JPH07507457A - 植物ウイルスゲノムのレプリカーゼ部分との植物形質転換によるウイルス耐性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物ウィルスゲノムのレブリカーゼ部分との植物形質転換によるウィルス耐性 これは、１９９０年３月１２日に出願した我々の既出願米国特許出願０７／４９ １．４７３の一部継続である。

タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）の外皮蛋白遺伝子で形質転換し、これを発現 する植物がＴＭＶに耐性であることを示す、Ｐ、パウエルーエイブル等の１９８ ６年の文献［サイエンス２２３　：　７３８参照］以来、種々のウィルス感染か らの多くの作物稀の保護にとって疑いもなく重要な意味を有する本概念の多くの 他の実施例がある。例えば今日まで、ウィルス外皮蛋白伝達耐性は、アルファル ファモザイクウィルス、タバコラットルウイルス、ポテトウィルスＸ１キユウリ モザイクウイルス（ＣＭＶ）　、ポテトウィルス並びにポテトウィルスＸ及びポ テトウィルスＹ外皮蛋白で形質転換された植物を含む１５の分類群の少なくとも ２５のウィルスに見られた。

ウィルス外皮蛋白をコード付けしているもの以外の植物ウィルス配列を、形質転 換植物が形質転換後ウィルス感染に耐性を示すことができるかどうかを決定する ために試験した。ＲＮＡ１及び２のほとんど完全長コピーを含むアルファルファ モザイクウィルスの陽性センス配列は、形質転換植物に耐性を誘発させることが できなかった［パイロロジイ１６３　：　５７２（１９８８）参照］。ＴＭＶ及 びポテト外皮蛋白遺伝子の抗センス配列は、形質転換タバコに低レベルの耐性を 誘発した［ブロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ ンシズＵＳＡ８６　：　６９４９（１９８９）及ヒＥＭ　Ｂ　Ｏ’）　＋−ナル ？　＋　１２７３（１９８８）参照］。ＣＭｖゲノムの（ＲＮＡＩの５”配列） 試験した３部分の一つからの同様の抗センスＲＮＡは、一つの形質転換系に低レ ベルの耐性を与えた。

植物ウィルスのサテライトＲＮＡから調製したＤＮＡによる植物形質転換を使用 する他の形の耐性が報告されている。例えばＣＭＶのサテライトの使用［ネイチ ャー３２８　＋　７９９（１９８７）参照］及び自己切断能力を有するサテライ トＲＮＡ由来の配列に基づくりポザイムの概念［ネイチャー３３４・５８５　（ １９８８）参照］。

本明細書に記載される発明は、一つの植物世代から他へ移しつる全く新しい型の ウィルス誘発耐性を示す。本発明は、ウィルスゲノムのレブリカーゼ部分の全部 又は一部から取った、コーディング配列を含んでいるトランスジェニック植物が 、ウィルスにより続いて起きる病気に耐性であることを開示する。接種葉に非常 に良性度のウィルス合成がありうるが、ウィルスは拡がっては見えず、従って病 気は発達しない。以下の記載では、ＴＭＶ由来の５４ｋＤａコーディング配列の 使用及びキュウリモザイクウィルスのポリメラーゼの一成分をコード化するＲＮ Ａ−２の修飾ｃＤＮＡを、本発明による広い技術の２つの特異実施例として記載 する。従って最も広い実施態様では、本発明は、病原性ウィルスゲノムのレプリ カーゼ部分から取った断片又は切片のＤＮＡコピーで形質転換した植物にウィル ス耐性をもたらす手段を明らかにする。さらに、本発明は、病原性ウィルスのレ プリカーゼゲノムの部分をコードするウィルスゲノムの部分を保持する形質転換 植物及びそれらの種子を明らかにする。本発明によれば、それらのゲノム内にウ ィルスレブリカーゼ遺伝子の部分を含む形質転換植物は、その部分が誘導された ウィルスによるその後のウィルス病に耐性であり、そして、それらの植物は、又 、他のご（関連するウィルスによるその後の病気にも耐性である。

以下に示す例証タバコモザイクウィルスの記載では、５４ｋＤａ配列の存在は、 局所退緑又は壊死の発達及びＴＭＶ感染に関連する症状又はウィルス複製のいか なる発達をも防止する。

ＴＭ〜′ゲノムの体制は、科学的共通性により明らかによく理解され、受入れら れる。ＴＭＶ　ＲＮＡの５゛から３°末端へと解読すると、開いた読み枠は、１ ２６及び１８３ｋＤａ蛋白、３０ｋＤａの運動蛋白並びに１７．５ｋＤａ外皮蛋 白をコードする。しかしながら、完全には明らかにされていないゲノム戦略の一 局面は、ゲノム及びサブゲノムＲＮＡの合成に関係するレプリカーゼ酵素の正確 な性質である。ウィルスが４つの蛋白をコードし、その二つはゲノムＲＮＡによ りコードされ、そして他の二つは個々のサブゲノムＲＮＡによりコードされるこ とは一般に受入れられるが、ウィルスが少なくとも一つの池の付加的且つ別の蛋 白をコードすることは一般に受入れられない。

Ｎ、Ｄヤング等［ジャーナル・オブ・セル・サイエンス・サブルメント７：２７ ７　（１９８７）参照］は、二つの共同開始蛋白、１２６ｋＤａ及び１８３ｋＤ ａ蛋白をコード化するゲノムＲＮＡの５゛近位部分がレプリカーセの成分である ことを報告した。１８３ｋＤａ蛋白は、１２６ｋＤａ蛋白のＵＡＧ停止コドンの 読み通しにより産生される。（既知機能を有する）池の二つの蛋白、３ＱｋＤａ 蛋白及び外皮蛋白は、それぞれ各遺伝子が５゛近位である別のサブゲノムｍＲＮ Ａから合成される。

