JPH07507201A

JPH07507201A - 可変鋳型反応

Info

Publication number: JPH07507201A
Application number: JP5516594A
Authority: JP
Inventors: クジャコフ，ユーリ; フィールズ，ハワード　エイ．
Priority date: 1992-03-10
Filing date: 1993-03-10
Publication date: 1995-08-10
Also published as: US5503995A; WO1993019202A3; AU672969B2; AU3798393A; CA2131630A1; EP0631636A1; WO1993019202A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２７、請求項２４に記載のキットであって、さらに前記二本鎖デオキシポリヌクレオチドから特有の一本鎖突出部を形成し得る酵素を含む、キット。

２８、請求項１に記載の方法を実施し、望ましくない成分を除くようにプログラムされた、自動合成機。

２９、請求項２８に記載の合成機であって、さらに合成を繰り返し循環するようにプログラムされた、合成機ＯユＩ」すＵ（塁種々の文献を本明細書中に引用する。これらの文献は、本発明に関連する技術水準をより充分に記載するために、本願明細書中に参考として援用する。

発明の背景異種の遺伝子系でＤＮＡフラグメントを機能的に発現させるための技術は、ＤＮＡ源の入手し易さに非常に大きな度合で依存している。遺伝子工学操作のための遺伝子物質を入手するには、２つの方法がある＝（１）天然源から適当な形にＤＮＡを単離、精製する（この技術は、よく作り上げられており、そして遺伝子工学および分子生物学の重要な要素を構成する）、または（２）種々の化学的−酵素的アプローチを用いるＤＮＡ合成であり、過去１５年以上にわたって熱心に探求されてきた学問である。前者のアプローチは、天然に生じる配列に限られ、配列自体を特異的に改変するのが容易ではない。後者のアプローチは、さらにもっと複雑で、労力を要する。しかし、化学的−酵素的なアプローチは、特に大きな制限もなく、いかなる所望のＤＮＡ配列でも調製可能であるなどの、多くの魅力的な特徴を有する。

現在は、オリゴヌクレオチドを合成し、アセンブリーして長いＤＮＡフラグメントにするために、２つの一般的な方法がある。第１は、合成されるべき配列全体を有するオリゴヌクレオチドを、最初にアニールさせ、次いでニックをＤＮＡリガーゼで修復する。次いで、フラグメントは直接クローニングされ、またはポリメラーゼチェーンリアクシ謬ン（ＰＣＲ）による増幅後に、クローニングされる。ＤＮＡは、インビトロで、より長い配列にアセンブリーするために使用される。このアプローチは、オリゴヌクレオチドの二次構造に対して、非常に鋭敏であるがそれは二次構造が合成を妨害するからである。それ故に、このアプローチは、効率が低く、そして長いＤＮＡフラグメントのアセンブリーに対する信頼性が低い。

遺伝子合成のための第２の一般的な方法では、ポリメラーゼを用いてアニールしたオリゴヌクレオチドペアーの、一本鎖のギャップを埋める方法である。ポリメラーゼ反応の後、オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は二本鎖になり、そして制限酵素で切断後、直接クローニングするか、または別の二本鎖フラグメントとライゲージリンすることにより、より長い配列にアセンブリーする。このアプローチは、比較的オリゴヌクレオチドの二次構造には無関係である；しかじ、ポリメラーゼ反応の後、各セグメントはクローニングされなければならない。このクローニング工程は、長いＤＮＡフラグメントの合成を有意に遅らせ、そしてアプローチの効果を著しく減少させる。さらに、このアプローチは、比較的小さいＤＮＡフラグメントのみに対して用いられ得、そして配列中に制限酵素認識部位を組み込む必要がある。

このように、現在ＤＮＡ合成のためのアプローチの大きな本質的な欠点は、低い効率、および使用前にクローニング手順により、またはＰＣＲにより合成したＤＮＡを増幅しなければならないという必要性である。現在のアプローチの主要な問題点は、長いポリヌクレオチドは、非効率な化学的または酵素的合成のいずれかを利用して、比較的短いオリゴヌクレオチドからアセンブリーされなければならないことである。長いポリヌクレオチドを合成するために短いオリゴヌクレオチドを使用することは、相補的塩基の種々の相互作用から生じる多（の問題、およびオリゴヌクレオチドの不利に作用する二次構造に関する問題の原因となり得る。これらの問題が効率を低（し、そして現在の合成のアプローチが広く用いられることを妨げている。

それ故に、あらゆる所望の配列の合成りＮＡを作るための、効果的な方法が非常に望まれている。このような方法は、あらゆる場合に適用され得る。例えば、この方法を用いて、公知の配列中に特異的な置換を有するＤＮＡの配列が効率よく作られ得、そしてこの配列は、改良された機能を発現し、そしてその機能でスクリーニングされる。本発明は、これらの要求を満足し、効率的でそして強力なりＮＡを合成する方法を提供する。

この方法は、一般的に可変鋳型反応（Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅ　ＴｅｍｐｌａｔｅＲｅａｃｔ　１ｏｎ）　（ＥＴＲ）と言われる。

発明の要旨本発明は、デオキシオリゴヌクレオチドを結合するサイクリックメカニズムに基づいてＤＮＡを合成する方法であって、特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドを循環させてノ１イブＩノダイズさせてＤＮＡを形成する条件下で：（ａ）一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドであって、それぞれ力（、二本鎖となったときに酵素的に処理されて、特有の３°−一本鎖の突出部を形成し得る５′ −配列を有し、該突出部は該一連の他の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドと選択的にサイクリ・ツクハイブリダイゼーシ曹ンし得る、一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチド；（ｔ））（ａ）の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドの一つと選択的にノーイブリダイズし得る３゛−配列を有する、特有のデオキシポリヌクレオチド；（Ｃ）一本鎖デオキシポリヌクレオチドからの二本鎖デオキシポリヌクレオチドの形成に関するポリメラーゼ；および（ｄ）二本鎖デオキシポリヌクレオチドから特有の一本鎖３゛突出部を形成し得る酵素；を組み合わせることを包含する方法を提供する。更に本発明は、一連の特有の合成一本鎖デオキシポリヌクレオチドが、それぞれが、責合して二本鎖になったときに酵素的１こ処理されて、特有の３°−一本鎖の突出部を形成し得る５°−配ＦＩＪを有し、該突出部は該一連の他の特有の一本鎖デオキシボ＋７ヌクレオチドと選択的にサイクリ・ノクハイブリダイゼーシヨンし得る、一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドを包含するキットもまた提供する。

