JPH07506811A - 二重担体の免疫原性構成体 - Google Patents

二重担体の免疫原性構成体

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二重担体の免疫原性構成体 ニー双肢坐皇剋 ここに記載する本発明は、その特許権使用料を払わないで政府の目的のために生 産し、実施許諾され、そして使用することができる。
ｌ−見皿坐分互 本発明は動物およびヒトのための活性な免疫化の有効性を増強し、そして受動的 免疫予防および治療のためにおよび科学的または診断的試薬として使用すべき抗 体を発生するための二重担体の免疫原性構成体に関する。
ｌ−見所生！東 ワクチン接種の方法において、医療科学は、疾患を引き起こさないが、疾患に対 して保護する抗体ａ形成を刺激する抗原で体を免疫化することによって、侵入性 因子に対して体自身を保護する体の先天の能力を使用する０例えば、死亡した微 生物を注射して細菌の疾患、例えば、腸チフスおよび百日咳に対して保護し、ト キシンを注射して破傷風およびボツリスムに対して保護し、そして弱毒化した微 生物を注射してウィルスの疾患、例えば、ポリオおよび麻疹に対して保護する。
しかしながら、単に外来因子を注射することによって抗体の形成を刺激すること は常に可能であるというわけではない、ワクチン調製物は免疫原性でなくてはな らない、すなわち、免疫応答を誘発しなくてはならない、ある種の因子、例えば 、破傷風トキソイドは先天的に免疫原性であり、そして変性しないでワクチンの 中に投与することができる。しかしながら、他の重要な因子は免疫原性ではなく 、そして免疫応答を誘発することができる前には、免疫原性分子に変換しなくて はならない。
免疫応答は、一般に次のように記載することができる複雑な反応の系列である： １、抗原は体の中に入り、そして抗原提示細胞に直面し、これらの抗原提示細胞 は抗原をプロセシングしそしてそれらの表面上に抗原の断片を保持する； ２、抗原提示細胞上に保持された抗原断片は、Ｂ細胞を助けるＴ細胞により認識 される；そして ３、８細胞は刺激されて増殖し、そして抗体形成細胞に分割し、これらの細胞は 抗原に対して抗体を分泌する。
大部分の抗原Ｔ細胞からの助は借りてのみ抗体を誘発し、それゆえ、Ｔ依存性（ ＴＯ）として知られている。これらの抗原、例えば、タンパク質は抗原提示細胞 によりプロセシングされ、こうして前述のプロセスにおいてＴ細胞を活性化する ことができる。このようなＴ依存性抗原の例は破傷風トキソイドおよびジフテリ アトキソイドである。
いくつかの抗原、例えば、多糖類は抗原提示細胞により適切にプロセシングされ 、そしてＴ細胞により認識されない、これらの抗原は抗体形成の誘発のためにＴ 細胞の助けを必要としないが、Ｂ細胞を直接活性化し、それゆえ、Ｔ独立性抗原 （ＴＩ）として知られている。このようなＴ独立性抗原は、インフルエンザ菌（ Ｉ［、１ｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型ポリリポシルーリチトールーホスフエートおよ び肺炎球菌莢膜多ＩＩ類を包含する。
Ｔ依存性抗原はある数の方法でＴ独立性抗原から変化する。最も顕著には、抗原 はアジュバント、すなわち、免疫応答を非特異的に増強する化合物についてのそ れらの必要性が変化する。溶解性Ｔ依存性抗原の大部分は、それらをアジュバン トとともに投与しないかぎり、わずかに低いレベルの抗体の応答を誘発する。標 準のＤＰＴワクチン（ジフテリア、百日咳、破傷風）をアジュバントの明鍵とと もに投与するのは、この理由のためである。　ＴＤ抗原を凝集物の形態に不溶性 化すると、また、アジュバントの不存在下においてさえ、それらの免疫原性は増 強される−　（Ｇｏｌｕｂ　ＢＳおよびＮｏ　Ｗｅｉｇｌｅ、　Ｊ。
［ｍ５ｕｎｏ１．１０２　：　３８９．１９６９）　、対照的に、Ｔ独立性抗原 は、アジュバントの不存在下に投与したとき、抗体の応答を刺激することができ るが、応答は一般に大きさが小さくそして期間は短い。
Ｔ独立性抗原とＴ依存性抗原との間の４つの他の差は、次の通りである； ａ）Ｔ依存性抗原は免疫応答をプライミングするので、同一の抗原で二次的に対 抗すると、メモリーの応答を誘発することができる。
メモリ一または二次的の応答は非常に急速に刺激され、そして−次的応答におい て見られるものより有意に高い抗体力価を獲得する。
Ｔ独立性抗原は、二次的応答のための免疫系をプライミングすることができない 。
ｂ）抗原のための抗体の親和性は、Ｔ依存性抗原で免疫化に経時的に増加するが 、Ｔ独立性抗原では増加しない。
ｃ）Ｔ依存性抗原は、Ｔ独立性抗原よりもいっそう効果的に、未成熟または新生 児の免疫系を刺激する。
＞　ｄ）Ｔ依存性抗原は、通常、ＩｇＭ、　ＩｇＧ１．　ＩｇＧ２ａ、およびＩ ｇＥ抗体を刺激するが、Ｔ独立性抗原はＩｇＭ、　ＩｇＧ１．　ＩｇＧ２ｂ、お よび１ｇＧ３を刺激する。
Ｔ依存性抗原／Ｔ独立性抗原のこれらの特性は、有効なワクチンとして使用する とき、明確な利点および欠点の両者を提供する。Ｔ依存性抗原は、大人および新 生児の両者の免疫系において長（生きる一次的および二次的応答を刺激すること ができるが、アジュバントとともに頻繁に投与しなくてはならない、こうして、 ワクチンは抗原、例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのみを 使用して調製されてきているが、このようなワクチンは最適な応答を刺激するた めにはアジュバント、例えば、明１の使用を必要とする。アジュバントは毒性に 関連し、そして免疫系を非特異的に刺激し、こうして望ましくないことがある特 異性をもつ抗体を誘発することが示された。
Ｔ依存性抗原に関連する他の欠点は、非常に小さいタンパク質、例えば、ペプチ ドは、アジュバントとともに投与したときでさえ、めったに免疫原性ではない、 これはことに不都合である。なぜなら、種々の病原体の一次的抗原決定基を提示 するように、そうでなければ非常に特異的でありかつ高度に有効であるワクチン を作るように、注意して合成された多数の合成ペプチドが、今日、入手可能であ るからである。
対照的に、Ｔ独立性抗原、例えば、多Ｉ！類はアジュバントの不存在下に免疫応 答を刺激することができる。不都合なことには、しかしながら、このようなＴ独 立性抗原は高いレベルまたは延長した抗体の応答を刺激することができる。なお いっそう大きい欠点は、未成熟またはＢ細胞を欠如する免疫系を刺激することが できないことである（Ｍｏｎｄ　Ｊ、　Ｊ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｒｅｖｉｅｗｓ　６４　：　９９＋　１９８２）（Ｍｏｓｉｅｒ　ＤＥ　ら、Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１９　：　１Ｂ７４．１９７７）　、　こうして、Ｔ 独立性抗原およびＴ依存性抗原の両者に対する免疫系は多数の応用について満足 すべきものではない。
Ｔ独立性抗原に関すると、このような抗原、ことに多Ｉ！！！、例えば、インフ ルエンザ菌（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）および肺炎連鎖球菌（Ｓ。
ｐｎｅｕｓｏｎｉａｅ）に対する保護的免疫性を子供に提供することは重要であ る。Ｔ依存性抗原に関すると、種々の病原体の一次的抗原決定基を提示する合成 ペプチドに基づくワクチンを開発することは重要である。
Ｔ独立性抗原に対する免疫応答を増強する１つのアプローチは、多ｍ類、例えば 、インフルエンザｉｌｌ　（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　ＰＲＰ　（Ｃｒｕｌ ｌｅＪ、　Ｍ、、　Ｌｅｗｉｓ　［１，Ｅ、　Ｊｒ、＃ｉＡ、　Ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎ　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔｏ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｒｉｄ　Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１０＋　１９ ８９）またはオリゴ糖類の抗原（＾ｎｄｅｒｓｏｎ　Ｐ賀ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１４２　：　２４６４．１９８９）を単一のＴ依存性抗原、例えば、破 傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドに接合することを含む、この方法に おけるＴ細胞の助けの漸増は、免疫化された多数の乳児に増強された免疫性を提 供することが示された。不都合なことには、わずかに低いレベルの抗体力価が誘 発され、そしてわずかの乳児のみが免疫化に対して応答する。
こうして、いくつかの免疫化を必要とし、そして保護的免疫性は数カ月間しばし ば遅延する。そのうえ、免疫化を受けるために多数回訪れることは、また、医学 的設備から遠くに住んでいる家族にとって困難であることがある（ことに発展途 上国において）、最後に、２力月以下の年令の赤ん坊は、反復した免疫化後、抗 体の応答をほとんど、あるいは具備することができない。
タンパク質またはペプチドのＴ依存性抗原のための現在の解決法は同様に欠点を 有する。Ｔ依存性抗原は、しばしば、アジュバントまたは他の放出系の中に組み 込まれる。しかしながら、このようなアプローチは毒性であるか、あるいは抗体 の応答の非特異的増強を誘発することがある（Ｄａｎｃｅｙ　ＧＦ　ら、Ｊ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２２　：　６３Ｂ。
１９７９）、、 そのうえ、Ｔ依存性抗原およびＴ独立性抗原の両者を使用するこれらのアプロー チは、単一のＴ依存性抗原のみを組み込んで免疫応答を増強する。このようなア プローチはＴ細胞の助けの漸増を最大としない、そのうえ、これらの方法は１つ の担体上に多数の抗原を投与することができないことによって、異常に制限およ び拘束され、こうして多数の注射を必要とする。
他のアプローチにおいて、研究者らはハブテン、例えば、トリニトロフェニル（ ＴＮＰ）をＴ依存性担体、例えば、分子量４００にのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ ”　）　（不活性の合成非イオン化高分子量ポリマー）に接合した。このような 接合体はアジュバントの不存在下にマウスにおいてＴ依存性応答を刺激すること が示された（Ｍｏｓｉｅｒ　ＤＥら、Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、　１３９　：　 １３５４　（１９７４））　、　シかしながら、この接合体単独は新生児のマウ スまたはＢ細胞免疫欠損マウスにおいて免疫応答を刺激することができなかった （Ｍｏｓｉｅｒ　Ｄｅ　ら、Ｊ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．１１９：　１８７４．１９ ７７）　、この接合体に対する免疫欠損マウスの応答は、特定のアジュバントの 存在下においてのみ誘発することができる（Ａｈｍａｄ　ＡおよびＭｏｎｄ　Ｊ Ｊ、　Ｊ、　Ｉｖｓｕｎｏｌ、　１３６　：　１２２３．１９８６）、これは前 述の理由で欠点を有する。
他の研究において、ＴＮＰを不溶性粒子上に接合し、そして新生児のマウスおよ び免疫欠損マウスのための有効な生体外免疫原であるが、それはマウスの匹数当 たり非常に高い密度のハブテンにおいてのみであることが発見された（Ｍｏｎｄ 　ＪＪら、Ｊ、Ｉｍｗｕｎｏｌ、　１２３　：２３９、１９７９）、他の実験室 、Ｄｉｎｔｚｉｓらは、ハブテン／担体の比、ならびに担体の分子量はか、Ｔ依 存性接合体の免疫原性およびそれが刺激する抗体の応答に強く影響を与えること を証明した（ＤｉｎｔｚｉｓＲＺら、　Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．　１４３　：　１ ２３９．　１９８９）　。
他の試みみた接合体は、抗免疫グロブリン抗体（抗１ｇ）を高分子量（２Ｘ１０ ”ダルトン）のデキスラン（グルコースポリマー）に接合して形成された「抗１ ｇデキスラン」接合体を含んだ、この接合体は、非常に低い濃度において、新生 児のおよび成熟Ｂ細胞ならびに免疫欠損マウスからのＢ細胞を活性化することが 発見された（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｍ、ら、Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　１４０　 ：　３３６４．１９８Ｂ）　、　シかしながら、抗ｒｇデキスランはＴ細胞誘導 の助けをほとんどあるいはまったく刺激せず、そしてそれは特異性に無関係にす べてのＢ細胞を活性化するので、ワクチンのための有効な賦形剤を提供すること ができなかった。
構成体は免疫応答の１つの型のみを最適化したので、これらのアプローチのいず れもこの問題を解決しなかった０例えば、Ｔ依存性担体上に接合された低分子量 のハブテンは抗ハブテンの応答のＴ依存性成分のみを最適化し、そしてＴ依存性 担体上に接合された低い免疫原性のＴ依存性分子はＴ依存性免疫性の刺激に鯨ら なくてはならず、そしてその溶解性の形態で、この複合体はＴ細胞を活性化する とき非常に制限を受けることがある。こうして、この分野において両者の成分を 最適化する構成体が要求されている。このような構成体はＴ依存性成分を最適化 して抗原特異的Ｂ細胞において高いレベルの活性化を刺激し、ならびにＴ依存性 成分を最適化してＴ細胞の助けを同時に漸増する。さらに、このような二次構成 体は新生児、大人および免疫欠損の動物およびヒトにおいてＴ依存性抗原および Ｔ独立性抗原の両者に対する抗体を高いレベルで急速に誘発するであろう。
