JPH07506842A

JPH07506842A - 二本鎖を有する非毒性リボソーム不活性化蛋白（ｒｉｐ），その製法および適用

Info

Publication number: JPH07506842A
Application number: JP6519616A
Authority: JP
Inventors: ヒルベス・フアン，トマス; フェレーラス・ロドリゲス，ホセ・ミゲル; イグレシアス・アルバレス，ロサリオ; シトレス・ゴンサレス，ルシア; アリアス・バジェホ，フランシスコ・ハビエル; ロホ・ロドリゲス，マリア・アンヘレス; ムニョス・マルティネス，ラケル; ヒメネス・ロペス，ピラル; マルティネス・デ・ベニート，フェルナンド
Original assignee: Universidad de Valladolid
Current assignee: Universidad de Valladolid
Priority date: 1993-03-02
Filing date: 1994-03-02
Publication date: 1995-07-27
Also published as: EP0652231A1; JP2004113252A; WO1994020540A1; US6008324A; AU6208494A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】二本鎖を有する非毒性リポソーム不活性化蛋白（ＲＩ　Ｐ）、その製法および適用発明の技術分野本発明は、リボ核酸を不活性化することにより、リポソームが機能するのを触媒的に妨げるリポソーム−不活性化蛋白（ＲＩ　Ｐ）の技術分野に関する。

さらに詳細には、本発明は、癌の治療および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に潜在的に用いられる非毒性の新規な２水銀ＲＩＰに関する。

本発明の先行技術植物界においては、真核生物由来の系で蛋白生合成阻害活性を含有し、蛋白型のものであって、正確な生化学的な解明が待たれているいくつかの種があるが、それはりボソームー不活性化蛋白（ＲＩ　Ｐ）として知られている（ガスベリーカンパニ（Ｇａｓｐｅｒｉ−Ｃａｍｐａｎｉ）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　１ｏｃｈｅ＠、　Ｊ　、　）、！１旦兵員、４３９−４４１頁（１９８０年）；ガスペリ（Ｇａｓｐｅｒｉ）ら、ジャーナル・オブ・ナチュラル・プロダクツ（Ｊ　、　Ｎａｔ、　Ｐ　ｒｏｄ、　）、第４８巻、４４６−４５４（１９８５年）：フェレシス（Ｆ　ｅｒｒｅｒａｓ）ら、セルラー・アンド・モレキュラー・パイモレキュラー・バイオロジー（Ｃｅ１１．Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、第３８巻：８０３−８１２頁（１９９２年）；ントレス（Ｃｉｔｏｒｅｓ）ら、セルラー・アンド・モレキュラー・／くイオロジ−（Ｃｅ１１．Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、第３９巻、８８５−９９５頁（１９９３年）、スチルペ（Ｓ　ｔｉｒｐｅ）ら、バイオテクノロジー（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１０巻、４０５−４１２頁（１９９２年）、／トレス（Ｃｉｔｏｒｅｓ）ら、エフ・ビイ・ビイ・ニス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、３２９巻、５６−６２頁（１９９３年））。これらの蛋白は、１本のポリペプチド鎖（１型）、２本のポリペプチド鎖（２型）または４本のポリペプチド鎖（４型）を有しつる（ントレス（Ｃｉｔｏｒｅｓ）ら、エフ・ビイ・ビイ・ニス・レターｒ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、第３２９巻、５９−６２頁（１９９３年））。１本鎖のポリペプチドの蛋白は、リポソームリボ核酸Ｎ−グルコシダーゼである（スチルペ（Ｓ　ｔｉｒｐｅ）ら、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、第１６巻、１３４９−１３５７頁（１９８８年））一方、２本鎖の蛋白は、通常ガラクトース残基およびその誘導体を認識する、リポソームリポ核酸Ｎ− グルコシダーゼ（Ａ鎖）２組の（各々の１組が２型分子に相当する）Ａ−Ｂ型二量体により形成されている０００および３４０００の間の分子量（Ｍｒ）を有する。Ａ鎖は、リボ核酸を不活性化させることによりリポソームが機能するのを触媒的に妨げる（ジメネズ（１９８５年）、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびセリトレンニコフ（Ｓ　ｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ）、１１８６頁（１９９３年））。該不活性化は、リポソームの大きい方のｒＲＮＡのアデノノンを遊離させることからなる（エンド−（Ｅｎｄｏ）およびツルギ（Ｔｓｕｒｕｇｉ）、アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、第１６巻、１３４９ −１３５７頁（１９８８年）：ギルベス（Ｇｉｒｂｅｓ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、第１７５巻、６７２１−６７２４頁、イグレシアス（Ｉ　ｇｌｅｓｉａｓ）レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、第３１８巻、１８９−１９２頁（１９９３年））。これらのトキシンを産生ずる植物におけるこれらの生物学的な役割は、全般的には知られていない（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびセリトンレニコフ（Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ）、バイオサイエンス・リボーツ（Ｂ　１ｏｓｃ、　Ｒｅｐ、　）、！旦拳、１９”２９頁（１９８６年））。

特に、該トキシンが同じ植物ファミリーに属する場合はそれらがいくっがのＮ− 末端アミノ酸配列の相同性を有するにもかかわらず、これらの蛋白は免疫学的にも化学的にも互いに異なっている（モンテキューチ（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｈｉ）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・プロティン・リサーチ（Ｉ　ｎｔ、　Ｊ　、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　）、第３３巻、２６３−２６７頁（１９８９年）；アリアス（Ａｒｉａｓ）ら、プランタ（Ｐ　１ａｎｔａ）、第１８６巻、５３２−５４０頁（１９オブ・イムノロノー（ＡｎｎｕＲｅｖ、Ｉ關ｕｎｏ１．　）、＠　３１Ｊ、１９７−２１２頁（１９８５年）、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）ら、アニュアル・レビュー・オブ・メディンン（Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、　）、第３７巻、１２５−１４２頁（１９８６年）：コッペル（Ｋｏｐｐｅｌ）、ｚ＜イオコンジュ・ケム（シ圧Ｏｎｊｃｈｅｍ、　）、ｊｆｔ＜　１　％、１３−２３頁（１９９０年）：ロード（Ｌｏｒｄ）、プラント・フィノオロジ−（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）、声」−ジさ、１−３頁（１，９８７年））および後天性免疫不全症候群（チル（Ｔｊｌｌ）ら、芯工玉２３（旦９ド繋）、！ノＡり１．１１６６−１１６８頁（１９８８年）；ゲーテイエ（Ｇｈｅｔｉｅ）ら、び−イオコンノユ・ケム（Ｂｉｏｃｏｎｊ、　Ｃｈｅｍ、）、＄１１’、２４−３１頁（１９９１年）、カーフ（Ｋａｈｎ）ら、ｘ４ｒ（Δ±ＤＳ）Ｊｉ、１１９７−１２０４頁（１９９３年）、ビアーズ（Ｂａｙｅｒｓ）ら、玉工〆（Δ上ＤＳ）、！」％、１１８９− １−１９６頁（１９９２年））治療用のイムノトキシンの構築におけるリポソーム−不活性化蛋白の使用について多大な関心が集められている。

ごく最近には、この（ＲＩ　Ｐ）ファミリーのうち少な（とも４つの蛋白が、それ自体で、後天性免疫不全症候群の病因であるＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡウィルスを活性化２型のＲＩＰおよび特にリジンも抗腫瘍活性を示す（バービエリ（Ｂ　ａｒｂｉｅｒｉ）およびスチルベ（Ｓ　ｔｉｒｐｅ）、キャンサー・サーベイズ（Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖ、）、！１拳、４８９−５２０頁（１９８２年））。

しかしながら、毒性の１本鎖のＲＩＰまたは毒性の２水銀ＲＩＰの使用は、以下の節に記載するごとく重要な利点を包含する：特に、本発明の「非毒性２本鎖ＲＩＰＪの発見に至るまで存在していた２本鎖のＲＩＰは、（スチルペ（Ｓｔｉｒｐｅ）ら、（バイオテクノロジー（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１０巻、４０５−４１２頁（１９９２年））に改定されている：リシン、アブリン（ａｂｒｉｎ）、ポルケンシン（ｖｏｌｋｅｎｓｉｎ）、ビスクミン（ν１ｓｃｕ＋ｍ１ｎ）およびモデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）である。この５種の蛋白は、極めて毒性が高いため、イムノトキシンおよび免疫複合体の構築に用いると、その実践的な治療に用いることが大変困難な高い毒性の化学種になりかねない。