しかしながら、一般に受入れられないことは、別個の蛋白が存在するという我々 の主張であり、そこで、１８３ｋＤａ遺伝子の読み通し部分に開いた読み枠が存 在することをめて、我々は５４ｋＤａ蛋白を標識した。本蛋白の存在についての 原理的証拠は、ｌ、ＲＮＡと呼ばれる、ＴＭＶ感染植物中の第三のサブゲノムＲ ＮＡが存在し、それはＴＭＶゲノムのヌクレオチド残基３４０５で開始し、５４ ｋＤａ蛋白についての開いた読み枠を含むという発見から来ている［パイロロジ イ１４５　：　１３２（１９８５）参照］。ｍＲＮＡとしての及びサブゲノムＲ ＮＡとしてのその機能の支持は、それがポリリポソームに見出されること及び１ １サブゲノムＲＮＡの二本鎖バージヨンに相当する大きさの二本鎖ＲＮＡが存在 することの観察から導かれる［パイロロジイ１１３　：　４１７（＋９８１）及 びパイロロジイ１３１：５３３　（１９８３）参照］。

より詳しくは、１８３ｋＤａ蛋白遺伝子の読み通し部分を含んでいるＴＭＶゲノ ムの部分の以下の配列は、 ３４０５　３４’７２　３４９５　４９１９す［ＴＭＶの完全ゲノムは６．３９ ５ヌクレオチド長であり、ゴーレット等、プロン−ディンゲス・オブ・す／ヨナ ル・アカデミイ・オブ・サイエンシズＵＳＡ７９　：　５８１８（１９８２）に 見出しうる］。ｌ、ＲＮＡはヌクレオチド６３９５で終結する。本配列中、本発 明による５４ｋＤａ開いた読み枠は、ヌクレオチド残基３４９５から４９１９に 延び、そして下線の部分は、以下の実施例でより完全に記載される植物形質転換 に用いた配列を示す。

より詳しくは、１．ＲＮＡ配列内の５４ｋＤａ蛋白についての遺伝子部分は、Ｉ ス１几ＡＵへへＡＡＧ［に工（石υＧＡ　ＡＧｔＪＡｔＪＬＪＬＧＬＸ：　（Ｊ ＧＡＩＩＡＡＡＧバ］Ｃす１１几＾ＧＡＡ　１３９６α叉１ｔｍｌｔｌＡｔ＋　 ＡＧＡＩＪＧＧＣＬＸｌ’ＬＪ　Ｗ　ｌ　４２５である。

残念にも、５４ｋＤａ蛋白は感染組織には見られなかった。エセリンア・コリに 発現される１２６ｋＤａ蛋白の読み通しに特異的な４３２アミノ酸についてのβ −ガラクトンダーセ融合蛋白に対する抗体が調製されると、プロトプラスト抽出 物中の５４ｋＤａ蛋白は免疫沈降又はそこで抗体が１８３ｋＤａ蛋白を検出する 条件下でのウェスタンブロッティングによっては検出できなかった［Ｔサイト等 、モレキュラー・アンド・／工不うル・ノエネティクス２０５　：　８２（１９ ８６）参照］。

同様に、５４ｋＤａ蛋白は、そのような蛋白が期待されるゲルの部分に時々フェ イントバンドが見られるけれども、全蛋白まで造られる抗血清を用いるウェスタ ンプロット［Ｇ、Ｊ、ヒルズ等、パイロロジイ１５８　＋　４８８（１９８７） 参照］で検出可能ではなかった。しかしながら、全蛋白まで造られる抗血清は、 ＴＭＶ　ＲＮＡ又は５４ｋＤａ蛋白遺伝子のＴ７転写物のいずれかのインビトロ 翻訳生成物から産生される５４ｋＤａ蛋白を沈澱することができる。

５４ｋＤａ蛋白に融合させようとする努力で、我々は本非構造ウィルス蛋白用の コーディング配列でタバコを形質転換した。予期しないことに、これらの形質転 換植物は、それから５４ｋＤａ配列が誘導されたＴＭＶのＵ１株の未接種葉での 複製に対し、完全な耐性を示す。本耐性は、植物が高濃度のウィルス又はウィル スＲＮＡのいずれかで接種されると現れた。

さらに、５４ｋＤａ）ランスジェニック植物により示される耐性は、幾つかの重 要な点でＴＭＶ外皮蛋白伝達耐性とは異なうた。耐性はＴＭＶ　ＲＮＡ及びＴＭ Ｖピリオンの両者に対し示した。それは接種材料の濃度を上げる期間にわたって 、又はそれとともに失われるようには見えなかった。又、それは５４ｋＤａｉ白 遺伝子が誘導され、ごく関連したミュータントであるＴＭＶ株に対して有効であ ったが、他のＴＭＶ株又は他のウィルスに対しては有効でなかった。

従って、本発明の新規な態様は、その「センス」定位で、ウィルスゲノムのレプ リカーゼ部分の一部によるその正常ゲノムの形質転換が既に行われた植物にウィ ルス耐性を伝えることである。

本発明の本態様及び他の態様のより完全な理解は、以下の図面及び実施例を引用 することにより得ることができる。

図１は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとツバリン合成酵素ポリアデニル化部位と の間に挿入されるＴＭＶ５４ｋＤａコーディング配列を含んでいる本発明による 植物発現ベクターを示す。

図２は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとツバリン合成酵素ポリアデニル化部位と の間に挿入される修飾Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２遺伝子配列を含んでいる植物 発現ベクターを示す。

図３は、宿主植物のゲノムの組込み用の修飾Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２キメラ 遺伝子の構築を示す。

