JPH07507304A - 製薬的に許容しうる固定乾燥ヒト血液血小板 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 製薬的に許容しつる固定乾燥ヒト血液血小板本出願は、１９９２年５月２９日に 出願された、係属出願、出願番号０７／８９１．２２７の一部継続てあり、その 開示を全ての引用して明細書記載の一部とする。

発明の分野 本発明は、ヒト患者への投与に適した固定乾燥血液血小板及び固定乾燥血小板の 局所適用による傷ついた組織の処置方法に関する。

発明の背景 輸注医療での血小板濃縮物の使用は、過去３０年間に十分に確立して来た。しか しながら、貯蔵期間中の血小板機能の急速な損失と細菌汚染の危険により、血液 銀行での血小板濃縮物の有効な商品目録の取り扱いが非常に困難である。多くの 場面で、血小板濃縮物の限られた貯蔵安定性はそれらの使用を劇的に減じて来た 。

Ｅフレイン等、ジャーナル・オン・ペディアトリクス４９．５１７−５２２（１ ９５６）は、凍結乾燥血小板材料の調製及び急性白血病及び再生不良性貧血の小 児への投与を記載している。注入の部位での痛みと静脈症Ｍｌ　（ｖｅｎｏｓｐ ａｓｍ）を示した。これらの材料の限られた有効性は本明細書の表２に示す。３ ０年以上も後でも、これらの材料は有効な治療処置に至っていない。

血液銀行用にもっと処理しやすい血小板注入治療をなすために、貯蔵期間中の血 小板機能の損失を少なくするか又は遅らせるための工夫手段に力１なりの関ｒｉ −力（払われて来た。一つの試みは、血漿フリー貯蔵媒体の開発の関係である。

例え；ｆ、Ｓホーム、米国特許第４．６９５．４６０号参照。他の試みは、血小 板を安定化するため生化学的技術を用いることである。例えばＡボウド等、米国 特許第４゜９９４．３６７号参照。これらの技術は、貯蔵安定性の有効な延長を 与えるけれども、これらは長期間、延長された貯蔵安定性を与えなし）。最終的 に数ある中で、時代遅れの血小板からの血小板膜微小庖の調製がＦ、チアオ、米 国特許第５，１８５，１６０号に記載されている。

診断検定に用いられる固定乾燥血液血小板がプリンクハウス等に対する米国特許 第４．２８７．０８７号に記載されている。このような固定乾燥血小板調製品は 、診断目的のため長期間、貯蔵できるが、これらはこれまでヒト製薬用途用の形 で提供されなかった。従って、ヒト患者への投与に適した延長された貯蔵安定性 を有する血液血小板調製品を調製する新規手段がずっと必要とされている。

発明の要約 本発明の第一の局面は、再構成によって、（ａ）トロンボゲン表面に付着し、（ ｂ）非トロンボゲン表面に付着せず、（ｃ）トロンボゲン表面への付着によって 形状変化（延展）を受け、（ｄ）互いに付着してトロンボゲン表面への付着に関 する止血プラグを形成し、そして（ｅ）例えば刺激及び／又は延展後（例えば代 謝的に活性な、生きた又は新鮮な血小板を普通に生じさせ、例えば傷ついた組織 に触媒する、その粒状内容物を放出する生理的刺激を受けた後）、それらの粒状 内容物を放出する、固定乾燥ヒト血液血小板である。

本発明の第二の局面は、固定乾燥血液血小板製剤より構成される医薬製剤である 。固定乾燥血液血小板製剤は、上記した特性を有する固定乾燥ヒト血液血小板を 含む。

本発明の第三の局面は、上記した特性を有する固定乾燥血液血小板を生成する血 液血小板を固定する方法及びそのように生成された血小板である。その方法は、 血小板を、固定剤、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタル アルデヒド又は過マンガン酸塩に（例えば血小板を固定剤の溶液と混合すること により）血小板を固定又は安定化するのに十分であるが、上で挙げた特性の損失 を生じさせるには不十分な時間、接触させることを含む。血小板は、次いで乾燥 して上述した特性を有する固定乾燥血液血小板を得る。

図面の簡単な説明 図１は、従来技術の固定乾燥血小板及び未活性コントロール血小板と比較した本 発明の小血板によるトロンビン産生を示す。

発明の詳細な説明 本発明の固定乾燥血液血小板は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及び グルタルアルデヒドからなる群から選ばれる化合物により固定しつる。このよう な試薬による固定は、血小板の生存度の損失を避けるために、米国特許第４゜２ ８７、０８７号に記述される方法の注意深い修飾を必要とする。一般的に、洗浄 血小板は、典型的には室温で１．８％までのパラボルムアルデヒド溶液中、６０ 分間までそれらをインキュベートすることにより固定する。以下、より詳しく検 討するように、血小板を十分に固定するよう注意しなければならず、さもないと 不都合な溶解がその乾燥の間に起きる。

別個技術は、過マンガン酸塩（例えば過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カ リウム）溶液中、血小板をインキュベートすることにより血小板を固定すること である。一般に、洗浄血小板は、０．００１ないしＩｇ／ｄＬのＫＭｎＯ４又は ＮａＭｎｏ４溶液中、５ないし２０分間それらをインキュベートすることによる 、より好ましくは０００５ないし０．５ｇ／ｄＬのＫＭｎＯ４又はＮａＭｎ０＊ 溶液中、５ないし１５分間それらをインキュベートすることによる、最も好まし くは、０゜００５ないし０．０５　ｇ／ｄＬのＫ　Ｍｎ　Ｏ４又はＮａＭｎＯ４ 溶液中８ないし１２分間それらをインキュベートすることによる本技術により調 製しつる。