この毒性を減じる１の方法は、これらの蛋白、一般的にはりシンとで形成されたイムノトキシンをラクトースと共に投与し、かくしてイムノトキシン中の（例えば、リジンのような）毒性蛋白部分に起因する非特異的な毒性を減じることである。ラクトースでブロックしたりシンおよび標的細胞の抗原に対する抗体とで形成されたイムノドキーシンの毒性は、イムノトキシンの抗体部と抗原との相互作用およびそれに続（該イムノドキノンの該細胞の内部への移動のみに起因するクミンからの非特異的毒性を評価するために、部位特異的突然変異あるいは該リジンのＡ鎖または他の毒性ＲＩＰのみとでイムノトキシンを形成することによってリジンが一部化学的に活性化されている。これらの全ての別法では、その結果、問題とするりシンまたは毒性ＲＩＰの活性が部分的に喪失されている（ブラットラー（Ｂｌａｔｔｌｃｒ）ら、暫−ンサー・セ４Ｌ＝ｒ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ）、惠↓應、５０−５５頁（１９８９年乃。公表された最も最近の方法は、リジンを修飾する最も良い方法は、完全なＡ−８９７２分子を用いて該クミンのＢ鎖とＤ−ガラクトースとの相しかしながら、該標的細胞の蛋白合成に際しＡ鎖の活性を顕著に減じるため溶液１本鎖のＲＴＰに関しては、毒性の２本鎖のＲＩＰよりは毒性が低いとしても、そのうちほとんどは、治療に適した血漿濃度を達するに必要であろう用量では温合には、それらは流体エンドサイトーシスにより、肝臓または腎臓によってかなり容易に捕捉され得る。一方、１本鎖のＲＩＰは、マクロファージ（バーバリエ１８４頁（１９７９年））に対して毒性である。

前記に引用した不都合な点に比して、本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰは、驚くべき蛋白合成阻害活性を維持しつつ、自発的には細胞内に入れないという利点を有する。言い換えれば、リジンおよび他の毒性２本鎖ＲＩＰに関して生化学者および分子生物学者が試みた非毒性２本鎖ＲＩＰに関し自然はすでに行っていたのである。従って、それらを多用量で用いても、リジンまたは他の毒性２本鎖ＲＩＰとの複合体が有するような危険は現れない。もう１つのさらなる利点は、非毒性２本鎖ＲＩＰとで形成させたし、イムノ！・キノンを用いると、ＲＩＰおよび抗体を維持する結合（類）を切断し、それに続いて非毒性ＲＩＰが放出されても、リジンの遊離が起こるのに比して危険がない。

蛋白が強力な免疫原性物質であるとすると、それでもっていかなるタイプの治療も可能とするためには、一方では最も低い免疫反応性のものを選択し、他方ではトキノンまたはイムノドキノンの毒性部分を患者において中性抗体が発生するものとして置き換えることができるという目的にて、該トキシンの最も広い可能な組合せを有する必要がある。

発明の詳細な説明まさに標題に示したごとく、本発明は、新規の２本鎖リボゾーム不活性化蛋白（ＲＩ　Ｐ）ないしその製法および使用に関する。

記載の蛋白は新規の蛋白型植物トキシンであり、その物理化学的および生化学的性質に基づくと２型または２本鎖型植物リポゾーム不活性化蛋白（ＲＩＰ）に分類され、１．６ｍｇ／ｋｇ体重の用量で体重３０ｇのスイス・ラット（Ｓｗｉｓｓ　ｒａｔ）に注射しても無毒であることが特徴である。

前記した先行技術に比する本発明の新規性は、前記したりシン、アブリン、ボケンシン、ビスクミンおよびモデシンの毒性の２水銀ＲＩＰを得ることに通じる毒性の植物を用いる代わりに、無毒な植物を用いて該２本鎖ＲＸＰを用いる点にある。

本発明の無毒の新規細胞外蛋白は、２の鎖、言い換えれば、特に哺乳動物リポソーム２８Ｓにリボ核酸Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するリポソームリボ核酸Ｎ− グリコンダーゼ活性を有するリポソームＡ鎖と、レクチン活性を有するＢ鎖とがジスルフィド結合により結合したもので：該新規の蛋白は、標的細胞にある膜受容体に認識される（抗体、ホルモンまたは他の蛋白のような）キャリアー分子に結合し、標的細胞の該リボ核酸の不活性化により該標的細胞上における鎖Ａの特異的かつ選択的な作用が可能で、正確にはその細胞外毒性の欠乏に起因する、キャリアー分子により選択されない細胞上の該ＲＩＰの無差別な攻撃を実質的に回避することにより特徴付けられる。

本発明のかかるよう定義される蛋白は、リボ核酸と触媒的に相互作用することができ、無細胞系の蛋白合成阻害を起こす。それらの阻害活性は、蛋白生合成の非蛋白抗生物質より非常に高い（モレキュラー・メカニズムズ・オブ・プロティン・バイオンンセシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、エイチ、バイスバッハ（Ｈ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびニス、ベスト力（Ｓ、　Ｐｅ５ｔｋａ）編、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）中の：ペスト力、ニス（Ｐ　ｅｓｔｋａ、　Ｓ　）ら（１９７７年）、インヒビターズ・オブ・プロティン・シンセンス（Ｉ　ｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、４６８−５５３頁）。

加えて、該蛋白は、リポソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）のＮ−グリコシダーゼ活性およびヒト赤血球細胞凝集素能を有する。

蛋白生合成阻害剤としての強力な能力およびそのリボ核酸に対する効果は、例えばＰＡＰ（ヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（ｐｏｋｅｖｅｅｄ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ））で示されイチアイブイートアクティビティ−（ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉ−ＨＩ　Ｖ−１ａｃｔｉｖｉｔｙ）、ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４７巻、９２−９５頁（１９９０年））、これらの蛋白を極めて有用なものとする。

本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰの最も重要な用途は、：トキノリに感受性のリポソームのイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）不活性化剤として、イン・ビトロ哺乳動物リポソームリポ核酸不活性化剤として、イン・ビトロ系における蛋白生合成の阻害剤として、細胞および組織における特異的なレセプターとは対照的にモノクローナル抗体に結合した該細胞および組織における蛋白生合成の阻害剤として、ならびに、ＲＮＡウィルス、特にヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすＨＩＶに対する抗ウィルス剤としてである。

同様に、真核生物のリポソームのイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）不活性化による蛋白生合成阻害の目的で、他の化学種との複合体を阻害該蛋白から構築することもできる。これらのラインに沿い、非毒性２本鎖ＲＩＰが試験した系のほとんど全てにおいて完全なりシンよりも無細胞系において高い蛋白合成阻害活性を有しくギル養細胞または３０ｇスイス・ラットに１．５ｍｇ／ｋｇ体重の濃度でそれらを投与するのが無毒であれば（ギルベス（Ｇｉｒｂｅｓ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＣｈｅＩｌｉｓｔｒｙ）、第２６８巻、１８１９５−１８１９９頁（１９９３年）；ギルベス（Ｇｉｒｂｅｓ）ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２２巻、１１８１−１１８６頁（１９９３年））、細胞の内部に適当に輸送されると、リジンのそれよりも効果は大きいであろう。蛋白の細胞内への輸送は、当該細胞表面の特異的な受容体により認識され、内部に取り込まれ得る抗体、ホルモンまたは他の蛋白のごとき適当な担体にそれらを結合させることにより達成される（スチルベ（Ｓ　ｔｊ、ｒｐｃ）ら、ゴオテクノロジー（ル里匹肪司凹α）、第１０巻、４０５−４１２頁（１９９２年）：本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰは、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウィルス（ＲＮＡウィルス）により引き起こされ持続される疾病において、リボ核酸（のイン・ビポ増殖および単離された無傷細胞における）機能を阻害するのに用いることもできる。

最後に、遊離のまたは他の化学種と結合させた形態の該蛋白は、ヒトおよび実験動物において特異的な標的細胞を不活性化するのに用いることもできる。

従って、本発明の該非毒性２本鎖ＲＩＰは、癌治療およびＡＩＤＳに潜在的に有用である。

本発明の該非毒性２本鎖ＲＩＰを得る一般的な工程は、非毒性植物から対応する部分を塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムで抽出し、（ｉ）蛋白合成を阻害でき、（ｉｌ）ヒト赤血球凝集素能を有する抽出物を得る第一の操作に続き、該抽出物を濃縮し、およびそれをイオン交換および／またはアフィニティーまたは分子排除クロマトグラフィー技術によって精製することを包含する該非毒性植物から該物質を単離することよりなる。

ところで、本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰの一般的範囲内で、２つの型、すなわち、酸性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰと、塩基性タイプの２末鎖ＲＩＰとを区別できる。従って、同トキシンを単離する工程には、前記の一般的なスキームに従いはするが、該酸性または塩基性の分子に基本的に起因するある種の修飾もある。

前記したことにより、本発明の酸性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰを得る工程は以下の操作・ａ）非毒性植物またはその一部分を選択し：ｂ）塩化ナトリウムおよびリン酸− ナトリウムで該植物の蛋白抽出物を得。

Ｃ）かく得られた抽出物から、以下の２つの要件（１）ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白合成を阻害できること：かっ（ｉｔ）赤血球凝集素能を有する；に沿う抽出物を選択し、ｄ）２つの要件に沿う抽出物を、酸処理したセファロース６　Ｂ　（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）上のアフィニティークロマトグラフィーに付して、Ｄ−ガラクトースまたはラクトースで溶出し。