より詳しくは、図１は、ｐＭＯＮ３１６のポリリンカ一部分のＸｈｏ１部位又は ５ＩＩａＩ部位のいずれかへのＴＭＶｃＤＮＡの挿入により誘導されたプラスミ ドを示す。これらのベクターにおける数字は、ＴＭＶゲノムでのヌクレオチドを 示す。

ＮＰＴｎ遺伝子は、形質転換植物に選択可能なカナマイノン耐性マーカーを与え る。

図２は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）とツバリンシンターゼポリアデ ニル化部位（ＮＯ５ｐｏｌｙＡ）との間に挿入される本発明による修飾Ｆｎｙ− ＣＭＶ　ＲＮＡ−２遺伝子配列を含んでいる植物発現ベクターを示す。以下の記 述で詳細に記載されるように、本プラスミド（ｐＣＭＶ　Ｎ／Ｂ−２３）は二元 性植物形質転換ベクターｐＲＯＫ２のＢａｍＨ１部位に本発明による修飾Ｆｎｙ −ＣＭＶＲＮＡ−２遺伝子を挿入することにより誘導された［ネイチャー３２１ ：４４６（１９８６）参照コ。これは、本プラスミドをＲＮＡ−２ｃＤＮＡ配列 の５゛部位でカットする５ｐｈｌで、ｐＦｎｙ　Ｎ／Ｂ−４を消化することによ り達成した。ＢａｍＨｌ−３ｐｈｌアダプターは、本５ｐｈＩ部位に連結し、次 いでＲＮＡ−２配列の３゛部位でカットするＢａａＨｌで消化し、それにより全 修飾ｃＤＮＡ分子を遊離させる。

本３ｋｂ断片を標準的技術によりｐＲＯＫ、のＢａｌＨｌ部位にサブクローンし 、ｐｃＭＶＮ／Ｂ−２３を産生しこ。植物形質転換に先立ち、本構築物を、Ｅコ リ株Ｍ〜！２９４−ｐＲＫ２０１３によって伝達される三父性交配［メリーズ・ オブ・エンザイモロノイ１１８　：　６２７（１９８６）参照］によりアグロバ ク刊功ム・ツメ７７２１７２株ＬＢＡ−４４０４に移入した。トランス結合体を それぞれ５ｏ及び１２５　ａｇ／ｍｌでのカナマイノン及びストレプトマイシン に対する耐性により選択した。図中の数字はＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２配列中 のヌクレオチドを指す。

ネオマイノンホスホトランスフェラーゼＩＩ　（ＮＰＴｎ）遺伝子は、形質転換 植物に選択可能なカナマイノン耐性マーカーを与える。ＬＢ及びＲＢ＝アグロバ タテリウム・ツメファシェンス伝達植物形質転換の間に植物ゲノムに移入された ＤＮＡの左及び右ボーダー。○ｒｉ＝復製のオリジン。

図３は、２つの段階でなされているｐＣＭＶ　Ｎ／Ｂ−２３の構築を示す。第一 に、９４塩基対部分はＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２の完全長ｃＤＮＡクローンか ら削除した。第二に、本削除誘導体を植物形質転換ベクター、ｐＲＯＫ、にサブ クローンした。

実施例店により完全に記載するように、ｐｌＢｌ−７６中のＦｎｙ−ＣＭＶ　Ｒ ＮＡ−２の完全長ｃＤＮＡクローンを含んでいるプラスミドｐＦｎｙ２０６は、 制限酵素Ｎｃｏｌ及びＢｓｔＥＩ［で消化した。本ＤＮＡは、次いでＤＮＡ修飾 酵素として作用するＥ、コリＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で処理し、プラ ント末端分子を得た。次いで本プラント末端ＤＮＡを結合し、標準的方法により Ｅ、コリＪＭＩ０１に移入した。これから得たプラスミドが標識ｐＦｎｙ　Ｎ／ Ｂ−４であった。本プラスミドを種々の制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により 分析し、９４塩基対削除を有することを示した。本削除も、結果として開いた読 み枠の変化となり、それにより本遺伝子は約７５ｋＤａの先を切り取った蛋白を コード化した。クローンの結果も、蛋白のアミノ末端で付加２９アミノ酸の潜在 性翻訳となるＲＮＡ−２遺伝子中のＡＵＧの上流潜在性翻訳イニンエータ−８７ としてＡＵＧの保持となった。

実施例店及びＸｌでさらに記載したように、ｐＮ／Ｂ−４に含まれる本修飾Ｆｎ ｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２遺伝子は、植物形質転換ベクターｐＲＯＫ、にサブクロ ーンした。本サブクローニングを促進するため、ＢａｍＨ１部位を本遺伝子の５ °末端に付加した。ｐＮ／Ｂ−４を５ｐｈｌ消化し、ＢａｍＨｌ−Ｓｐｈｌアダ プターを遺伝子の５′末端に位！する５ｐｈｌ部位に結合した。本結合反応に続 いて、ｐＢ／Ｎ−４を、５゛及び３゛両末端にＢａ５Ｈ１相補末端を含んでいる 部位の約２９６０塩基対の断片を遊離したＢａｍＨｌで消化した。それはｐＲＯ Ｋ、中のＢａａＨｌ部位に結合した本断片であり、得られるプラスミドをｐＣＭ Ｖ　Ｎ／Ｂ−２３と命名した。

本プラスミドは、実施例Ｈにより始めに記載した次の試験のためにタバコに本修 飾Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２遺伝子を移入するのに用いた。

特に、図３に関しては、植物は、Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２のどの構造物が植 物に形質転換されたか、どんな培養が特異形質転換に用いられたか、及び特異再 産生植物を示している符号で命名される。ｒＮ／ＢＪはＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ −２のどの構築物が特異植物に形質転換されたかを示す。Ｎ／Ｂ１−８の場合、 本植物中の構築物は、ｐＣＭＶ　Ｎ／Ｂ−２３に由来する（図２参照）。数字「 １」又は「２」は、２つの培養管のどちらがＮ／Ｂ構築物でタバコを形質転換す るのに用いられたを示す。命名に見られる第二の番号は、単に特異植物番号を示 す。

