような組換α、−サブユニットー発現性細胞系統に結合する能力を持った分 泌抗体について試験しスクリーニングすることかできる（エリス等、［１５］参 照）。

抗−ＶＬＡ−４抗体を産生させるには、この種のスクリーニング分析にて陽性と 試験されたハイブリドーマ細胞を、これらハイブリドーマ細胞がモノクローナル 抗体を培地中に分泌する条件下および充分な時間にて栄養培地で培養する。ハイ ブリドーマ細胞に適する組織培養技術および培地は周知されている。細胞を除い たハイブリドーマ培養上澄液を集め、必要に応じ抗−ＶＬＡ−４抗体をさらに周 知の方法で精製することができる。

或いは所望の抗体は、ハイブリドーマ細胞を２．６゜１０．１４−テトラメチル ペンタデカン（ブリスティン（ＰＲＩ　５ＴＡＮＥ）；シグマ・ケミカル・カン パニー社、セントルイス、ＭＯ）で処理されたマウスの腹腔内に注射して産生ず ることもできる。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖して抗体を分泌し、膣液と して蓄積する。

この抗体を、腹腔がら注射器により膣液を抜取ることに、　より回収することが できる。

従来、数種の抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体が記載されている（たとえばサ ンチェズ・マドリード等、１９８６　［１２］　；ヘムラー等（１９８７）［１ ３］　；プリド等（１９９１）［１４］参照）。ここでの実験については、ＨＰ Ｉ／２と称する抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体（バイオジエン・インコーポ レーション社、ケンブリッジ、ＭＡから人手）を使用した。抗−ＶＬＡ−４抗体 ＨＰＩ／２の重鎖および軽鎖の可変領域をクローン化し、配列決定し、さらにヒ ト免疫グロブリン重鎮および軽鎖の定常領域と組合せて発現させた。この種のキ メラＨＰＩ／２抗体は特異性および能力においてネズミＨＰＩ／２抗体と類似し 、本発明による処置方法に有用である。同様に、人体適応化した組換抗−ＶＬＡ −４抗体もこれら方法に有用である。ＨＰＩ／２　Ｖ、ＤＮＡ配列およびその翻 訳アミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　１およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２１：示す。ＨＰ１／２　Ｖ、ＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列をそれ （’１ｓＥＱ　１０　ＮＯ：３およびＳＥＱ　ＩＤＮ０：４に示す。

たとえばＨＰＩ／２のようなモノクローナル抗体およびＶＬＡ−４のα鎖を認識 しうる他の抗−ＶＬＡ−４抗体（たとえばＭａｂ　ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ ２５、Ｐ　４　Ｃ２）が本発明に有用である。抗体はＶＬＡ−α。

鎖のＢｌもしくはＢ２エピトープを認識することが最も好ましい（ブリド等（１ ９９１）　［１５］参照）。特定の科学理論に拘束されるものでないが、本発明 の方法により使用される抗−ＶＬＡ−４抗体は少な（とも初期にわたり消化管の 炎症部分へのＶＬＡ−４−発現性白血球の移動を特異的に阻止することができる 。或いは、ＩＢＤＭ織に既に補充された白血球による炎症媒体およびサイトカイ ンの放出を何らかのＶＣＡＭ−１−媒介信号導入（たとえば従来観察されている Ｔ−細胞同時活性化）を妨げる抗−ＶＬＡ−４抗体により阻止することかできる （たとえばバークリ−等、１９９１［８］）。モノクローナル抗体ＨＰＩ／２は 、ＶＣＡＭ−１−発現性細胞に対する白血球付着を阻止し、ＶＬＡ−４−媒介の Ｔ−細胞活性化を促進しないことが示されている。

本発明の方法は、炎症性腸病に罹患している哺乳動物に抗−ＶＬＡ−４抗体から なる組成物を投与することを特徴とする。後記実施例は綿毛シシザルで観察され た結果を示す。綿毛シシザル（ＣＴＴ）とＩＢＤヒトとで観察された自然の慢性 広汎性大腸炎の間には生理学的および組織化学的な類似性が示されている（たと えばボトルスキー等、１９８５ａ　［１６］　、ボトルスキー等、１９８５ｂ　 ［１７］参照）。従来の研究は、ヒトＩＢＤの処置で使用される治療化合物に対 してＣＴＴは同等な反応を示している（たとえばマダラ等、１９８５　［１８］ 参照）。したがって、ここに示した結果は、ＩＢＤに罹患した人間を含む全ゆる 哺乳動物に適切でありかつ適用することができ、本発明の方法がこれに有用であ る。