また、この分野において、多数の抗原を取り付け、こうしである数の抗原を１回 の注射で提供することができる構成体が要求されている。単一の構成体上の多数 の抗原で個体を免疫化することができるワクチンは、極めて価値があるであろう 。
要約すると、この分野において、（ａ）Ｔ依存性成分およびＴ依存性成分の両者 を最適化して、子供および大人の両者において、ならびに免疫欠損を有する個体 において、長期間にわたって接続する、非常に急速なかつ大きい抗体の応答を刺 激する構成体；　（ｂ）多数の抗原または他の免疫増強アジュバントを取り付け ることができる構成体；および（ｃ）受動免疫予防または治療のためにおよび診 断のために、あるいは研究の目的で使用できる、モノクローナル抗体またはポリ クローナル抗体を急速に刺激するであろう構成体が要求されている。
ＩＶ（７）！ｈ 本発明は、免疫原性を改良する二重担体の免疫原性構成体により、先行技術の構 成体の問題および欠点を克服する。二重担体の免疫原性構成体は、Ｔ依存性抗原 である少なくとも１種の二次担体に接合された高分子量の少なくとも１種の一次 担体からなる。このような−次組体は、Ｔ細胞およびＢ細胞の両者に対して比較 的高い抗原密度で二次担体の多数のコピーを提示することができる。さらに、こ のような大きいバックボーンのマトリックスは多数かつ異なる二次担体のための 効率よい担体として作用するので、単一の構成体は多数の抗原特異性を含有する ことができる。好ましい実施態様において、−次組体はそれ自体直接的にかつ潜 在的に活性なり細胞であることができ、そして多数の二次担体を支持する大きい が比較的非分解的パンクボーンとして働くすることができる、高分子量のＴ独立 性抗原である。
二次担体はＴ依存性抗原である。Ｔ依存性抗原として、二次担体はＴ細胞を活性 化しかつ漸増して、それ自体に対する抗体、ならびにそれ自体または一次担体に 接合することができる他の決定基に対する抗体の生産を増大する。二次担体の多 数のコピーを一次担体に接合してＴ細胞の活性化を有意に増強し、これにより二 次担体に対する抗体の生産を増大することができる。
好ましい実施態様において、本発明は、また、−次組体および／または二次担体 に接合された少なくとも１種の部分、例えば、ハプテンおよび抗原を含む、接合 は前記部分が二次担体により発生したＴ細胞の助けから利益を得るようにさせる 。
本発明の二重担体の免疫原性構成体は、また、非免疫原性または低い免疫原性の 分子を前記二重担体の構成体上に接合することによって、前記分子を強く免疫原 性の分子に変換させる。さらに、免疫増強アジュバントを担体のいずれかに接合 して免疫原性をさらに増強することが可能である。好ましくは、このような二重 担体の免疫原性構成体は無毒の成分から調製される。さらに、このような二重担 体の免疫原性構成体は抗原性部位の変更を減少することができる。
なぜなら、−次組体、例えば、デキスランへのタンパク質の接合は担体に対する 最小の変更を含むからである。
最後に、本発明の二重担体の免疫原性構成体は、治療、予防、診断、および研究 に適用することができる。
本発明の追加の利点および面は、以下の詳細な説明に記載されており、詳細な説 明から誘導されるか、あるいは本発明の実施により知ることができる。
本発明の利点を達成するためにかつ本発明の目的に従い、この明細書の中に具体 化されかつ広（記載されているように、本発明は、Ｔ依存性抗原である少なくと も１種の二次担体に接合された７１１Ｄの分子量より大きい高分子量の分子であ る少なくとも１種の一次担体から構成された二重担体の免疫原性構成体からなる 。この構成体の免疫原性は少なくとも１種の担体単独より大きい、好ましい実施 態様において、−次組体はＴ独立性抗原であり、そして二次担体はタンパク質で ある。他の好ましい実施態様において、少なくとも１種の部分は構成体の少なく とも１種の担体に接合されている。接合された部分の免疫原性は接合されない部 分より大きい。
本発明の他の面は、少なくとも１種の二重担体の免疫原性構成体および製剤学的 に許容されうる担体からなるワクチンに関する０本発明のなお他の面は、免疫刺 激量のワクチンを投与することによって患者を処置する方法に関する０本発明の 他の面において、二重担体の免疫原性構成体は当業者に知られているアジュバン ト、例えば、ヒトにおける使用が承認されているアルミニウム塩類とともに投与 する。
本発明の他の面は、宿主をワクチンで免疫化し、こうして免疫原に対して向けら れた抗体を生産し、次いで抗体またはモノクローナル抗体を生産するために使用 できるＢ細胞を単離することによって、抗体を生産する方法に関する。なお他の 面において、本発明は治療的に有効量の免疫治療用組成物を投与することによっ て患者を処置する方法に関する。他の面において、本発明はこのような抗体から なる診断および研究の試薬に関する。
この明細書の中に加えられそしてその一部分を構成する添付図面は、本発明のい くつかの例示的１！様を示しそして、説明と一緒に、本発明の詳細な説明する働 きをする。
本発明の上の目的および種々の他の目的、特徴および付随する利点の多くは、添 付図面と組み合わせて考慮して、次の詳細な説明を読むと、いっそうよく理解さ れるであろう。
ｌ　の　な量゛ 第１図は、それらのＴ細胞の要件に基づく抗原の２つの古典的タイプの描写を示 す、Ｔ独立性抗原（およびハプテン化されたＴＩ抗原）はＴ細胞の不存在下に応 答を刺激し、モしてＴ依存性抗原（およびハブテン化ＴＤ抗原）は最適な抗体の 応答の誘発のためにＴ細胞の参加を必要とする。
第２図は、二重担体の免疫原性構成体の１つの態様を概略的表示であ゛るニ ー　−次組体は高分子量ポリマー（ＨＭＷＰ）　、例えば、デキストラン（Ｄｅ ｘ）　； −Ｄｅｘに接合された二次担体は、高いレベルのＴ細胞の活性化を刺激する任意 の物質であることができる；−　ハプテンは任意の低分子量分子、例えば、オリ ゴ＄１１１、多糖類、ペプチド、薬物などであり、これらは二次担体に接合され ている； 第３図は、ＢＳＡ−Ｄｅｘ接合体に対する投与量の応答のグラフの表示である。
１０〜５００μｇ／マウスの投与量の範囲でＰＢＳ接合体中のＢＳＡ−Ｄｅｘで 静脈内免疫化されたマウスにおいて、血清１ｇＧ１抗体力価／ウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）を測定した。マウスを免疫化後１４日に採血し、そして抗体力価を ＥＬＩＳ＾により決定した。接合されないＢＳＡはマウスにおいて免疫原性では ない、この図面は、Ｄｅｘへの接合がＢＳＡを高度に効力のある免疫原に変換す ることを示す。
第４図は、Ｄｅｘに接合し、そして示した投与量でマウスに静脈内（ＩＶ）注射 した種々の大きさのタンパク質を描写する。血清１ｇＧ１抗体力価をＥＬＩＳ＾ により決定した。接合されたタンパク質と対照的に、Ｄｅｘにカップリングされ なかった抗原によるマウスの免疫化は、コレラトキシンの免疫化を除外して検出 可能な抗体の形成を与えず（力価は１０より低い）、コレラトキシンの免疫化は 、Ｄｅｘ接合体より有意に低いにもかかわらず、検出可能な力価を与えた。この 図面は、Ｄｅｘへの異なるタンパク質の接合がタンパク質を有効な免疫原に変換 することを示す。
第５図は、ハブテン化ＢＳ＾に対する応答のグラフの表示である。
マウスをトリニトロフェニル化ＢＳ＾（ＴＮＰ−ＢＳＡ）（５０＃ｇ）またはＤ ｅｘに接合されたＴＮＰ−ＢＳＡ　（ＴＮＰ−ＢＳＡ　Ｄｅｘ）　（５０ｉｔ　 ｇ　）で免疫化し、そして２１日後に採血した。抗ＴＮＰ力価をＥＬＩＳＡによ り測定した。この図面は、−次担体としてＤｅｘおよび二次担体としてＢＳＡを 使用することによって、ＢＳＡおよびＴＮＰの両者に対するすぐれた抗体の応答 が誘発されることを証明する。こうして、ＴＮＰの二次タンパク質担体分子への 接合とこの複合体の一次担体への接合との組み合わせは、ＴＮＰを有効な免疫原 に変換した。
第６図は、抗ペプチドの応答のグラフの表示である。この研究は第５図に示す前 の研究を支持する。これが示すように、マラリア誘導ペプチドＰ７４の二次担体 Ｏ５＾への接合、およびこの複合体の０４１Ｘ−次担体への接合は、非免疫原性 ペプチド（ＰＴ４）を有効な免疫原に変換する。これはとくに合成ペプチドのた めのこの構成体の利用を証明するとき関係する。
第７図は、デキストランに接合された多数の抗原のグラフの表示である。この研 究は、３つの抗原的に異なる分子をＤｅｘに接合することによって調製されたｎ ｅｗ複合体に対して抗体の応答を評価する。
この研究において、オバルプミン（ＯＶ＾）とカップリングしたＴＮＰ　。
＋リゾチーム（ＬＹＳ）をＤｅｘに接合し、そして５０＃ｇのこの接合体を混合 物にｒｖ注射した。９日後、マウスを採血し、そして血清をＥＬＩＳＡにより抗 ＯＶＡ　、抗丁ＮＰおよび抗ＬＹＳ抗体力価について決定した。この研究は、多 数の無関係の抗原を一次Ｄｅｘ担体上に接合することによって、ワクチン調製物 をつくることができることを証明する。
第８図は、ハブテン化ＢＳＡ−Ｄｅｗのブースティングのグラフの表示である。
マウスを（ＴＮＰ−ＢＳＡ）　Ｄｅｗ　（５０＃　ｇ　）　７！免疫化し、次イ テＴＮＰ−ＢＳＡ単独であるいはｎｅｗに接合されたＴＮＰ−ＢＳへの第２回の 注射でブースティングした。１４日後にマウスから採血し、そして血清を抗ＴＮ Ｐおよび抗ＢＳ＾抗体について力価決定した。この図面が示すように、いったん マウスがＤｅｘ接合体（−次担体および二次担体の両者から成る構成体）で免疫 化されると、すぐれたブースターの応答が達成され、そして抗体のブースティン グは完全なワクチン構成接合体の使用と同様に接合されないＴＮＰ−ＢＳＡ（二 次担体のみ）で効果的に達成することができる。これが証明するように、いった ん−次的応答が接合体で刺激されると、接合されないまたは天然の抗原により、 大きい二次的応答を誘発することができる。
第９図は、ＢＳＡでブースティングしたＢＳＡ−Ｄｅｘの反応速度論のグラフの 表示である。マウスをｓｏ、ｇのＢＳＡ−Ｄｅｘ　（−次担体および二次担体） で免疫化し、そして５週後５０ｕｇのＢＳＡ　（二次担体のみ）でブースティン グした。マウスを種々の時間に採血し、そして血清をＥＬＩＳＡによりＢＳＡ　 、二次担体に対する抗体力価について決定した。
この図面が示すように、二次的抗体の応答はＢＳへのみ、デキストランに接合さ れていない二次担体により誘発することができ、そしてこの応答は非常に長く生 き、そして１１週より長く持続する。
第１０図は、担体に対する抗体の応答のグラフの表示である。　Ｄｅｘに対して 応答しない正常または免疫欠損のマウスに、ＢＳＡ−Ｄｅｘ　（５０＃ｇ）を注 射した。マウスを１１．２０および２９日後に採血し、そして血清の抗ＢＳＡ力 価をＥＬＩＳＡにより測定した。この研究が証明するように、Ｄｅｘ担体は多価 の配列で細胞に抗原を提示すうマトリックスを単に提供することができ、Ｄｅｘ 接合体に対する抗体の応答はデキストラン担体に対する抗体の応答をマウントす るマウスの能力に依存せず、免疫系の細胞はＤｅｘを有効な担体として機能する 免疫原として必ずしも認識せず、そして重要なことにはＢＳＡ−Ｄｅｘ接合体は 免疫欠損マウスにおいて応答を刺激することができる。
第１１図は、子供のマウスにおけるＢＳＡ−Ｄｅｘの免疫原性のグラフの表示で ある。２週齢のマウスおよび大人のマウスの両者に５０＃ｇの８５＾−Ｄｅｘを 腹腔内注射し、そして１２日後に採血した。血清の抗ＢＳＡ力価をＥＬＩＳＡに より測定した。この研究が示すように、免疫学的に未成熟であるマウスでさえ、 このＤｅｘタンパク質−担体接合体で免疫化し、そして二次担体（ＢＳＡ）に対 するすぐれた抗体の応答を誘発することができる。
第１２図は、分子量の効果のグラフの表示である０分子量７０Ｋ、４００Ｋ、ま たは７００にの大きさで分離したＤｅｘを使用して、ＢＳＡ−ＤｅＸ接合体を作 った。マウスに５０＃ｇの種々の接合体をＩＶ注射し、そして１４日後に採血し た。血清の抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。この図面が示すように、有効 な担体分子を提供するためにはＤｅｘは〉７０にの大きさでなくてはならず、そ して４００にはすぐれた応答を誘発するが、より大きい分子量の担体はなおいっ そう有効である。
第１３図は、注射のモードの効果のグラフの表示である。マウスを３つの異なる ルートを経てＢＳＡ−Ｄｅｘで免疫化した：静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）　、 または筋肉内（１？ｌ）　、マウスを１４日後に採血し、そして血清の力価をＥ ＬｒＳＡにより決定した。この研究が示すように、Ｄｅｘタンパク質−担体接合 体（−次担体および二次担体の複合体）は、ＩＶ、ＳＣまたはＩＭのいずれで与 えても、匹敵する応答を刺激する。
第１４図は、多数のかつ異なる二次担体（破傷風トキソイド、髄膜炎菌外膜タン パク質、およびウィルスタンパク質）を少な（とも１種の一次担体に接合した、 二重担体の免疫原性構成体の略図である。
二次担体はさらにハブテン化するか、あるいはしないことができる。
第１５図は、百日咳トキソイドのデキストランへの接合の成功のグラフの表示で ある。このプロフィルは、生理食塩水およびアジドと平衡化した５４００ＳＦゲ ル濾過カラムに適用したＰＴ−ｄｅｗである。流速は０．２　ｍ１７分、２５滴 ／管であった。矢印は接合しないトキソイドの位置を示す。００２８０はタンパ ク質の測度であり、そしてＣＰＭ１５０ｔＩｌは５０μｌのアリコートの中に存 在する計数７分、すなわち、存在するトリチウム化デキストランの量の測定を意 味する。