例えば上記実施例中の数字「８」は、これが本形質転換実験で得られる第８産生 植物であることを単に示す。

実施例Ｉ 植物及びウィルス株の培養及び維持 ＴＭＶ株Ｕ、をＡ、アセリン等［パイロロジイ９１　：　（１９７８）参照コに より記載されるように感染ＮタバクムＣνターキノユ・サムスン植物から精製し た。ウィルスＲＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈澱により分離した。Ｎ、 タバクムＣＶ。

キサンチｎｎをＴＭＶ感受性の全身性宿主として、モしてＮ、タバクムＣＶ、キ サンチｎｃを局所病巣宿主として用いた。植物は２４時間当り１４時間光循環、 ２４℃で温室又は生育室に維持した。

実施例■ ５４ｋＤａ遺伝子のコーディング ＴＭＶ５４ｋＤａ遺伝子のりｏ−ンは、ＴＭＶ　ＲＮＡ配列ノ塩基対４９０６な いし４９２３に相補の配列の５゛末端に結合したＢａｍＨ１部位からなる２２塩 基オリゴヌクレオチドブライマーを用いることにより得た。第−鎖ＤＮＡはＭ− ＭＩＶ逆転写酵素により合成し、逆転写酵素及びループバック合成によるフレノ ウによる連続的処理で二本鎖とした［Ｔマニアティス等、モレキュラー・クロー ニングニア・ラポラトリイ・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバ−９Ｎ Ｙ）　（１９８２）参照］。二本鎖ｃＤＮＡをＢａｍＨｌで消化し、Ｍ１３ｍｐ １８のＢａｍＨ１部位に結合した。試験したクローンは、プライマーにより与え られたＢａｍＨ１部位をロックした。この結果、５４ｋＤａの終止コドンの削除 、及びそのＣ末端での５つのアミノ酸による５４ｋＤａの蛋白の伸長となった。

５４ｋＤａの挿入体をＨａｅｌｌによる消化により除き、フレノウで処理して３ ゛オーバーハング末端を鈍（し、最後にＰ　ｓｔｌで消化した。挿入体はＰｓｔ ｌ／Ｓ■ａ１消化ｐＢＳ　（−）に結合され、その結果ＴＭＶ　ＲＮＡ配列のヌ クレオチド残基３４７２ないし４９１４由来のＴＭＶ配列を含むプラスミドｐＲ ＴＴ−１となった。挿入体の定位は、Ｔ７プロモーターからの転写が図１に示さ れるように（＋）センス転写物を与えるものである。

配列決定は試験した全てのクローンが位置３３３２由来の配列を含んだが、プラ イマーにより与えられたＢａ纏Ｈ１部位を欠いた。これにより、５４ｋＤａ終止 コドンの削除及びベクターＭ１３ｍｐ１８から導かれた５つのアミノ酸によるそ のＣ末端での５４ｋＤａ蛋白の伸長となった。無傷の開いた読み枠の存在は、Ｔ ＭＶ配列のＴ７転写ベクターへの挿入により証明された。Ｔ７転写物を合成し、 網赤血球溶解質系で翻訳した。インビトロ翻訳は、ＡＵＧが位ｆ１３４９５で開 始コドンとして機能することを確認した所望とする５４ｋＤａ生成物を得た。生 成物は、５４ｋＤａ抗血清を用いる免疫沈降により所望とする５４ｋＤａ蛋白で あると証明された。

ｐＲＴＴ−１のＴＭＶ５４ｋＤａ配列挿入体はＨｉｎｄｍ及びＳ　ａｃｌによる 消化により除去し、フレノウによる処理によりプラント末端とし、ｐＭＯＮ３１ ６のＳ　ｍａｌ又はＸｈｏ１部位のいずれかに結合した［Ｓ、Ｇ、ロジャース等 、メリーズ・イン・エンザイモロジイ１１８・６２７　（１９８６）参照］。ｐ ＭＯＮ３１６は、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータ ーとツバリンシンターゼ３′未翻訳部分との間に位置するポリリンカ一部分にユ ニークなＸｈｏ１部位を含む。５１ａ１部位は、ポリリンカ一部分に、及びｐＭ ＯＮ３１６のＴｉプラスミド同種部分内に見出される。プラスミドｐＴｓ５４１ Ａは、ノパリンンンターゼ３゛未翻訳部分及びＴ１同種部分の一部の削除となっ た５ｅａ１部位へのＴＭＶ配列の挿入により産生じた。ＴＭＶ配列のＸｈｏ１部 位への挿入の結果、ｐＴｓ５４１が形成した。センス又はアンチセンス定位のい ずれかに５４ｋＤａ配列を含んでいるクローンを特徴付けし、分離した。各構築 物を、二枚交配系の手段によりｐＴｉＢ６Ｓ３−８Ｅを保持するアグロバクテリ ウム・ツメファシェンスＧＶ３１１１に移入し［Ｒ，Ｔ。

フエアシイ等、バイオ／チクノロシイ３　：　６２９　（１９８５）参照］、ト ランスコンシュガントはカナマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性によ り選択した。