医薬製剤を調製するのに使用する血液血小板調製品は、外部成分、特に調製品が 投与される患者に遊離のトロンビン産生を与える溶解血液血小板が実質的にフリ ーであるべきである。従って、さもないと乾燥段階の間に不都合な溶解が生じる ので、乾燥前に（上述の特性により示されるその生存度を壌すことな（）血小板 を十分に固定するよう注意が必要である。例えば、ヒト医薬製剤の調製に用いる のに適した血小板調製品は、１ミリリツトルの溶液中１０’血小板の再構成で、 ミリリットル当りｌ０ＸＩＯ’以下の微粒子（溶解血小板の断片残留）を示し、 好ましくは再懸濁及びペレット化後、懸濁液中、乳酸デヒドロゲナーゼのリット ル当り１５０国際単位（ＩＵ）以下（リットル当り２２００１Ｕは、１ミリリツ トル中１０９細胞の全溶解を示す）を示す。

固定後、血小板の乾燥は、全ての適当な手段により実施しうるが、好ましくは凍 結乾燥により実施する。許容し得ないレベルの血小板溶解を起こすかも知れない ので、乾燥前に血小板調製品を安定化するよう注意を払わなければならない。

安定化は、適当な水置換分子（又は「安定剤」）、例えばアルブミン又はトリハ ロースを含む溶液に血小板を懸濁すること、次いで溶液を乾燥することにより実 施しうる。一実施態様では、０．１ないし２０重量％のアルブミンが用いられ、 より好ましくは１ないし１０重量％のアルブミンが用いられ、最も好ましくは５ ないし１０重量％のアルブミンが用いられる。対象への投与に関しては、調製品 中のアルブミンは対象と同じ種のもの（例えばヒトアルブミン）であるべきであ る。別法として、調製品は、異なる種のアルブミンと乾燥し得、アルブミンは再 構成て血小板から分離され、そして同じ種のアルブミンが対象への投与用の再構 成調製品に逆添加（ａｄｄ　ｂａｃｋ）　シうるが、全ての非種特異的アルブミ ンは処置さねている対象の抗原でありうるので、これを除くよう注意すべきであ る。

本発明の医薬製剤は、滅菌無菌パッケージ中、パイロジエン−フリーで無菌の乾 燥（好ましくは凍結乾燥）血小板を単に含みうる。アルブミンは上記したように 含まれうる。医薬製剤は又、製薬的に許容しうる担体中に再構成された本発明の 血小板調製品を含みうる。血小板を再水和し、それにより血小板が上で述べた特 性を有し、静脈注射に適する全ての水性担体を用いうる（例えば滅菌、パイロジ エンフリー、生理食塩水）。付加的試薬、例えば緩衝剤防腐剤及び他の治療的に 活性な薬剤も再構成製剤に含みうる。例えば米国特許第４，９９４．３６７号参 照（その開示を引用して明細書記載の一部とする）。

本発明の再構成医薬製剤は、典型的には静脈注射によりヒト患者に投与される。

そのような処置が必要な患者は、（洗浄（ｖａｓｈｏｕｔ）血小板減少症を含む ）血小板減少症にかかった患者、出血性血小板機能障害にかかった患者及びひど い出血を経験している損傷被害者を含む。投与される医薬製剤の量は、患者の体 重と状態によって変化するが典型的には容量で２０ないし３５０ミリリツトル、 濃度でミリリットル当りｌＸｌ０’ないし３Ｘ１０’血小板（より好ましくは、 ミリリットル当り２Ｘ１０’ないし３Ｘ１０’血小板）にわたる。医薬製剤は、 無菌のパイロジエンフリーの容器にパッケージされ、単位投与量としてこれらの 容量と供与量を提供する。

本明細書では、そのような処置の必要な対象の傷害治癒を促進する方法を開示す る。その方法は、固定乾燥血液血小板を傷害治癒を促進するのに十分な量、傷害 者に適用することを含み、該血小板は、その表面に血小板誘導生長因子を発現す る。対象は、ヒト患者又は獣医薬の動物対象（即ち、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等 ）でありうる。小血板は、全ての適当な種（即ち、ヒト、ウシ、ブタ等）のもの でありうるが、好ましくは処置を受ける対象と同じ起源の種のものである。血小 板は、それらがＰＤＧＦを発現する限り、全ての適当な手段により調製しつるが 、好ましくは、例えば本明細書に記載される方法であって、それにより刺激及び ／又は延展後（例えば代謝的に活性で、生きた又は新鮮な血小板を普通に生じそ の粒状内容物を放出する生理的刺激を受けた、例えば傷害組織と接触した後）血 小板誘導生長因子を放出する手段により調製しつる。すり傷、切り傷、裂傷、や けど等を含むいずれの型の傷もその方法により処置しつる。傷は皮膚組織に対す る傷でありうるし、又は他の器管に対する傷、例えば手術の間に受けたような腸 、牌、肝臓等の内部器管の組織に対する傷でありうる。血小板は、全ての適当な 手段により、例えば血小板を傷に振りかけ又は噴霧することにより、傷に適用し うるし、或は以下に検討するように外科補助具の手段により適用しつる。血小板 を傷に直接振りかける場合、傷は所望により次いで清浄な高分子接着材料を噴霧 しうるし、或は次いで何らかの他の適当な包帯又は包帯剤で被覆しつる。血小板 の投与量はＩＣ−２の外科補助具表面領域又は傷表面領域当り少な（とも０．５ −ＩＸＩＯ’血小板であるべきである。供与量の上限は特に重要ではないが、一 般にｌｃｓ”外科補助具表面領域又は傷表面領域当り５−１０ＸＩＯ”血小板で あろう。