図面の簡単な説明図１は、サイクリ・１りＥＴＲに対する一般的な機構の図式である。

図２−１は、ＨＢＶに対応するフラグメントをＥＴＲ合成するために設計したオリゴヌクレオチドの配列を示す。ＥＴＲ（ＢｉｔＸＩ）およびクローニング（ＢｇｌｌｌおよびＡｐａｌ）のために使用する制限酵素の認識部位を示す。

図２−１■は、ＦＩＢＶゲノムに対応する３つのデオキシオリゴヌクレオチドに対するＥＴＨのメカニズムの段階的な説明を示す。

図３−Ｉは、ＨＣＶのヌクレオキャプシド遺伝子の５°末端領域に対応するデオキシオリゴヌクレオチドの一次構造を示す。

ＥＴＲ（ＢｓｔＸｌ）、遺伝子のアセンブリー（Ｄｄｅり、およびクローニング（Ｎｄｅｌ）に用いた制限酵素の部位が示されている。

図３−１１は、ＥＴＲを図式的に表したものを示す。デオキシオリゴヌクレオチドは、実線として示されている。点は、二本鎖フラグメントのＤＮＡポリメラーゼで合成された領域を表す。

上の鎖は、オリゴｌおよび新たに合成された配列からなる。

下の鎖は、ＢｓｔＸＩで切断後の、および鎖のまさに３°末端で新しい配列を合成後の、残存するオリゴヌクレオチド配列で構成されている。反応に関与するデオキシオリゴヌクレオチドの順番が示されている。

図４−Ｉは、ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子の中央の部分に対応するデオキシオリゴヌクレオチドの一次構造を示す。

図４−１１は、ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子の中央の部分に対応するＥＴＨの図式である。

図５−１は、）ＩＣＶヌクレオ牛ヤブシド遺伝子の３°末端領域に対応するデオキシオリゴヌクレオチドの一次構造を示す。

図５−１１は、ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子の３゛末端領域に対応するＥＴＨの図式である。

発明の詳細な説明可　鋳型反応ＥＴＲ）　の雪日。ＥＴＲは、長いポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントを合成するための方法であって、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型として短い合成オリゴヌクレオチドを用いる。この方法は、以下の３つの主要な成分を含むサイクリック機構に基づ＜：（Ｌ）二本鎖ＤｌｉＡを合成するポリメラーゼ活性、（２）３’末端一本鎖領域を創り出す酵素活性、および（３）ポリメラーゼ反応の鋳型として使用される特異的に設計された合成デオキシオリゴヌクレオチド。

最も重要な工程は、ポリヌクレオチド鎖を合成する「伸長点」で３°末端一本鎖領域が酵素により生成される工程であり、その伸長点は、続くポリメラーゼ反応の鋳型として次のオリゴヌクレオチドの相補的な結合に使用される。

各サイクルに対してオリゴヌクレオチドが付加されていく順番は、それぞれの３ °末端配列にコードされている。伸長しているＤＮＡ分子の３°末端で、ヌクレオチドの特異的な配列は、合成オリゴヌクレオチド由来のヌクレオチドの相補的な配列とアニールし得る。従って、１つの工程で長いＤＮＡフラグメントを合成することは可能である。それは、全ての必要な酵素活性を含有し、混合物を至適温度および至適緩衝液でインキコベートすることにより１本の反応チューブ内で、デオキシオリゴヌクレオチドの全セットと単に結合することにより、可能である。

各サイクルは、合成オリゴヌクレオチドの３゛末端領域と二本鎖ＤＮＡの３゛突出（ｐｒｏｔｒｕｄ　［ｎｇ）領域との相補的結合で始まる（図１の工程ｌ）。

アニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼ反応が起こり、短い合成オリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼに対する鋳型として用いられて、ＤＮＡの第２の鎖が作られる（図１の工程２）。重合の完了後、二本鎖ＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドの長さの分伸長された。ＤＮＡ合成サイクルの第２ラウンドを始めるために、他の酵素反応が起こり、５゛末端から数個のヌクレオチドを取り除いて、３° 付着末端を残すようにして３゛突出一本鎖部分が作られる。この突出部は、他の短い合成オリゴヌクレオチドとのアニールに用いられる（図１の工程３）。

従って、本発明は、デオキシオリゴヌクレオチドを結合するサイクリックメカニズムに基づいてＤＮＡを合成する方法であって、特有のデオキシポリヌクレオチドを循環させてハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされたデオキシポリヌクレオチドを重合してＤＮＡを形成する条件下で：（ａ）一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドであって、それぞれが、二本鎖であるときに酵素的に処理されて、特有の３−一本鎖の突出部を形成し得る５°−配列を有し、該突出部は該一連の池の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドと選択的にサイクリックハイブリダイゼーションし得る、一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチド；（ｂ　Ｈａ　）の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドの一つと選択的にハイブリダイズし得る３°−配列を有する、特有のデオキシポリヌクレオチド；（Ｃ）一本鎖デオキシポリヌクレオチドからの二本鎖デオキシポリヌクレオチドの形成に関するポリメラーゼ；および（ｄ）二本鎖デオキシポリヌクレオチドから特定の一本鎖３゜突出部を形成し得る酵素；をあらゆる順番で組み合わせることを包含する方法を提供する。

本明細書中で使用される「サイクリック」は、通常の繰り返し順での逐次ハイブリダイゼーシヨンを意味する。従って、上記のように、デオキシポリヌクレオチド（以下ｒ　ＤＰＮＴＪとする）のハイブリダイゼーションが、特異的に制御された順番でのみ起こる。例えば、それぞれが所望の長いＤＰＮＴ特有のセグメントをコードしている（２つまたはそれ以上の）一連のＤＰＮＴが、合成される。