５４ｋＤａコーディング配列を、図２に示すようにそれがＣａＭＶ３５Ｓプロモ ーターの後に、続いてノパリンシンノターゼ３′未翻訳部分が来るように、植物 発現ベクターｐＭＯＮ３１６にサブクローンした。本構築物は、最後に、アグロ バクテリウム・ツメファ／エンス伝達葉ディスク形質転換によりタバコ植物に移 入した。被形質転換体は、カナマイシン耐性に基づき、及びノバリンノンシター ゼの生成で選択した。４つの形質転換植物がｐＴｓ５４１で産生じ、他の４つの 植物が３′ノパリンシンノダ一ゼ未翻訳部分と５４ｋＤａ開いた読み枠から直ち に下流に位置するＴ１同種部分の一部に欠けるｐＴｓ５４１Ａで産生じた。この 削除は、キメラＴＭＶ５４ｋＤａ遺伝子配列の植物ゲノムへの組込みを妨害しな かった。

子孫種子を各自家受精植物から集めた。さらに、植物をキメラＴＭＶ遺伝子で形 質転換し、５４ｋＤａアンチセンスＲＮＡが生成するようにした。二つの独立し たアンチセンス被形質転換体は選択し、成熟植物に再生された。

実施例■ 植物形質転換 無菌のＴＭＶ感受性のニコチアナ・タバクムＣＶキサンチ曲葉の切片をホー／ユ ［サイエンス２２７　：　１２２９（１９８５）参照］により記載されるよう＋ ：、ＴＭＶ５４ｋＤａコーディング配列を含んでいる修飾アグロバクテリウム・ ツメファシェンスＧＶ３１１１により形質転換した。形質転換カルスを３００ｕ ｇ／ｍｌの濃度でカナマイシンを補足した再生媒体上で選択した。耐性カルスを 苗条及び根を再生するよう誘導し、土壌に移し、室温で維持した。

実施例■ 核酸分析 ＤＮＡはマリ−及びトンプソンの修飾法により植物の葉から分離した［ヌクレイ ツク・アンッズ・リサーチ８　：　４３２０１９８０）参照］。ＤＮＡを１．０ ％アガロースゲルに分割した制限酵素で消化し、ナイロン膜に移し、ＴＭＶ５４ ｋＤａ配列に特異的な３！Ｐ標識プローブにハイブリダイズした。ＲＮＡを葉組 織から分離し、ＲＮＡをホルムアルデヒドを含有する１、２％アガロースゲルに 分割し、ニトロセルロースフィルターペーパーに移した。プロットを５４ｋＤａ コーディング配列に相補の３２Ｐ標識プローブにハイブリダイズした。６つの独 立形質転換植物をキメラ遺伝子の発現に関し分析した。ゲノムＤＮＡを形質転換 及び未形質転換Ｎ、タバクムＣＶ、キサンチｎｎ、から分離した。ゲノムＤＮＡ のＢａ■Ｈ１消化物を１３Ｐ標ｍＴＭＶ５４ｋＤａ配列特異プローブにハイブリ ダイズした。３．Ｑｋｂ断片へのハイブリダイゼーションは、完全長５４ｋＤａ コーディング配列の存在を証明した。　５４ｋＤａ配列挿入体は１．４４ｋｂで あり、他の１．５９ｋｂはベクターＤＮＡを隣接することにより提供される。ト ランスジェニック植物中の５４ｋＤａ蛋白遺伝子のコピー数は、サザン分析によ り測定されたように、異なるトランスジェニック植物間のディプロイドゲノム当 り１ないし５コピーであることを証明した。５４ｋＤａ配列のコピーは非形質転 換植物にも、５４ｋＤａ配列挿入体を欠いているｐＭＯＮ３１６で形質転換され た植物にも検出されなかった。

形質転換植物から抽出したＴＭＶ５４ｋＤａ転写物もＲＮＡに関するノーザン分 析により試験した。１．５ｋｂのキメラＭＲＮＡに関する予期された大きさを、 各トランスジェニック植物由来の全ＲＮＡに確認した。３°ツバリンシンタ一ゼ 未翻訳部分及びＴｉ同種部分に欠ける組込みプラスミドを含んでいる植物も１， ６ｋｂ転写物を合成する。さらに、ｎｏｓ　３°配列により通常伝えられる終結 配列の欠損の結果として生じつるより大きな転写物が合成された。全ての植物で 多（の小さな未確認転写物も検出された。ベクターだけで形質転換された植物は 、ＴＭＶ　５４ｋＤａ配列プローブとハイブリダイズする転写物を生成しなかっ た。

トランスジェニック植物も実施例■によるＴＭＶ５４ｋＤａ蛋白の発現について 分析した。ウェスタンブロッティング又は記載された免疫沈降方法を用い分析す ると、５４ｋＤａ蛋白は５４ｋＤａ）ランスジェニック蛋白から或は５４　ｋＤ ａ　トランスジェニック植物又はコントロールより調製したプロトプラストから 検出できなかった。

実施例Ｖ 免疫分析 ５４ｋＤａ蛋白に対する抗血清は、５４ｋＤａ蛋白の内部部分、特にアミノ酸残 基１６４ないし１７９をウサギに注入することにより造った。５４ｋＤａＴ７転 写物のインビトロ翻訳生成物は、合成ポリペプチドに対して作られた抗血清によ り免疫沈降性であった。ウェスタンブロッティング用に、形質転換及び未形質転 換植物の全抽出物は５０ｍＭ）リス−ＨＣ１、ｐＨ７，５，１％ドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＤＳ）、１０■Ｍ２−メルカプトエタノール緩衝液中に葉試料を均 一にすることにより調製し、１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電 気泳動に付し、そしてニトロセルロースフィルターに移した。フィルターをまず 特異抗体と続いて金接合抗ウサギ抗体及び銀促進剤とインキュベートした。

５４ｋＤａ蛋白をめる研究で、１１−２Ｘ５０■ＴＭＶ感染ターキッシュ・サム スン・タバコ葉細片を、１ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する１０＋Ｍ ＫＨ２ＰＯ４中１０μＣｉ／ｍｌの濃度で３５３−メチオニンと真空濾過した。