固定乾燥血小板は、外科補助具の手段、例えば傷包帯剤又は包帯、縫合、織物、 補綴処置等により傷に適用しうる。全てのそのような補助具は、組合せで固定さ れた生理的に許容しつる基質材料及び基質材料によりもたらされる（例えばコー チングとして適用し、又は注入して）固定乾燥血液血小板を含み、血小板は、そ の表面に血小板誘導生長因子を発現する。典型的には、そのような外科補助具は 、無菌容器にパッケージされた無菌の形で提供される。外科補助具基質は、（即 ち、基質上に乾燥血小板を振りかけるか或は固定血小板の水性調製品中で又はそ の上で保持される固定血小板の水性調製品と、基質を乾燥（例えば凍結乾燥）さ せ、それにより幾らかの血小板を基質に付着させることにより）パッケージング の前に血小板で被覆し、血小板でパッケージして、それにより幾らかの血小板を パッケージ内の基質に付着させ、適当な接着材料で基質に付着させ、或は対象へ の適用前に手術補助剤に単に振りかける。

外科補助具基質は、如何なる形をもとりうるし、又は生理的に許容しうる疎水性 又は親水性の全ての固体材料でありうる。例えば縫合は、モノフィラメント又は より合せでよく、生分解性又は非生分解性でよく、又、例えばナイロン、絹、ポ リエステル、綿、ガツト、グリコリド及びラクチドのホモポリマー及びコポリマ ー等の材料から造りうる。例えば補綴用具は、動脈、静脈、管、アソファン（ａ ｓｏｐｈａｇｉ）の修復に用途を有する織った又は押し出した管状構造、掛ける ことができるか又は調和しており、そしてヘルニア修復に及び損傷した肝臓、腎 臓及び他の内部器管を支持するのに外科的に有用な織った又はニットの織物：ビ ン、スクリュー及び補強板：心臓弁（例えば固定ブタ心臓弁）、人口贋又は軟骨 材料等を含む。上記縫合に関して述べたような高分子材料は、別法として無菌の 傷包帯材としての用途にパッケージされた薄いフィルムとして与えつる。包帯は 、全ての適当な基質材料、例えば織った又は不織の綿或いは傷への又はその上方 への適用に適した他の織物から造りうるし、所望によりバッキング材料を含みう るし、さらに傷上方の包帯を守るために、その表面上の−又はそれ以上の接着部 分を所望により含みうる。

本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に説明の 目的のためだけであり、発明を限定するものと取るべきでない。

実施例１ 凍結乾燥ヒト血小板の調製（プロトコール１）ヒト血小板は、酸性クエン酸デキ ストロース（Ａ　ＣＤ）抗凝固剤（０，０８５Ｍクエン酸三ナトリウム、０．０ ７０２Ｍクエン酸、０．１１１Ｍデキストロース、ｐＨ４，５）、一部抗凝固剤 対５．６６部血液にした血液から調製する。血小板を分画遠心分離により分離し 、酸性クエン酸塩食塩水（０，０Ｏ５４４Ｍクエン酸三ナトリウム、０．１５４ Ｍ　ＮａＣ１，０，１ＮＨＣ１でｐＨ６，５に調整）で３回洗浄した。

洗浄後、血小板は５．Ｑｍｌの１８％パラホルアルデヒド溶液（９，０ｍ１４％ パラホルムアルデヒド溶液プラス１．ＱｍｌＡｃＤプラス１０．Ｑｍｌ　０．１ ３５Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４のように調製）中、１００１１１の血液由来の洗浄血小 板を４５分間室温でインキュベートすることにより固定する（固定時間は６０分 まで延長しうる）。

別法として、１０％バラホルムアルデヒド溶液中、１００＋＋＋１の血液由来の 洗浄血小板を４５分間、室温でインキュベートする（固定時間は、６０分まで延 長しつる）。

パラホルムアルデヒドを除くために、バラボルムアルデヒドインギュベー／ヨン 後、等量のイミダゾール緩衝食塩水（０，０８４Ｍイミダゾール：　０．１４６ ＭＮａＣ１，１，ＯＮ　ＨＣｌでｐＨ６，８に調整）を容管に加え、１５００倍 ｇで８分間室温で遠心することにより血小板をペレット化する。上清をデカンテ ーションし、血小板を５　１０ｍ１イミダゾール緩衝食塩水ｐＨ７，３５中に血 小板ペレットを再び懸濁することにより洗浄する。洗浄を２回以上繰り返し、パ ラホルムアルデヒドを除去する。第三回洗浄後、血小板を血清アルブミンの５％ 溶液（クエン酸食塩溶液、０．００５４Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５４Ｍ　 ＮａＣ１、ｐＨ６゜５の１００１１＋当り５ｇｍアルブミン）に再び懸濁する。