ｅ）前段階の蛋白ピーク物を分子排除クロマトグラフィーに付し：ｆ）レクチンおよび非毒性２本鎖ＲＩＰを含有する蛋白ピーク物を得て。

ｇ）各々のピークの蛋白合成阻害を分析し：ｈ）蛋白合成を阻害するピークを選択することよりなる。

本発明の該塩基性タイプの２水銀ＲＩＦ’を得る工程は、以下の操作・ａ）非毒性植物またはその一部分を選択し：ｂ）塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムで該植物の蛋白抽出物を得て：Ｃ）かく得られた抽出物から、以下の２つの要件（ｉ）ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白合成を阻害できること：および（Ｕ）赤血球凝集素能を有する：に沿う抽出物を選択し：ｄ）該抽出物の塩基性蛋白をＳ−セファロースＦＦ上にイオン交換クロマトグラフィーに付し：次いで、塩化ナトリウムで溶出し：ｅ）前段階で得た蛋白ピーク物を透析し：ｆ）該透析物をＣＭ−セファロースＦＦ上の第２のイオン交換クロマトグラフィーに付し：ｇ）蛋白合成を阻害する前段階のピーク物を選択し、次いで、同選択したピーク物をアミコン（ＡＭＩＣＯＮ）で濃縮し；ｈ）前段階の生成物をハイ−ロード・スーパーデツクス（Ｈｉ−Ｌｏａｄ　５ｕｐｅｒｄｅｘ）７５を配したＦＰＬＣ器具上に分子排除クロマトグラフィーに付して塩基性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰを得ることよりなる。

本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰのうち、サムブカス（Ｓ　ａｍｂｕｃｕｓ）属の植物から単離されたものは特に言及する価値がある。

さらに詳細には、酸性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰの中には以下のもの力（挙げられる・一すムブカス・ニグラ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、）の樹皮から単離されたニグリンｂ　（ｎｉｇｒｉｎ　ｂ）　；および−サムブカス・エブルス・エル、（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｅｂｕｌｕｓ　Ｌ、）の葉から単離された工包含される：一すムブカス・ニグラ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、）の葉から単離された塩基性ニグリン１．および一すムブカス・ラセモサ・エル（Ｓａｃｂｕｃｕｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｌ、）の樹皮から単離されたラセモシンｂ　（ｒａｃｅｍｏｓｉｎ　ｂ）。

さらに詳細なこれらの各々の蛋白の種類および性質の分析ならびにそれらを得る工程については後記する・ニグリンｂニグリンｂは、以下の工程：ａ）ＮａＣ１およびＮａＨ，ＰＯ４の水溶液で予め摩砕したサムバカス・ニグラ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、　）の樹皮を抽出し：ｂ）得られた液状抽出物をメツツユを通して濾過し、その濾液を遠心し。

Ｃ）上清の流体をアフィニティークロマトグラフィーの工程に付し、クロマトグラフィーカラムに適用して、抽出用緩衝液で該カラムを洗浄し、ｄ）Ｄ−ガラクトースを含有する抽出用緩衝液で洗浄した該カラムを溶出し、該蛋白画分を収集し、ｅ）得られた蛋白画分を透析、凍結乾燥し、それをＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ，に予め溶解した分子排除クロマトグラフィーに付し、得られた３つの溶出ピークの２番目のものがニグリンｂに相当する：により特徴付けられる工程手段によりサムブカス・ニグラ・エル（Ｓ　ａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａＬ、）の樹皮から単離する。

この工程手段によりニグリンｂは、ドデ／ル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定して最終純度９９％の状態で得られた。

工程（Ｃ）のクロマトグラフィーは、酸、通常０．ＩＮＨｃ＋で約５０℃にて約３時間処理し、抽出用緩衝液で平衡化する（６％のアガロース・マトリックスよりなる）セファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　６　Ｂゲルで主として行う。

工程（ｅ）のクロマトグラフィーは、（アガロースおよびデキストランよりなる）ハイ−ロード・スーパーデックス（Ｈｉ−Ｌｏａｄ　５ｕｐｅｒｄｅｘ）　７５ゲルで主として行う。

かく得られたニグリンｂの相対的分子量（Ｍｒ）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、還元剤存在下にてＡ鎖につき２６．０００、Ｂ鎖につき３２．０００、その不在下には５８．０００であった。

ニグリンｂの２本のポリペプチド鎖のアミノ末端のアミノ酸配列は、アリアス第１８６巻、５３２−５４０頁（１９９２年）。得られた結果は以下の通りである：ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＬｅｕＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ −Ｂ鎖：Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｘｘｘ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　’ＴｈｒＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉ　ｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　Ｖａｌ　Ａｓｐ（Ｘｘｘ：いずれのアミノ酸であってもよいことを意味する）かく得られ特徴付けられた各々のナルギンｂが、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用されることが示された。

塩基性ニグリン１塩基性ニグリン１は、以下の工程：ａ）ＮａＣ１およびＮａＨ２ＰＯ４の水溶液でサムブカス・ニグラーｘル（Ｓ　ａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ　Ｌ、）の葉を抽出し：ｂ）得られたペーストをメツツユを通して濾過し、予め酸性にした濾液を遠心し；Ｃ）予め酸性にした得られた流体を、イオン−交換クロマトグラフィーに付し、最初に酢酸ナトリウムで、その後にリン酸−ナトリウムでカラムを洗浄し；ｄ）洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムの水溶液で溶出して蛋白画分を収集し；ｅ）該蛋白画分をリン酸−ナトリウムに対して透析し、それをイオン強度グラジェントにてイオン交換クロマトグラフィーに付し、塩基性ニグリン１を含有する両分を分離することにより特徴付けられる工程手段によりサムブカス・ニグラ・エル（Ｓ　ｕｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ　Ｌ、）の葉から抽出する。

かく得られた塩基性ニグリン１の相対分子量（Ｍｒ）は、ラエムリー（Ｌａｅｍｍｌｙ）プロセスによるポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、還元剤の不在下にて６６．０００、還元剤の存在下にてＡ鎖につき３２．０００、Ｂ鎖につき３４．０００であった。

アミ／−末端のアミノ酸配列をアリアス（Ａｒｉａｓ）らにより示されているごとくに決定した（アリアス（Ａ　ｒｉａｓ）ら、ブランク（Ｐ　１ａｎｔａ）、第１９６巻、５３２−５４０頁（１９９２年））。得られた結果は以下の通りであるニーＡ鎖・ブロックされたアミノ末端のアミノ酸 −Ｂ鎖：Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｘｘｘ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ＸＸＸ　ＸＸＸかく得られ特徴付けられた各々の塩基性ニグリン１は、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用できることがニブリン１は、以下の工程ａ）予め摩砕したサムブカス・エブルス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｅｂｕｌｕｓ　Ｌ、Ｘ葉）をＮａＣ１およびＮａＨ，ＰＯ，の水溶液で抽出し：ｂ）得られた液状抽出物をメツツユに通して濾過し、その濾液を遠心し。

Ｃ）その上演をアフィニティークロマトグラフィ一工程に付すクロマトグラフィーカラムに適用して、該カラムを抽出用緩衝液で洗浄し、ｄ）Ｄ−ガラクトースを含有する抽出用緩衝液で、該洗浄したカラムを溶出し、該蛋白画分を収集し；ｅ）該蛋白画分を濃縮し、それをＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４で平衡化したカラムの分子排除クロマトグラフィーに付して蛋白溶出ピーク物が得られ、その最後のものがニブリン１に相当する；により特徴付けられる工程手段によりサムブカス・エブルス・エル（Ｓ　ａｍｂｕｃｕｓｅｂｕｌｕｓ　Ｌ、）の植物の葉から単離する。

この工程手段により、ニブリン１は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定したところ最終純度９９％の状態で得られた。

工程（Ｃ）のクロマトグラフィーは、酸、通常０．１ＮＨＣＩで約５０℃にて約３時間処理し、抽出用緩衝液で平衡化した（６％のアガロース・マトリックスよりなる）セファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　６　Ｂゲルで主として行う。

かく得られたニブリン１の相対的分子量（Ｍｒ）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、還元剤存在下にてＡ鎖につき２６．０００、Ｂ鎖につき３０．０００、その不在下には５６．０００であった。

該鎖のアミノ末端のアミノ酸配列は、以下の通りであるニーＡ鎖二１１ｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａｌ　５　１０Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ −Ｂ鎖。

Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｘｘｘ　Ａｌａ　Ｉ　ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＰｈｅＴｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｘｘｘ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

（Ｘｘｘ：いずれのアミノ酸であってもよいことを意味する。）かく得られ特徴付けられたニブリン１は、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用できることが示された。

ラセモシンｂラセモンンｂは、以下の工程：ａ）サムブカス・ラサモサ・エル（Ｓａａ＋ｂｕｃｕｓ　ｒａｃｅｓｏｓａ　Ｌ、）の樹皮をＮａＣ１およびＮａＰＯ４Ｈ２の水溶液で抽出し：ｂ）得られたペーストをメツシュに通して濾過し、予め酸性にした濾液を遠心し。

Ｃ）予め酸性にした流体を、イオン交換クロマトグラフィーに付し、最初に酢酸ナトリウム、次いでリン酸−ナトリウムでカラムを洗浄し；ｄ）洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムの水溶液で溶出し、蛋白画分を収集し：ｅ）該蛋白画分をリン酸−ナトリウムに対して透析し、それをイオン強度グラジェントにてイオン交換クロマトグラフィーに付して、ラセモシンｂを含有する両分を分離し：ｆ）前記の濃縮した画分を分子排除クロマトグラフィーに付して、ラセモンンｂを得るにより特徴付けられる工程手段によりサムブクス・ラセモサ・エル（Ｓ　ａＩＩｂｕｃｕｓｒａｃｅ＋＋ｏｓａ　Ｌ、）の樹皮より単離する。