次いでこれらを薄暗い光で２５℃、２０時間インキュベートした。プロトプラス トも５ｓＳ−メチオニンで標識した。それらはニコチアナ・タバクムＣＶキサン チＮＮ葉から調製した。プロトプラスト（５−１０ＩＩＣｉ／ｍｌの５ｓ５−メ チオニン／ｍｌを含有している約１５０．０００／＋１）を光の下、２５℃で４ ０時間インキュベートした。次いでこれらを低速濾過により集めて、２ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、０．５％３ＤＳ、０．２％β−メルカプトエタノール及び１０μｇ／ｍ ｌフェニルスルホニルフロリドをプロテアーゼインヒビターとして含んでいる２ ０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５緩衝液に溶解した。葉切片を乳鉢中、同じ 溶液、ただしその一つはインヒビターを含有しないで抽出した。次いで抽出物を ミクロフユーグ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）遠心により精製し、上清を５４ｋＤａ蛋 白について試験した。５４ｋＤａ蛋白の存在を標識葉又はプロトプラストの抽出 物を上記した抗血清とインキュベートすることによりめた。免疫沈降、ポリアク リルアミドゲル及びオートラジオグラフィアッセーも実施した。

本抗血清は、５４ｋＤａ遺伝子転写物のインビトロ翻訳生成物に非常に活性であ ることが確認され、それは５４ｋＤａ蛋白の製造に必要なＲＮＡを含んでいるＴ Ｍ■ピリオンから調製されるＲＮＡのインビトロ翻訳生成物から５４ｋＤａ蛋白 を容易に沈澱することができた。蛋白はＴＭＶ感染植物又は５４ｋＤａ形質転換 植物のいずれかの葉で検出できなかった。

実施例■ 形質転換植物の接種 自家受精トランスジェニック植物からのＲ１実生は、研磨剤として加えられたセ ライト（商標）を含む５０論Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，２の園ｌ当り１００〆ｇ ＴＭＶ−Ｕ、、又はｐＨ８，６，５０ＩＩＭトリスーリン酸緩衝液中３００μｇ ／社の濃度のＴＭＶ−１Ｊ、ＲＮＡを通常通り接種した。各植物の２つの葉を接 種した。接種材料の容量は接種材料濃度は、適切な塗布に十分な容量があるまで 、臨界決定子であるので、標準化しなかった。続く実験では、ごく関連するＴＭ Ｖミュータント、Ｆガーンアーアレナル等、パイロロジイ１３２　：　１３１（ １９８４）により記載されるように、それを鮮烈な黄色症状の結果として記録す るのが容易である、ミュータントｂ６が葉に惹起する。植物は毎日、症状発達の 可視観察により記録した。幾つかの例では、接種植物中のウィルスの存在を標識 ｃＤＮＡを伴う葉抽出物をＴＭＶにプローブすることにより測定した。

トランスジェニック植物のＴＭＶによる感染に対する感受性を測定する最初の実 験で、植物は１１１当り５０μｇＴＭＶ−Ｕｌを接種した。５４ｋＤａコーディ ング配列を含んでいる８つの独立した形質転換植物の各々からの４つの根実生、 ベクターのみで形質転換したコントロール及び幾つかの非形質転換キンサチｎｎ 変異体を接種した。植物は１室に保持し、症状発達を毎日モニターした。接種５ 日に、トランスジェニックコントロール及び非形質転換コントロールは特徴的モ ザイク症状が明らかに発達したが、形質転換植物は症状発達のしるしを示さなか った。実験の終了した接種後４８日まで、トランスジェニック植物では症状は発 達しなかった。これらの植物の接種及び上方葉の均−物を、局所病巣宿主Ｎ、タ バクムＣＶ、キサンチｎｃに接種するのに用い、症状のない感染が存在するかど うか測定した。これらの植物では検出可能なウィルスの不在を示す局所病巣は発 達しなかった。全ての再産生植物は、それらが、完全ｐＭＯＮ３１６ベクターへ と挿入されたＴＭ■配列を有するｐＴｓ５４１で、又はｎｏｓ　３　’未翻訳部 分及びＴｉ均質部分を欠失するｐＴｓ５４１　で形質転換されたかにかかわりな くＴＭＶに耐性であった。５４ｋＤａアンチセンスＲＮＡの合成の結果である定 位でのキメラ遺伝子で形質転換された植物は、ＴＭＶによる感染に耐性でなかっ た。しかしながら、これらの植物は、ベクター形質転換コントロールに比べて機 構発達での遅延を示した。これは単に機構発達での遅延であったので、これらの 植物はこれ以上試験しなかった。

自家受精トランスジェニック植物由来の子孫実生は耐性現象の遺伝性（ｉｎｈｅ ｒｉｔａｂｉＦｔｙ）についても分析した。Ｒ１産生種子をｍｌ当り３００〆ｇ カナマイシンを含有する組織培養培地で発芽させた。カナマイノン感性実生はク ロロチック（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ）で子葉段階を越えて生育しなかった。カナマ イシン耐性を発現する実生対カナマイノンに感受性を有するものの分割比は、元 の被形質転換体の各々で、ＮＰＴｌｌ遺伝子が多重遺伝子位置で組込まれたこと を示す。自家受精植物由来の種子を、ｍｌ当り３００〆ｇカナマイノンを含有し ている媒体で発芽させた場合、９５％の実生はカナマイシンに耐性であるように なり、５％の実生はクロロチックとなった。トランスジェニック実生は１００　 ｇｇ／ｍｌの濃度でＴＭＶ−Ｕｌを接種すると、２４％のこれらの植物は症状が 発達したが、残りの７６％はウィルス感染に耐性を示した。従って、ＴＭＶに対 する耐性は、約３：１比（耐性；感受性有り）で分離したが、実生はカナマイシ ンに対する耐性に関し、約１９＝１の比で分離した。多数のカナマイシン耐性「 逃亡者」は、これを組込みキメラＴＭＶ遺伝子の発現用の子孫実生をスクリーニ ングする不確かな手段にする。全ての続く感染実験は系５４１Ａ１１誘導Ｒ１実 生の集団を分離することで行なった。