本発明にしたがって投与される抗−ＶＬＡ−４抗体は、慢性ＩＢＤ罹患者に予防 的に投与して病気の寛解傾向をもたらし或いは維持しうるが、好ましくは本発明 の方法は病気の急性再発を処置すべく使用される。

抗−ＶＬＡ−４抗体は、抗−ＶＬＡ−４抗体と医薬上許容しうるキャリヤとから なる組成物として投与することができる。好ましくは、組成物は静脈内注射に適 する形態である。潰瘍性大腸炎またはクローン氏病の急性再発については０．０ ５〜５．０ｍｇ／患者１ｋｇ／１日（好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／患者１　 ｋ　ｇ／１日）の投与量で使用されるが、それより多量もしくは少量の投与も患 者の年齢、感受性、耐性および他の特性、再発の急性程度、病気の履歴および過 程、用いる抗体の血漿レベルおよび半減期、並びにその認識部位に対する親和性 、さらに担当医により日常的に考えられる他の同様な因子を考慮して指示するこ とができる。活発な病気からの寛解傾向に維持するには０．０５〜５．０ｍｇ／ 患者１に、ｇ／１日（好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／患者１ｋｇ／１日）を使 用し得るが、それより多量もしくは少量の投与も患者の年齢、感受性、耐性およ び他の特性、再発のパターン、病気の履歴および経過、用いる抗体の血漿レベル および半減期、並びにその認識部位に対する親和性、並びに他の同様な担当医に より日常的に考えられる因子を考慮して指示し、或いは用いることができる。

たとえば投与量を調整して、抗体の特定血漿レベルをたとえばネズミ抗体につき ５〜３０μｇ／　ｍ　Ｉ　ｚより好ましくは１０〜１５μｇ／ｍｌの範囲にする と共に、このレベルをたとえば所定期間（たとえば１週間）にわたり或いは臨床 結果が得られるまで（たとえば再発が静まるまで）維持することかできる。より 緩徐に消費されると思われるキメラ抗体および人体適応抗体では、有効血漿レベ ルを維持するには、より低い投与量でよい。さらにＶＬＡ−４に対し高い親和性 を有する抗体もしくは断片は、より低い親和性の抗体もしくは抗体断片よりも回 数を少なく或いは投与量を少なくして投与する必要がある。

適する医薬キャリヤはたとえば無菌塩水、生理緩衝溶液などを包含する。医薬組 成物はさらに、活性成分の放出を調節するよう或いは患者人体におけるその存在 を長期化させるよう処方することもできる。多くの適する薬剤供給系はこの目的 につき公知であり、たとえばハイドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイ クロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、微小球などを包含する。燐 酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）が注射用組成物につき好適なキャリヤである。

さらに本発明の目的には、ＶＬＡ−４のα４サブユニツトに結合しうる抗体を用 いねばならない。モノクローナル抗体を使用することが好ましい。

天然産の抗体の他に、ＶＬＡ−４に結合しうる適する組換抗体も代替として使用 することができる。この種の組換抗体は、組換ＤＮＡ技術によりたとえば宿主細 胞を所望抗体の軽鎖および重鎮免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡを含有した 適する発現ベクターで形質転換して産生された抗体、並びに抗−ＶＬＡ−４抗体 の重鎖および／または軽鎖のヒンジ領域および定常領域の１部または全部が異な る種の免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎮の対応領域で置換されている組換キメラ 抗体を包含する（すなわち、投与抗体に対する免疫反応を最小化させるため、処 置されるＩＢＤ罹患者と同じ種が好ましい）（たとえばジョーンズ等、１９８６ 　［１９］　、ワード等、１９８９　［２０］および米国特許第４，８１６，３ ９７号（ボス等）［２１］参照、これら全てを参考のためここに引用する）。こ こで特に考えられる組換抗体はＣＤＲ−グラフト抗体もしくは「人体適応」抗体 を包含し、ここでたとえばネズミ抗体の超可変領域はたとえばヒト抗体の骨格領 域にグラフトされる（たとえばリーチマン等、１９８８　［２２］　、マン・サ ンプ・コ等、１９９コ［２３］　、ブラウン・ジュニア、１９９１　［２４］参 照）さらに抗−ＶＬＡ−４抗体のＶＬＡ−４−結合性断片、たとえばＦａｂ、Ｆ ａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）　２、およびＦ（Ｖ）断片；重鎖モノマーもしくは ダイマー；軽鎖モノマーもしくはダイマー：並びに１個の重鎮と１個の軽鎖とよ りなるダイマーもここで考えられる。この種の抗体断片は、化学法によりたとえ ば完全抗体をたとえばヘプンンもしくはパパインのようなプロテアーゼで切断し て、或いは組換ＤＮＡ技術によりたとえば端を切り取った重鎖および／または軽 鎖遺伝子で形質転換された宿主細胞を用いて産生させることができる。重鎮およ び軽鎖モノマーは同様に、完全抗体をたとえばジチオスレイトールもしくはβ− メルカプトエタノールのような還元剤で処理して、或いは所望の重鎮もしくは軽 鎖またはその両者のいずれかをコートするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞 を用いて産生させることができる。