血小板を位相差顕微鏡とアメリカン・オプティカル・ブライト−ライン血球計数 器を用い計数する。血小板濃度を立方ミリメーク（ｃｍｍ）当りｓｏｏ、ｏｏｏ に調整する。

血清アルブミン溶液中の濃度調整血小板のアリコート（１，０ｍ１）を２０ｍ１ ガラスバイアルに入れ、−７０℃で凍結する。次いで血小板を１２時間又は粗い 白色粉末が明らかになるまで凍結乾燥する。血小板生成物は、乾燥時間の量温度 を＝２５℃に上げたのち、１００ないし５００ｍ１の大量で殻凍結（ｓｈｅｌｌ 　ｆｒｅｅｚｅ）　Ｌ、−４０℃で凍結乾燥することもできる。凍結乾燥生成物 は使用まで一２０℃ないし一７０℃で貯蔵する。

凍結乾燥血小板は、１．０ＭＮａ０１（で７．３５のｐＨに調整した領０８４Ｍ イミダゾール緩衝液（塩無添加）により再び水和する。イミダゾール緩衝液の添 加後、溶液は数分間掻き混ぜることなく保ち、次いでバイアルを横揺れ又は回転 することなく静かに混合し、再水和単一血小板の等分懸濁液を生成する。

実施例２ 凍結乾燥ヒト血小板の調製（プロトコール２）全血液は、健康なボランティアド ナーから抗凝固剤（ＣＰＤＡ−１）のその標準成分を含む商業血液収集パック（ フエンワル４Ｒ６４０２、バクスター・ヘルス・ケア）に集められる。収集され た各単位の酸塩添加全血液の最終容量は５００ＣＣである。各バッグの全血液を 遠心して血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）を得、これをバッグから吸引し、（上記実 施例１に記載されたのと同様）リン酸緩衝食塩溶液で３回遠心／再懸濁ステップ により洗浄する。次いで洗浄血小板を再び遠心し、血小板を（上記実施例１に記 載されたのと同様）１．８％バラホルムアルデヒドを含む緩衝溶液で室温にて４ ５分から１時間、処理する。安定剤の除去及びパラホルムアルデヒドを除くため の血小板洗浄後の血小板の収率は、安定化剤の血小板懸濁物中のカウントの６０ −８０％である。安定化後アルブミンが洗浄緩衝液に含まれなくなると、血小板 収量が減少する。

凍結乾燥前の最終血小板再呼濁液の組成は適切な収率を得るのに重要である。

一般に、緩衝塩類液中、有効量の安定剤、例えばアルブミン又はトレハロースが 凍結乾燥／再水和ステップによって８５−１００％の収率で血小板を得るのに必 要である。アルブミンは０．１ないし５０ｇ／ｄＬの量、より好ましくは１ない し２５ｇ／ｄＬの量、最も好ましくは５−１０ｇ／ｄＬの量を含むべきである。

トレハロースは０．１−１０Ｍ、より好ましくは領２−５Ｍ、最も好ましくは０ ５−１．０Ｍの量、含むべきである。幾つかの型の再水和溶液が、パラメーター 結果°リン酸緩衝食塩水ｐＨ＝７．３、ト・Ｊス緩衝食塩水ｐＨ＝７．４、イミ ダゾール緩衝食塩水又はユニツル（商標）生理均衡塩類溶液で目立って相違する ことなく用いられる。

本実施例に記載されるように調製した再水和血小板調製品についての典型的デー タは、以下の表１に与えられる。

表１　インビトロでの再水和血小板の実行明細書に記載したように調製した血小 板調製品の再水和後の微粒子カウントは、４．５Ｘ５．０−１０’／ｍＬであっ た。本実施例に記載したように調製した血小板の低張ショック試験反応は、０． ０３０−０．０３６０Ｄ／分（新鮮な血小板については０．１００−０．１５０ ）であった。放出乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ｌ１１１溶液中１０９血小 板の再呼濁後の上清中のＬＤＨの量は、５０ないし２００ＩＵ／Ｌ　（＞１５０ 又は２５０は有意な細胞質漏出を示す）であった。

実施例３ 過マンガン酸塩安定化による凍結乾燥ヒト血小板の調製全血液は、健康なドナー から抗凝固剤（ＣＰＤＡ−１）の標準成分を含む商業血液収集パンク（フェンワ ル４Ｒ６４０２、バクスター・ヘルスケア）に得られる。各単位の収集されたク エン酸添加全血液の最終容量は５００ｃｃである。各バックの全血液を遠心して 血小板リッチ血漿（ＰＲＲ）を得、これをバ・ツクから吸引し、上記実施例１に 示したようなリン酸緩衝塩類溶液で３回遠心／再懸濁ステップにより洗浄した。

洗浄血小板を１／１０量の緩衝食塩水に再び懸濁し、０゜０１ｇ／ｄＬの最終濃 度でＫ　Ｍ　ｎ　Ｏａ又はＮ　ａＭ　ｎ　Ｏ＋を含むリン酸緩衝塩類溶液を含む 過マンガン酸塩溶液に滴加した。血小板の懸濁液は、過マンガン酸塩溶液中、室 温で１０分間インキュベートし、次いで緩衝液中０．１−５．０ｇ／ｄＬアルブ ミンで上記のように２回洗浄して過マンガン酸塩を除去した。過マンガン酸塩処 理及び続く洗浄の間、血小板の損失はわずかに１０−２０％であった。