合成において、それぞれのＤＰＮＴの配列は、酵素により切断される時に、特有の３°−突出部が作られるように選択される。この３°−突出部は、一連のＤＰＮＴの中のたった一つとのみハイブリダイズする。ＤＰＮＴが結合する場合、ＤＰＮＴの内２つだけが、最初にハイブリダイズする。一旦このノーイブリダイゼーシ１ンが起こると、残りの合成される配列がセ・１トされる。ポリメラーゼは、２つのハイブリダイズしたＤＰＮＴを利用して、二本鎖を形成する。次いで、好適な酵素が二本鎖ＤＰＮＴに作用して、特有の３°一本鎖突出部を形成する。

次いで、この特有の３゛突出部とのみハイブリダイズする次のＤＰＮＴがハイブリダイズする。一旦このハイブリダイゼーションが起こると、ポリメラーゼは再び二本鎖の合成へと向かう。二本鎖の形成後、酵素は再び特有の３°一本鎖突出部をつくりだす。

この末端は、次の特有のＤＰＮＴのみとハイブリダイズさせるように、合成されたものである。次いで、配列は所望の回数繰り返される。

本発明は、両方向へ向って進むハイブリダイゼーションおよび切断を提供する。

例えば、最初にＤＰＮＴを、引き続いて形成される両末端の部分に切断部位を有する所望の配列の中央部にハイブリダイズする。ＤＰＮＴおよび酵素を選択することにより、一方向性の合成手順を行うことができるが、二本鎖ＤＮＡの両末端に酵素部位が作られる。

上記の方法により、一旦長いＤＰＮＴが作られると、新たな一連のＤＰＮＴであって、それぞれが、重合して二本鎖になったときに酵素的に処理されて、特有の３°−一本鎖の突出部を形成し得るＳ−配列を有し、該突出部は該一連の他の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドと選択的にサイクリ・ツクハイブリダイゼーシ冒ンし得るＤＰＮＴが加丸られ得る。この手順は、何回も繰り返され得る。

ＤＰＮＴの反応回数は、ハイブリダイゼーションの望ましくない妨害によりのみ制限される。このことは、特有の３゛突出を創り出し、そして配列の類似性が低いＤＰＮＴをハイブリダイズすることにより避は得る。従って、遺伝子およびゲノム全体を含有する非常に長いＤＰＮＴは、この方法により合成され得る。

上記から理解し得るように、この方法は特有の３′一本鎖突出部が、酵素的に処理されハイブリダイズされた特有のＤＰＮＴにより形成されるかぎり、実施される。「特有」は、ＤＰＮＴの１つのヌクレオチド配列を意味し、この配列は別のＤＰＮＴ上には存在しないので、選択的なハイブリダイゼーシヨンが起こり得る。選択的なハイブリダイゼーシヨンに必要な特有のヌクレオチドの数は、ハイブリダイゼーション条件に依存する。

例几ば、４ヌクレオチドの３°突出部は、反応の至適温度は約３７℃である。この至適温度は、他のポリメラーゼを合成に利用した場合は異なる。これは真実である。なぜなら、ポリメラーゼが異なると、相補的な複合体に対する親和性が異なるからである。熱安定性酵素もまた、このような複合体にむしろより高い親和性を有する。より長い３°突出部はハイブリダイゼーションにおいて、より反応性に富み、そしてより特異的であり、そしてより高いアニーリング温度を用いる。しかし、一本鎖領域は、二次構造が形成されるのを避は得る大きさでなければならない。この領域は、ハイブリダイゼーションに効果的であるためには、反応温度では一本鎖の形態をとる。この観点から、より高い反応温度が用いられ得るため耐熱性の酵素がＥＴＲでより効果的であり得、従って、非常に効果のある一本鎖末端領域は、約７−９ヌクレオチド長さであり得る。このような長さは、一本鎖形態を維持する条件は常法で見出し得る。ＤＰＮＴ間の特異的で相補的な複合体は、より高温で効果的に構成され得、この温度では不正確な複合体を形成する可能性が減少する。７−９ヌクレオチド３゛突出部の至適温度は、５５−６５ ℃付近であり、耐熱性のポリメラーゼの活性に至適な温度である。従って、３° 突出部の好適な長さの範囲は、約３−１２ヌクレオチドである。実施例の節に記載した方法により、特定の系における至適長さおよび至適温度をルーチンでテストし、より長い突出部を作成し得る。

一連のメンバーの正確な５′配列は、最終的なりＮＡに所望される配列および突出部の形成に使用する酵素の種類に依存する。

従って、一旦最終的な所望の配列が選択されると、所望の配列に相当する５°− 配列が合成され、切断されるかまたは露出されて、所望される配列が残り、または所望でない配列はもしあるとすれば、次の組のメンバーとハイブリダイゼーシツンする前に除去される。例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いる場合、ハイブリダイズのための一連のそれぞれのメンバーに特有の配列が作られるように切断されなければならない。

ＢｓｔＸＩは、実施例の節に詳細に記載するように、このような制限エンドヌクレアーゼの１例をしめす。このエンドヌクレアーゼにより、４つの特有のヌクレオチドが一連のそれぞれのメンバー中に合成され、切断後にも残るからである。

処理されると特有の３°突出部を生じる５°−配列の特有な性質により、一連のＤＰＮＴのメンバーは、制限エンドヌクレアーゼが用いられる場合に、例えばＤＮＡ合成機で合成される。ノ＼イブリダイゼーシゴンを開始するＤＰＮＴは、第２のＤＰＮＴと直接／Ｘイブリダイズし得るので、酵素的な処理により影響を受けない。

従って、第１の特有のＤＰＮＴは、所望であれば合成以外の方法で入手され得、そして一本鎖または二本鎖化され得る。例えば、ＤＰＮＴは、天然のＤＮＡから、例えばプラスミド、ファージのゲノム、またはウィルスのゲノムを制限エンドヌクレアーゼで切り取ったフラグメントであり得る。同様に、フラグメントはＰＣＲを用いて特異的に増幅することにより入手され得る。