泳動により得られた値で、還元剤の不在下にて５８．０００、還元剤の存在下にてＡ鎖につき２７．５００、Ｂ鎖につき２９．５００であった。

か（得られ特徴付けられたラセモシンｂは、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用できることが示された。

発明の具体例加えて、以下の実施例の手段により本発明を説明するが、該実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１にグリンｂ）この実施例は以下の８つの章：ａ）サムブカス・ニグラ・エル（ＳａＩＩｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、）の樹皮からニグリンｂを得ること；ｂ）見かけ上の分子量をめること二〇）ニグリンｂのポリペプチド鎖のアミノ末端配列：　ｄ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性：ｅ）蛋白生合成の阻害：ｆ）ラットにおける毒性；ｇ）赤血球細胞凝集素能；ｈ）免疫学的な関係に分けられる。

ａ）ニグリンｂの獲得１５．１ｇのサムブカス・ニグラ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、）の樹皮を、２８０ｍＭの塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸−ナトリウム塩（ｐＨ７，５）１２１ｍｌと共に４℃において１２時間摩砕した。得られた抽出物をチーズ−クロスを通して濾過して残存する固形物を除去した。液状抽出物をＪＡ−１４０−ター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｊ　１遠心機）中１３００Ｏｒｐｍで４５分間遠心し、上清（１２０，８ｍ１）を収集した。上清流体を、抽出用緩衝液で平衡化した、酸で処理したセフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　６　Ｂ　（５０℃において３時間０．ＩＮ塩酸で処理したセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　６　Ｂ　５０　ｍ　ｌ　）を充填したクロマトグラフィーのカラムに適用した。次いで、カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに達するまで抽出用緩衝液で洗浄した。次いで、２００ｍＭ　Ｄ−ガラクトースを含有する緩衝液を適用した。吸収のピーク（２２，５ｍｌであって０．２４３ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度）を収集し、水に対して透析し、最終的に凍結乾燥して７．２ｍｇの蛋白を得た。５．２ｍｇのこの蛋白調製物を４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）０．６ｍＩ中に溶解し、各０３ｍ１の２の分割量をスーパーデノクス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）　７５クロマトグラフイーカラムに適用した。０５ｍｌずつの画分を収集し、３つのピーク物が得られた。２つめのピーク物は電気泳動的に均質なニグリンｂであった。

ｂ）ニグリンｂの見掛けの分子量の決定ラエムリ−（Ｌａｅｍｍｌｙ）プロセス（ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７巻、第６８０頁〜第６８５頁）により、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ドデンル硫酸ナトリウムの存在下１５％アクリルアミドおよび２．７％ビスアクリルアミド、５ＤＳ−ＰＡＧＥ）によって相対的分子量（Ｍｒ）を測定した。得られたＭｒ値は、還元剤の存在下、Ａ鎖につき２６．０００およびＢ鎖につき３２．０００であって、還元剤不存在下で５８，０００であった。

Ｃ）ニグリンｂのポリペプチド鎖のアミノ末端配列ニグリンｂの２つのポリペプチド鎖のアミノ末端配列は、アリアス（Ａｒｉａｓ）らにより示されているごとく測定した（アリアス（Ａｒｉａｓ）ら、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）、第１ｃｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＬｅｕＡｓｐ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ −Ｂ鎖。

Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｘｘｘ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｘｘｘ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＸＸＸ　Ｖａｌ　Ａｓｐ（Ｘｘｘはそれがいずれのアミノ酸でもよいことを意味する）ｄ）ｒＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性ニグリンｂのＮ−グルコンダーゼ活性は、ニグリンｂにより脱プリン化されたｒＲＮＡについての酸性培地中におけるアニリンの作用の結果であるｒＲＮＡ断片の放出によって測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、以下に示すように、ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌを塩基ニグリンｌとインキュベートすることにより測定した。１００μｍのウサギ網状赤血球溶解物を、３７℃において１５分間、２ｍＭ　ＭｇＣ］　２．１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ　ＫＣＩおよび２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，８）を含む溶液中０．８μｇとインキュベートした。

その後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、飽和されたフェノール容量の１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，８）でこれらの反応混合物からｒＲＮＡを抽出した。

フェノールによる抽出はさらに二度行い、最終的に一８０℃において２時間で、３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）において二倍エタノール容量によりｒＲＮＡを沈澱させた。次いで、ｒＲＮＡを等容の２Ｍアニリン（ｐＨ５，２）で処理した。アニリンをジエチルエーテルで抽出した（等容で２回）。ｒＲＮＡを、次いで、二倍エタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）による沈澱によって沈澱させた。放出された断片の電気泳動分析は以下のように行なった。最終工程で得られたｒＲＮＡ沈澱を水中に再び懸濁させた。電気泳動用緩衝液中の３μｇｏ）ｒＲＮＡをポリアクリルアミドゲルディッンユ（サルスチオ（Ｓａｌ、ｕｓｔｉｏ）およびスタンレー（Ｓｔａｎｌｅｙ）による、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、第２６５巻、第５８２頁〜第５８８頁〔１９９２年〕に準じて調製した４、８５％アクリルアミドおよび０．１５０％ビス−アクリルアミド）の各々に入れた。電気泳動は１５ｍＡにおいて１００分間、ミニゲル系（マイティー・スモール（Ｍｉｇｈｔｙ　Ｓｍａｌｌ）、ホーエーフｙ−（Ｈｏ　ｅ　ｆ　ｅ　ｒ））中で行なった。ゲルの染色は０．５μｇ／ｍ＋のエチジウムブロマイド中で２０分間行なった。視覚化は３１２ｎｍにおけるＵ■トランシスリュミネーターによって行った。

ｅ）蛋白生合成の阻害ｉｎ　ｖｉｖｏの蛋白生合成阻害実験は、以下の文献に記載された標準的条件において、異なる無細胞系を用いて行った。典型的な実験の結果を表１に示す。

異なる無細胞系において行った蛋白生合成に対するニグリンｂの効果無細胞系　Ｉ　Ｃｓｅ　（ｎ　ｇ／ｍ　！　）　文献つ号ギ思状赤血球　１　６　１ラフト旺１　１２．１　１小ｉＦ４！　＞　１０００００　１Ｅノア　ｆチバ　ｘｈ、（Ｖｉｃｉａ　５ａｔｉｖａ　Ｌ、）ｉｆ　＞　１　０００００　２ラツト脳　２．３　１工／エリキア、コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　＞　１０００００　３文献ニアリアス（＾ｒｉａｓ）ら、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）、第１８６巻、第５３２頁〜第５４０頁［１９９２年］：２、アリアスら、フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３０巻、第３１６５頁〜第３１８７頁［１９９１年コ　：３、ギルベス（Ｇｉｒｂｅｓ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　）、第６７巻、第２５７頁〜第２６５頁［１９７６年］ＩＣ６゜は、各無細胞系の標準的条件において５０％の蛋白生合成の阻害を引き起こす蛋白濃度を示す。実験は文献に記載された条件下で行った。

ｆ）ラットにおける毒性実験は約３０ｇの体重のスイス（３ｖｉｓｓ）ラットについて行った。

体重１ｋｇ当たり１．５ｍｇのニグリンｂを、１５日の期間、死を引き起こさせないように、腹腔組織内に注入した。

ｇ）赤血球細胞凝集素活性赤血球細胞凝集の実験は終体積１１ｍ１の０．５％赤血球細胞溶液を用い、９６デイツンユのプレート上で行った。

合計ヒト・赤血球ν集（ｍｇ／ｍｌの蛋白）血液型Ａ　Ｂ　ＡＢ　Ｏニグリンｂ　Ｏ，０２５０，０１２５０，０１２５０，０１２５ニグリンｂで１．５力月間免疫したウサギから得られたポリクローナル抗体は、塩基ニグリン１、ニブリンｌおよびラセモシンｂと反応し、サムブカス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）ＩＩの植物から得られたこの蛋白のファミリー間に存在する免疫学的関係についての考えが得られる。

実施例２（塩基ニグリン１）この実施例はａ）サムブカス・ニグラ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、　）の葉からの塩基ニグリンｌの獲得；ｂ）見掛けの分子量の測定：Ｃ）塩基ニグリンｌのポリペプチド鎖のアミノ末端配列：　ｄ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性：ｅ）蛋白生合成の阻害：ｆ）ラットにおける毒性：ｇ）赤血球細胞凝集素活性：ｈ）免疫学的関係：の８つの章に分かれる。

ａ）塩基リグリンＬの獲得５００ｇ＋７１サムブカス・ニグラ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ、　）の葉を、１４０ｍＭの塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸−ナトリウム塩（ｐＨ７，２）４リツトルの溶液中で４℃において１２時間抽出した。得られたペーストをチーズ−クロスを通して濾過して残存する固体を除去した。液状抽出物を氷酢酸でｐＨ４に酸性化し、現れた固形物を０℃において、１３０００ｒｐｍで４５分間遠心することによって除去した。流出した流体（約４リツトル）を、ニス・セファロース・ファースト・フロー（Ｓ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）のイオン交換クロマトグラフィーカラム（１０Ｘ５ｃｍのカラム）に付した。平衡化されたカラム溶液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）であった。酸性化した蛋白流体をカラムに適用した。