凍結乾燥／再度水和後７０−１００％の収集を維持するため、凍結乾燥前の最終 再懸濁溶液中、安定剤、例えばトレハロース又はアルブミンを好ましくは上で与 えた範囲に含むことが必要である。再水和溶液組成物は、臨界的ではないが（バ ラホルムアルデヒド固定血小板に対してと同様）等張でｐＨ７，３−７，４に緩 衝剤処理されるべきである。再水和過マンガン酸塩固定血小板の分析による典型 的データを以下の表２に示す。

表２．　インビトロでの再水和血小板の実行本実施例に記載される過マンガン酸 塩方法で固定した血小板調製品の再水和後の微粒子計数は２．６−４．０Ｘ１０ ’／ｍＬであった。本方法により調製された血小板に対する低張ショック試験反 応は、Ｏ−０，０３００Ｄ／分（新鮮な血小板については０．１００−０．１５ ０）であった。放出ＬＤＨは５０−２００　ＴＯ／してあった。

実施例４（比較例Ａ） パラホルムアルデヒド安定化血小板を特徴づけるための活性化マーカーの使用本 実施例の目的は、本発明のバラホルムアルデヒドで固定された血小板はトロンポ ゲン表面に接触後、それらの粒子内容物を放出するが、既知技術の血小板はそう ではないことを示すことである。実験した血小板調製品は１．０％パラホルムア ルデヒドで６０分間（パラホルム、１）そして１．８％バラホルムアルデヒドで ６０分間（パラホルム、２）安定化した：これらはプリンクハウス等、特許に記 載されるように調製した、即ち、２％パラホルムアルデヒドで１２０分間固定し た血小板（プリンクハウス）と比較した。

表３に記載した試験で使用したマーカー、ＣＤ６２及びＧＰ５３は、ベクトンー ディキンソン・インコーホレイテッドから得られる商業的に入手可能な抗体であ り、血小板粒子から放出された抗原の血小板表面での存在を示すのに用いられる 。血小板表面での粒子放出抗原の存在は、血小板活性化の証拠として取られる。

これらの抗原に対する抗体は、活性化マーカーという。血小板誘導成長因子（Ｐ ＤＧＦ）に対する抗体は血小板膜結合ＰＤＧＦを検出するのに用いられる。ＰＤ ＧＦ抗体は、ゲンザイム（ケンブリッジ、ＭＡ）から得た。バウムガートナー接 着試験に用いた脈管は正常人から得た。

実験は、環状潅流チェンバーでの使用に関し、新鮮な未置換全血液に比較し、分 画遠心分画により天然血小板をフリーとした新鮮な全血液に取り込むことによる 分離凍結乾燥血小板調製品の活性化性（ａｃｔｉｖａｔａｂｉｌｉｔｙ）を示す ために実施した。血液は、正常ヒトドナーからクエン酸塩抗凝固剤（ＣＰＤＡ− １）に収集した。２つの１ｃｍ条片のイヌ動脈管を先細の棒上に裏返し、蛎動性 ポンプにより１３ＱｍＬ／分で駆動する再循環ループに挿入した。ループは先ず 緩衝液を、次いで血液（新鮮な又は冷凍乾燥した血小板のいずれかを含む）を室 温で５分間潅流させ、次いで２％バラホルムアルデヒドの２分間潅流により付着 性血小板を脈管に永久的に固定する。脈管表面上の血小板は、ＧＰＩＩｂＩ［ａ に対する蛍光モノクローナル抗体の付加により検出した。付着は、蛍光細胞によ り覆われた脈管表面のパーセントの概算としてエピ−蛍光顕微鏡法により定性化 した。又、（非付着性血小板を有する）残留血液は、採取して血小板リンチ血漿 （ＰＲＰ）とする。ＰＲＰはさらに２％パラホルムアルデヒドで室温にて１−２ 時間固定し、その後、ＣＤ６２又はＧＰ５３又はＰＤＧＦに対する蛍光標識モノ クローナル抗体とインキュベートする。試料中の血小板表面上のこれらのマーカ ーの存在は、ベクトン・ディキンソン、ファクスカン（商標）流動血球計算器の 標準流動血球計算器により検出した。結果の定性化は非特異性コントロール抗体 （非免疫マウスＩ　ｇＧ　２　、）により回収されたバックグラウンドよりも大 きな蛍光を有する血小板のパーセントとして表した。知見は、脈管条片の潅流の 開始直前又は直後に採った血液試料について比較した。本比較の結果は表３に示 す。

表３　活性化マーカーによるバラホルムアルデヒド安定血小板の比較表３から、 安定化の濃度と時間が実質的に異なる性質を有する血小板をもたらすことが判る 。パラホルム、１及びパラホルム、２血小板は、脈管壁のサブ内皮表面を越えて 循環した血液中の血小板上に存在する増大する数々の活性化マーカーを示した。