ＰＣＲフラグメントは、より適切である。それは、増幅したフラグメントの末端配列は、プライマーで容易に改変され得るからである。ここで、プライマーは、ヌクレオチドの人工的に合成された非天然状導体を含む、所望のヌクレオチドの改変を導入して増幅に用いられる。選択された条件下で効率的にハイブリダイゼーションを行うのに充分な適切なヌクレオチドは、この最初のハイブリダイゼーションに利用され得る。

この特有の合成を開始させるＤＰＮＴは、一連のものから、第二のＤＰ　ＮＴをハイブリダイゼーションするための鋳型を提供して合成を開始するが、効率を挙げるために固体支持体に結合され得る。固相により、合成したＤＮＡを反応の他の成分から効率的に分離し得る。別の支持体も、この方法に適用され得る。

例えば、支持体は、マグネチックラテックスビーズまたはマグネチックコントロールポアガラスピーズであり得る。第１のＤＰＮＴに付着したこれらのビーズにより、所望の生成物が反応混合物から磁石により分離される。ＤＰＮＴはビーズに、種々の公知の技術により結合し得る。その技術は、例えばカルボジイミド処理（Ｇｉｌｈａｍ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　７：２８０９−２８１３　（１９６８）；Ｍｉｚｕｔａｎｉ　およびＴａｃｈｂａｎａ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏ　ｒａ　ｈ　３５６：２０２−２０５（１９８６）；　Ｗｏｌｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：２９１１−２９２６　（１９８７）；　Ｍｕｓｓｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：５３５３−５３７２　（１９８））ＨＬｕｎｄら、Ｎｕｃｌｅ［ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：１０８６１−１０８８０　（１９８８））である。固相に付着したＤＰＮＴは、ＤＮＡ分子全体を合成するためのプライマーである。合成は、和合性オリゴヌクレオチドのセットと酵素を共に加えて行われ得る。適切な時間インキ１ベートした後、この方法では結合しなかった成分を洗い流し、そして反応を繰り返して、鋳型として利用されるそれぞれのオリゴヌクレオチドの効率を上げる。あるいは、他のオリゴヌクレオチドセットを加えて、合成を続は得る。この「セット原理」は、溶液での合成でしか行えないが、この方法を、（他の如何なる方法でもできない）長いＤＮＡ分子を合成するための非常に強力な方法に変える。

固相は、合成に効果的に用いられるが、長いＤＮＡを合成するのに充分な空間を有するボアがある。固相は、反応に不要なあらゆる成分と非特異的に結合し得ない材料で構成され得る。

この問題を解決する１つの方法は、長いＤＮＡ分子に対して適切なコントロールボアガラスピーズを用いることである。最初のプライマーは、長いコネクターを通じてビーズに付着され得る。コネクターの役割は、固体支持体の表面から好適な距離に、プライマーを置くことである。

部分的にハイブリダイズした一本鎖から二本鎖の合成に関する、あらゆるポリメラーゼが使用され得る。適切なポリメラーゼは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸１！ｌＤＮＡポリメラーゼ■の長いフラグメント、Ｔ７フアージのＤＮＡポリメラーゼを包含する。重合の至適条件は、使用するポリメラーゼの型により異なる。同様に、至適ポリメラーゼも合成に必要な条件により異なり得る（Ｂｅｊら、Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２６　（３−４）：３０１−３３４　（１９９１）：　ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：　４０７６−４０８０　（！９８９）；　Ｐｅｔｒｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８５：　６２５２−６２５６　（１９８８））ｏ　５°末端から特定のヌクレオチドを取り除く作用のある酵素の１つの例は、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＸＩである。この制限エンドヌクレアーゼは、ＥＴＲと和合性である。その理由を、以下に示す：（１）３’突出部が作られている、（２）一本鎖３°突出部には如何なる配列制限もない、および（３）切断後、制限部位は次の合成用オリゴヌクレオチドとの相互作用により修復される。

（以下余白）実験の部はＢｓｔＸＩの使用に関しているが、本発見は、どのようにして得られるかをとわず、特有の３−突出部の生成にある。従って、本願の方法には、二本鎖ＤＮＡから特有の３“−突出部を形成し得る任意の酵素が利用され得る。本方法に使用される他の現在知られている酵素として、Ｔ７およびλファージのエキソヌクレアーゼのような二本鎖ＤＮＡに特異的な５°−エキソヌクレアーゼ、およびｒｅｃＡのようなりＮＡ組換え酵素を含む。

二本鎖ＤＮＡに特異的な５−エキソヌクレアーゼを利用する方法は、以下のように実施し得る：ポリメラーゼ反応のテンプレートとして反応に用いられるオリゴヌクレオチドを、特定の部位で化学的に改変してＴ７エキソヌクレアーゼが改変ヌクレオチドを飛び越えないようにする。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｓ　ｍ　、　Ｓｅｒ、　２１：１１９−１２０（１９１１９）に記載の方法を用いてオリゴヌクレオチドホスホロジチオエートが、利用され得る。上記のように、ボリメラ・−ゼはまずハイブリダイズしたＤＰ　ＮＴのギャップを埋める。反応終了後、Ｔ７のエキソヌクレアーゼは５−末端から二本鎖ＤＮＡを切断し始める（反対側の５°−末端は末端から切断されないように修飾するかまたは固相に接着される）。この反応は改変位置まですすんで終わる。

次いで、エキソヌクレアーゼ活性により作られた３°−突出部は、サイクル反応で次のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに用いられ得る。Ｔ７が二本鎖ＤＮＡに比較的強い選択性を有することは周知である。

（ＫｅｒｒおよびＳａｄｏｗｓｋｉ、Ｌ１旦ム１．Ｓｈ剋Ｌ２４７：コ１１−３１８　（１９７２）；　Ｔｈｏｍａｓｌよび０１１ｖｅｒａｌ　ユニー司よΩよニーｑｈ皇息。

２５コニ４２４−４２９　（１９７Ｂ）；　５ｈｏｎ　ら　、　シ　２５：ｌコ８２コー１コ８２７　（１９８２））他の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、λファージにコードされている（　５ａＹｅｒＳら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：７９１−８０２（１９８８））。この酵素もまた本方法で利用し得る。