カラムにより保持されなかった部分を捨てた。次いで、カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度が最少値に下がるまで、１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，５）で洗浄した。次いで、カラムを５ｍＭのリン酸−ナトリウム塩溶液（ｐＨ７）で洗浄した。２回の洗浄液を捨てた。最終的に、カラムを１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸−ナトリウム塩溶液（ｐＨ７）で洗浄した。流出した蛋白を５ｍＭのリン酸−ナトリウムに対して透析した。次いで、この蛋白調製物を、予めリン酸−ナトリウム（ｐＨ７）で平衡化したンーエム・セファロース・ファースト・フｏ　−（ＣＭ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　ＦｌｏｖＸｌ　０．５　ｘ　２．６　ｃｍ）中のイオン力グラジエントにおけるイオン交換クロマトグラフィーに付した。最初に蛋白は固定され、次いで、０．７リツトルの５ｍＭリン酸−ナトリウム塩（ｐＨ７）および０７リツトルの３００ｍＭ塩化ナトリウムからなるイオングラジエユ／トを適用した。液速を７ｍｌ／分に調節し、１０．５ｍＩずつの両分を収集した。塩基ニグリン１を含む画分１５ないし３５を収集した。両分を合し、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ）とＹＭＩＯ膜で１０ｍ１の体積まで濃縮した。濃縮物を０．４Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸−ナトリウムの溶液で平衡化したハイ−ロード・スーパーデックス（Ｉｌｉ−Ｌｏａｄ　５ｕｐｅｒｄｅｘ）　７５−　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分子排除クロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィーを同緩衝液中で行い、塩基ニグリンｌに相当する両分を合した。

ｂ）ニグリンＩの見掛けの分子量の測定ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ドデンル硫酸ナトリウムの存在下、１５％アクリルアミドおよび２．７％ビスアクリルアミド、５ＤＳ−ＰＡＧＥ）によって相対分子量（Ｍｒ）を測定した。得られたＭｒ値は、還元剤の不存在下において６６．０００であって、還元剤の存在下、Ａ鎖につき３４，０００およびＢ鎖に対し３４．０００であった。

Ｃ）ニグリンポリペプチド鎖のアミノ末端配列塩基ニグリン１の２つのポリペプチド鎖のアミノ末端配列は、アリアスは以下の通りである。

−Ａ鎖ニブロックされたアミノ末端のアミノ酸−Ｂ鎖：＾１ａ　Ｐｒｏ　Ｘｘｘ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｘｘｘ　Ｘｘｘ（Ｘｘｘはそれがいずれのアミノ酸でもよいことを意味する）ｄ）塩基ニグリン１のｒＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性塩基ニグリン１のＮ−グルコシダーゼ活性は、塩基ニグリン１により脱プリン化されたｒＲＮＡについての酸性培地中のアニリンの作用の結果であるｒ　ＲＮＡ断片の放出によって測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、以下に示すように、ウサギ網状赤血球溶解物を塩基ニグリン１とインキュベートすることにより測定した。

１００μｍのウサギ網状赤血球溶解物を３７℃において１５分間、２ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　２、ｌＱｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭＫＣｌおよび２０ｍＭｔ− リス−塩酸（ｐＨ７，８）を含む溶液中、塩基ニグリン１０．５μｇとインキュベートした。その後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、飽和されたフェノール容積の１００ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，８）でこれらの反応混合物からｒＲＮＡを抽出した。フェノールによる抽出をさらに二度行い、最終的に一８０℃において２時間で、３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）において二倍のエタノール容積によりｒＲＮＡを沈澱させた。次いで、ｒＲＮＡを等容の２Ｍアニリン（ｐＨ４，５）で処理した。アニリンをジエチルエーテルで抽出した（等容で２回）。

ｒＲＮＡを、次いで、二倍のエタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウムは以下のように行った。最終工程で得られたｒＲＮＡ沈澱を水中に再び懸濁させた。電気泳動緩衝液中の３μｇのｒＲＮＡをポリアクリルアミドゲルディツシュ（サルスチオ（Ｓａｌｕｓｔｉｏ）およびスタンレー（Ｓｔａｎｌｅｙ）による、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、第２６５巻、第５８２頁〜第５８８頁（１９９２年〕に準じて調製した４、８５％アクリルアミドおよび０．１５０％ビス−アクリルアミド）の各々に入れた。電気泳動は１５ｍＡにおいて１００分間、ミニゲル系（マイティー・スモール（Ｍｉｇｈｔｙ　Ｓｍａｌｌ）、ホーニーファー（Ｈｏｅｆｅｒ））中で行なった。ゲルの染色は０．５μｇ／ｍｌのエチジウムプロミド中で２０分間行なった。視覚化は３１２ｎｍにおけるＵＶｌ−ランスイリュミネーターによって行った。

（Ｐｌａｎｔａ）、第１８６巻、第５３２頁〜第５４０頁［１９９２年コに記載されている標準的条件下、無細胞系のウサギ網状赤血球を用いて行った。典型的な実験の結果を表２に示す。

無細胞系における蛋白生合成に対するニグリンｌの効果無細胞系　Ｉ　Ｃｓｏ　（ｎ　ｇ／ｍ　＋　）つ号ギ鱈状赤ｌ關Ｍ書　１．８０ＩＣ５゜は、５０％の蛋白生合成阻害を引き起こす蛋白濃度を示す。

ｆ）ラットにおける毒性実験は約３０ｇの体重のスイス（Ｓｗｉｓｓ）ラットについて行った。

体重１ｋｇ当たり１．５ｍｇの塩基ニグリン１を、１５日の期間死を引き起こさないように、腹腔組織内に注入した。

ｇ）赤血球細胞凝集素活性赤血球細胞凝集の実験は、終体積０．１ｍｌの０．５％赤血球細胞溶液を用い、９６デイツシユのプレート上で行った。

合計ヒト・赤血球細胞凝集（ｍｇ／ｍｌの蛋白）血液型Ａ　Ｂ　ＡＢ　Ｏ塩基ニグリンＩ　Ｏ，１６００，１６００，１６００，１６０ｈ）免疫学的関係塩基ニグリンｌでウサギを１，５力月間免疫することによって得られたポリクローナル抗体は、ニグリンｂ１ニブリンｌおよびラセモシンｂと反応し、サムブカス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）属から得られたこの蛋白のファミリー間に存在する免疫学的関係についての考えが得られる。

実施例３（ニブリンｌ）この実施例はａ）サムブカス・エブルス・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｅｂｕｌｕｓ　Ｌ、　）の葉からのニブリンＩの獲得；ｂ）見掛けの分子量の測定；Ｃ）ニブリン１のポリペプチド鎖のアミノ末端配列、ｄ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性；ｅ）蛋白生合成の阻害：ｆ）ラットにおける毒性二ｇ）赤血球細胞凝集素活性：ｈ）免疫学的関係；の８つの章に分かれる。

ａ）ニブリン１の獲得サムブカス・エブルス（Ｓａ＋ａｂｕｃｕｓ　ｅｂｕｌｕｓ　Ｌ）の葉１００ｇを、２８０ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸−ナトリウム溶ｍ（ｐＨ７，５）の１０１００Ｏと共に４℃で１２時間摩砕した。得られた抽出物をチーズ− クロスで濾過して残存する固形物を除去した。液状抽出物を、ＪＡ−１４０−ター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｊ　２１遠心機）で１３０００ｒｐｍにて遠心し、上清（９９０ｍｌ）を収集した。上清流体を、抽出用緩衝液で平衡化した、酸処理セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　６　Ｂ　（０，Ｉ　Ｎ塩酸で５０℃にて３時間処理したセファロース６Ｂ２５０ｍｌ）１９０ｍｌを充填したり０７トグラフイーカラム（９，５Ｘ５ｃｍ）に適用した。次いで、該カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに落ちるまで抽出用緩衝液で洗浄した。次いで、２００ｍＭ　Ｄ−ガラクトシダーゼを含有する抽出用緩衝溶液を適用した。吸収のピーク物を収集し、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ）およびＹＭＩＯ膜にて７．５ｍｌまで濃縮した。次いで、濃縮した蛋白溶液を、４００ｍＭ　ＮａＣ］および５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）で平衡化したハイ−ロード・スーパーデックス（Ｈｉ−Ｌｏａｄ　５ｕｐｅｒｄｅｘ）　７５カラムに適用した。溶出させて、各々が２０ｍ１のい（つかの蛋白ピーク物が得られ、最後のものが電気泳動的に均質なニブリンｌてあった（最小Ｍｒピーク）。

ｂ）見掛けの分子量の測定レムリイ（Ｌａｅｍｍｌｙ）プロセス（ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７．６８０−６８５）によって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ドデンル硫酸ナトリウムの存在）における１５０％アクリルアミドおよび２．７％ビス−アクリルアミド、５ＤＳ−ＥＤＴＡ）により相対的分子量（Ｍｒ）を測定した。得られたＭｒ値は、還元剤の存在下で、Ａ鎖につき２６０００、Ｂ鎖にっき３００００、還元剤の不存在下で５６０００であった。