逆にプリンクハウス調製品は、ＣＤ６２マーカーとの循環後、実質的に何の活性 化も示さず、ＰＤＧＦで最少変化しか示さない。

実施例５（比較例Ｂ） 過マンガン酸カリウムで調製した血小板を特徴付けるための活性化マーカーの使 用 本実施例の目的は、本発明の過マンガン酸塩で固定した血小板がトロンボケン表 面に接触後それらの粒子内容物を放出するが、既知技術の血小板は放出しないこ とを示すことである。本実施例は、血小板を上記実施例３に記載したように過マ ンガン酸塩で固定した以外は上記実施例４と実質的に同じ方法で実施した。３つ の異なる過マンガン酸塩固定血小板調製品を使用した：　０．０２Ｍ過マンガン 酸塩で安定化し、トレハロースの存在で凍結乾燥した血小板（パーム、１）；０ ゜０２Ｍ過マンガン酸塩で安定化し、ヒト血清アルブミンの存在で凍結乾燥した 血小板（パーム、２）：及び０．０１Ｍ過マンガン酸塩で安定化し、ヒト血清ア ルブミンの存在で凍結乾燥した血小板（パーム、３）。比較目的のため、血小板 は、又、２％バラホルムアルデヒドで１２０分間固定し、ウシ血清アルブミンの 存在で乾燥した。データは以下の表４に示す。

表４から、本発明の過マンガン酸塩固定血小板に比べ、プリンクハウス血小板調 製品はトロンポゲン脈管にさらした後、実質的に何の活性化も示さなかったこと が判る。

表４．　活性化マーカーによる過マンガン酸塩固定血小板の比較実施例６（比較 例Ｃ） 脈管サブ内皮への再水和血小板の付着 新鮮な再水和血小板の暴露されたサブ内皮脈管への付着能力を環状潅流チェンバ ーで試験した。プリンクハウス血小板調製品と上記実施例４及び５に記載したよ うに調製した血小板を比較した。血小板はＡＣＤ抗凝固全血液からとり、乾燥及 び再水和血小板の種々の調製品で置き換えた。次いで全血液及び再水和血小板を 含む血液を幾つかの裏返し脈管を含むチェンバーヘボンブで入れた。流量及び剪 断率は全ての調製品について一定であった。結果を以下の表５に示す。

表５．　脈管サブ内皮への再水和血小板の付着変化性は種類の間で高いが、プリ ンクハウス血小板が他の調製品よりも「より粘着性（ｓｔｉｃｋｅｒ）Ｊであっ たことは明らかである。全調製品は脈管サブ内皮に付着するが、さらされた脈管 壁の少しの領域しか本発明により調製された血小板によって被覆されない。もち ろん、代謝的に「死んで」いる先行技術の血小板の付着は、適当な代謝反応後に はない受身の性質である。

実施例７（比較例Ｄ） 低張ショック回復試験 低張ショック回復試験は、水を除去して血小板による増加した水取り込みにより 生じる腫脹を回復する血小板の能力を評価するのに用いる。腫脹の回復の程度を 測定するため、クエン酸添加血漿中３Ｘ１０’／ｍＬの血小板懸濁液をクロノロ グアブレボメーター（ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）中３７℃で１／２容量脱イオ ン水で処置した。光透過率信号（％Ｔ）は、低張ショックのために血小板による 水の取り込みで直ちに増加しく％Ｔ最大）、次いで、処理していない血小板によ り水が活発に放出されるので、基線近く（希釈に関し修正された、％Ｔ基礎）に ％がもどる。

１０分後の回復の程度は、 として示される。低張ショックからの回復の程度は、非撹拌ペイトンアブレボメ ーターで２２℃である以外、上記と同様に行った分離測定であった。回復の程度 は、脱イオン水の添加後、１分から３分の％Ｔの変化の程度として算出した。表 ６に示す結果は、新鮮な血小板コントロールで得た％Ｔの変化の程度のパーセン トとして表す。低張ショック試験での血小板の回復の率と程度は膜統合性と残余 代謝活性に太き（依存する。ブリンクハウス血小板調製品は非反応性であり、一 方、本発明の血小板調製品は４０ないし１０％回復を示した。

表６　異なる安定化血小板調製品の低張ショック回復実施例８（比較例Ｅ） 血小板調製品によるトロンビン産生 本実施例の目的は、固定剤の濃度及び固定化の時間の小さな変化が刺激に対する 血小板の異なる反応となることを示すことである。４つの血小板調製品をトロン ビン産生（それは血小板濃度依存である）及び血小板の表面のプロ］・ロンビナ ーゼコンプレックスの支持について試験した。結果は図１に示す。血小板カウン ト×１０００は、水平軸に与えられる。単位でのトロンビン産生は垂直軸に与え られる。調製品は、（１）パラホルム１血小板（図１中三角）、（■）パラホル ム２血小板（四角）、（ｉ）プリンクハウス血小板（ダイアモンド）及び（ｔｖ ）コントロールとして新鮮な洗浄血小板（円）であった。パラホルム２血小板は 、最大程度のトロンビン産生を示し、続いてパラホルム、１血小板、次いでプリ ンクハウス血小板であった。コントロール血小板は最低程度のトロンビン産生を 示した。

実施例９ 固定乾燥血小板上の血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）の発現本実施例の目的は、 その表面でのＰＤＧＦの発現用の種々の手段により固定され、乾燥された血小板 を試験することである。抗体及び血小板調製品は、上記実施例５及び６に記載し た通りである。データは以下の表７に示す。