第１６図は、破傷風トキソイド−デキストラン、ジフテリアトキソイド−ジフテ リアトキソイド、または百日咳トキソイドの単一の投与量を流体として、あるい はアジュバントのリン酸アルミニウム上に吸収させて注射したマウスの抗デキス トランの応答を描写する図表である。この図表が示すように、マウスは抗体、主 としてＩｇＧ１゜１ｇＧ２、およびＩｇＭを２週までに発生し、そして抗体は少 なくとも８週間持続した。（下の実施例９を参照、）第１７図は、高分子量のデ キストランに接合したときの二次担体、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイ ド、および百日咳トキソイドに対する抗体の応答の３つの部分のグラフの表示で ある。抗デキストラン抗体と同様に、これらのタンパク質に対する抗体は少なく とも２週までに誘発され、そして少なくとも８週間持続した。第１５図および第 １６図が一緒に証明するように、二重のかつ逆の増強は本発明の接合体を使用し て達成された。（詳細については実施例９を参照、） 第１８図は、破傷風トキソイドの中和の影響のグラフの表示であり、接合体が保 護的レベルの抗トキシン抗体を発生したことを示す。
第１９図は、第１９ａ図に従い投与した２つの投与量の接合体で達成された二重 および逆の免疫増強の２つの部分のグラフの表示である。
部分（ａ）は二次担体により誘発された抗タンパク質抗体のレベルを記載する０ 部分（ｂ）はアイソタイプによりカテゴリー化される抗デキストラン抗体のレベ ルを記載する。
第２０図は、ＰＲＰに対するジフテリアトキソイドの接合のグラフの描写である 。このプロフィルは、ＰＢＳと平衡化した５３００ＳＦゲル濾過カラムに適用し たＤＴ−ＰＲＰのものである。流速は０．２５ｍ１／分、２５滴／管であった。
矢印は接合しないトキソイドの位置を示す、　００２８０はタンパク質の測度で あり、そして００４３０はレゾルシノール炭水化物のアンセイにおいて生成した 吸収を意味しくＤｕｂｏｉｓ、　Ｈら、Ａｎａｌ。
Ｃｈｅｗ、　２８　：　３５０　（１９５６））そしてＰＩＩＰの相対量の測度 である。
Ｍ−圧を旦ｙ焦盪立旧員星に皿 本発明の現在好ましい１１１１をここで詳細に説明し、その例は添付図面に示さ れている。
本発明は、第２図に示すように、少なくとも２つの担体、すなわち、７０ｋＤａ の分子量より大きい高分子量の少なくとも１種の一次担体およびそれに接合され たＴ依存性抗原である二次担体から構成された免疫原性構成体に関する。担体は 、取り付けられあた物質の免疫原性が増強されるように、他の物質を取り付ける ことができる物質である。
好ましい態様において、構成体の免疫原性は少なくとも１種の担体単独の免疫原 性より大きい、免疫原性の測定方法は当業者によく知られており、そして構成体 の注射後の種々の時間における量、適合活性およびアイソタイプの分布の測定を 包含する血清抗体の測定を主として包含する。より大きい免疫原性は、抗体の応 答のより高い力価および／または持続性により反映されることができる。免疫原 性は、また、無毒の物質または微生物と対抗する保護を誘発する能力により測定 することができる。免疫原性は、また、新生児のマウスおよび／または免疫欠損 マウスを免疫化する能力により測定することかできる。免疫原性は、処置すべき 患者の集団において、あるいは患者の集団の免疫応答をまねる集団において測定 することができる。
両者のタイプの担体の寄与の結果、二重担体の構成体は、メカニズム、例えば、 Ｂ細胞、マクロファージまたは他の抗原提示細胞により増強された抗原の提示を 経るＴ細胞の助けの極端に効力のあるアクチベーターである。このような構成体 は、大人、子供、および未成熟または免疫欠損の免疫系をもつものにおいて、非 常に急速かつ長く生きる抗体の形成を誘発するであろう。
本発明の構成体は好ましくは水溶性であるが、あるいは水性媒質の中に維持する ことができる。溶解性は構成体の合成の間に可溶化試薬を使用して誘導すること ができる。さらに、本発明の構成体は可溶化試薬の使用により水性媒質の中に維 持することができる。
本発明の構成体を合成する方法は、最終生成物の物理的および化学的性質の有利 なコントロールを可能とする。コントロールすることができる性質は一次担体お よび二次担体の電荷の変更（カチオン化タンパク質がいっそう免疫原性であるこ とができるという証拠に照らして有利である）、−次担体の大きさの変化による 構成体の大きさの変化、構成体の架橋度の選択（循環における大きさおよび半減 期の変動を得るために）、−次担体に接合する二次担体のコピー数の選択、およ び選択した細胞集団に対する（例えば、マクロファージに対する、抗原提示を増 強するために）ターゲツティングを包含する。
本発明の構成体の免疫応答は、免疫調節剤および／または細胞ターゲツティング 部分の添加によりさらに増強することができる。これらの実在物は、例えば、（ １）解毒したリボ多糖または誘導体、（２）ムラミルジペプチド、（３）免疫学 的に関係する細胞に構成体をターゲツティングする細胞表面の決定基と相互作用 することができる炭水化物、脂質、およびペプチド、（４）インターロイキン、 および（５）細胞表面の成分と相互作用することができる抗体を包含する。
第２図に表すように、本発明の構成体は二次担体の１または２以上のコピーを接 合することができる大きいバックボーンのマトリックスを提供する少なくとも１ 種の一次担体から構成される。さらに、下に説明するように、ｌまたは２以上の 一次担体または二次担体は部分にさらに接合することができる。接合方法は当業 者によく知られており、そしてＢｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｍ、ら、Ｊ、　Ｉｓｍｕｎ ｏｌ、　１４０　：　３３６４　（１９８８）およびＭｏｎｇｉｎｉ　Ｐ、　Ｋ 、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４８　：　３８９２　（１９９２）（両者を 特別に引用によってここに加える）のへテロライゲイジョンの技術を包含する。
また、Ｗｏｎｇ、　Ｓ、　Ｓ、、タンパク質の接合体および架橋の化学（Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓ ｓｌｉｎｋｌｎｇ）、ＣＲＣＰｒｃｓｓ　、ボストン（１９９１）　（これを特 別に引用によってここに加える）を参照のこと、しかしながら、われわれは、こ れらの方法は、タンパク質のためにこの分野においてよく知られているが、接合 体のワクチンの合成へのそれらの適用を最適化するために多少の変更を必要とす ることを発見した。
当業者は理解するように、接合体のワクチンの調製において使用する抗原は価値 がある。したがって、生産物の高い収率を与えかつ重貰なエピトープの修飾を最 小とする化学的手順を使用することが望ましい、炭水化物にタンパク質を接合す る多数のプロトコールはカーポジイミドを使用してアミド結合を形成する（Ｃｒ ｕｓｅ　Ｊ、　Ｍ、＋Ｌｅｗｉｓ　Ｒ，Ｅ、　Ｊｒ、　ｋＭ、、Ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎ　Ｃｏｔｒｉｂｕｔｉｏｒｉｓ　ｔ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、　１０ ＋　１９８９）　＊　この試薬は非選択的であり、タンパク質の広範な修飾およ び潜在的に望ましくない重合を引き起こす、収率はしばしば低い、他の方法はジ サルファイド結合を生じ、これらの結合はチオ−エーテル植物誘導より安定性に 劣る（Ｃｒｕｓｅ　Ｊ、　Ｍ、、　Ｌｅｗｉｓ　Ｒ，Ｅ、　Ｊｒ、ｇ、Ｃｏｎｊ ｕｇａｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓｉｎ　Ｃｏｔｒｉｂｕｔｉｏｎａ　ｔｏ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｗｕｎｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、１（Ｌ１９８ ９）　。
対照的に、本発明の化学はこれらの困難性を排除するようである。
好ましいプロトコールの要素は次の通りである：　（１）チオールによる二次担 体（例えば、トキシンタンパク質）の誘導、（２）チオール反応性試薬、例えば 、マレイミド、ヨードアセテートによる一次担体ポリマーの誘導、（３）チオ− エーテル結合の形成および（４）接合しないポリマーおよびタンパク質からの接 合体の分離。
タンパク質および炭水化物の誘導に引き続いて、通常、カラムの脱塩工程および 濃度を実施する０首尾よく使用された別法は、適当な分子量カットオフ・フィル ターを使用して限外濾過装置〔例えば、アミコン（ＡＩＩｉｃｏｎ）圧力フィル ター〕によりすべての工程、好ましくは工程１〜３を実施することである。これ は取り扱いおよび転移を最小にする。
試薬の群の数および成分の濃度および他の細部をコントロールすることによって 、この化学は鎖間の架橋度、重合度および凝集の比較的円滑なコントロールを可 能として、主要なエピトープの高い収率および最小の修飾を達成する迅速な方法 を生ずる。
当業者は認識するように、特定の接合方法は個々の一次担体および二次担体に依 存して変化することができるが、ここにおいて教示が与えられぞして当業者が知 ると、他の方法およびここにおいて提示した方法の必要な変更は当業者の技量の 範囲内である。しかしながら、当業者の助けとなるために、特定の一次担体のた めの代表的な接合をここに記載する。これらの技術は一次担体のデキストラン（ 「方法」と題する節を参照）およびインフルエンザｉｌｌ　（Ｈａｅｗｏｐｈｉ ｌｕｓｉｒ＋ｆｌｕｅｎｚａｅ）の多５ｅｌｌ　（ＰＩＩＰ）　（実施例１１参 照）に向けられるが、これらの技術は後述する他の一次担体とともに使用するこ とができる。
当業者に知られているように、他の化学的技術をデキストランまたはＰＰＰおよ び他の一次担体とともに使用することができる。
本発明の範囲内の担体の接合は、担体上の重要なエピトープの最小の崩壊を提供 する。なぜなら、−次組体、例えば、デキストランへのタンパク質の接合はデキ ストランに対する最小の変更を含むからである。さらに、本発明の範囲内の一次 担体は、また、官能基を含むことができるか、あるいは化学的に操作して官能基 を有するようにすることができる。デキストランおよびＰＲＰを使用するときの ように、官能基の存在は１または２以上の二次担体への一次担体の共有結合の接 合を促進することができる。このような官能基は次のものを包含するが、これら に限定されない二アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド、ヒドラジド、エポキ シド、およびチオール。
各−次組体の大きいバックボーンは多数の異なる二次担体のための理想的なマト リックスを提供するので、１つのワクチンは多数の抗原特異性を含有することが できる。そのうえ、−次組体は、二次担体の多数のコピーを比較的高い抗原密度 でＢ細胞およびＴ細胞の両者に提示することによって、抗体の生産を刺激するこ とができる。
また、それはマクロファージまたは他の細胞のタイプに構成体をターゲツティン グして抗原のプロセシングを増強できることを含む他の利点を提供することがで きる。
好ましいＵＳにおいて、少なくとも１種の一次担体の分子量は７０．０００〜２ ，０００，０００　ｋＤａ以上の範囲である。第１２図に記載するように、より 好ましい分子量は４００，０００　ｋＤａ以上であり、なおいっそう好ましい分 子量は２，０００，０００　ｋＤａである。少なくとも１種の二次担体への一次 担体の接合は一次担体の架橋を生ずることがある。このような架橋は、最終構成 体がより高い分子量をもつかぎり、より低い分子量の担体（例えば、７０．０Ｏ ＯｋＤａ）の使用を可能とする。ここに含有される教示およびこの分野における 通常の技術に基づいて、当業者は所望の特定の構成体のために最適な分子量を選 択することができる。
他の好ましい態様において、少なくとも１種の一次担体はＴ独立性抗原であり、 これによりＴ独立性抗原およびＴ依存性抗原の利点を組み合わせる。このような 担体はそれ自体直接にかつ潜在的にＢ細胞を活性化し、そして大きいが比較的非 分解性のバックボーンとして働いて多数の二次担体を運ぶことができる。しかし ながら、下に詳しく説明するように、本発明はそれ自体免疫原性でない一次担体 を使用して実施することができる。
−次組体は天然に存在する、半合成であるが、あるいは完全に合成の高分子量の 分子であることができる。好ましい１！様において、少なくとも１種の一次担体 はデキストラン、カルボキシメチルセルロース、アガロース、フィコール、ポリ アクリルアミド、の多Ｗ！ｌＩ。
およびそれらの組み合わせから成る群より選択されるポリマーである。
１つの好ましい態様において、−次組体はデキストランである。
ここにおいて使用するとき、デキストラン（ｒｄｅｘ　Ｊ　）は単一の糖から構 成された多糖を呼び、そしてファーマシア（ｐｈａｒ＋５ａｃｌａ）を包含する ある数の源から入手可能である。フィコールは、半合成ポリマーの１例であり、 不活性の合成の非イオン化高分子量ポリマーである０合成ポリマーはポリアクリ ルアミド（アクリル樹脂の水溶性高分子量ポリマー）、ポリビニルアルコール、 部分的に加水分解されたポリ酢酸ビニル、およびポリビニルピロリドンを包含す る。他の好ましい態様において、−次組体は微生物の多糖である。なお他の好ま しい態様において、微生物の多ｍｉは病原性微生物から誘導される。なおさらに 他の好ましい態様において、−次組体は肺炎球菌莢膜多Ｉ’１ｌ（ＤＩ型を包含 する）、Ｂ群の連鎖法菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）血清型、緑［９Ｉｉ Ｉ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｌｎｏｓａ）のムコエキソ多ｍｉ。
緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の莢膜多糖類（フィッシャ−１型株を包 含する）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ ）の多＄ａ（ＰＲＰを包含する）、およびそれらの組み合わせから成る群より選 択される。なおさらに他の好ましい態様において、−次組体はインフルエンザ菌 （Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の多ＩＩ　（ＰＲＰ）であ る。