Ｃ）ニブリン１のポリペプチド鎖のアミノ末端配列ニブリン１の２本のポリペプチドのアミノ末端配列は、アリアス（Ａｒｉａｓ）ら［アリアス（Ａｒｉａｓ）ら、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）　１８６．５３２−５４０（１９９２）］に紀載されているごとくに測定した。結果は以下の通りである。

−鎖Ａ− １１ｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｃｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ一鎖ＢＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｘｘｘ＾ｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＰｈｅＴｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｘｘｘ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＶａｌ＾ｓｐ　Ｐｒ。

（Ｘｘｘはそれがいずれのアミノ酸であってもよいことを意味する）ニブリン１の該Ｎ−グルコ／ダーゼ活性は、ニブリン１によって脱プリン化されたｒＲＮＡに対する酸性媒質中におけるアニリンの作用の結果として、ｒＲＮＡ断片の放出として測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、後記するごと（、ウサギ網状赤血球溶解物１００μｍをニブリン１と共にインキュベートすることによって測定した。

ウサギ網状赤血球溶解物１００μｍを、２ｍＭ　ＭｇＣＬ、１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ　ＫＣＩおよび２０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）を含有する溶液中、ニブリン１の６．８μｇと共に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ｒＲＮＡを、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、１００ｍＭトリス −ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）の飽和フェノール容量で、これらの反応混合物から抽出した。フェノール抽出をさらに２回行い、最後に、−８０℃にて、２倍エタノール容量の３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）でｒＲＮＡを２時間で沈殿させた。次いで、該ｒＲＮＡを１倍容量の２Ｍアニリン（ｐＨ４，５）で処理した。該アニリンをジエチルエーテル（１倍容量、２回）で抽出した。次いで、該ｒＲＮＡを、２倍エタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）で沈殿させた。遊離した断片の電気泳動分析を以下のごと（に行った。最後の工程で得られたｒＲＮＡ沈殿物を水に再懸濁させた。電気泳動緩衝液中のｒＲＮＡ３μｇを、ポリアクリルアミドゲル・ディツシュ（サルスチオ（Ｓａｌｕｓｔｉｏ）およびスタンレイ（Ｓｔａｎｌｅｙ）　［ジャーナル・オブ・バイオケミカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６５．５８２−５８８．１９９０コに準じて調製した４、８５％アクリルアミドおよび１１５０％ビス−アクリルアミド）の各々に入れた。ミニゲル系（マイティ・スモール・ヘーファー（ＭｉｇｈｔｙＳｍａｌｌ、　Ｈｏｅｆｅｒ）にて、１５ｍＡにて電気泳動を１００分間行った。ゲルの染色は、エチジウムブロマイド０．５μｇ／ｍ］で２０分間行った。可視化は、３１２ｎｍにおけるＵＶランプ・トランスイリュミネーターで行った。

ｅ）蛋白生合成の阻害ｉｎ　ｖｉｔｒｏ蛋白生合成の阻害実験は、文献に記載された標準的条件にて、異なる無細胞系を用いて行った。典型的な実験の結果を以下の表３に示す。

表３」怪江哩４丼工覇ご１」鎚」？匡葺グ豊」雲憚無細胞系一−−−−−−−−−−−−−−−土ｐ□ゴ町Δｌ）　文献ウサギ網状赤血球溶解物　８．５１ラツト肝臓　１５　１小麦胚芽　＞１０００００　１ビシア・サテイバ　＞１０００００　１（Ｖｉｃｉａ　５ａｔｉｖａ）Ｌ胚芽ラット脳　５１工／エリキア・コリ　＞１０００００　３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｆ）文献＋　ｌ　、　Ａｒ１ａｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｌａｎｔａ　１ｇ６．５３２ −１９９２：２．　Ａｒ１ａｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０．３１８５−３１８７１９９１：３．　Ｇｉｒｂｅｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋香A　６７゜ＩＣａａは、各無細胞系の標準的な条件における蛋白生合成の５０％阻害を引き起こす蛋白濃度を示す。実験は、文献に示された条件で行った。

ｆ）ラットにおける毒性実験は、約３０ｇの体重のストス（Ｓｗｉｓｓ）ラットで行った。

体重１ｋｇ当たりニブリン１の１．６ｍｇを、いずれの死滅も引き起こすことなく、１５日間、腹腔的注射した。

ｇ）赤血球細胞凝集活性赤血球細胞凝集実験は、最終容量０．１ｍｌにて、０５％赤血球細胞溶液を用合計ヒト赤血球細胞凝集（１ｍｌ当たりのｍｇの蛋白）ニブリン１　０，０５　０．０２５　０．０１２５　０．０１２５ｈ）免疫学的関係ウサギを１．５月間ニブリン１で免疫することによって得られたポリクローナル抗体を、ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）　ｂ　、塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）　ｂおよびラセモシン（Ｒａｃｅ＋ａｏｓｉｎ）　ｂと反応し、サムブカス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）属の得られた蛋白のこのファミリーの間に存在する免疫学的関係の考えが得られた。

実施例４（ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）　ｂ　）本実施例は７つの章：ａ）サムブカス・ラセモサ・エル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｌ）の樹皮がらのラセモンンｂの獲得、ｂ）見掛けの分子量の測定；　ｃ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性、ｄ）蛋白生合成の阻害；ｅ）ラットにおける毒性：ｆ）赤血球細胞凝集素活性１ｇ）免疫学的関係：に分けられる。

ａ）ラセモンンｂの獲得サムブカス・ラセモサーエル（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｒａｃｅｍｏｓａ　Ｌ）の樹皮２５０ｇを、４℃にて、１４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸−ナトリウムの溶液（ｐＨ７，２）の２リツトルで１２時間抽出した。得られた抽出分をチーズ−クロスで濾過して残存する固形物を除去した。液状抽出物を氷酢酸でｐＨ４に酸性化し、出現した固形物を１３０００ｒｐｍにおける０℃での４５分間の遠心によって除去した。溶出した流体（はぼ２リツトル）をＳ　セファロース・ファースト・フロラ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）　（８、４Ｘ　５　ｃ　ｍのカラム）におけるイオン交換クロマトグラフィーに付した。

平衡化したカラム溶液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）であった。酸性化した蛋白流体を該カラムに適用した。該カラムによって保持されなかった分を捨てた。次いで、該カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度が最小値に減少するまで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，５）で洗浄した。次いで、該カラムを５ｍＭリン酸−ナトリウム溶液（ｐＨ７，）で洗浄した。２回の洗液を捨てた。最後に、該カラムを１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸−ナトリウム溶ｇｊｉ、（ｐＨ７，）で溶出した。溶出した蛋白を５ｍＭリン酸−ナトリウム（ｐＨ７，）に対して透析した。この蛋白調製物を、次いで、リン酸−ントリウム（ｐＨ１，）で予め平衡化したＣＭ−セファロース・ファースト・フロラ（カラム４．７Ｘ２．６ｃｍ）におけるイオン力グラジェントにてのイオン交換クロマトグラフィーに付した。最初に蛋白が固定され、次いで、５ｍＭリン酸−ナトリウム溶液（ｐＨ７）の０．７リツトルおよび３００ｍＭ塩化ナトリウム溶液の０．７リツトルよりなるイオングラジェントを流した。液速を１分間当たり７ｍｌに調整し、１０．５ｍｌずつの画分を収集した。ラセモンンｂを含有する画分４ないし１５を収集した。該両分を合し、ＡＭＩＣＯおよびＹＭ膜にて１０ｍ１の容量に濃縮した。次いで、濃縮物を、０．４ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸−ナトリウム溶液（ｐＨ７，）で予め平衡化したハイ−ロード・スーパーデックス（Ｈｉ−Ｌｏａｄ　５ｕｐｅｒｄｅｘ）　７５−　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃを用いる分子排除クロマトグラフィーに付した。該クロマトグラフィーを同緩衝液にて行い、純粋なラセモンンｂに対応する画分を合した。

ｂ）見掛けの分子量の測定レムリイ（Ｌａｅｍｍｌｙ）プロセス（ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７．６８０−６８５）によって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ドデンル硫酸ナトリウムの存在下における１５％アリクリルアミドおよび２．７％ビス−アクリルアミド、５ＤＳ−ＰＡＧＥ）によって相対的分子量（Ｍｒ）を測定した。得られた該Ｍｒ値は還元剤の不存在下では５８０００であって、還元剤の存在下では、Ａ鎖につき２７５００、Ｂ鎖につき２９５００てあった。

Ｃ）ラセモシンｂのｒＲＮＡに対するＮ−グルコンダーゼ活性ラセモノンｂによって脱プリン化されたｒＲＮＡについての酸性培地中におけるアニリンの作用の結果として、ラセモンンｂのＮ−グルコンダーゼ活性ヲ、ｒＲＮＡ断片の放出として測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、後記するごと（、ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌをラセモシンｂと共にインキュベートすることによって測定した。

ウサギ網状赤血球溶解物１００μｍを、２ｍＭのＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭＫＣｌおよび２０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）を含有する溶液中にて、ラセモンンｂの０５μｇと共に３７℃にて１５分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡの存在下にて、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）のフェノール容量でこれらの反応物混合物からｒＲＮＡを抽出した。