表７　血小板表面でのＰＤＧＦの発現 これらのデータは、ブリンクハウス血小板と本発明の血小板がその表面にＰＤＧ Ｆを発現すること、及びパーム２とパラホルム２血小板が刺激の前又は後でブリ ンクハウス血小板よりも表面にＰＤＧＦをより多（発現することを示す。

実施例１０ ブタの傷害治癒を促進するＰＤＧＦを発現する固定乾燥血小板のに局所投与本実 施例は、ブタの傷害治癒を促進する、その表面にＰＤＧＦを発現する血小板の用 途を記載する。

本実施例に用いるブタ血小板は、以下に記述するように修飾した、上記実施例１ に記載した方法で実質的に調製した。パラホルムアルデヒドを除くために、等量 のイミダゾール緩衝食塩水、（ＩＢＳ）ｐＨ７，３５を加える。血小板を室温に て１５００ｘｇで８分間遠心することによりベレット化する。上清を排出し、ペ レットを５−Ｉｔ）ｍｌ　ＩＢＳ、ｐＨ６，８に再びせ濁する。洗浄を２回繰り 返した。続いて手段は、ブタ血小板の濃度が８Ｘ］、Ｏ’／μｍである以外、実 施例１に記載したものと同じである。ブタアルブミンを実施例２に記載したと同 様の量、乾燥の安定剤として加えた。

血小板包帯剤は、ｌＱｃ＋ｎ直径ベト直径ベト９平中センチメートル四方上にバ イオプレイン■（商標）外科包帯剤（トンＢ・ホウランド・インコーホレイテッ ド、サガーランド、テキサス）を用い調製した。１ｃｍ２の包帯剤を、包帯剤に 該当量の血小板を含む１ｍｌの溶液をビベントで与えることにより３．２Ｘ１０ ’ブタ血小板で飽相し、次いで血小板を伴う包帯剤を凍結乾燥室に注意して移し 、材料をあらい（ｃｒａｃｋｅｄ）白色粉末が明らかになるまで一４０℃で乾燥 した。

２匹の成長したブタを研究した。ブタを麻酔し、直径３ミリメートル（罷）のパ ンチを用いコントロールパンチ傷害を与えた。０日に、３龍深さ×３１巾の傷を 、麻酔ブタの背中に沿った毛をそり落とした滅菌領域に生成させた。傷は表皮、 真皮及び脂肪組織を通過する。３列の６つの傷がそれぞれ生じた。列１を乾燥血 小板で処理した。列２を乾燥血小板を含んだメツシュで処理した。１日目に各列 の傷一つを除去した。２日目に、各列の傷２を除去した。各日の続く４日に、各 列の各スクリーニング傷を研究用に除去した。除去組織をホルムアルデヒドで固 定し、標準的組織学的技術で処理し、染色し、傷害回復の証拠を顕微鏡で調べた 。

各セクションを血小板の存在、傷害上皮再発育の側面に沿って又は底部での線維 芽細胞増殖及び炎症反応の証拠について試験した。各部位にパックした血小板の 量は、正確に測定しなかった。列１の傷害を乾燥血小板で充填した。各パンチ傷 害を乾燥血小板で毛細管充填した。列２の傷を、各偶に乾燥血小板を含むｌａｗ ２メッシュをバッキングすることにより処理した。

定性的に全ての処理セク／ヨンは、未処理の傷に比べて優れた回復を示した。

実施例１１ 正常及びツインウィルブランド病大への固定乾燥血小板の静脈内投与再水和血小 板のインビボ止血効果を測定するために、２匹の正常穴と１匹のツインブランド 因子欠損（ホンウィルブランド病、ｖＷＤ）犬に再水和固定乾燥正常イヌ血小板 を注入した。イヌ血小板は、血小板を０６７％パラホルムアルデヒド溶液中、１ 時間固定した以外、上記実施例１及び２に記載したヒト血小板と実質的に同じ方 法で固定し、乾燥そして再構成した。以下の表８はイヌの注入及び特性に関連す る物理学的データである。

表８．　正常（Ｎ）及びホンウィルブランド病（ｖＷＤ）イヌへの再水和血小板 （ＲＰ）の注入 イヌへの血小板注入後、上記上液試料を以下のように約４時間、実験によって収 集した。麻酔大に再水和血小板を注入する。頚動脈をさらす。血圧を測定するた めに大腿動脈にカヌーレを入れ、第二カヌーレを試料収集及び液体の投与用に大 腿静脈に入れた。一本の頚動脈に既知技術にコルス等、サーキュレーション・リ サーチ５９．１５−２６（１９８８）参照）に従って付加狭窄によりピンチ傷害 に付す。イヌは血圧心拍数、呼吸等の変化をモニターし、固定乾燥血小板の注入 に対する如何なる逆反応をも評価する。再水和血小板を蛍光染料でラベルし、注 入し、そして血液試料収集して、抹消循環中、形成した血栓中、崩壊血管壁（サ ブ内皮）及び正常血管壁の癒着の領域での標識再水和血小板の存在を試験する。

イヌの耳の端で切断を行い、部分を付着再水和血小板について顕微鏡試験用に調 製した。

表９はこれらの研究の結果を示す。

表９　正常（Ｎ）及びフォノウィルブランド病（ｖＷＤ）犬への再水和血小板（ ＲＰ）の注入の影響 前述の実施例は本発明を示すものであって、それを限定するものと解してはなら ない。発明はそれに含まれる請求の範囲の均等物とともに以下の請求の範囲によ り定義される。