この構成体の二次担体は、また、すぐれた抗体の応答を誘発するために特定の利 点を提供する。Ｔ依存性抗原のように、二次担体はＴ細胞を活性化しかつ漸増し 、これによりＴ細胞依存性抗体の生産を増大する。しかしながら、二重担体の免 疫原性構成体はそれ自体強く免疫原性である必要はないが、強く免疫原性の担体 は本発明の範囲内である。−次組体への二次担体の多数のコピーのカップリング は、アジュバントの不存在下でさえ二次担体に対する抗体の生産を有意に増大す る。
好ましいＢ様において、二次担体はタンパク質、ペプチド、Ｔ細胞アジュバント またはＴ細胞の助けを活性化しかつ漸増することができる他の化合物である。二 次担体はウィルス、細菌、寄生生物、動物および真菌の構成成分から成る群より 選択されるが、これらに限定されない、より好ましい態様において、二次担体は タンパク質、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）、破傷風トキ ソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイドまたは細菌の外膜タンパク質 であり、これらは生化学的または製剤学的供給会社から入手するか、あるいは標 準の方法により生産することができる（Ｃｒｕｓｃ、　Ｊ、　Ｍ、およびＬｅｗ ｉｓ、　Ｒ，Ｅ、＋　Ｊｒ、（＆ｉｉ）　ＣｏｎＪｕｇａｔｉｖｅ　Ｖａｃｃｉ ｎｃｓｉｎ　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　 ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、１０（１９８９））　（特別に引用 によってここに加える）、二次担体として機能する他の成分は、免疫学における 当業者に知られているであろう。
本発明の二次担体は、少なくとも１種の一次担体に接合することができる。二次 担体は一次担体と反応することができる官能基を含有するか、あるいは二次担体 は前述の一次担体と反応できるように操作することができる。
前述したように、特定の二次担体の多数のコピーならびに種々の二次担体を一次 担体に接合することができる。−次組体への二次担体の多数のコピーのカップリ ングは、二次担体に対する抗体の生産を有意に増大する。
本発明の二次担体は、接合されているか、あるいはされていないか、あるいは後 述する免疫原にカップリングされているかどうかにかかわらず、好ましくは水溶 性である。
他の！ｓ樺において、第２図に表すように、部分を１または２以上の一次担体お よび／または二次担体に接合することができる。このような接合はその部分に対 する増強された抗体の応答を促進する。
−次組体および／または二次担体へこのような部分を接合する技術は当業者によ く知られており、そして、一部分、入手可能な官能基（例えば、アミノ、カルボ キシル、チオおよびアルデヒド基）を通したカップリングを包含する。参照、Ｓ 、　Ｓ、　Ｗｏｎｇ、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕ ｇａｔｅ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　（１９９ １））　、およびＢｒｅｎｋｅｌｅｙ　ら、Ｂｒ１ｅｆ　５ｕｒｖｅｙ　ｏｆ　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｊｕｇａ ｔｅｓ　Ｗｉｔｈ　Ｄｙｅｓ、　Ｈａｐｔｅｎｓ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓｓ−１ｉｎ ｋｉｎｇ　ＡｇｅｎＬｓ＋Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３ １１　（Ｊａｎ、　１９９２）、特別に引用によってここに加える０本発明のハ ブテンをまず二次担体（これはＴ依存性成分であることができる）に接合し、次 いで一次担体（これはＴ依存性成分であることができる）にカップリングし、そ の後これをカップリングする。あるいは、二次担体をまず一次担体に接合し、次 いでハブテンをこの接合体に接合することができる。この第２の方法は対応する ハブテン、例えば、アミノ基を含有するペプチドのハブテンの修飾を最小とする ことを促進することができる。
ここにおいて使用するとき、部分は、それ自体またはいったんカップリングされ ると、免疫系を刺激することができる物質である。
これらの部分は、ハブテン、抗原、またはそれらの組み合わせを包含する。ハブ テンは小さい分子、例えば、化学物質、はこり、およびアレルゲンを呼び、それ らはそれら自体抗体の応答を誘発することができるが、いったん担体にカップリ ングされると、誘発することができる。抗原は、正しい循環下に、抗体の形成を 誘発することができる分子である。これらのハブテンおよび抗原は、細菌、リケ ッチア、真菌、ウィルス、寄生生物、薬物、または化学物質から誘導することが できるが、これらに限定されない、それらは、例えば、小さい分子、例えば、ペ プチド１．糖類、オリゴ￥１ｌｌｌ（例えば、インフルエンザ菌（Ｈ，１ｎｆｌ ｕｅｎｚａｅ）のポリリボシル−リビトール−ホスフェート）、トキシン、エン ドトキシンなおどを包含することができる。
他の態様において、本発明は二重担体の免疫原性構成体および製剤学的に許容さ れうる担体から構成されたワクチンに関する。このようなワクチンは、有効治療 量の二重担体の免疫原性構成体および患者への適切な投与のための形態を提供す るために適当な量の担体を含有するであろう。
製剤学的に許容されうる担体は、無菌の液体、例えば、水および油であることが でき、石油、動物、植物および合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱 油、ゴマ油などを包含する。製剤組成物を静脈内に投与するとき、水は好ましい 担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、 また、液体の担体として、とくに注射可能な溶液のために使用することができる 。適当な製剤学的担体は、Ｍａｒｔｌｎ　Ｅ、　Ｗ、＋　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓＰｈａｒｗａｃｅｕｔｔｃａｌ　５ｃｉｃｎｃｅｓ（特別に引用によってここ に加える）に記載されている。
本発明の二重担体の免疫原性構成体から構成することができるワクチンは、図表 １に記載されているワクチンを包含するが、これらに限定されない。
図表１ ジフテリアワクチン 百日咳（サブユニット）ワクチン 破傷風ワクチン インフルエンザ菌（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｓ）　ｂ型（リン酸ポリリボース） 肺炎連鎖法＄１１　（Ｓ、　ｐｎｅｕ＋５ｏｎｉａｅ）、すべての血清型大腸菌 （Ｅ、　ｅｏｌｉ）、エンドトキシンまたはＪ５抗原（ＬＰＳ　、脂質Ａおよび ゲンタビオース） 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、０多１１１１（血清型特異的）クレブシェラ属（Ｈ ｅｂｓｉｅｌｌａ）　、多ＩＩ類（血清型特異的）黄色ブドウ球菌（Ｓ、　ａｕ ｒｅｕｓ）、５および８型（血清型特異的および普通の保護的抗原） 表皮ブドウ球菌（Ｓ、　ｅｐｉｄｅｒ−ｉｍｉｄｉｓ）　％血清型多１１１．Ｉ Ｉおよびｍ（および普通の保護的抗原） 髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清型特異的またはタンパク質 抗原ポリオワクチン おたふくかぜ、麻疹、風疹ワクチン ＲＳウィルス 狂犬病 肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ１など ヒト免疫欠損ウィルスＩおよびＩＩ　（ＧＰ１２０．　ＧＰ４１．　ＧＰ１６０ ．　ｐ２４など）単純ヘルペス１型および２型 ＭＶ ＢＶ 水痘／帯状庖疹 マラリア 結核 カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　％他のカンジ ダニューモジステイス・アリニイイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉ りマイコプラズマ インフルエンザウィルスＡおよびＢ アデノウィルス 群Ａ連鎖法菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）群Ｂ連鎖球薗属（ｓ　ｔｒｅｐ 　ｔｏｃｏｃｅｕｓ）、血清型１ａ、Ｉｂ、ｎおよび■シュードモナス・アエリ ノサ（Ｐｓｃｕｄｏｓｏｎａｓ　ａｅｒｙｉｎｏｓａ）　（血清型特異的） ライノウィルス バラインフルエンザエ（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｃｎｚａｅ）　、１型、２型および ３型コロナウイルス サルモネラ属（Ｓａｌｓｏｎｃｌｌａ）赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ） ロタウィルス エンテロウィルス トラコーマクラミジアおよびニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈ ｏｍａｔｉｓｌ　ｐｎｅｕｗｏｎｉａｅ）　（ＴＭＡＲ）本発明は、また、患者 に免疫刺激量のワクチンを投与することによって患者を処置することに関する。
患者は処置が有益である被検体を呼び、そして哺乳動物、ことにヒト、ウマ、ウ シ、イヌ、およびネコならびに他の動物、例えば、ニワトリを包含する。患者に 免疫刺激量は、疾患の予防、軽減、または処置のために患者の免疫応答を刺激す ることができるワクチンの量を呼ぶ０本発明のワクチンは任意のルートで投与す ることができるが、好ましくは静脈内、筋肉内、および皮下の注射により投与さ れる。
本発明は、また、前述のワクチンで宿主を免疫化し、こうしてドナーがワクチン に対して向けられた抗体を生産するようにすることによって、細菌、ウィルス、 寄生生物、真菌、または化学物質により引き起こされる感染に対する免疫治療剤 を調製する方法に関する。
抗体を単離するか、あるいは後に骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗体をつ くるためにＢ細胞を得ることができる。モノクローナル抗体をつくる方法はこの 分野においてよく知られており、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　１ｉ ａｔｕｒｅ　２５６　：　４９５　（１９７５）（特別に引用によってここに加 える）そしてそれ以上ここで説明することは必要ではない。
ここにおいて使用するとき、免疫治療剤は患者の受動的処置においてに使用する ための特定の免疫原に対して向けられた抗体の組成物を呼ぶ、血漿のドナーは、 ワクチンの中に含有させる免疫原に対する抗体の生産のためにワクチンを注射す る被検体である。
本発明は、また、保護量の免疫治療剤を投与することによって患者を処置する方 法に関する。このような処置は、免疫原に対する抗体を患者に生産させず、むし ろ血漿ドナーにより生産された免疫原に対する抗体を使用することにおいて受動 的である。治療用抗体の量は、免疫原により引き起こされる疾患を予防し、軽減 するが、あるいは処置することができる抗体の十分な数を表す場合、保護的であ る。このような量は当業者により決定されることができ、そして患者および疾患 のプロフィルの特性に基づいて変化する。
本発明は、また、細菌、ウィルス、寄生生物、真菌、または化学物質により引き 起こされる疾患の特徴を示す因子に対する抗体（またはＢ細胞）を生産するよう に、前述のワクチンで宿主を免疫化することによって、前記因子を検出するため の診断試薬および／または研究試薬を生産する方法に関する。抗体および／また はＢ細胞は前述したように単離することができる。ここにおいて使用するとき、 診断試薬は、疾患の特徴を示す因子を検出するために使用できる抗体（ポリクロ ーナルまたはモノクローナル）の組成物を呼ぶ、ここにおいて使用するとき、研 究試薬は、実験室において使用できる抗体（ポリクローナルまたはモノクローナ ル）の組成物を呼ぶ。
ここにおいて提供する実施例は、能動的または受動的予防または治療のために、 および診断、または研究の目的で使用できるモノクローナル抗体またはポリクロ ーナル抗体を生産するワクチンの製造における本発明の実施を、限定を意味しな いで、例示する方法を提供する。
代表的な実験のプロフィルを選択して、新規な二重担体の免疫原性構成体の製造 方法および機能の概念を例示する。
方ユ ■、特記しない限り、マウス（ＤＢＡ／２Ｊ）を８週齢で使用し、そして０．１ １の種々の抗原の生理食塩水溶液で静脈内的、皮下的または筋肉内的に免疫化し た。すべての実験において、５匹のマウス／群を使用した。採血は尾の静脈によ った。
■、アミノエチルカルパルＤｅｘ　（ＡＥＣＭ　Ｄｅｘ）アミノ−エチルカルパ ルＤｅｘ　（ＡＥＣＭ　Ｄｅｘ）は、本質的にＢｕｎｓｗｉｃｋら、Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１４０　：　３３６３　（１９８８）　（特別に引用によってこ こに加える）に記載されているようにして調製した。　ＡＢＣＭ　Ｔ２Ｏ００デ キストラン［ファーマシア（Ｐｈａｒ■ａｃｊａ）　］をゲル透過カラム（ＣＬ ２Ｂカラム２．５　ｘｔｏｓ　ｃｍ）上に通過させた。カラムの最初の１／３か らの物置をプールし、そして２，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する ことが決定された。この物質をここでＨＩ’ｌＷ　ＡＥＣＭ　デキストランと呼 ぶ。