ハイブリドーマ技術に対する代案として、所望の抗−ＶＬＡ−４特異性を有する 抗体断片をファージクローニング法によって分離することもできる（たとえばク ラ・ソクソン等、１９９１　［２５コ参照）。

さらに上記の検討から明らかなように、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１相互作用を抑 制し或いはＶＣＡＭ−１−媒介信号導入を抑制するのに充分な特異性を以てＶＬ Ａ−４に結合する他のポリペプチドおよび分子も、抗−ＶＬＡ−４抗体と同様に ＩＢＤの処置に有効である。たとえば可溶型のＶＣＡＭ−１（たとえばオスポー ン等、１９８９　［２６］参照）またはその断片をＶＬＡ−４結合部位に競合す るよう投与することにより、抗−ＶＬＡ−４抗体の投与と同様な効果をもたらす こともできる。ＶＬＡ−４リガンドの結合領域に類似すると共にＶＬＡ−４のリ セブタ領域に適合する小分子も用いることができる（デブリン等、１９９０　［ ２７］　、スコ・７トおよびスミス、１９９０　［２８］　、並びに米国特許第 ４，８３３゜０９２号（ゲイセン）［２９］参照、これら全てを参考のためここ に引用する）。処置患者におけるＩＢＤ組織の炎症を効果的に減少させるこの種 のＶＬＡ−４−結合性ポリペプチドもしくは分子の使用がＩＢＤの処置につき代 案方法として考えられる。

さらに、抗−ＶＬＡ−４抗体をＩＢＤに対し治療効果を有する他の抗体と組合せ て使用しうることも考えられる。たとえば、ここに報告した有利な効果が内皮Ｃ 二対する白血球補充の抑制に基づく範囲で、抗−ＶＬＡ−４抗体を白血球抗原と 内皮細胞リセブタ分子との間の付着を阻害する他の抗体と組合せることが有利で ある。たとえば本発明により抗−ＶＬＡ−４抗体を使用する他１こ、抗−ＥＬＡ Ｍ−１抗体、抗−ＶＣＡＭ−１抗体、抗−ＩＣＡ　Ｍ　−１抗体、抗−ＣＤＩ抗 体、抗−〇Ｄ１８抗体および／または抗−ＬＦＡ−１抗体の使用も有利である。

適するビヒクルにて処方する場合、ここで考えられる医薬組成物はたとえば経口 、食道内もしくは鼻腔内、さらに皮下、筋肉内、静脈内、動脈内もしくは非経口 のような任意適する手段により投与することができる。通常の静脈内（ｉ、ｖ、 ）または非経口投与が再発症状を処置するのに好適であり、調時放出ビヒクルに おける経口投与が寛解傾向を維持するのに好適である。

本発明による方法の結果としてのＩＢＤ患者の改善は、当業界における実務者に 知られた多くの方法で評価することができる。たとえばトルーローブ・ウイッッ の基準（Ｔｒｕｅｌｏｖｅ−Ｗｉｔｔｓ　ｃｒｉｔｅｒｉａ）（たとえばリヒチ ガー等、１９９０　［３０］参照）のような観察される徴候の改善を用いること ができ、或いは結腸組織の試料を生検して組織学的に特性化することもできる（ たとえばマダラ等、１９８５　［１８］参照）。