これらのエキソヌクレアーゼの主な利点は、反応で、より高温で使用するのに必要なあらゆる大きさの一本鎖３°−突出部を作る可能性があることである。さらに、エキソヌクレアーゼは任意の平滑末端を認議するため、これを使用することにより、二本鎖に重合されたときに制限部位を有するＤＰＮＴの合成が必要でなくなる。

ＤＮＡ組換え酵素を用いても本方法を実施し得る。ｒｅｃＡは強い配列特異的な方法で、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖をＤループ構造を作る溶液からの一本鎖ＤＮＡで、置換し得る。

（ｃｏｘおよびＬｌｌｈｌｌａｎ　ａ　Ａｎｎ。

ｖ　°　５６：２２９−２６２　（１９８７）；　Ｔａｄｉ−Ｌａｇｋｏｗｓｋｉら”　１６＝８１５７−８１６９　（１９８ｇ）；　Ｈａｈｎら　、ム旦工ｑＬ４−ｑｈ皇ｍ１２６コ：７４コｌ−７４３６（１９ｆｌＢ））本方法のこの改変において、ＤＰＮＴはポリメラーゼおよびｒｅｃＡを用いて一反応で結合する。ポリメラーゼは一本鎖ギャップを埋め、ｒｅｃＡは二本鎖ＤＮＡ鎖のうち１つの末端領域をポリメラーゼに新しいテンプレートを提供する溶液からの一本鎖ＤＰＮＴで、置換する。この反応の利点はハイブリダイゼーシコンの強い特異性であり、それは酵素の関与による。その他の種々の方法としては、例えば制限エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼでは、ハイブリダイゼーションは、酵素の関与がない唯一のステップである。制限エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは、３゛−突出部を作り得るのみだが、ｒｅｃＡは二本鎖ＤＮＡの末端で一本鎖領域を作り、その３゛−突出部にオリゴヌクレオチドをアニールし得る。

本発明はまた、本発明に用いられる種々の新規組成物を提供する。ＤＰＮＴが、それぞれが重合して二本鎖になったときに、酵素的に処理されて特有の３°−一本鎖突出部を形成し得る５°−配列を有し、その突出部は、その一連の他の特有の一本鎖ＤＰＮＴと選択的にサイクリックハイブリダイゼーシ嘗ンし得る、一連の特有の合成一本鎖ＤＰＮＴを含むキットを提供する。ＤＰＮＴは凍結乾燥してまたは生理食塩水のような適切なキャリアー中に存在し得る。キットは、さらに一連の特有の一本鎖ＤＰＮＴのうちの１つに選択的にハイブリダイズし得る３° −配列を有する特有のＤＰＮＴを含有し得る。その上さらに、キットは一本鎖ＤＰＮＴから二本鎖ポリヌクレオチドの形成を指示し得るポリメラーゼを含み得る。更にキットは、二本鎖ＤＰＮＴから特有の一本鎖突出部を形成し得る酵素を含み得る。

本発明はまた、請求項１に記載の方法を実施し、望ましくない組成物を除くようプログラムされた自動合成機を提供する。この合成機は合成を繰り返し循環するようにプログラムされ得る。

に籠五材料と方法デオキシオリゴヌクレオチドを自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ＋　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いて合成し、ＴＢＥ緩衝液（０，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡおよび７Ｍ尿素を含む、０．０４５Ｍはう酸トリス、ｐＨ８，３）の１０％ポリアクリルアミドを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製した。オリゴヌクレオチドは電気溶出によりゲルから回収した。

ＥＴＲは、３７℃でｏ、ｓ〜ｓ時間、１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液、ｐＨ７，９１７）５０μｌノ容量で行ツタ。反応溶液は、ｌｏｍＭ　ＭｇＣ１：　５０ｍＭ　ＮａＣ１；　１ｍＭ　ＤＴＴ；それぞれ０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　；５ユニツトの天然のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）　；３０−ＬニットのＢｓｔＸｌ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）　；および各デオキシオリゴヌクレオチドの０．５〜１００１００ｐを含む、反応経過の分析は、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、　ＳｍＭ　ＤＴＴ、　ＬｏμＣＩ［７−”Ｐ］ＡＴＰ　（５゜Ｇｏｏ　Ｃｉ／ｍｍｏ１．　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　ｌｆｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＬ）　、および１０〜２０ｐ＋ｉｏｌのオリゴヌクレオチドを含む５ｈＭ　）リス塩酸、ｐＨ７，６中でＢｓｔＸ１部位を有しないデオキシオリゴヌクレオチドのうちの１つを用いて［γ−３２Ｐ］＾ＴＰで放射標識することにより行った。ＥＴＨの完了後、生成物を８Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドのＰＡＧＥにより分析し、特異的な生成物がオートラジオグラフィーで現れた。

結果ＢｓｔＸＩを　いたＥＴＨの　証ＢｉｔＸＩは、上記の要求を満たす市販のエンドヌクレアーゼである。この酵素の主な欠点は、次のオリゴヌクレオチドをアニーリングするのに４つのヌクレオチドの一本鎖３°−突出部しか生成しないことである。本発明者らは、この短い突出部は更に長い突出部を生じるエキソヌクレアーゼと比較するとＥＴＩ？の全体の能率を低（することを予測した。それにもかかわらず、本発明者らはこの方法がＥＴＲによるＤＮＡ合成に関与する循環メカニズムを検証するための最も簡単な方法に相当したので、このアプローチを調査することを決定した。そこでさらに、４組のオリゴヌクレオチドを設計し、合成した（図２〜５）。