また、デキストランをＴ７ＯおよびＴ５００デキストラン（ファーマシア）から 調製しそして、それぞれ、ＣＬ６Ｂ中止ＣＬ４Ｂカラムで分画した。中央のカッ トを取り、濃縮し、そして戻して比較的均質な調製物を得た。トリニトロベンゼ ンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を使用して、デキストラン分子量たりのアミノ基の平 均数を決定した。高分子量のデキストラン調製物は１５０〜２００アミノ基／２ ，０００．ＯＯＯダルトンを有した。
ＡＢＣＭ　Ｔ５００調製物は１５０アミノ基、　４００．０００ダルトンを有し 、そしてＡＥＣ？Ｉ　７７０１Ｍｌ製物は３５アミノ基／７０．０００ダルトン を有した。デキストラン濃度の決定を促進するために、ＡＥＣＭデキストランを 少量のＮ−スクシニミジル（３Ｈ−２，３）プロピオネート〔アマ−ジャム（八 −ｅｒｓｈａｍ）　（３８−ＮＳＰ　）との反応により日常的に放射線標識化し た。　１０，０００個の分子量たりほぼ１個が修飾された。　（３１１−ＡＥＣ Ｍ　Ｄｅｘ）を次のようにして軽度にトリニトロフェニル化した：　０．０１Ｍ のホウ酸ナトリウムｐ）１９．３中の０．０１Ｍの新しく調製したＴＮＢＳの５ ０μｌを、２１のＨＥＰＥＳ緩衝液（０，０１Ｍ　ＨＲＰＥＳ、２ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、　０．０２％アジド、ｐＨ７，５）　＋０．５　ｓ＋１の０．１　Ｍのホウ 酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９，３中の２０−ｇのＨ？ｌＷ　ＡＥＣＭ　デキストラ ンの撹拌した溶液に添加した。室温において暗所で２時間後、試薬をＰ６ＤＧ脱 塩カラム〔バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）　）上で除去し、そして標識化したデキ ストランをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　３０（ファーマシア）を使用 する限外濾過により濃縮した。　３６６　ｎ−における１１　、０００のモル吸 光係数を使用して、ＴＮＰ／！ＩＭＷデキストランの比は４０：ｌであると決定 された。これはそれ以上の反応のためにほぼ１００〜１５０の遊離アミノ基が残 った。
この方法の変法は他の一次担体のための通常であることがある。
例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のムコエキ ソ多糖（ＭＥＰ）は、カルボキシルを含有する５００　ｋＤａの分子であり、ま ずエチレンジアミンおよび水溶性カーポジイミドで部分的に誘導することができ る。対照的に、アミノ基を含有する緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）フィ ンシャーｌ型多糖は標準のプロトコールでよく応答することができるが、高い塩 の存在により促進することができる。
ｍ、　ＡＥＣＭ　Ｄｅｘへのタンパク質の接合ヘテロライゲイジョン技術（Ｂｒ ｕｎｓｗｉｃｋ　Ｍ、ら、Ｊ、　Ｉｗｍｕｎｏｌ、　１４０：　３３６４．１９ ８８、特別に引用によってここに加える）を使用して、＾ＥＣ７１デキストラン にタンパク質を接合した。タンパク質をアセチルチオール化し、そしてデキスト ランを試薬Ｓｌ＾Ｐ　（Ｂｒｕｎｓｎｉｃｋ　Ｍ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　１４０　：　３３６４．１９８Ｂ、特別に引用によってここに加える）でヨー ドアセチル化したが、他の試薬、例えば、ヨード酢＃Ｎ−ヒドロキシルスクシン イミドエステル（ＩＡＮＨ３）を使用することができる。
タンパク質は典型的には４〜８倍モル過剰の試薬ＳＡＴ＾〔カルビオケム（Ｃａ ｌｂｉｏｃｈｅｍ）　）と１〜２時間反応させた。活性化されたデキストランお よびタンパク質の各々を脱塩してアセテート緩衝液（１〇−門　酢酸ナトリウム 、０．１　Ｍ　ＨＣＩ、２−Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．０２％アジ化ナトリウム、ｐ Ｈ５，０）に入れて過剰の試薬を除去し、そしてセントリコン３０を使用して′ ａ縮した。典型的にはタンパク質およびデキストランを３０〜６０：１のモル比 で混合し、ｐＨを濃ＨＥＰＥＳ　ＩＩ衝液＋ヒドロキシルアミンでｐＨ７，５に 上昇させた。最終濃度は７５請Ｍ　Ｈ［！ＰＥＳ、２−門ＥＤＴＡ、　０．０２ ％アンドおよび５０ａ＋Ｍ　ヒドロキシルアミンであった。４゛Ｃにおいて一夜 の反応後、接合体を０．２　ｍＭ　メルカプトエタノールで１時間処置しく残留 するヨードアセチル基を消費するため）、次いで１０−Ｍ　ヨードアセトアミド で処置しくすべてのチオール基を消費するため）、次いで必要に応じて濃縮しく 例えば、遠心装置または圧力限外濾過により）、そしてＰＢＳと平衡化し、タン パク質の分子量に依存して５２００ＳＦ、　５３００ＳＰまたは５４００ＳＦ　 （ファーマシア）を含有するｌｘ５８ｃｍのゲル濾過カラム上に濾過させた。放 射活性空隙カラムのピークをプールし、そして必要に応じて濃縮した。溶液をミ レノクス（ＭＮｌｅｘ）　ＧＶまたはＨＶフィルター〔ミリポア（Ｍｌｌｌｉｐ ｏｒｅ）に通過させることによって滅菌した。
Ｐ７４ヘブチド（ＣＮＩＧＫＶＰＮＶＱＤＱＮＫ、単一文字のアミノ酸コード） を次のようにしてＢＳＡに接合した。　４００　ＩＩＩのＨＥＰＥＳ　ＩＩ街液 中の１１．６−ｇのＢＳＡ　（ペンテ・ンクス（Ｐｅｎｔｅｘ）　）をヨードア セトアミド中で１０１にした。これはへテロ２官能性試薬と反応しそして重合を 引き起こしうる元のチオール基をブロックすることであった。１０分間インキユ ヘーションした後、タンパク質を１２倍モル過剰の５ＩＡＰの添加によりヨード アセチル化した。１時間後、この溶液を脱塩してアセテート緩衝液の中に入れ、 そして３９■ｇ／■■に濃縮した。
チオールペプチドを放射線ｔＩ識化して、ＢＳＡに接合したペプチドの量を推定 した。ペプチドをＨＥＰＥＳ緩衝液中に溶解し、そして１．５倍モル過剰のエル マンズ試薬を添加してチオールをブロックした。
３０分後、１０倍モル過剰のＮ−エチルマレイミドを添加して、解放した半分の エルマンズ試薬のチオールを消費する。１時間後、チオ保護されたペプチドをＮ −スクシニミジル（”Ｈ−２，３）−プロピオネート（３Ｈ−ＮＳＰ）　（アマ −ジャム）で放射線標識化した。接合直前に、ポリペプチド溶液を５０ｍＭのジ チオスレイトールにし、そしてすべての試薬をＩ　Ｘ３８ｃｍＧ−１０カラム（ ファーマシア）で除去した。
空隙体積中を流れる放射能のピークをプールした。ペプチドの比活性は約２．５ 　ＸＩＯ”であった、放射線標識化したチオールペプチドを４．５　ｍｇのＢＳ Ａに１５：１のモル比で添加し、そしてｐＨ５ｘ　ＨＥＰ［！Ｓの添加により７ ．５に上昇させた。最終体積は１．２■ｌであった。−夜反応させた後、この溶 液を０．２　ｍＭのメルカプトエタノールで１時間処置し、そして未反応のペプ チドをＰＢＳで平衡化したｌ　Ｘ１５ｃｓ＋のＰ６ＤＧカラムで除去した。最終 のペプチド抗原単独は６：１であると決定された０次いで、ＢＳＡについて記載 したように、このペプチド−タンパク質接合体をデキストランカップリングした 。
β−ラクトグロブリンＢ、アプロチニン、オバルプミン（ＯＶＡ）およびリゾチ ームをシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をベ ンテックス（Ｐｃｎ　ｔｅｘ）またはアムレスコ（＾−ｒｅｓｃｏ）から入手し た（生物技術等級）、ワタシニアタンパク質はイサベラ・ファーキイ（ｌｓａｂ ｅｌｌａ　Ｑｕａｒｋｙｉ）博士（ジッージストーン大学メディカル・スクール ）から提供された。
０．１Ｍのホウ酸ナトリウム、０．２　Ｍ　）ＩＣ１，０，０２％アジ化ナトリ ウム、ρ８９．１）中のＴＮＢＳの４〜１２倍モル過剰（０，２５Ｍ　［溶液か ら）を、同一の緩衝液中のそれぞれＯＶＡまたはＢＳへの５０ｍｇ／■Ｉ溶液に 添加することによッテ、ＴＮＰ−ＯＶＡおよびＴＮＰ−ＢＳＡを調製した。４° Ｃにおいて一夜反応させた後、タンパク質をＨＥＰＥＳ　ＩＩ衝液の中に透析し た。
比を３６６０−におけるＯＤから決定し、そして２８０ｎ−においてハブテンの 寄与を補正した。　（００２８０＝０．３２ＸＯＤ３６６）。
■、血清１ｇＧ１、およびＩｇＭ抗ＴＮＰ力価をＥＬＩＳ＾により決定した。こ のアッセイはわれわれの前述のアッセイと同様に実施したが、ただしこの場合に おいて、アルカリ性リン酸塩接合抗体を使用し、そしてマイクロタイターウェル を抗ＴＮＰ抗体の測定のために１０Ｍｇ／ｍｌのＴＮＰフィコールで、あるいは 抗ＢＳＡ抗体の測定のために１０Ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで２時間コーティングした 。また、他の被験タンパク質を１０Ｍｇ／ｍｌでコーティングした。アルカリ性 リン酸塩接合抗体で処置した後、マイクロタイタープレートのウェルに２００μ ｌのｐ−二トロフェニルホスフエー）（ＩＭ　）リスｐＨ９，８中の１１１４１ ／ａｌｌ）を充填し、室温において０．５〜１時間インキエベーシッンし、そし て各ウェル中の溶液のＡ４゜、をタイターチク・マルチスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅ ｋＭｕｌｔｉｓｋａｎ）分光光度計〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マクリーン、バージニア州〕で決定した。　ＥＬＩＳ ＾についての力価を従来記載されたように計算した（参照、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、　Ｉ、４５　Ｊ、　 Ｃｏｌｉｇａｎ、　Ａ、　Ｋｒｕｉｓｂｅｃｋ、　Ｄ、　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ。
Ｅ、　５ｈｅｖａｃｈおよび−、　５ｔｒｏｂｅｒ、　Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　 ５ｏｎｓ＋　１９９１　、特別に引用によってここに加える）。
裏施■土 現在のワクチンは、劣った免疫原性、各抗原について別々のワクチン構成体およ びすぐれた抗体の生産を誘発するために多数のブースター注射の必要性を包含す る多数の欠点を有する。高分子量ポリマー（ＨＭＷＰ）を−次抗原として使用し てワクチンのバックボーンを準備した。任意のＨＭＷＰを使用することができる が、Ｄｅｘをこれらの研究のために選択した。　ｎｅｗ　ＨＭＷＰをを使用して Ｔ細胞およびＢ細胞に高い密度の二次担体を提示し、そして多数の他の異なる抗 原のための担体を準備した（第１図および第２図）。
抗原をＨＭＷＰ−次担体にカップリングしたとき、これらの抗原に対する抗体の 応答が増強される（第３図および第４図）、接合しないＢＳＡの単一の注射は検 出可能な抗体の応答を誘発しないが、ｎｅｗに接合されたＢＳＡは１０〜５００ μｇ／投与においてすぐれた抗体の応答を誘発する（第３図）、−次担体のＤｅ ｗへの異なるタンパク質の接合は、それらのタンパク質を強く免疫原性とする（ 第４図）、これらの研究は、ウィルスの抗原（ワクシニア−Ｄｅｘ）、細菌の抗 原およびトキシン（コレラトキシン−Ｄｅｘ）および免疫原性に劣った他の物質 を包含した。したがって、二次タンパク質担体は広範な種類のタンパク質、例え ば、ＢＳＡまたはトキシン／トキソイド、例えば、コレラ、破傷風またはジフテ リアを包含することができるであろう。
Ｄｅｘ−次担体の方法は変化することができるが、＞７０ｋＤａでなくてはなら ず、そして大きさが約４００〜２０００ｋＤａ）において最も有効な分子である （第１２図）、シかしながら、８Ｍ１４Ｐの最適な大きさは利用する特定の一次 担体に依存して変化することができる。　Ｄｅｘ　８Ｍ１４Ｐは多糖であり、そ して免疫欠損マウスはそれに対する抗体の応答をマウントしない、しかしながら 、正常マウスおよび免疫欠損マウスの両者はＤｅｘにカンブリングされたＢＳＡ に対して等しくすぐれた抗体の応答を生成する（第１Ｏ図）、これが証明するよ うに、−次担体としてＤｅｘは単に１種または２種以上の抗原を細胞の多価の配 列で提示するマトリックスを提供し、そしてそれ自体免疫原性である必要がない 、また、これらの研究が示すように、種々のタンパク質を二次担体として使用す ることができ、そして二次担体くちワクチン抗原および非免疫原性抗原の両者と して働くことができる。
１旅■叢 二重担体のワクチン構成体がＴＮＰを使用して完全に証明される（第５図）、マ ウスをＴＮＰで免疫化して二次担体８Ｓ＾（ＴＮＰ−ＢＳＡ）にカップリングさ せ、そしてＴＮＰ−ＢＳＡをまたＨＭＷＰ−次担体（Ｄｅｘ）にカップリングさ せる。二次担体ＢＳ＾単独へのＴＮＰの接合はＴＮＰへの抗体の応答を増強しな かった。しかしながら、二次担体／ＴＮＰ複合体を一次担体にカップリングする と、（（ＴＮＰ−ＢＳＡ）　ｎｅｗ　）はＴＮＰの免疫原性を増強した。さらに 、ＢＳＡ　（二次担体）は、Ｄｅｘ単独と、あるいはＤｅｘおよびＴＮＰとカッ プリングしたとき、免疫原性であった。
したがって、二重担体のワクチン構成体を使用すると、ＨＭＷＰは二次担体を有 することができ、そして他の抗原を二次担体にカップリングすることができる。
抗体は二次担体に対して誘発され、ならびにそれおよび非免疫原性ハブテン分子 に接合された抗原は免疫原性とされるであろう、二次担体が抗体がそれに対して 保護的免疫性を提供する抗原、例えば、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキ ソイドである場合、これはと（に重要である。このワクチン構成体は、また、多 数の無関係の抗原の一次担体へのカップリングを可能とする（第７図）　、　Ｔ ＮＰをＯＶＡ　（二次担体）にカップリングし、次いでＤｅｘ　（−次担体）に 接合した。また、ＬＹＳをＤｅｘに独立に接合した。