以下、限定はしないが実施例により本発明の方法および組成物につきさらに説明 する。

Ｋ猛勇ユ にお【るＶＣＡＭ−１ 白血球付着に関与する内皮細胞表面蛋白質の発現に活性ＩＢＤが関係するかどう かを決定するため実験を行なった。ＩＢＤ罹患者の結腸組織におけるＶＣＡＭ− １の発現を正常もしくは無関係の結腸組織を対照に評価した。

ヒト結腸鏡生検組織試料を患者の同意により得、ＯＣＴコンパウンド（ティシュ −チク社）に装着すると共にイソペンタン／液体窒素で急速凍結することにより 凍結切片として作製した。ヒト結腸試料を正常結腸、活性の潰瘍性大腸炎結腸（ ＵＣ−活性）、不活性の潰瘍性大腸炎結腸（ＵＣ−不活性）、無関係の潰瘍性大 腸炎結腸（ＵＣ−無関係）、活性クローン氏病結腸（ＣＤ−活性）および無関係 のクローン氏病結腸（ＣＤ−無関係）から得た。

凍結切片（〜４μ）をゼラチン被覆されたスライド（１％ゼラチン、６０℃で１ 〜２分間加熱、風乾、室温にて１％ホルムアルデヒド、風乾）に載せ、３０分間 にわたり風乾し、アセトンで４℃にて１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、次 いでメタノール中で０．３％Ｈ２Ｏ２により処理した（３０分間、室温）。次い でスライドをＰＢＳで３０分間洗浄し、希釈正常ヒト血清（１：１００）と共に インキュベートし、さらにジョーン・ノ１−ラン博士から供与された抗−ＶＣＡ Ｍ−１抗体４Ｂ９（１：　１００）と共に室温にて６０分間インキュベートした 。対照スライドを抗−牛血清アルブミン（抗−ＢＳＡ）抗体（シグマ・ケミカル ・カンパニー社、セントルイス、ＭＯ）と共にインキュベートした。次いで試料 をＰＢＳで１０分間洗浄し、第２のビオチニル化されたウサギ抗−マウス免疫グ ロブリン（ダコ・コーポレーション社、サンタ・バーバラ、ＣＡ）と共に室温に て６０分間インキユベートシ、次いでアビジン結合のペルオキシダーゼ（ベクタ ステイン（ｖＥＣＴＡＳＴＡＩＮ）、ベクター・ラプス社、バーリンガム、ＣＡ ）を用いて可視衣」− ヒト　における　トレ」 ＶＣＡＭ−１発現 ｎ　’ｎ　％ 正常（１１）　６　（５４，４） ＶＣ活性（２３）　１４　（６０，９）ＵＣ不活性（８）　５　（６２，５） ＵＣ無関係（１０）　４　（４０，０）ＣＤ活性（９）　５　（５５，５） ＣＤ無関係（１２）　７　（５８，３）これらデータは、たとえばフリートマン 等［６］およびライス等［７］により報告されたようなＶＣＡＭ−１がＩＢＤに 関与する結腸組織と正常な結腸組織との両者にて発現されるという観察を確認す る。ＣＤ組織およびＵＣ組織の両者にて、ＶＣＡＭ−１は免疫細胞化学により試 料の約６０％で観察された。

実施例１■ ＣＴＴ　血？（１）Ｌ−ＶＬＡ−４ｖ１．。

ＣＴＴ白血球におけるエピトープを認識するがどうかを確認するため、抗−ＶＬ Ａ−４モノクローナル抗体（ＨＰＩ／２、バイオジエン・インコーポレーション 社、ケンブリッジＭＡがら入手）を試験した。

ＣＴＴからの血液試料（３ｍ　ｌ）をヘパリン処理すると共にＣＴＴ末梢血液単 核白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）をヒトＰＢＬを分離する製造業者の指示に従いフィコー ル・ハイバック濃度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ） （ファルマシア社）により分離した。ＣＴＴ　ＰＢＬを、ベクトン・ジヶンソン ＦＡＣＳ技術（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｔａｒ）および標 準技術を用いＦＡＣＳ分析によってネズミ抗−ヒトＶＬＡ−４モノクローナル抗 体ＨＰＩ／２およびＨＰ２／１に対し結合する能力につき検査した（たとえばロ ブ等、１９９１ａ　［３１Ｆ参照）。両モノクローナル抗体はＣＴＴ　ＰＢＬに 結合し、このことはヒトおよびＣＴＴの両ＶＬＡ−４がこれら２種の抗体により 認識される同様なエピトープを有することを示す。