プロトンビナーゼコンプレ・ノクス中の凍結乾燥血小板補正書の翻訳文提出書 平成６年１１月２５日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．再構成により、 トロンボゲン表面に付着し、 非トロンボゲン表面に付着せず、 トロンボゲン表面への付着によって形状変化（延展）を受け、互いに付着してト ロンボゲン表面への付着によって止血プラグを形成し、そして それらの粒状内容物を放出する、 固定乾燥ヒト血液血小板。
2. ２．該血小板が凍結乾燥される、請求項１の固定乾燥血小板。
3. ３．該血小板が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデ ヒドからなる群から選ばれた化合物により固定される、請求項１の固定乾燥血液 血小板。
4. ４．該血小板が過マンガン酸塩で固定される、請求項１の固定乾燥血液血小板。
5. ５．該血小板がアルブミンで安定化される、請求項１の固定乾燥血液血小板。
6. ６．該血小板がトレハロースで安定化される、請求項１の固定乾燥血液血小板。
7. ７．固定乾燥血液血小板を含む医薬製剤であって、該固定乾燥血液血小板が、実 質的に、再構成により、 トロンボゲン表面に付著し、 非トロンボゲン表面に付着せず、 トロンボゲン表面への付着によって形状変化（延展）を受け、互いに付着してト ロンボゲン表面への付着によって止血プラグを形成し、そして それらの粒状内容物を放出する、 ヒト血液血小板よりなる。
8. ８．アルブミンを更に含む、請求項７の医薬製剤。
9. ９．ヒトアルブミンを更に含む、請求項７の医薬製剤。
10. １０．該血小板が凍結乾燥されている、請求項７の医薬製剤。
11. １１．水性の生理的に許容しうるキャリヤー中で再構成された、請求項７の医薬 製剤。
12. １２．該血小板が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアル デヒドからなる群から選ばれた化合物で固定される、請求項７の医薬製剤。
13. １３．該血小板が過マンガン酸塩で固定される、請求項７の医薬製剤。
14. １４．固定乾燥ヒト血液血小板の製造法であって、該ヒト血小板を固定剤に該血 小板を固定するのに十分な時間接触させ、次いで該血小板を乾燥して固定乾燥血 液血小板を生成させること、 該接触段階は、該血小板が、再構成により、（ｉ）トロンボゲン表面に付着し、 （ｉｉ）非トロンボゲン表面に付着せず、（ｉｉｉ）トロンボゲン表面への付着 によって形状変化（延展）を受け、（ｉｖ）互いに付着してトロンボゲン表面へ の付着によって止血プラグを形成し、そして （ｖ）それらの粒状内容物を放出する、能力を失わせるには不十分な時間、実施 すること、を含む。
15. １５．該接触段階を、該血小板を該固定剤を含む溶液と混合することにより実施 する、請求項１４の方法。
16. １６．そのような処置の必要な患者の血液凝固を促進する方法であって、（ａ） 水性の製薬上許容しうるキャリヤー中、固定乾燥血液血小板を含む医薬製剤を再 構成して再構成血液血小板製剤を提供すること、（該固定乾燥血液血小板は、実 質的に、再構成により、（ｉ）トロンボゲン表面に付着し、 （ｉｉ）非トロンボゲン表面に付着せず、（ｉｉｉ）トロンボゲン表面への付着 によって形状変化（延展）を受け、（ｉｖ）互いに付着してトロンボゲン表面へ の付着によって止血プラグを形成し、そして （ｖ）それらの粒状内容物を放出する、ヒト血液血小板によりなる）、 次いで （ｂ）該構成血液血小板を患者に、血液凝固を促進するのに有効な量、投与する こと、 を含む。
17. １７．該患者が血小板減少症にかかっている、請求項１６の方法。
18. １８．該再構成血液血小板製剤を静脈内に投与する、請求項１６の方法。
19. １９．そのような処置を必要とする対象の創傷治癒を促進する方法であって、固 定乾燥血液血小板をその傷に創傷治癒に有効な量、局所的に適用すること（該血 小板は血中板誘導成長因子をその表面に発現する）を含む。
20. ２０．該固定乾燥血液血小板が、促進後、該血小板誘導成長因子をその表面に発 現する、請求項１９の方法。
21. ２１．該固定乾燥血液血小板が、実質的にトロンボゲン表面に付着し、 非トロンボゲン表面に付着せず、 トロンボゲン表面への付着によって形状変化（延展）を受け、互いに付着してト ロンボゲン表面への付着によって止血プラグを形成し、そして それらの粒状内容物を放出する、 再構成による ヒト血液血小板よりなる、請求項１９の方法。
22. ２２．固体の生理的に許容しうる基質、及び該基質材料によりもたらされた固定 された乾燥血液血小板（該血小板はその表面に血小板誘導成長因子を発現する） を、組合せて含む、外科補助具。
23. ２３．該基質が、創傷包帯剤、縫合糸、織物及び補綴用具からなる群から選ばれ る、請求項２２の外科補助具。
24. ２４．該外科補助員が、無菌容器にパッケージされる、請求項２２の外科補助員 。