フェノール抽出をさらに２回行い、最後に、３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，２）における２倍エタノール容量にて、−８０℃で２時間、ｒＲＮＡを沈殿させた。次いで、ｒＲＮＡを１倍容量の２Ｍアニリン（ｐＨ４，５）で処理した。アニリンをジエチルエーテル（１倍容量で２回）で抽出した。しかる後、２倍エタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５゜２）での沈殿によってｒＲＮＡを沈殿させた。遊離した断片の電気泳動分析は以下のごとくに行った。最後の工程で得られたｒＲＮＡ沈殿物を水に再懸濁させた。電気泳動緩衝液中のｒＲＮＡ３μｇを、サルスチオ（Ｓａｌｕｓｔｉｏ）およびスタンレイ（Ｓｔａｎｌｅｙ）　（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６５．５８２−５８８　（１９９０））に準じて調製したポリアクリルアミドゲル・ディツシュ（４，８５％アクリルアミドおよび０．１５０％ビス−アクリルアミド）の各々に入れた。ゲルの染色は、０．５μ ｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで２０分間行った。可視化は３１２ｎｍにおけるＵＶランブトランシスリュミネーターで行った。

ｄ）蛋白生合成の阻害ｉｎ　ｖｉｔｒｏ蛋白生合成阻害実験は、アリアス（Ａｒｉａｓ）ら［プランタ（Ｐｌａｎｔａ）１８６．５３２−５４０．１９９０］に記載されている標準条件にて、無細胞系ウサギ網状赤血球溶解物を用いて行った。結果を表４に示す。