さらにＣＴＴ　ＰＢＬは固定化された組換可溶性ヒトＶＣＡＭ−１（バイオジエ ン・インコーポレーション社）で被覆されたマイクロタイター板に付着すること も観察され、この結合はＨＰＩ／２およびＨＰ　２／１により阻止された。これ らの結果は、ＣＴＴ　ＰＢＬがＶＬＡ−４に依存してＶＣＡＭ−１に結合するこ とを示し、さらｊ：ＨＰ１／２およびＨＰ２／１がＣＴＴ　ＶＬＡ−４とヒトＶ ＣＡＭ−１との相互作用を阻止することを示す（ロブ等、１９９１ｂ　［３２］ 参照）。

大［ 毛シシザルのＳ　・ 抗−ＶＬＡ−４抗体、ＨＰＩ／２　（ＩｇＧ１）（７）無菌塩水における保存溶 液およびブラシーボ対照（塩水のみ）を自然の大腸炎の徴候（すなわち下痢など ；マダラ等、［１８］参照）を示す１０匹の綿毛シシザル（ＣＴＴ）に投与すべ く作製した。５匹のＣＴＴにＨＰＩ／２を接種すると共に、残り５匹にはプラシ ーボを静脈内注射により接種した。毎日１ｍｇ　ＨＰＩ／２（すなわちＣＴＴの 体重約５００ｇに対し約２　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　／　１日）を８日間で（試験 の０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日目）　、ＣＴＴにＨＰＩ／ ２を注射した。各動物から結腸組織試料を１日おきに（試験の０日、２日、４日 、６日、８日および１００日目生検した。

生検から得られたデータを用いて各動物につき急性炎症指数を決定し、これは大 腸炎の経過の半定量的分析を示す（マダラ等、［１８］参照）。試験開始前（０ 日目）および試験の終了（１００日目における炎症指数を下表ＩＩに示す（「処 理ＣＴＴＪは抗体ＨＰＩ／２を接種し；　［比較ＣＴＴＪはブラシーボを接種し た）。

表」二重 ０日目　１立旦月 平均　１．　８　１．　２ これらの結果は、抗−ＶＬＡ−４抗体による処理が急性炎症指数における有意（ ｐ＜０．０１）の減少を与え実施例ＩＩＩに記載した試験を１４匹のＣＴＴを用 い、７匹にＨＰＩ／、２を接種し、７匹にプラシーボを接種して繰り返した。０ 日目がら１００日目至る急性炎症指数の変化を表Ｉ’　Ｉ　Ｉに示す： 平均　２，０　０．４３ 平均　１．７１　１．００ この結果は、ＨＰＩ／２を接種したＣＴＴにおける急性炎症の有意の減少を示す 。

以上、限定を意味することなく本発明の方法を実施例につき説明したが、この説 明は単に例示の目的に過ぎず、本発明の忠恕および範囲を逸脱することなく多く の改変をなしうろことが当業者には了解されよう。たとえば用いる実際の投与ｍ 、用いる抗体、抗体断片もしくは同族体の種類、投与方式、正確な組成、処置の 投与時間および投与法、並びに他の多くの特徴は全て上記説明の範囲内で変化さ せることができ、したがってこれら改変は全て本発明の範囲内であることから了 解されよう。

引用文献 １１０．”親画Ω、　２４９．　ｐｐ、　１０３０−３３　（１９９０１゜ＩＩ 　１”）ＩＩＩ　ｉ＋物を谷とのたｙ）、ユニに引用する。

配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人コロブ、ロイＲ１ （ｉ　ｉ）発明の名称：炎症性腸病の処置（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数“４ （ｉｖ）通信宛先： （Δ）住所：アレグレッチ・アンド・ウィトコツ、リミテッド （Ｂ）町名コサウス・ワラカー・ドライブ１ｏ番、シュイテ　３０００ （Ｃ）車名・シカゴ （Ｄ）州名：イリノイ州 （Ｅ）国名：Ｕ、ｓ、Ａ。