抗体は抗原の各々に対して誘発された。こうして、このワクチン構成体のＨＭＷ Ｐバックボーンは、二次担体のタンパク質の配列および／または二次担体にカッ プリングされた多数の異なる抗原をもつ多価ワクチンの生産に適当である。（多 担体／多抗原のワクチン）ｌ施■主 前の実施例において、二重担体のワクチン構成体が種々の抗原で有効であること を示した。このデータは寄生生物（マラリア）誘導ペプチド抗原（ｐ７４）を使 用して支持され、そして拡張される。二重担体のワクチン構成体は、ペプチド抗 原単独または二次担体ＢＳ＾に接合されたペプチドより有意にすぐれていること が示された（第６図）。Ｐ７４−ＢＳＡ接合体を）ＩＭＷＰ−次担体（Ｄｅｘ） にカップリングした後にのみ、この小さい抗原に対してすぐれた抗体の応答が誘 発された。
しかしながら、ＨＭＷＰ担体は抗原を細胞に提示スラリーマトリックスを単に提 供し、そして免疫原性である必要がない（第１Ｏ図）。
裏施■土 ワクチンが長期間にわたって免疫性を効果的に増強するためには、すぐれたブー スターの応答が重要である。二重担体のワクチンで一次免疫化後、ブースター抗 体の応答を接合しない二次担体でさえ誘発することができる（第８図）、さらに 、ハプテン化担体を使用したとき、ブースターの応答はＴＮＰおよびＢＳ＾二次 担体の両者に対して観察された。それ以上の分析において、ＢＳＡ二次担体に対 する一次および二次抗体の応答は長く続く（第９図）。
１胤ＬＬ ＢＳＡ−Ｄｅｘ接合体を分析して、宿主の免疫状態の効果および抗体の応答への 免疫化のルートを評価した。免疫学的に成熟した大人および免疫学的に未成熟の 子供の両者のマウスは一次担体および二次担体の複合体で効果的に免疫化され、 二重担体のワクチンが未成熟の免疫性をもつ子供および若い乳児においてさえ抗 体の応答を誘発するであろうことを証明する（第１１図）　、ＢＳＡ（二次担体 ）に対する抗体の応答は、大人および子供の両者のマウスにおいて類似する。さ らに、ＩＶ、　ｒＭ、およびＳＣルートのすべてはＢＳＡに対するすぐれた抗体 の応答を誘発した（第１３図）、シたがって、ワクチン投与のルートは接種のい かなる単一の型にも限定されず、そしてワクチン受容体の年令または免疫学的状 態により限定されない、しかしながら、１１ＭＷＰの大きさは有効なワクチン構 成体を得るためには重要である。
例えば、ＨＭＷＰ　Ｄｅｘについて、大きさは＞Ｔｏ、０００、好ましくは〉４ ００、０００でなくてはならない（第１２図）。
裏旌■旦 多数の担体のワクチンの調製は第１４図に図解されている。３の二次担体をこの 系において使用し、それらの２・つはさらに他の部分に接合される。インフルエ ンザ菌（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｓ）　ＰＲＰを破傷風トキソイドの二次担体に カップリングさせ、マラリア誘導ペプチドを髄膜炎菌外膜タンパク質にカップリ ングさせ、そしてウィルスのタンパクｉｔ（例えば、Ｒ５Ｖ−Ｆタンパク質）を 接合しないままにする０次いで、各二次担体の１または２以上を高分子量のポリ マーのバックポーンに接合する。
実隻医１ 次の４つのアプローチのいずれかにより、多数の特異性を有するようにワクチン を設計することができる：（１）２またはそれ以上の構成体、各々は同一の一次 担体に接合された異なる二次担体から成る； （２）２またはそれ以上の異なる構成体、各々は同一の一次担体および二次担体 から成るが、異なる部分を有する；（３）２またはそれ以上の異なる構成体、各 々は異なる一次担体、同一の二次担体および異なる部分から成る；および（４） ２またはそれ以上の異なる構成体、各々は異なる一次担体、異なる二次担体およ び異なる部分から成る。
実施１１ 下の図表２および３に記載するように、ＴＮＰ−ＢＳＡに接合されたデキストラ ンを使用する免疫化は、応答の大きさ、持続性などを包含する、抗体の応答の多 数のパラメーターを大きく増強した（図表２）。
同様に、ＢＳＡ−デキストランまたはＴＮＰ−ＢＳ＾デキストランを使用する免 疫化は、抗体の応答の多数のパラメーターを大きく増強した（図表３）。
図表２ ＴＮＰ−デキストラン、ＢＳＡ−デキストランまたはＴＮＰ−ＢＳＡデキストラ ンにより誘発された抗体の応答の比較 免疫化 ＴＮＰ−ＢＳＡ（７ジハンドなし）　ＴＮＰ−ＢＳＡデキストラン五二ＴＮＰ力 ｌ Ａ、応答の大きさ　＋十＋十 Ｂ、応答の持続性　＋＋＋＋ Ｃ３二次応答について　−＋十＋＋ のブースト能力 り、新生児の免疫化　＋十士十 能力 Ｅ、Ｂ細胞欠損マウス　−　＋十＋＋ を免疫化する能力 Ｆ、抗体の活性　＋＋＋＋ Ｇ、皮下的免疫化能力　−＋＋＋十 図表３ ＴＮＰ−デキストラン、ＢＳＡ−デキストランまたはＴＮＰ−ＢＳ＾デキストラ ンにより誘発された抗体の応答の比較 免疫化 ＴＮＰ−Ｄｅｗ　ＢＳＡ−ＤｅｘまたはＴＮＰ−ＢＳＡ　Ｄｅｘ 坑工旺二１値　ＴＮＰ　たはＢＳＡ Ａ、応答の大きさ　＋　＋＋＋＋ Ｂ、応答の持続性　７〜１０日　４０〜６０日Ｃ８二次応答について のブースト能力　＋十＋十 〇、新生児の免疫化 能力　＋＋＋＋ Ｅ、Ｂ細胞欠損マウス を免疫化する能力　＋＋＋十 Ｆ、抗体の活性　低い　高い Ｇ、皮下的免疫化能力　＋＋十十 裏施■ニ 一次担体としてデキストランおよび二次担体としてジフテリアトキソイド（ＤＴ ）　、百日咳トキソイド（ＰＴ）　、および破傷風トキソイド（ＴＴ）を使用し て、３つの二重担体の構成体を調製した。これらの接合体をまずデキストランお よびタンパク質の濃度について分析して、接合の成功を評価した。その後、接合 体をマウスの２つの群に注射して、二重担体の免疫原性構成体に対する免疫応答 を決定した。
Ａ、材料および方法 １．動物 雌の異系交配マウス（ＣＤ−１）、４週齢、を、ヤールス・リバー（Ｃｈａｒｌ ｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）、ウィルミントン、マサチュセッッ州がら購入した。
２、試薬 鰯免疫化抗ＴＴマウスの血清をＳ、　Ｃ，Ｓｚｕ博士（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｌｍ５ｕｎｉｔｙ ＋　ＮＴＮ＋　Ｂｅｔｈｅｓｄａ）から受け取った。精製したＩｇＧ１．　Ｉｇ Ｇ２ａ、　ＩｇＧ２ｂ、　１ｇＧ３およびＩｇＭならびにヤギ抗マウスＩｇＧ、 　ＩｇＧ１．　ＩｇＧ２ａ、　ＩｇＧ２ｂ、　１ｇＧ３．　ＩｇＨのアルカリ性 ホスファターゼ接合体をフィッシャー・バイオテクノロジー（ＦｉｓｈｅｒＢｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、スビングフィールド、ニュージャーシイ州、がら入 手した。精製したマウスＩｇＧ　、精製したヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｆａｂ特異 的）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵からのアビジン、Ｂｒ１ｊ　−３５お よびホスファターゼ基質をシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｓ ｉｃａｌ　Ｃｏ、＋　ミゾリー州セントルイス）がら購入した。クロマトグラフ ィー的に精製された破傷風トキソイド（ＴＴ）　、百日咳トキソイド（ＰＴ）お よびジフテリアトキソイド（ＤＴ）を、後述するように二次担体の調製のために ならびにＥＬＩＳＡをコーティングするために、マサチュセ７′ン・パフ゛リン ク・ヘルス・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　 Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）（ＭＰＨＢＬ）により提供された。
マウスにデキストラン−百日咳トキソイド（ＰＴ）接合体（後述するように調製 した）を３１日の間隔で２回注射し、そして第２回の注射後２週にマウスを採血 することによって、抗デキストラン参照マウス血清を調製した０種々のマウスの 血清を等しい体積でプールした。同様に、マウスにリン酸アルミニウム吸着（後 述する吸着法）ＤＴまたはＰＴを注射することによって、抗り丁参照マウス血清 および抗ＰＴ参照マウス血清を調製した。
Ｂ、二次担体タンパク質の調製 次の精製および解毒技術により、ＭＰＩＩＢＬは二次担体タンパク質、ＤＴ、　 ＰＴ、およびＴＴを調製した：まず破傷風トキソイドを硫酸アンモニウム分画お よびセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−５０およびＤＥＡＥカラムクロ マトグラフィーにより精製することによって、破傷風トキソイドを調製した０次 いで、精製された破傷風トキソイドをホルマリンで解毒した。まずジフテリアト キソイドをホルマリンで解毒し、次いで硫酸アンモニウム分画およびＤＥＡＥカ ラムクロマトグラフィーにより精製することによって、ジフテリアトキソイドを 調製した。百日咳トキソイドをアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、 次いで百日咳トキソイドをテトラニトロメタンで解毒することによって、百日咳 トキソイドを調製した。
セントリコン（Ｃｅｎｔｏｌｉｃｏｎ）　３０装置（アミコンから）を使用して 、ジフテリアトキソイドを１０−ｇ／ｍｌに濃縮し、そして破傷風トキソイドを ４．７ｍ’ｇ／■ｌに濃縮し、そして百日咳トキソイドを’１．８ｍｇ７ｍ１に 濃縮した。
１／９体積（７）ＨＥＰＥＳ　ｐ液液濃厚物（０，７５Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　１０ ＋ｓＭ　ＥＤＴＡ。
ｐＨ７，５）を各トキソイド溶液に添加し、そして１２〜１４モル比のＳＡＴ＾ （カルビオケム）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２５■Ｈまたは０．１ Ｍの原溶液からゆっくり添加した。多分多数の容易にアクセス可能なアミノ基が 解毒の間にブロックされたために、１抜の下に前述したより高い比の試薬／タン パク質が接合体のすぐれた収率を得るために必要であった。室温において１時間 後、誘導トキソイドをＰ６ＤＧカラム（バイオラド）で酢酸塩緩衝液の中に交換 し、そしてセントリコン３０を使用して空隙体積中のタンパク質を濃縮した。百 日咳トキソイドが４縮することができる前に、１／９体積のＨＥＰ［！Ｓ　ＩＩ 街液を添加してｐＨを上昇させることによって、百日咳トキソイドの曇りを最初 に除去した。引き続く調製において、調製をＨＥＰＥＳ　ＩＩ衝液液■７．５の 中に交換した。この溶液は透明に止まった。
Ｂ、−次組体の調製 一次担体は、ｌにおいて前述したように調製した。簡単に述べると、高分子量の アミノエチルカルバミルデキストラン（約２Ｘ１０’ダルトン）（トリチウムで 軽度に放射線標識化された）をＳ！＾Ｐでヨードアセチル化し、そして酢酸塩緩 衝液（１０■Ｈ酢酸ナトリウム、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１Ｍ　ＮａＣ１，０ ，０２％アジ化ナトリウム）の中に交換し、そして濃縮した。
Ｃ，デキストランへのトキソイドの接合接合体は前述のへテロライゲイシラン化 学の変法を使用してｌｌＩ製した（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋら、Ｍｏｎｇｉｎｉ　ら ）、簡単に述べると、アセチル−チオレート化トキソイドをヨードアセチル化デ キストランのおだやかに撹拌した溶液に添加した。　ｐＨを上昇させ、そしてほ ぼ１／９体積の０．５　Ｍのヒドロキシルアミンを含有するＩＨＥＰＥｓ　ＩＮ Ｎ液液添加によりチオールを脱保護した。この溶液は重量基準でほぼ等しい量の 毒性およびデキストランを含有した。最終トキソイド濃度は５ｍｇ／ｍｌ　（Ｄ Ｔ）　、１．１　ｍｇ／ｍｌ　（ＰＴ）および５．９　ｍｇ／■Ｉ　（ＴＴ）で あった。
４°Ｃにおいて一夜反応させた後、接合体を０．２　ｍＭのメルカプトエタノー ルで１時間処置し、次いで１０ｍＭのヨードアセトアミドで１０分間処置した０ 次いで、接合体をＰＢＳと平衡化した５３００ＳＦまたは５４００ＳＦのｌＸ５ ８ｃ−〇カラム（ファーマシア）のゲル濾過により分画した０次いで、接合体を 含をする空隙体積のピークをプールし、そしてミレノクス（Ｍｉｌｌｅｘ）　Ｈ Ｖ　（０，４５μｍ＞のフィルター（ミリボア）を使用して滅菌濾過した。
３種類のトキソイドのうちで、百日咳は接合のプロトコールに対してとくによく 応答した。第１５図に記載するように、高い百分率の百日咳トキソイドはデキス トランとの高分子量の接合体に変換した。
最大の１５７ミノ基、および多分多数のこれより少ないアミノ基がトキソイド上 で修飾されたと、推定される。
Ｄ、接合の成功の決定 ３種類の接合体の各々のタンパク質濃度を００２８０により決定し、そしてミク ロＢＣＡアッセイ〔ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）　）により標準としてＭＰＨＢＬ から入手した精製されたトキソイドを使用して確証した。
デキストラン濃度をトリチウム化ＡＥＣＭデキストランの比活性から決定した。
これらの結果を後述する： タンパク質　タンパク質／ｄｅｘ　タンパク質／ｄｅｘ（−ｇ／■１）（モル） 　（１１／Ｗ）１、　ＤＴｘｄ−ｄｅｗ　Ｏ，３４１２０，６２、ＰＴｘｄ−ｄ ｅｘ　Ｏ，７３１４０，７３、ＴＴｘｄ−ｄｅｘ　Ｏ，４３２２１，１タンパク 質／デキストランの重量／重量は、接合法がトキソイドをデキストランに首尾よ くカップリングしたことを示す、これらの結果はオークタロニーのプレート上の 分析により確証された。
Ｄ、リン酸アルミニウム上への接合体の吸着各トキソイドに対応する流体の接合 体に加えて、各接合体の試料をアジュバントのリン酸アルミニウム上に吸着させ た。塩化アルミニウムおよびリン酸４ナトリウムの沈澱によりつくった新しく調 製したリン酸アルミニウムゲル（ｐＨ６，０）の４ｍｇ／ｓｌ上に、各試料を吸 着させた。チメロサルを０．０１％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度で添加した。
調製物を室温において一夜震盪した。