表４ＴＣ５ｏは、蛋白生合成の５０％阻害を引き起こす蛋白１度を示す。

ｅ）ラットにおける毒性実験は、約３０ｇの体重の５ｗ１ｓｓラツトで行った。

体重１ｋｇ当たりラセモンンｂ　１．６ｍｇを、いずれの死滅も起こさせることなく、１５日の期間腹腔的注射した。

ｆ）赤血球細胞凝集素活性赤血球細胞凝集実験は、最終容量０．１ｍｌにて０．５％赤血球細胞溶液を用いて、９６デイツンユのプレートで行った。

合計ヒト赤血球細胞凝集（ｍ！当たりのｍｇの蛋白）血液型ウサギをエルビン（Ｅｂｕｌｉｎ）　１およびニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）　ｂに対して１．５月間免疫することによって得られたポリクローナル抗体をラセモンンｂと反応させ、サムブカス（Ｓａ＋＊ｂｕｃｕｓ）属の植物で得られたこのファミリーの蛋白の間に存在する免疫学的関係の考えが得られた。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　ＡＥＤＣＯ７Ｋ　１／１６（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ；　ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ（７２）発明者　シトレス・ゴンサレス、ルシアスペイン　バジャドリ、フエンテ・エル・ソノは６番−セグンド・エフエ（７２）発明者　アリアス・バジエホ、フランシスコ・ハビエルスペイン　バジャドリ、サン・ペドロ４番−セブチイモ・セーＩ（７２）発明者　ロホ・ロドリゲス、マリア・アシヘレススペイン　バレンシア、ナバラ３！４（７２）発明者　ムニョス・マルティネス、ラケルスペイン　ソリア、アベニーダ・デ・う・ビクトリア１番−チルセロ・アー（７２）発明者　ヒメネス・ロペス、ピラルスペイン　バジャドリ、エルナンド・デ・アワーニヤ２７番−キント・へ− （７２）発明者　マルティネス・デ・ベニート、フェルナンドスペイン　バジャドリ、プエンテ・コルガンテ１６番−プリメロ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の、細胞外領域において２本の鎖を持つ、新規な非毒性のリボソーム不活性化蛋白（ＲＩＰ）であって；該新規な蛋白は、標的細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）に結合しており、そのいくつかのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して細胞外領域において毒性を欠く、該担体分子によって選択されなかった細胞に対する該ＲＩＰの無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴とする当該ＲＩＰ。
２．ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の新規な非毒性リボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）であって；該新規蛋白は、標識細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）によって結合されており、そのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して毒性を欠く担体によって選択されなかった細胞に対する該ＲＩＰの無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴とし、さらに、塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムの水性塩基で植物の対応する部分を抽出し、続いて、該抽出物を濃縮し、次いで、イオン交換および／または分子排除クロマトグラフィー技術によってそれを精製することによるいくつかの最初の工程によって、非毒性植物の単離によって得られることを特徴とする当該ＲＩＰ。
３．サムブカス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）属の植物から単離した植物トキシンであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の新規リボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
４．該蛋白がニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂと命名されたものであって、サムブカス・ニグラ・エル（ＳａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａＬ）の樹皮から単離されたことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項いずれか１項に記載の新規リボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
５．該蛋白がニグリン（（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂと命名されたものであって、サムブカス・ニグラ・エル（ＳａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａＬ）の葉から単離されたことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項いずれか１項に記載の新規リボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
６．該蛋白がエブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１と命名されたものであって、サムブカス・エブルス・エル（ＳａｍｂｕｃｕｓｅｂｕｌｕｓＬ）から単離されたもものであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項いずれか１項に記載の新規リボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
７．該蛋白がラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂと命名されたものであって、サムブカス・ラセモサ・エル（ＳａｍｂｕｃｕｓｒａｃｅｍｏｓａＬ）から単離されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項いずれか１項に記載の新規リボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
８．該ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して、還元剤の存在下で２２０００の鎖Ａの相対的分子量および３２０００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、その不存在下で５８０００の相対的分子量を有し、それらの鎖がアミノ末端において以下のアミノ酸配列：鎖Ａ；【配列があります】鎖Ｂ；【配列があります】（ここに、Ｘｘｘはいずれかのアミノ酸を表す）を有する請求の範囲第４項記載の新規なリボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
９．該塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定して、還元剤の不存在下で６６０００の相対的分子量を有し、還元剤の存在下で３２０００の鎖Ａの相対的分子量および３４０００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、それらの鎖が以下：鎖Ａ；ブロックされたアミノ末端のアミノ酸、鎖Ｂ；【配列があります】の配列のアミノ末端を有する請求の範囲第５項に記載の新規なリボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
１０．該エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）ｌが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、還元剤の存在下で２６０００の鎖Ａの相対的分子量および３００００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、かつその不存在下で５６０００の相対的分子量を有し、かつアミノ末端における以下のアミノ酸配列：鎖Ａ；【配列があります】鎖Ｂ；【配列があります】（ここに、Ｘｘｘはいずれかのアミノ酸を表す）を有する請求の範囲第６項記載の新規なリボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
１１．該ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂが、ポリアクルアミドゲル電気泳動によって測定して、還元剤の不存在下で５８０００の相対的分子量を有し、還元剤の存在下で２７５００の鎖Ａの相対的分子量および２９５００の鎖Ｂの相対的分子量を有することを特徴とする請求の範囲第７項記載の新規なリボソーム− 不活性化蛋白（ＲＩＰ）。
１２．塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムの水性溶液で植物の対応する部分を抽出して、（ｉ）蛋白の生合成を阻害でき、かつ（ｉｉ）ヒト赤血球凝集素活性を有する抽出物を得、続いて、該抽出物を濃縮し、次いで、イオン交換および／またはアフィニティーおよび分子交換クロマトグラフィー技術によって精製する最初のいつくかの操作よりなることを特徴とする非毒性植物を単離することによって請求の範囲第１項記載の非毒性で新規な２本鎖のリボソーム−不活性化蛋白（ＲＩＰ）の製法。
１３．塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムを用いて、ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白生合成を阻害でき、かつヒト赤血球細胞凝集素活性を有する、予め選択された非毒性植物の粗製蛋白抽出物を得；該抽出物を酸処理したセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ上のアフィニティークロマトグラフィーに付し、Ｄ−ガラクトースおよびラクトースで溶出させ；対応するピーク物を分子排除クロマトグラフィーに付し；レクチンおよび非毒性の２本鎖ＲＩＰを含有するピーク物を得、最後に、該蛋白合成を阻害するピーク物を選択するために蛋白合成の阻害の分析を行うことを特徴とする請求の範囲第１２項記載の製法。
１４．該非毒性植物がサムブカス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）属に属する請求の範囲第１３項記載の製法。
１５．該酸タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰがニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂであって、以下の操作：（ａ）従前に摩砕したサムブカス・ニグラ・エル（ＳａｍｈｕｃｕｓｎｉｇｒａＬ）の樹皮をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出し；（ｂ）得られた液状抽出物をメッシュに通してろ過し、ろ液を遠心し；（ｃ）抽出用緩衝液で平衛化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに上清流体を適用し、カラムを抽出用緩衝液で洗浄し；（ｄ）該洗浄したカラムをＤ−ガラクトシダーゼを含有する抽出用緩衝液で溶出し、蛋白面分を収集し；（ｅ）得られた蛋白面分を透析し凍結乾燥し、予めＮａＣｌＮａＨ２ＰＯ４に溶解し分子排除クロマトグラフィーに付して、そのうち２つ目のものが対応するニグリンｂである３つのピーク物を得る；ことによって得られる請求の範囲第１４項記載の製法。
１６．該酸タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰがエブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１であって、以下の操作：（ａ）従前に摩砕したサムブカス・エブルス・エル（ＳａｍｂｕｃｕｓｅｂｕｌｕｓＬ）の葉をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出し；（ｂ）得られた液状抽出物をメッシュに通してろ過し、ろ液を遠心し；（ｃ）抽出用緩衝液で平衡化したアフィニティークロマトグラフイーに上清流体を適用し、該カラムを抽出用緩衝液で洗浄し；（ｄ）該洗浄したカラムを、Ｄ−ガラクトースを含有する抽出用緩衝液で溶出し、蛋白画分を収集し；（ｅ）蛋白画分を濃縮し、それを、ＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４を用いるもう１つの予め平衡化した分子排除クロマトグラフィーカラムに適用し、溶出させて、そのうち最後のものがエブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１である蛋白ピーク物を得る；ことによって得られる請求の範囲第１４項記載の製法。
１７．塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウムを用いて、ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白生合成を阻害でき、かつヒト赤血球細胞凝集素活性を有する、予め選択された非毒性植物の粗製蛋白抽出物を得；該抽出物をＳ−セファロース（Ｓｏｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦ上の塩基蛋白のイオン交換クロマトグラフィーに付し、蛋白合成を阻害する蛋白ピーク物を選択し；該選択したピーク物をＣＭ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦ上の第２のクロマトグラフィーに付し、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ）で濃縮するために、蛋白合成を阻害するものを再度選択し、最後に、分子排除クロマトグラフィーに付すことよりなる、塩基タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰを得るための請求の範囲第１２項記載の製法。
１８．該非毒性植物がサムブカス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）属に属する請求の範囲第１７項記載の製法。
１９．該塩基タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰが塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１であって、以下の操作；（ａ）サムブカス・ニグラ・エル（ＳａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａＬ）の葉をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出し；（ｂ）得られたペーストをメッシュを通してろ過し、予め酸性化したろ液を遠心し；（ｃ）得られた予め酸性化した流体をイオン交換クロマトグラフィーに付し、まず、カラムを酢酸ナトリウムで洗浄し、次いで、リン酸−ナトリウムで洗浄し；（ｄ）該洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウム溶液で溶出させ、蛋白画分を収集し；（ｅ）該蛋白画分を、イオンカグラジエントにて、イオン交換クロマトグラフィーに付し、塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１を含有する画分を分離し；（ｆ）予め濃縮した面分を分子排除クロマトグラフィーに付して塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１を得る；ことによって得られる請求の範囲第１８項記載の製法。
２０．該塩基タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰがラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｊｎ）ｂであって、以下の操作：（ａ）サムブカス・ラセモサ（Ｓａｍｂｕｃｕｓｒａｃｅｍｏｓａ）の樹皮をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出し；（ｂ）得られたペーストをメッシュを通してろ過し、予め酸性化したろ液を遠心し；（ｃ）得られた予め酸性化した流体をイオン交換クロマトグラフィーに付し、まず、カラムを酢酸ナトリウムで洗浄し、次いで、リン酸−ナトリウムで洗浄し；（ｄ）該洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸−ナトリウム溶液で溶出させ、蛋白画分を収集し；（ｅ）該蛋白面分を、イオンカグラジエントにて、イオン交換クロマトグラフィーに付し、ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂを含有する画分を分離し：（ｆ）予め濃縮した画分を分子排除クロマトグラフィーに付してラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂを手与る；ことによって得られる請求の範囲第１８項記載の製法。
２１．非毒性２本鎖リボソーム−不活性化蛋白の、トキシンに感受性のリボソームのｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
２２．非毒性２本鎖リボソーム−不活性化蛋白の、哺乳動物リボソーム・リボ核酸のｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
２３．リボソーム−不活性化蛋白の、真核生物のｉｎｖｉｖｏ不活性化による蛋白生合成を阻害するために用いるための、他の化学種との複合体の構築における使用。
２４．２本鎖を持つ非毒性リボソーム不活性化蛋白の、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス（ＲＮＡウイルス）によって引き起こされる病気における、リボ核酸の機能的増殖（ｉｏｖｉｖｏにての単離した無傷細胞におけるもの）を阻害するための使用。
２５．２本鎖を持つ非毒性リボソーム不活性化蛋白の、ヒトおよび実験動物において特異的標的細胞を不活性化するための、単独あるいは他の化学種と組み合わせた形態における治療上の使用。
２６．前記請求の範囲いずれか１項に記載の使用のための、分子クローン化技術によって得られた２本鎖を持つ非毒性リボソーム不活性化蛋白の使用。
２７．請求の範囲第２１項ないし第２６項いずれか１項に記載の２本鎖を持つ非毒性リボソーム不活性化蛋白の使用であって、ここに、該蛋白がアルキル化および／またはチオール化によって化学的に修飾されて用いられる当該使用。
２８．ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、トキシンに感受性のリボソームのｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
２９．ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、哺乳動物リボソーム・リボ核酸のｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
３０．ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、真核生物におけるリボソームのｉｎｖｉｖｏ不活性化によって蛋白生合成を阻害するのに用いるための、他の化学種との複合体の構築における使用。
３１．ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス（ＲＮＡウイルス）によって引き起こされるかあるいは維持される病気における、リボ核酸の（ｉｎｖｉｖｏ機能的増殖であって単離された無傷細胞におけるもの）を阻害するための使用。
３２．ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、ヒトおよび実験動物において特異的標的細胞を不活性化するための、単独あるいは他の化学種との複合体の形態での使用。
３３．前記請求の範囲いずれか１項に記載した使用のための、分子クローン化技術によって得られたニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの当該使用。
３４．請求の範囲第２８項ないし第３３項いずれか１項に記載のニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの使用であって、該ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂがアルキル化および／またはチオール化によって化学的に修飾されて用いられる当該使用。
３５．塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、トキシンに感受性のリボソームのｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
３６．塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）ｂの、哺乳動物リボソーム・リボ核酸のｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
３７．塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１の、真核生物のリボソームのｉｎｖｉｖｏ不活性化のための、蛋白生合成を阻害するのに用いるための、他の化学種との複合体の構築のための使用。
３８．塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１の、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス（ＲＮＡウイルス）によって引き起こされるかあるいは維持される病気における、リボ核酸の（ｉｎｖｉｖｏ機能的増殖であって単離された無傷細胞におけるもの）を阻害するための使用。
３９．塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１の、ヒトおよび実験動物において、特異的標的細胞を不活性化するための、単独あるいは他の化学種との複合体形態における治療上の使用。
４０．前記請求の範囲いずれか１項に記載の使用のための、分子クローン化技術によって得られた塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１の当該使用。
４１．請求の範囲第３５項ないし第４０順いずれか１項に記載の塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１の使用であって、該塩基ニグリン（Ｎｉｇｒｉｎ）１がアルキル化および／またはチオール化によって化学的に修飾されて用いられる当該使用。
４２．エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の、トキシンに感受性のリボソームのｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
４３．エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の、哺乳動物リボソーム・リボ核酸のｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
４４．エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の、真核生物のリボソームのｉｎｖｉｖｏ不活性化によって蛋白生合成を阻害するために用いる、他の化学種との複合体の構築における使用。
４５．エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス（ＲＮＡウイルス）によって引き起こされるかあるいは維持される病気における、リボ核酸の（ｉｎｖｉｖｏ機能的増殖であって単離した無傷細胞におけるもの）を阻害するための使用。
４６．エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の、ヒトおよび実験動物において特異的標的細胞を不活性化するための、単独あるいは他の化学種との複合体形態での治療上の使用。
４７．前記請求の範囲いずれか１項に記載の使用のための、分子クローン化技術によって得られるエブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の当該使用。
４８．請求の範囲第４２項ないし第４７項いずれか１項に記載のエブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１の使用であって、該エブリン（Ｅｂｕｌｉｎ）１がアルキル化および／またはチオール化によって化学的に修飾して用いられる当該使用。
４９．ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの、トキシンに感受性のリボソームのｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
５０．ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの、哺乳動物リボソーム・リボ核酸のｉｎｖｉｔｒｏ不活性化のための使用。
５１．ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの、真核生物のリボソームのｉｎｖｉｖｏ不活性化によって蛋白生合成を阻害するのに用いるための、他の化学種との複合体の構築における使用。
５２．ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス（ＲＮＡウイルス）によって引き起こされるか維持される病気における、リボ核酸の（ｉｎｖｉｖｏ機能的増殖であって単離された無傷細胞におけるもの）を阻害するための使用。
５３．ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの、ヒトおよび実験動物において特異的標的細胞を不活性化するための、単独あるいは他の化学種との複合体形態での治療上の使用。
５４．前記請求の範囲いずれか１項に記載の使用であって、分子クローン化技術によって得られたラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの当該使用。
５５．請求の範囲第４９項ないし第５４項いずれか１項に記載のラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂの使用であって、該ラセモシン（Ｒａｃｅｍｏｓｉｎ）ｂがアルキル化および／またはチオール化によって化学的に修飾して用いられる当該使用。
５６．可能な癌および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療のための、請求の範囲第２１項ないし第５５項いずれか１項に記載の非毒性リボソーム−不活性化蛋白の使用。