第１セツト、Ｂ型肝：ウィルス（ＨＢＶ　ゲノムのＤＮＡフラグムヱエ旦皇底　最も有力な合成りＮＡフラグメントの適用の１つは、特に、長い配列中に多（の変異の導入を望むとすれば、ＤＮＡの部位特異的変異である。ＥＴＲを用いて、ＨＢＶゲノムの末端のタンパク質をコードする配列に相当するＤＮＡフラグメントを合成し、デオキシヌクレオチドの１つのヌクレオチド配列を変化することにより改変した。このフラグメントは、３つのデオキシヌクレオチドから作られ（図２−１）（配列番号２〜４）、図２−１１に示すようにＥＴＨにより合成された（配列番号５〜９）。３つのデオキシヌクレオチド全ては、ＤＰＮＴの存在下でＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔＸｌで１つのチューブ内で結合した。異なる相対濃度のオリゴヌクレオチドが反応で用いられた。デオキシヌクレオチド＾（配列番号２）を放射標識した。デオキシヌクレオチドＡおよびＢ（配列番号３）の濃ｉＥ　’ｆｉ：　ｌ　ｐｌａｌに固定し、デオキシヌクレオチドＣ（配列番号４）の濃度をｔｐ謙ｏ１．１０ｐｇ＋ｏｌ、および１００１００ｐで用いた。１０ｐｍｏｌおよび１００ｐ＋ｚｏｌのＣを含む反応は、１０ｐｍｏｌおよび１００１００ｐを含む反応の間の効果に有為な差異はないが、ｌｐｍｏｌのＣを含む反応より効果があった。Ｂの量を１０ｐｍｏｌに増加したときに、全長の７ラグメントの合成効率に改善はなかった。標ｍＡの１０倍を越えるモル過剰の８およびＣは、ＥＴＨの効果を改善しなかったが、これらの条件は反応をさらに再現性を良くした。次の全ての実験では、標識オリゴヌクレオチドの少なくとも１０倍モル過剰の非標識オリゴヌクレオチドが、反応をモニターするために用いられた。ＢまたはＣを含まないコントロール実験で、予期された大きさのＤＮＡフラグメントは見つからなかった。反応（よ、４℃、１０℃、２０℃、３７ ℃、４２℃、および６５℃の定温で行なわれた。最高の収率は、３７°Ｃで得られた。４℃、１０℃、または度ではＡおよびＢのダイマーのみ見られた。３７° Ｃでは、全長のフラグメントが５分のインキュベージ１ン後に得られた。５時間のインキュベージ１ン後に、全長のフラグメントは、オートラジオグラフィーにより強い）１′ンドを与えた。このフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼで切断され、ＰＣＲＩこより増幅され、電気泳動により測定される正確な大きさのフラグメントを生成した。

放射標識デオキシヌクレオチドＡを用いる実験で、全長の７ラグメントが変性条件下の電気泳動で同定された。放射標識デオキシヌクレオチドＣが用いられたとき、合成は起こらなかった。この結果は再現され、ＡのみがＢおよびＣをテンプレートとして用いる全長のＤＮＡフラグメントのポリメラーゼ合成を開始し得ることを示唆した。ＥＴＨの二本鎖ＤＮＡ生成物は、ポリメラーゼ反応により合成され、Ａで開始された中断のない鎖、およびポリメラーゼ反応用のテンプレートとして反応に関与した他のオリゴヌクレオチドとの間にニックを有する第２鎖を含む。これらのニックは、ＤＮＡリガーゼで修復され得る。または、ＤＮＡフラグメントは直接クローニングに用いられ、ＰＣＨにより増幅され、または制限エンドヌクレアーゼのような他のＤＮＡ修飾酵素で処理され得る。

２セツト、Ｃ型　：ウイルス　ＨＣＶ　のヌクレオ牛ヤプシタンパク　をコードするＤＮＡフラグメントの合成　ＨＣｖヌクレオキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を３７ラグメントに分けた。各フラグメントを、ＥＴＲにより別々に合成した（図３〜５）。第１のフラグメントは、５デオキシヌクレオチド（図３）（配列番号１０〜１４）から、第２のフラグメントは３デオ牛ジヌクレオチド（図４）（配列番号１５〜１７）から、そして第３のフラグメントは、４デオキシヌクレオチド（図５）（配列番号１８〜２１）から合成された。反応はすべて上記のように行われた。最長の合成フラグメントは、２２８塩基対（ｂｐ）を含んでいた。全長の７ラグメントの収率は、約５〜１０％であると見積られた。

オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子（図３）の第１のセグメントをＥＴＲで合成するために種々の緩衝液を試験した（表１）。

ＮＥＢ３緩衝液は、Ｂｓ　ＬＸ　ｌに最適の緩衝液であるのに対して、種々のＴａｑ緩衝液がＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼに最適である。しかし、ＥＴＲ反応の最良の結果はＮＥＢ２およびＮＥＢ４で得られた。

ＢｓｔＸＩおよびＴａｑポリメラーゼの両方が、高い至適温度条件を有する。しかし、ＢｓｔＸｌにより短い一本鎖突出部が形成されるため、ＥＴＲはこれらの酵素の至適温度よりむしろ、３７℃で最適であることが判明した。

ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子（コアタンパク質）に相当する第１のセグメントのＥＴＲ合成において、デオキシヌクレオチドの相対濃度は１　：　４　：　２０　：　４０　：　６０であった。相対濃度が１：１：２０：４０：６０に変化したとき、ＥＴＨの反応率（速度）も同様に変化した。

オリゴヌクレオチドの１：４：２０：４０：６０の相対濃度で、ＮＥＢ２中で３７°ｃ、３時間インキュベーンコン後に全長フラグメントが検出され得た。デオキシヌクレオチドｌおよび２の１：ｌの相対濃度で、フラグメントがたった３０分間のインキュベージｌン後に検出可能な量合成された。