耐性のレベルを測定する実験では、実生は、ＴＭＶの濃度を変えながら接種した 。耐性は、■ｌ当り５００〆ｇのＴＭＶまで濃度を上げて観察した。耐性植物は 接種後３０日間、症状の続く発達は全くなく維持した。葉試料を接種植物から取 り、ウィルス複製及びウィルスの広がりに関しアッセーした。葉試料の抽出物は 精製ＴＭＶ　ＲＮＡから調製したｃＤＮＡでプローブした。ウィルスは接種葉で も、耐性を示した植物の全集でも検出できず、耐性植物でウィルス複製がないこ と、又、耐性は完全で植物中のウィルスの無症候制拡散となる症状発達の抑制で ないことを示す。ＴＭＶ配列がなくベクターのみを含んでいるトランスジェニッ ク植物及び非形質転換植物をコントロールとして用い、ウィルスは両タイプのコ ントロール植物で及び症状が発達した子孫セグレガント（ｓｅｇｒｅｇａｎｔ） で容易に検出することが可能であった。

トランスジェニック植物のウィルス感染に対する耐性の最終評価として、幾つか の植物は、接種後直ちに３１℃に維持した成長室に移し、ＴＭＶに対する５４ｋ Ｄａ誘導耐性が温度感受性であるかどうかを測定した。５４ｋＤａ遺伝子配列を 保持する７接種植物中、５つは３１℃で症状が発達しなかったが、全てのコント ロール植物は２４℃で保持したものに特有の症状が発達した。

結論として、先の記載は、ウィルスのレプリカーゼ部分に関係するウィルスゲノ ムのコーディング配列蛋白を含んでいるトランスジェニック植物が、それから蛋 白の最初に得られたウィルスによる感染に耐性であるという本発明の新規な局面 を示した。

ウィルス外皮誘導耐性と比較して、本発明には多くの利点がある。例えば、本発 明で記載したようにレプリカーゼ関連コーディング配列を利用するウィルス感染 に対する耐性は、高濃度の接種材料を用いると耐性が破壊する外皮蛋白誘導耐性 のように「こわれやすく」ない。逆に、本発明により、完全耐性は、高濃度のウ ィルス又はウィルスＲＮＡで攻撃した植物の非接種葉では観察されない。一方、 ＴＭＶ及びＡＩＭＶの外皮蛋白により伝達される保護は、ウィルスＲＮＡを接種 することによりな（すことができる。５３ｋＤａコ一ド配列を利用する本発明に よる誘導耐性は、ウィルスＲＮＡで攻撃したときも依然そのままである。５４ｋ Ｄａのトランスジェニック植物での耐性のレベルは発現のレベルによるとはみえ ない。

遺伝子配列の一コピーのみを伴う植物は、無傷のバイロンに対する耐性に低下を 示さなかった。ＴＭＶ外皮蛋白の単一コピーも植物を防御するのに十分であり、 これに対し、ＡＩＭＶ外皮蛋白の一コピーはそうではない。

上記に加えて、ウィルス生活サイクルが本発明によるレプリカーゼゲノムの部分 を用いて崩解される段階を見出すことに向けた研究も実施した。

実施例■ タバコ植物にコチアナ・タバクムＬ　）ｃｖ、キサンチ曲並びに５４ｋＤａトラ ンスノエニソクキサンチｎｎ、及びＴＭＶ局所病巣インディケータ−宿主キサン チＮＮを温室条件下に保持した。プロトプラスト調製に用いた植物は、使用前少 な（とも１週間、１４時間明／１０時間暗サイクル、２４℃の生育室に移した。

光強度をチーズクロスで暗くすることにより１２５−１５０ｇＥ・「２・ｓ−１ に減じた。

ＴＭＶ株Ｕ１及びＵ２［フィトパソロジイ４４：２７７（１９５４）参照］を精 製しり［パイロロジイ９１・１３３（１９７８）参照］。以下の実施例の幾つか で用いたＴＭＶ株Ｕ１は、ウィルスの完全長ｃＤＮＡクローンから産生した転写 物から誘導した。全植物のウィルス感染は研摩剤としてセライトを含む０．０５ Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７，０緩衝液００５．０．５又は１．Ｏｍｇ／ｍｌのＴ ＭＶ株Ｕ１による完全拡大キサンチ曲又は５４ｋＤａ）ランスジェニックタバコ 葉の上及び下面の接種により達成した。ウィルスＲＮＡは、ＴＭＶ株Ｕ１及びＵ ２からフェノール抽出及びエタノール沈澱により調製した。

実施例■ プロトプラスト調製及び感染 プロトプラストは５４ｋＤａトランスジエニツク植物及びコントロール、非トラ ンスジユニツクタバコ植物の葉から得た。プロトプラスト（０，５−１，０Ｘ１ ０＠細胞／■１）はＴＭＶ株Ｕ１又はＵ２から抽出したウィルスＲＮＡとのエレ クトロポレーションにより感染した。エレクトロボレーンジンは、２つの３００ ｖの５閣ｓｅｅパルスを適用することによるブロゲネター１エレクトロボレーシ コン装置に結合した単一環電極（２，５關高、１ｃ■ギヤツプ）を用い、２簡１ の無菌の０．７■ｌの無菌０．７Ｍマニトールの最終容量で達成した。慣用上は １０ａｇ／■ｌが用いられるが、ウィルスＲＮＡ濃度は１０から１０（ｂｇ／■ １に及んだ。さらに、全実験は、緩衝液のみでエレクトロポレートした模擬接種 プロトプラストのセットを含んだ。