ＣＦ）　Ｚ　夏　Ｐ　：　６０６０６ （Ｖ）コンピュータ読取形式： （Ａ）媒体：フロソビーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ　ｐｃコンパチブル（Ｃ）ｍ作システム：　ＰＣ− ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３ＣＤ）ソフトアエアー：パテント・イン・リリースＮｏ、 １．０、バージョンＮｏ、１．２５（ｖｉ）本出願データ： （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ （Ｂ）出願日　１９９３年２月１日 （Ｃ）分類： （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）代理人の情報。

（Ａ）氏名：マツクニコラス、ジャネットＭ。

（Ｂ）登録番号＋３２，９１８ （Ｃ）参照番号：９２，３０８−Ａ。

ＤＯＯ３ＣＩＰ　ＰＣＴ （ｉｘ）電信情報： （Ａ）電話：　３１２−７１５−１０００（Ｂ）テレファックス：　３１２−７ １５−４２３４（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報；（ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ＝３６０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鏡型ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー−線状 （ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ （１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃ−フィーチャＣＢ）位置＝１ （Ｄ）他の情報：註ｒｐＢΔＧ１５９挿入物：ＨＰＩ／２重鎖可変領域二アミノ 酸１はＧｌｕ（Ｅ）であるが、Ｇｉｎ（Ｑ）も置換することができる」 （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）位置：１．．３６０ （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ　１Ｄ　Ｎｏ、１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２ の情報；（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１２０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ　ｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２：ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ｔＬ ｎ　Ｇｉｎ　Ｓｉｒ　Ｇｕｙ　Ａｌａ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　＾１ｍ　５ａｔ２　６　、　１１　Ｌ６ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　ＴｈｒＡｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈｓ　ｋｓｎ　Ｘｉｓ　Ｌｙｓ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＷｅｅ　ＨＬｓτｒｐ　 ＶａＬ　Ｌｙｍ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ＧＬｙムｕ　ＧＬ ｕτｒｐ　Ｘｉｓ　ＧｌｙＡｒｇ　Ｉｌ＠Ａｊｐ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｓｉｒ　Ｇｌ ｙ　Ａｊｐ　Ｔ’ｈｔ　Ｌ７１　Ｔ）τＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ｐｉｎ　ＧＬ ｎＶａＬ　Ｌｙｓ　＾１＆　Ｔｈｒ　Ｘ＞ｍ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ｕｐ　Ｔｈｒ　 Ｓｉｒ　Ｓｓｒ　Ｊｕｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　ｔａｕにＬｎｔａｕ　Ｓ＠ ｔ：　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　５ｓｒ　ＧＬｕ　Ａｊｐ　Ｔｈｒ　ＡＬｍ　Ｖ ａＬ　Ｔ）ｒｒＴｙｒ　Ｃｙｍ　ＡＬａ１１１ｊｐ　Ｏ１２Ｍｓｌ：τｑ　ｌ／ ａｌ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＡＬａムｕ　Ａｓｐ　Ｆ）ｎτｒｐ　 Ｇｌｙ　Ｇ１ｎ１ｏｔ　１０６　ｉｌｌ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３の情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）＃Ｊｔ型二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置二１．．３１８ （Ｄ）他の情報： 生成物＝ｒＨＰ１／２軽鎖可変領域」 （ｉ　ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃ−フィーチャ（Ｂ）位置＝１ （Ｄ）他の情報：：註ｒｐＢＡＧ１７２挿入物：ＨＰＩ／２軽鎖可変領域」 （ｘｉ）配列の説明：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ６．