Ｅ、マウスの免疫化 １、最初の実験のために、５匹のマウスの群に流体として、あるいはアジュバン トのリン酸アルミニウム上に吸着された種々の接合体を注射した。マウスについ ての種々の接合体の投与量は、マウスにおいてタンパク質に対する抗体の応答を 生成するタンパク質の投与量に基づいて選択した。第１６図↓よマウスに注射さ れた種々の接合体の投与量を示す、同一の投与量を流体の接合体およびリン酸ア ルミニウム吸着接合体について使用した。吸着された調製物について、各マウス についてリン酸アルミニウムの投与量は０．４　ｍｇ／ｍｌであり、これは吸着 された破傷風トキソイドについてＭＰＨＢＬから入手したアジュバントのヒト投 与量の１１５である。各マウスに０．１　ｍｌの適当な濃度に希釈された流体ま たは吸着された接合体を皮下注射した。
マウスを２．４および８週に採血し、そして血清を分離した。１つの群について の血清を等しい体積でプールした。
２、第２実験を実施して種々の接合体の中に存在するデキストランの同一の投与 量に対するマウスの免疫応答を研究し、そして接合体のブースターの投与量を評 価した。第１９ａ図に記載するように、１０匹のマウスの群に、種々の接合体中 のデキストランまたは遊離デキストランの２Ｍｇ／マウスを３１日の間隔で２回 皮下注射した。マウスを第１回の注射後４週および第２回の注射後２週に採血し た。
血清を分離し、そして個々のマウスの血清を抗デキストランまたは抗タンパク質 抗体について、後述するように、ＥＬＩＳＡにより評価した。
Ｆ、酵素結合免疫吸着アッセイ 抗デキストラン参照マウスの血清を、それぞれ、抗原特異的１８Ｇ。
ＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプについて標準化した。超免疫化抗破傷風トキソ イド参照マウス血清、抗ジフテリアトキソイド参照マウス血清および抗百日咳ト キソイド参照マウス血清を、次の文献に記載されている方法により、それぞれの 抗原特異的１ｇＧについて標準化した：　Ｈ，Ｄ、　Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒおよび Ｊ、　Ｗ、　Ｎｏｓｌｅｇ、クラス特異的抗体の定量についての固相イムノアッ セイの標準化に対する一般的アプローチ、Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　１９８１＋　４６＋　１２９−１４０−、変更を加えた。
１００　ｔｔ　１のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７，２中で５Ｍｇ／＋ｓｌに 希釈した特定の抗原、ここでＴＴ、　ＰＴまたはＤＴで室温において一夜コーテ ィングした、高い結合性の洗浄容易なマイクロタイタープレート〔コーニング・ グラス・ワークス（Ｃｏｒｎｉｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ）　、コーンング、 ニューヨーク州〕上でＥＬＩＳＡを実施した。プレートをすべてのステップの間 において０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄した。
０．１％Ｂｒ１ｊ　３５および０．５％ＢＳ＾（ＰＢＢ）を含有するＰＢＳ中の 参照血清および被験血清の系統的２倍希釈をプレートの中で実施した。プレート を室温に２時間保持し、そして洗浄した。　ＰＢＳ中で希釈したアルカリ性ホス ファターゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、　ＩｇＧ１．　ＩｇＧ２ａ。
ＩｇＧ２ｂ、　１ｇＧ３またはＩｇＭをそれぞれのプレートを添加した。プレー トを再び室温において２時間保持し、そして洗浄した。最後に、１Ｍ　ジェタノ ールアミン−０，５ｍＭ　塩化マグネシウム緩衝液ＰＨ９，８中でｌａｇ／ｓｌ に希釈した１００　ｍｌのホスファターゼ基質を各ウェルに添加した。プレート をＥＩｊＳＡ　リーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ＭｕｌｔｉｓｋａｎＰｌｕｓ、フ ロー・ラボラトリーズ）で４０５ｎ−の波長で読んだ、抗原特異的抗体（Ｉｇ／ ＠ｌ）を標準曲線からロドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ）変換を使用して外挿した。
抗デキストランＥＬＩＳ＾について、最初にプレートをアビジンで一夜コーティ ングし、次いでＰＢＳ中のビオチニル化デキストランの１Ｍｇ／ｍｌの溶液を室 温において１時間の間添加した。このＥＬＩＳＡは、プレートをデキストランで 直接コーティングしたときのものに対する３０の血清血漿について抗デキストラ ンＩｇＧの非常に類似する結果を与えた。したがって、大部分の実験はプレート をデキストランで直接コーティングすることによって実施した。
Ｇ、結果 １、単一の注射 前の実施例において使用したマウスと異なり、この実験は若いマウスに集中した 。これらのマウスは、序論および第１１図に記載するように、接合しないデキス トランおよび他のＴ独立性抗原に対してよく応答しない、当業者は知るように、 ２才以下の若い子供は、また、２型のＴ独立性抗原に対してよく応答しない、し たがって、これらの結果は若い子供にいっそう直接に適用可能である。
これらのマウスは２週で抗体を誘発し、そして高度にレベルで少なくとも８ｉ！ ！１間持続した。第１６図に記載するように、誘発された主要なアイソタイプは ＩｇＧ１．１ｇＧ３、およびＩｇＧＭであった。さらに、ＰＴ−ｄｅｘは低いレ ベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂを誘発した。また、第１６図が証明するよう に、リン酸アルミニウム吸収接合体を注射したマウスは流体の調製物を注射した ものより高いレベルのＩｇＧおよびＩｇＭを示した。
さらに、二次担体のＤＴ、　ＴＴ、およびＰＴに対する抗体の応答を評価し、そ して第１７図の（ａ）、（ｂ）、および（Ｃ）に記載する。各場合において、接 合体を注射したマウスは少なくとも２週までにタンパク質成分に対する抗体を示 し、そしてそれらの抗体の持続は少なくとも８週であった。同様に、リン酸アル ミニウムへの吸収は免疫応答を増強した。
そのうえ、これらのデータは二重担体の各成分についての既往応答を明瞭に証明 する。
免疫原性破傷風トキソイドで期待されるように、接合した形態および接合しない 形態の両者に対する抗体の応答が存在した。しかしながら、劣った免疫原性のジ フテリアトキソイドおよび百日咳トキソイドでは、接合した形態に対して免疫応 答の顕著な増強が存在した。
第１６図および第１７図は、−緒に、本発明の接合体を使用して達成された二重 および逆の免疫増強証明する。
さらに詳しくは、破傷風トキソイドの中和活性を第１８図に記載するように評価 した。　０．０１抗トキシン単位（Ａｕ）またはそれより大きい血液レベルは、 破傷風トキソイドに対する保護を提供すると考えられる。こうして、接合体は、 流体の接合体について４週以内にそしてリン酸アルミニウムのアジュバント上に 吸収された接合体について２週以内に、０．１および１．Ｏｕｇの投与量で破傷 風トキソイドに対して保護的レベルの抗体を誘発した。
２、ブースターの注射 第１９ａ図に記載するように、変化する量のタンパク質に対して一定量のデキス トランをマウスに注射した。また、この図表が証明するように、各接合体は二次 担体（トキソイド）に対する免疫応答を誘発した。第９（ｂ）図が示すように、 接合しないデキストラン単独は、２回の投与後、種々の接合体により誘発された 抗デキストラン抗体レベルと比較して非常に低いレベルのＩｇＧ３およびＩｇＭ を誘発する。第１実験において観察されるように、デキストラン−ＰＴ接合体は 他の接合体より比較的大きいレベルのＩｇＧ’ｌａおよびＩｇＧ２ｂを誘発した 。
第１９図の部分（ａ）および（ｂ）は、−緒に、本発明の接合体を使用して達成 された二重および逆の免疫増強を証明する、すなわち、二次担体の接合は一次担 体に対する応答を増強し、そして逆が成り立った。
１振１ｊ 高分子量の一次担体のインフルエンザ菌す型の炭水化物（ポリリボシルリビトー ルホスフェ−）’ＰＲＰＪ）（これはまた臨床的に関係する）に接合された、ジ フテリアトキソイド、百日咳トキソイド、破傷風トキソイドを有する二重担体の 免疫原性構成体（これらは臨床的に関係するタンパク質の二次担体である）の合 成を下に説明する。すべての個々の成分はヒトにおける使用について既に承認さ れてきていることに注意すべきである。
Ａ、二次担体の調製 トキソイドをセントリコン３０を使用して構成した。ジフテリアトキソイド（Ｄ Ｔ）を５．２５−ｇ／ｍｌに、百日咳トキソイド（ＰＴ）を２．６１１μｌ−１ に、そして破傷風トキソイド（ＴＴ）を３．２−ｇ　／　ｍ　１に、それぞれ、 Ｓ縮した。１／９体積の濃ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した。　５ＰＤＰ　（シグマ またはカルビオケムから入手可能である）をＤＴのおだやかに撹拌した溶液に１ ６＝１のモル過剰量でそしてＴＴに２０：１モル過剰量で添加した。　ＰＴにつ いて、試薬５ＡＴＡを１１：１の比（ＤＭＦ中の原溶液）をおだやかに撹拌した 溶液に添加した。
２つの試薬５ＡＴＡおよび５ｐｏｐは、当業者に知られている異なる利点をもっ て、異なるように保護されたチオールを生成した。簡単に述べると、５ＡＴＡの 生成物はアセチルチオールであり、これはヒドロキシルアミンでゆっくり脱保護 されるが、ＳＰ口Ｐの生成物はチオ−ピリジル基である。後者は［ｌＴＴで急速 に除去されて生成物を豊富に生成し、チオール基の数の容易な定量を可能とする 。　５ＡＴＡは炭水化物をヨードアセチル化するとき選択する試薬であることが できる。なぜなら、チオール脱保護試薬のヒドロキシルアミンは適合性であるか らである。炭水化物をマレイミドで誘導し、そして脱保護試薬を接合の前に除去 しなくてはならないとき、５ＰＤＰは好ましいことがある。
１〜２時間後、ＤＴおよびＴＴの溶液をＰ６［ＩＧツカラム上酢酸塩Ｉｌｌ液液 中に交換し、濃縮し、そして２０分間ジチオスレイトール（ＤＴ？）中で５０５ Ｍにした。　ＰＴ溶液を３０分間ヒドロキシルアミン中で５０ｍＭにし、次いで 、ＰＴは低いｐｔ＋で沈澱することがあるので、ＩＩ！！Ｐｕｓ　ＩＩ衝液液平 衡化したＰ６ＤＧカラム上で脱塩した。チオール化トキソイドをセントリコン３ ０で濃縮した。千オール／トキソイドのモル比はＤＴについて６．５であり、そ してＴＴについて４．７であった。それはＰＴについて決定しなかった。
Ｂ、−次担体の調製 高分子量のインフルエンザ菌す型の炭水化物（ポリリボシルリビトールホスフェ ート＝ＰＲＰ）を臭化シアン法を使用してアジピン酸ジヒドラジドで誘導しくＰ ＲＰ−ＡＰ）次いでゲル濾過により大きさで分画した。　（Ｃｒｕｓｅ　Ｊ、　 Ｍ、＋　Ｌｅｗｊｓ　Ｒ，Ｅ、　Ｊｒ、ｌｉ、　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｖａｃｃ ｉｎｅｓｉｎ　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１０＋１９８９）　、最終生成物は ３００　ｋＤａみら平均分子量およびほぼ１６ヒドラジドｉ／３００　ｋＤａの 炭水化物を有した。　ＰＩＩＰ−＾Ｈは、マサチュセッツ・パブリック・ヘルス ・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｐｕｂｌｉ ｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＭＰ ＨＢＬ）、ボストン、マサチュセッツ州、から提供された。
ＰＲＰ−ＡＨを次の方法に従いさらに誘導した。より高い濃度の架橋剤および／ またはより長いインキエベーシッン時間を使用して、ＡＥＣＭ−デキストランの アミノ部分のそれと比較して、減少したヒドラジド基の反応性を補償した。
大部分の調製物について、ＰＩＩＰ−八Ｈをヨードアセイル比（ＳＩＡＰを使用 する）の代わりに試薬ＧＭＢＳ　（カルビオケム）でマレイル化することによっ てチオール反応性とした。なぜなら、マレイミド濃度は３０４０−におけるその 吸収から容易決定することができるからである（吸光係数−６２０Ｍ−’　（Ｋ ｉｔａｇａｗａ、　Ｔ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９４　：　１１６０（１ ９８３））　、さらに、マレイミド基は（１）ヨードアセチル基よりいっそう反 応性であり、反応時間をより短（し、そして（２）加水分解しそしてそれゆえ必 然的にメルカプトエタノールによるクエンチングを必要としない、チオール感受 性タンパク質についての１つの利点。マレイミド基の欠点は比較的かさ高いこと であり、これは追加のエピトープを導入することがあり、そして加水分解が活性 基の数を減少することであり、これは架橋の程度を減少する。しかしながら、特 定の試薬および条件を選択して安定性改良した（例えば、アルキルマレイミド、 高い試薬濃度および短い反応時間およびｐＨ５の脱塩工程）、また、デキストラ ンの接合体とともに使用したように、ヨードアセチル化試薬を使用してＰＲＰ− ＡＨを調製した。
マレイミド−ＰＲＰの１例は次の通りである。４０μｌのマレイミド試薬ＧＭＢ Ｓ　ＣＤＭＦ中の０．１　Ｍ）　（カルビオケム）を、１５７μｌ　ＩＩＢＰＥ Ｓ緩衝液中の’１ｍｇのＰＲＰ−ＡＨの撹拌した溶液に添加した（最終濃度＝７ ５１０ＥＰＥＳ、１＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．０２％アジド、ｐｌ＋７．５）、 室温において２時間後、この溶液を酢酸塩緩衝液（１０＠Ｍ　酢酸ナトリウム、 ０．ＩＭＮａＣｌ、２ｓＭ　ＥＤＴＡ、　０．０２％アジ化ナトリウム）と平衡 化したＰ６ＤＧ（バイオラド）で脱塩し、そして空隙体積をセントリコン３０（ アミコン）で０．４７ｍ１に濃縮した。　３０４　ｎｓにおける６２０　Ｍ−’ の吸光係数を使用して、マレイミドの濃度は２２５　μＭであると推定された。