ＥＴＨにより合成された３つのフラグメントの各々を、ＰＡＧＥにより精製し、ＰＣＨにより増幅した。増幅生成物を、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＤＮＡリガーゼで処理した。全遺伝子ヲ再び増幅し、制限エンドヌクレアーゼマッピンクニヨり分析した。増幅生成物を、Ｔ７プロモーターのコントロール下で発現ベクターに挿入した。簡単にいうと、このＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＴＳ７　（特にＨＣＶコアタンパク質の発現用に構築された）を、Ｎｄｅ　Ｉおよび旧ｎｄｌｌｌで切断した。酵素を除いた後、これらのＤＮＡ成分を混合し、ＤＮＡリガーゼで処理した。ライゲーション混合物かを用いてＥ、　ｃｏｌｉを形質転換し、Ｔ　７　ＲＮＡポリメラーゼを生成した。形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉ細胞は、免疫活性生成物を発現したがこれはすてにＨＣｖ抗コア活性の反応性を示すことが知られている血清（ＭＡＴＲＩＸ、　ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋｓ　ＩＬ）を用いるウェスタンプロ、７ト分析により検出された。さらに、発現生成物は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、正確な分子量を宵した。従って、ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子に相当する３つのセグメントは全て、　ＥＴＨにより正しく合成された。

次いでフラグメントを、標準方法を用いて配列決定した。

配列でＥＴＨの成功が確認された。配列で正確に設計通りであることが判明した。ＥＴＲを利用したＤＮＡ合成は正確な原物通りのＤＮＡを合成する方法である。

前述の記載は本発明の好ましい実施態様にのみ関係していることおよび以下に示す請求の範囲に記載のように多くの改変および修飾がなされることを理解するべきである。

（以下余白）配列表（１）一般的情報：（ｉｉ）発明の名称：可変鋳型反応（ＩＩＩ）配列数：２１（ｉｖ）連絡住所：（Ａ）住所人：二−ドル＆ローゼンパーグ、ビイ、シイ。

（Ｂ）番地ニスイード　４００．エヌ、ダブリ１−０．カーネギイウエイ（Ｃ）市：アトランタ（Ｄ）州ニジ冒−ジア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：　３Ｇ３０３（Ｖ）コンピューター読み出し形！１：（＾）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換（Ｃ）ＯＳ　：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリースＳｔ、Ｏ，バージ冒ンｔｔ、ｚｓ（ｖｌ）現在の出願データ：（＾）出願番号：米国第０７７８４９．２９４号（Ｂ）出願日：　１９９２年３月１０日（Ｃ）分類：（ｖｌｉｉ）代理人／事務所情報：（Ａ）氏名：ペリーマン、デイピタド　ジー。