３：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ’、 ４の情報：（ｉ）配列特性： （Δ）長さ＝１０６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉ　ｉ）分子型、蛋白質 （ｘｌ）配列の説明：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４：Ｓａｔ　Ｚｌａ　ＶａＬ　Ｍａ ｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌ７＠　Ｆｈａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａ ｌ　Ｓｓｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１３ Ａｊｐ　Ａｒｇ　ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　 Ｓａｔ　（ｉｎ　Ｓｅｔ　ＶａＩＴｏｗ　ｋｍ　ＡｍｐＶａｌ　ＡＩＩＩＩＴｒ ｐ　Ｔｙｒ　ｌｌｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　（ｌｙ　Ｇｌｍ　Ｓｉｒ　Ｐｒ ｏ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ｔａｕ　ｌ１■ τｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｓｒ　Ａｊｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　 ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｆｈａ　Ｔｈｒ　ＣＬｙＳ＠ｔ　Ｃ１ｙ　Ｔ ｙｒ　にｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｆ’ｈａ　Ｔｈｒ　１１＠　Ｓ ｉｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｃａｎ　ＡＬａ６５　７Ｇ　７５　８０ ＧＬｕ　Ａｊ＄ｌ　Ｌ＠ｕ　Ａｌｍ　ＶａＩＴｙｒ　Ｆｈａ　Ｃ７１Ｇｉｎ　Ｇ Ｌｎ　ＡＪ？　Ｔ）Ｔ　Ｓａｔ：　５＊ｒ　！’ｒａτｙｒ補正書の翻訳文提小 書 （特許法１８４条の８） 平成６年　８月１２日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．炎症性腸病に罹患した哺乳動物に抗−ＶＬＡ−４抗体からなる組成物を投与 することを特徴とする炎症性腸病の処置方法。
2. ２．抗−ＶＬＡ−４抗体組成物を静脈内投与する請求項１に記載の方法。
3. ３．抗−ＶＬＡ−４抗体をＨＰ１／２、ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５および Ｐ４Ｃ２よりなる群から選択する請求項１に記載の方法。
4. ４．抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２またはＶＬＡ−４に結合しうるその断片で ある請求項１に記載の方法。
5. ５．組成物を、炎症性腸病罹患者の体重に対し０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの抗 体を与えるような投与量にて投与する請求項１に記載の方法。
6. ６．組成物を、炎症性傷病罹患者の体重に対し０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗体 を与えるような投与量にて投与する請求項５に記載の方法。
7. ７．組成物を、哺乳動物において１０〜１５μｇ／ｍｌの抗体の血漿レベルを与 えるのに有効な量にて投与する請求項１に記載の方法。
8. ８．哺乳動物が人間である請求項１に記載の方法。
9. ９．哺乳動物が潰瘍性大腸炎の罹患者である請求項８に記載の方法。
10. １０．哺乳動物がクローン氏病の罹患者である請求項８に記載の方法。
11. １１．組成物を炎症性腸病の急性再発に際し投与する請求項１に記載の方法。
12. １２．炎症性腸病に罹患した哺乳動物にＶＬＡ−４のα４サブユニットに結合し うる抗体、組換抗体、キメラ抗体、これら抗体の断片、ポリペプチドもしくは小 分子またはこれらの任意の組合せ物を、前記哺乳動物を救助するのに有効な量に て投与することを特徴とする炎症性腸病の処置方法。
13. １３．抗体、ポリペプチドもしくは分子をモノクローナル抗体ＨＰ１／２；この 種の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２もしくはＦ（Ｖ）断片；可溶性Ｖ ＣＡＭ−１ポリペプチド；またはＶＬＡ−４のＶＣＡＭ−１−結合性領域に結合 する小分子から選択する請求項１２に記載の方法。
14. １４．組成物が複数の抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体またはそのＶＬＡ−４ 結合性断片からなる請求項１２に記載の方法。
15. １５．組成物が抗−ＶＬＡ−４の他に抗−ＥＬＡＭ−１抗体、抗−ＩＣＡＭ−１ 抗体、抗−ＶＣＡＭ−１抗体、抗−ＣＤＸ抗体、抗−ＬＦＡ−１抗体、抗−ＣＤ １８抗体またはこの種の抗体の組合せ物を含む請求項１２に記載の方法。
16. １６．抗−ＶＬＡ−４抗体がＨＰ１／２またはＶＬＡ−４に結合しうるその断片 である請求項１２に記載の方法。
17. １７．組成物を、炎症性腸病罹患者の体重に対し０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇの 抗体、抗体断片、ポリペプチドもしくは小分子を与えるような投与量にて投与す る請求項１２に記載の方法。
18. １８．組成物を、炎症性腸病罹患者の体重に対し０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇの抗 体、抗体断片、ポリペプチドもしくは小分子を与えるような投与量にて投与する 請求項１７に記載の方法。
19. １９．組成物を、哺乳動物において１０〜１５μｇ／ｍｌの抗体の血漿レベルを 与えるのに有効な量にて投与する請求項１２に記載の方法。
20. ２０．ＩＢＤ罹患者におけるＩＢＤ組織にて急性炎症を顕著に減少させるのに有 効な、実質的にＶＬＡ−４を認識するモノクローナル抗体を医薬上許容しうるキ ャリヤ中に含んでなる医薬組成物。