残留ヒドラジド含量はＴＮＢＳアッセイ（吸光係数＝１７４００　Ｍ−１，４９ ８ｎｍにおいて、ヒドラジドについて）を使用して４μＭより少ないと推定され た。こうして、誘導は本質的に完結したと判定された。百日咳トキソイドを有す る接合体の調製において、誘導されたＰＲＰを酢酸塩緩衝液の代わりにＨＥＰＥ Ｓ　１１街液Ｐ）１７．５と平衡化されたカラムで脱塩した。
Ｃ０ＰＲＰへの二次担体の接合 チオール化ＤＴおよびＴＴを窒素雰囲気下に脱酸素したＰＲＰ−マレイミドの撹 拌した溶液に添加し、そして１／９体積の−ｆｉ）ＩＥＰＥＳ　ｇ液液の添加に よりｐｉ（を上昇させ、そして室温において一夜した。チオール化ＰＴをＰＩＩ Ｐ−マレイミドの撹拌した溶液に添加し、そして４℃において一夜放置した。− 夜反応させた後、この溶液を１時間０．２　ｍＭのメルカプトエタノールとしく 加水分解しないマレイミドを完全に除去し）次いで１０■Ｈのヨードアセトアミ ドの中に１０分間放置した（すべての遊離のチオールを消費した）、溶液を５３ ００５Ｆまたは５４００ＳＦカラムのゲル濾過により分画して、接合しないＰＲ Ｐおよびトキソイドを除去した。高分子量の接合体をセントリコン３０で：ａ縮 し、そして滅菌濾過した。
第２０図に記載するように、ジフテリアトキソイドは非常に首尾よく高分子量の ＰＲＰとの接合体に変換した。７より少ないアミノ基がトキソイド上で修飾され たことが推定される。
最終生成物の組成は次の通りであった：トキソイド　キソイド／ＰＲＰ（モル） 　トキソイドＰＲＰ　＝３００　ｋＤａ）　−」ｊｈＬ−ＤＴ　４．５　０．８ ＰＴ　５．４　２．９ ＴＴ　３．９　１．９ これらのデータ、とくに重量／重量の測定値は接合の成功を証明している。
この方法は、（１）化学の詳細、とくにチオ−エーテル結合の使用および（２） 高分子量のＰＲＰの使用、（３）クロマトグラフィーにより精製したトキソイド の使用および（４）とくにアクセルラー（ａｃｃｅｌｌｕｌａｒ）百日咳トキソ イドの使用において、他の既知の接合と異なるとわれわれは信する。
本発明の他の態様は、この明細書およびここに開示した本発明の寞施を考慮する と当業者にとって明らかであろう、明細書および実施例は例示として考慮され、 本発明の真の範囲および精神は次の請求の範囲により示されることを意図する。
二重担体ワクチンのモテル 浄書（内容に変更なしン 古典的抗原構成体 １．７細胞依存性（ＴＤ） ！夏、Ｔ細胞独立性（ＴＩ） ＢＳＡ−Ｄｅｘに対する投与量の応答 １、オバルブミンーＤＥＸ　３６４ ２．θラクトグロブリンＢ−ＤＥＸ　３３７３、リゾチーム−ＤＥＸ　１６６６ ４、アプロチニン−ＤＥＸ　２６１ ５、ワクシニア−ＤＥＸ　１２．Ｂｏ。
６、コレラトキシン　７９４ ７、コレラトキシン−ＤＥＸ　１２，４３３８、破傷風トキソイド−ＤＥＸ　１ ，７６１ハブテン化ＢＳＡに対する応答 抗ペプチドの応答 Ｆｉｇ、５ デキストランの多数の抗原 （（ＴＮＰ−〇ＶＡ）　＋　ＬＹＳ）−ＤＥＸＦｉｇ、７ ハブテン化ＢＳＡ−Ｄｅｘのブースティング■　ＴＮＰ−ＢＳＡ ＢＳＡでブースティングしたＢＳＡ−Ｄｅｗの反応速度論抗体の応答はデキスト ラン担体の認識に依存しないＦｉｇ、１０ ＢＳＡ−Ｄｅｘは子供のマウスにおいて免疫原性であるＦｉｇ、１１ デキストラン担体の分子量 モノ　７０Ｋ　４００Ｋ　２０００に デキストランの分子！ 注射のモード 多数の担体のワクチン構成体 Ｆｉｇ、ｉ４ 百日咳トキソイド−デキストラン接合体Ｆｉｇ、１５ 調製物　を貸与量　２週　４週　８週 −一一一―■−ｄ−曙−一一一一吻一―　■−−−響破傷風トキソイド流体　Ｌ 　）３　ユ　ｇＧ、＆　３Ｓ、＊破傷風デキスト流体　４．５　２４１　Ｚ８． ３破傷風トキソイドＡＩＰＯ１ｕｏ、ｚ　！７Ｌ２　ｍ、。
破傷風デキスＡＩＰＯｙｙ、ｇ　ｉう１１　Ｌ３０．１４に傷風ト１′ノイド流 体　◇、Ｌ　Ｌ６　１９破傷Ｂλデキスト流体　。、ｌ　ＩＪ　ＩＬＪ　１３　 畠破傷風トキソイドへＩＰＯＯ，Ｌ　ｎ、＆　Ｄ、。　９＆　畠破傷風テキスト ＡＩＰＤ　０．１　＆ｏ、＞　ｕｊ、ａ　＊ｅ、。
生理食塩水対照　（Ｑ、ｅ＆　ｚｏ、Ｏａ　４６．Ｏａ３　ジフテリアトキソイ ド−テキストラン接合体調製物　を貸与量　２週　４週、　８週岬−ａｉｌ　− ―−一　−一―−一　−一一―ジフテリアＤＣＰ−５２流体　Ｗ　（０，Ｌ　Ｏ ，！　Ｌ３ジ万り？−デキスＪ　体１１１　コ・２　１１・Ｓ　１コ・７ジ万り ＰＤＣＰ−５２ＡＩＰＯＩＱ　ｌｓ、ｏ　−ｚ、＊　ｕｏ、。
う万りＰ−７キス流体　１０　５Ｇ、＆　Ｌ＆Ｏ，ＯＬ５０．０う万りＰＤＣＰ −５２流体　Ｌ　ｃｏ、ｌ　（０，１＜６．１ラフテリＰ−デキス流体　Ｌ、ｌ 　３　コ　ａｌう万りＰＤＣＰ−５２ＡＩＰ０　１　ｑ、ｖ　３Ｍ、１　３＊、 ＊シフテリＰ−デキスＡ　Ｉ　ＰＯｘｙ、、ｘ　ｙｚ、ａ　□１．。
；　百日咳トキソイド−デキストラン接合体投与量　２週　４遇　８週 調製物　、−ｍ− 百日咳ブー託、流体　２　０．Ｉ　Ｌ！　１．＆°百日咳１キλ流体　−１７１ １０４’７百日咳ブーｋｃ、　ＡＩＰＯ１２Ｌ＋　ｕｓ、ｓ　１０６．０ブール ープキスＡＩＰＯａＬ　＆ｓ、ｚ　１３ｇ、０対照＜ＯＪ＆４（１，０＆＜ｅ、 ｏｔ ・１５匹のＣＤ−１雌４週齢マウスの名工２′　クロマトグラフィー精製した破 傷風トキソイドの口・ントＣＰ−４９Ｆｉｇ、　１９ａ ジフテリアトキソイドＰＲＰ接合体 Ｆｉｇ、２０ 手続補正書（方式） 平成り年８月１９日

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. １．少なくとも１種の７０ＫＤの分子量より大きい高分子量の分子からなる一次 担体、および 一次担体に接合したＴ依存性抗原からなる少なくとも１種の二次担体、からなる 二重担体の免疫原性構成体。
  2. ２．構成体の免疫原性が少なくとも１種の担体単独より大きい、請求の範囲１記 載の二重担体の免疫原性構成体。
  3. ３．少なくとも１種の一次担体の分子量が４００ＫＤａより大きい、請求の範囲 １記載の二重担体の免疫原性構成体。
  4. ４．少なくとも１種の一次担体の分子量が２０００ＫＤａより大きい、請求の範 囲１記載の二重担体の免疫原性構成体。
  5. ５．少なくとも１種の一次担体がＴ独立性抗原である、請求の範囲１記載の二重 担体の免疫原性構成体。
  6. ６．少なくとも１種の一次担体が、デキスラン、フィコール、ポリアクリルアミ ド、微生物の多糖類、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請 求の範囲１記載の二重担体の免疫原性構成体。
  7. ７．少なくとも１種の一次担体がデキスランである、請求の範囲６記載の二重担 体の免疫原性構成体。
  8. ８．少なくとも１種の一次担体がフィコールである、請求の範囲６記載の二重担 体の免疫原性構成体。
  9. ９．少なくとも１種の一次担体がポリアクリルアミドである、請求の範囲６記載 の二重担体の免疫原性構成体。
  10. １０．少なくとも１種の二次担体がタンパク質である、請求の範囲５記載の二重 担体の免疫原性構成体。
  11. １１．タンパク質がウイルス、細菌、寄生生物、動物および真菌のタンパク質か ら成る群より選択される、請求の範囲１０記載の二重担体の免疫原性構成体。
  12. １２．タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソ イド、細菌外膜タンパク質、ウイルス外膜タンパク質、およびそれらの組み合わ せから成る群より選択される、請求の範囲１０記載の二重担体の免疫原性構成体 。
  13. １３．少なくとも１種の一次担体が複数の二次担体に接合されている、請求の範 囲１記載の二重担体の免疫原性構成体。
  14. １４．さらにアジュバントを含む、請求の範囲１記載の二重担体の免疫原性構成 体。
  15. １５．少なくとも１種の請求の範囲１記載の二重担体の免疫原性構成体、および 製剤学的に許容されうる担体、 からなるワクチン。
  16. １６．患者に免疫刺激量の請求の範囲１５記載のワクチンを投与することからな る、患者を処置する方法。
  17. １７．ワクチンを静脈内、筋肉内、または皮下に投与する、請求の範囲１６記載 の方法。
  18. １８．ステップ： 宿主を請求の範囲１５記載のワクチンで免疫化して免疫原に対して向けられた抗 体を生産し、そして ドナーから抗体またはＢ細胞を単離する、からなる、細菌、リケッチア、ウイル ス、寄生生物、真菌または化学物質により引き起こされる疾患に対する抗体を生 産する方法。
  19. １９．請求の範囲１８記載の方法により生産された抗体からなる免疫治療用組成 物。
  20. ２０．Ｂ細胞を使用してモノクローナル抗体を生産する、請求の範囲１８記載の 方法。
  21. ２１．治療的に有効量の請求の範囲１９記載の免疫治療用組成物を患者に投与す ることからなる、患者を治療する方法。
  22. ２２．少なくとも１種の７０ＫＤの分子量より大きい高分子量の分子からなる一 次担体、 前記一次担体に接合したＴ依存性抗原からなる少なくとも１種の二次担体、およ び 一次担体または二次担体のいずれかに接合されたハプテン、抗原、およびそれら の組み合わせから成る群より選択される少なくとも１種の部分、 からなる二重担体の免疫原性構成体。
  23. ２３．接合された部分の免疫原性が接合されない部分より大きい、請求の範囲２ ２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  24. ２４．少なくとも１種の一次担体の分子量が４００ＫＤａより大きい、請求の範 囲２２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  25. ２５．少なくとも１種の一次担体の分子量が２０００ＫＤａより大きい、請求の 範囲２２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  26. ２６．少なくとも１種の一次担体がＴ独立性抗原である、請求の範囲２２記載の 二重担体の免疫原性構成体。
  27. ２７．少なくとも１種の一次担体が、デキスラン、フィコール、ポリアクリルア ミド、微生物の多糖類、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、 請求の範囲２２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  28. ２８．少なくとも１種の一次担体がデキスランである、請求の範囲２７記載の二 重担体の免疫原性構成体。
  29. ２９．少なくとも１種の一次担体がフィコールである、請求の範囲２７記載の二 重担体の免疫原性構成体。
  30. ３０．少なくとも１重の一次担体がポリアクリルアミドである、請求の範囲２７ 記載の二重担体の免疫原性構成体。
  31. ３１．少なくとも１種の二次担体がタンパク質である、請求の範囲２２記載の二 重担体の免疫原性構成体。
  32. ３２．タンパク質がウイルス、細菌、寄生生物、動物および真菌のタンパク質か ら成る群より選択される、請求の範囲３１記載の二重担体の免疫原性構成体。
  33. ３３．タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソ イド、細菌外膜タンパク質、ウイルス外膜タンパク質、およびそれらの組み合わ せから成る群より選択される、請求の範囲３１記載の二重担体の免疫原性構成体 。
  34. ３４．少なくとも１種の部分が一次担体にカップリングされている、請求の範囲 ２２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  35. ３５．少なくとも１種の部分が二次担体にカップリングされている、請求の範囲 ２２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  36. ３６．少なくとも１種の一次担体が複数の二次担体に接合されている、請求の範 囲２２記載の二重担体の免疫原性構成体。
  37. ３７．一次担体に接合された少なくとも１種の二次担体が少なくとも１種のハプ テンにさらに接合されている、請求の範囲２２記載の二重担体の免疫原性構成体 。
  38. ３８．さらにアジュバントを含む、請求の範囲２２記載の二重担体の免疫原性構 成体。
  39. ３９．少なくとも１種の請求の範囲２２記載の二重担体の免疫原性構成体、およ び 製剤学的に許容されうる担体、 からなるワクチン。
  40. ４０．患者に免疫刺激量の請求の範囲３９記載のワクチンを投与することからな る、患者を処置する方法。
  41. ４１．ワクチンを静脈内、筋肉内、または皮下に投与する、請求の範囲４０記載 の方法。
  42. ４２．ステップ： 宿主を請求の範囲３９記載のワクチンで免疫化して免疫原に対して向けられた抗 体を生産し、そして ドナーから抗体またはＢ細胞を単離する、からなる、細菌、リケッチア、ウイル ス、寄生生物、真菌または化学物質により引き起こされる疾患に対する抗体を生 産する方法。
  43. ４３．請求の範囲４２記載の方法により生産された抗体からなる免疫治療用組成 物。
  44. ４４．Ｂ細胞を使用してモノクローナル抗体を生産する、請求の範囲４２記載の 方法。
  45. ４５．治療的に有効量の請求の範囲４３記載の免疫治療用組成物を患者に投与す ることからなる、患者を治療する方法。
  46. ４６．請求の範囲４２記載の方法により生産された抗体からなる診断試薬。
  47. ４７．請求の範囲４２記載の方法により生産された抗体からなる研究試薬。
  48. ４８．各担体の免疫原性が他の担体へのその接合により増強されている、請求の 範囲１記載の二重担体の免疫原性構成体。
  49. ４９．各担体の免疫原性が他の担体へのその接合により増強されており、そして 前記部分の免疫原性が担体へのその接合により増強されている、請求の範囲２２ 記載の二重担体の免疫原性構成体。
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