（Ｂ）登録番号：３３．４３１１（Ｃ）照会／記録番号：　１４１４．００１（ｉＸ）電話回線情報：（＾）電話：　４０４−６８８−０７７０（Ｂ）テレファックス：　４０４−６８８−９８８０（県１碌り）（２）配列番号（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ）：１の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ＝１２塩基対（ＢＪ型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（目）配列の種類ニゲツムＤＮＡ（ｘｌ）配列の特徴：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　：ＩＣＣＡＮＮＮＮＮＮＴ　ＧＧ　１２（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：５９塩基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー；直鎖状（１１）配列の種類ニゲツムＤＮＡ（夏Ｉ）配列の特徴：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｔ　：２ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＭＴＣＴＣＧＧＧＡ　ＡＴＣＴＣＭＴＧＴ　ＴＡＧＴＡｎＣＣＴ　ＴＧＧＡＣＴＣＡ丁Ａ　ＡＧＧＴＧＧＧＭ　５９（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：３の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ：６８塩基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロノー：直鎖状（１ｉ）配列の種類ニゲツムＤＮＡ（ｘｌ）配列の特徴：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　：３（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：４の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さニア９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類ニゲツムＤＮＡ（ｘｉ）配列の特徴：配列番号（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ）　：４ｃｃＣＧＧＧＣｃｃＡ　ＣＡＡＡＴＴＧＴｒＧ　ＡＣＡＣＣＴＡＴｒＡ　ＡＴＡＡＴＧＴＣＣＴ　ＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧ　ＭＴＣＴＴＡＧＧ`　６０ＭＧＧＭＧＧＡＧ　ｍＧＣＣＡＣＴ　７９ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡ　ＴＭＧＧＴＧＧＧＡ　Ａ　２１り２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：９の情報：（１）配列の特色：（Ａ）長さ：３８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類ニゲ／ムＤＮＡ（ｘｉ）配列の特徴：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　＋９ＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＧｎＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＡ　ＧＡＴＣＴＧＧＧ　３Ｂ（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）・１０の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａｌ長さニア６塙基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（ｉｉｌ配列の種類ニゲツムＤＮＡ（×１）配列の特徴：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：１ＯＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡ　ＧＣＡＣＧＡＴＴＣＣＴＡＡＡＣＣＡＣＡＡ　ＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡ　ＭＣＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＡＣＧＡ　U０ＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧ　ＴＡＡＡＧＴ　７６（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：１１の情報：（宜）配列の特色：（Ａ）長さ＝６９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）ｊｌ［の数ニ一本鎖（Ｄ）トボロノー：直鎖状（Ａ）長さ二４５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状ＣＣＣＣＣＡＴＣＴＴ　ＣＣＴＧＧＴＣＧＣＧ　ＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡ　ＡＣＣＴＡＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣ４５ＧＧＣＴＧＣＧＧＧＴ　ＧＧＧＣＧ　７５ＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡ　Ｇ　７１（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＞＋２１の情報：（ｉ）配列の特色二（＾）長さニア３塩基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロノー：直鎖状（ｉ＋＞配列の種類；ゲノムＤＮＡ（ｘｉ）配列の特徴：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　：２１ＧＧＣＣＡＧＭＧＧ　ＭＧ　７３オリゴＡｇｌＩＩ５１リコ゛′Ｂ５ｔＸＩ５’　−ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣ丁ＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＧＧＴＡＣＴＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣ| ＣＣＡＣＣｎＡ丁Ａｐａ工ＭＡＧＧＡＡＧＧＡＧｍＧＣＣＡＣＴ９１１Ｉ５ｔＸＩ５ｔＸＩＮｄｅＩＢｓｔＸＩＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＧ　（２）５ｔＸ１５’−ＣＣＣＣＣＡＴｃｔｔｃＣＴＧＧＴＣＧＣＧＣＧＣＡＣＡＣＣＣＭＣＣＴＡＧＧＴＣＣＣｃｔｃｃ　（３）５ｔＸＩ５°−ＣＣＣＣＣＭｃｃｔｃＧＴＧＧＴＴＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧＧＡＡＧＴｃｔｔｃ　（４）ｄｅｌｄｅｌ５ｔＸＩＡＴＣＣＣＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧ　（７）１ａＩＳ’−ＣＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＣｎＡＣＣＣＡＡＡＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＴＡＣＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡ　（８）Ｃ１ａｌＢＳｔＸＩ５ｔｘｒＨｉｎｄＩＩＩ補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１゛８４条の８）平成６年９月１２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．デオキシオリゴヌクレオチドを結合するサイクリックメカニズムに基づいてＤＮＡを合成する方法であって、特有のデオキシポリヌクレオチドを循環させてハイプリダイズさせ、ハイブリダイズされたデオキシポリヌクレオチドを重合してＤＮＡを形成する条件下で：（ａ）一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドであって、それぞれが、重合して二本鎖になったときに酵素的に処理されて、特有の３′−一本鎖の突出部を形成し得る５′−配列を有し、該突出部は該一連の他の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドと選択的にサイクリックハイブリダイゼーションし得る、一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチド：（ｂ）（ａ）の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドの１つと選択的にハイプリダイズし得る３′−配列を有する特有のデオキシポリヌクレオチド；（ｃ）一本鎖デオキシポリヌクレオチドからの二本鎖デオキシポリヌクレオチドの形成に関し得るポリメラーゼ；および（ｄ）二本鎖デオキシポリヌクレオチドから特有の一本鎖３′−突出部を形成し得る酵素；を組み合わせることを包含する方法。
２．請求項１に記載の方法であって、さらに前記合成されたＤＮＡと第２の一連の特有の合成の一本鎖デオキシポリヌクレオチドとを、特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドを循環させてＤＮＡとハイブリダイズさせる条件下で結合させることを包含し、該第２の一連の特有の合成一本鎖デオキシポリヌクレオチドは、それぞれが、重合して二本鎖になったときに酵素的に処理されて、特有の３′− 一本鎖の突出部を形成し得る５′−配列を有し、該突出部は該一連の他の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドと選択的にサイクリックハイブリダイゼーションし得る、方法。
３．複数回繰り返される、請求項２に記載の方法。
４．請求項１に記載の方法であって、前記一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドが合成される、方法。
５．請求項１に記載の方法であって、前記一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドが遺伝子の特有部分を各々コードする、方法。
６．請求項１に記載の方法であって、前記一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドが少なくとも３つのデオキシポリヌクレオチドを含む、方法。
７．請求項１に記載の方法であって、前記５′−配列が、二本鎖になったときに制限エンドヌクレアーゼで酵素的に切断され、３′−突出部を形成し得る、方法。
８．請求項７に記載の方法であって、前記５′−配列が、【配列があります】（配列番号１）を含有し、Ｎは任意の核酸である、方法。
９．請求項１に記載の方法であって、前記５′−配列が、二本鎖になったときに二本鎖デオキシポリヌクレオチドに特異的な５′−エキソヌクレアーゼにより酵素的に切断され、３′−突出部を形成し得る、方法。
１０．請求項１に記載の方法であって、（ｂ）のデオキシポリヌクレオチドが、（ａ）のデオキシポリヌクレオチドと結合する前に固相支持体に結合される、方法。
１１．請求項１０に記載の方法であって、前記固相支持体がビーズからなる、方法。
１２．請求項１１に記載の方法であって、前記ビーズが固相のコントロールドポアガラスである、方法。
１３．請求項１２に記載の方法であって、前記ビーズがグリセロールでコートされている、方法。
１４．請求項１１に記載の方法であって、前記ビーズがアビジンでコートされている、方法。
１５．請求項１４に記載の方法であって、前記アビジンビーズがビオチンに結合されている、方法。
１６．請求項１に記載の方法であって、前記結合が実質的に同時に行われる、方法。
１７．請求項１に記載の方法であって、前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、方法。
１８．請求項１に記載の方法であって、前記酵素が制限エンドヌクレアーゼである、方法。
１９．請求項１８に記載の方法であって、前記制限エンドヌクレァーゼがＢｓｔｘＩである、方法。
２０．請求項１に記載の方法であって、前記酵素が二本鎖デオキシポリヌクレオチドに特異的な５′−エキソヌクレアーゼである、方法。
２１．請求項２０に記載の方法であって、前記エキソヌクレアーゼがＴ７エキソヌクレアーゼおよびλファージエキソヌクレアーゼからなる群から選択される、方法。
２２．請求項１に記載の方法であって、前記酵素がＤＮＡ組換え酵素である、方法。
２３．請求項２２に記載の方法であって、前記ＤＮＡ組換え酵素がｒｅｃｏＡである、方法。
２４．一連の特有の合成一本鎖デオキシポリヌクレオチドを含むキットであって、該一連の特有の合成一本鎖デオキシポリヌクレオチドは、それぞれが重合して二本鎖になったときに、酵素的に処理されて特有の３′−一本鎖突出部を形成し得る５′−配列を有し、該突出部は、該一連の他の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドと選択的にサイクリックハイブリダイゼーションし得る、キット。
２５．請求項２４に記載のキットであって、さらに前記一連の特有の一本鎖デオキシポリヌクレオチドの１つと選択的にハイプリダイズし得る３′−配列を有する特有のデオキシポリヌクレオチドを含む、キット。
２６．請求項２４に記載のキットであって、さらに前記一本鎖デオキシポリヌクレオチドから二本鎖ポリヌクレオチドの形成に関し得るポリメラーゼを含む、キット。
２７．請求項２４に記載のキットであって、さらに前記二本鎖デオキシポリヌクレオチドから特有の一本鎖突出部を形成し得る酵素を含む、キット。
２８．請求項１に記載の方法を実施し、望ましくない成分を除くようにプログラムされた、自動合成機。
２９．請求項２８に記載の合成機であって、さらに合成を繰り返し循環するようにプログラムされた、合成機。