エレクトロボレーンヨン後、プロトプラストをインキュベーション媒体、５０ｍ Ｍクエン酸で緩衝化した、１ｍＭＫＮＯｓ、ｌ　ｍＭ　Ｍｇ　Ｓ　Ｏａ、０．１ ｍＭ　ＣａＣ１＊、１ｕＭ　Ｋｌ、０．０１＃Ｍ　ＣｕＳＯ４，１０ｇｇ／ｍｌ リモシディン及び１００　ｇｇ／ｍｌ力ルベニノリンを含む０．７Ｍマニトール 、ｐＨ５，５緩衝液に再懸濁した。プロトプラスト（３■１）を寒天プレート（ ６０Ｘ１５ｍｍ皿に調製した接種媒体中１％極上寒天）に移し、低い明りで２５ ℃で接種した［パイロロジイ１６１　：４８８（１９８７）参照〕。

実施例■ プロトプラスト蛋白の分析 プロトプラスト中のＴＭＶ外皮蛋白の蓄積はウェスタンブロッティングにより検 出した。プロトプラストを低速遠心により集め、５０−１００μｇの５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）試料緩衝液に崩解した［ネイチャー ２７７：６８０参照コ。

放出蛋白を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにエレクトロプロ ットし、株ＵＩＴＭＶ外皮蛋白及び［１２８■］プロテインＡに対するウサギポ リクローナル抗血清（１＋１０００希釈）を用いプローブした。プロトプラスト 中のウィルスコード化蛋白の合成をモニターするため、Ｌ　［３６３］メチオニ ンをインキュベーション媒体に１０ｇＣ１／ｍｌの濃度で加えた。連続ラベリン グ後、プロトプラストを０．７■１マンニトールで洗浄し、緩衝液中に崩解した 。［ｓ６Ｓ］標識蛋白を５ＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー２２７：６８０（１９７ ０）参照コ及びオートラジオグラフィにより分析した。

実施例Ｘ ＲＮＡの分析 エレクトロボレーンヨン後、種々の時間で、プロトプラストを集め、無菌０゜７ Ｍマニトールで洗浄し、５０１ＭトリスＨＣＩ、ｐＨ８，０緩衝液１０■Ｍ　Ｅ ＤＴＡ、２％ＳＤＳ中に崩解し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ ール（５０：５０：１）で抽出した。幾つかの例では、エタノール沈澱に続き、 塩化リチウム可溶（ｄｓＲＮＡ濃厚）及び塩化リチウム不溶（ｓｓＲＮＡ濃厚） フラクションを調製した［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ５　 ：　２２３８　（１９８５）参照］。葉ＲＮＡは液体窒素中で細粉化した葉組織 で開始する同様の方法で調製した。

ＲＮＡをホルムアルデヒド含有、１．２％アガロースゲル上で分離し、ニトロセ ルロースにプロットし、次いでこれをインビトロ合成、［”ｐコ標識転写物でプ ローブした。ノーザンプロットは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ−０，１５Ｍ塩化ナ トリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、５×デンハーズ溶 液、５０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，０，１％ＳＤＳ、２５０μｇ／鵡 １の酵母ＲＮＡ及び５０％ホルムアミド中４５℃で２４時間、プレハイブリダイ ズし、そしてハイブリダイズし、０．ｌＸ５ＳＣ，０，２％ＳＤＳ、６５℃で５ 回洗浄した。特異的にハイブリダイズしているＲＮＡバンドの相対量は、鋳型と してオードラジオグラフを用い適当領域のニトロセルロースフィルターを切断す ること、及び液体ノンチレーノヨンスペクトロメーターを用いて結合した放射活 性プローブの量を測定することにより定量した。

インビトロ合成ＲＮＡプローブは、２つのＤＮＡ鋳型から調製した。１）１２６ ｋＤａ蛋白読み枠の全てを含む、株ＵＩＴＭＶのヌクレオチド１−３．７８５に 対応する挿入体を含んでいるｐＢＳＭ１３の誘導体、ｐＢｓ１２６のＴ３ポリメ ラーゼ転写［モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボラトリーズ（１９８９）参＠］は、Ｔｈｉ〜′ゲノムＲＮＡの本部分に対応 し、完全長（−）センスＴＭＶＲＮＡの３゛部分に相補の（＋）センス転写物を 生ずる。２　）　Ｔ　Ｍ　Ｖの外皮蛋白遺伝子（ヌクレオチド５．６６３から３ ゛末端まで）に対応する挿入体を含んでいるｐＳＰ６４誘導体のＳＰ６ボリメラ ーゼ転写［モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ ボラトリーズ（１９８９）参照］。これは、（＋）センス全長並びにその全てが 同一３′末端を有する、サブゲノムＴＭＶ　ＲＮＡに相補の（−）センス転写物 を生ずる。さらに、株ＵＩＴＭＶ５４ｋＤａ蛋白をコード化する配列を含んでい る、ｐＲＴＴ−１のＴ７転写物を調製し、インビトロ翻訳系で小麦胚芽［ＰＮＡ Ｓ（ＵＳＡ）７０：２３３０（１９７３）参照〕及び網赤血球溶解物派生［ヨー ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリイ６７＋２４７（１９７６）参 照コをプログラムするのに用いた。

株ＵＩＴｈｉＶＲＮＡと２４又は４８時間速くエレクトロボレートされた５４ｋ Ｄａトランスジエニツク植物由来のプロトプラスト［実施例■参照］は、局所病 巣インディケータ−植物に関するパイオアｙセーにより検出しうる感染ウィルス は全く含有しなかったが、同一実験条件下で、これらのプロトプラストは感染株 Ｕ２ＴＭＶを複製した。逆に、非形質転換植物由来のコントロールプロトプラス トはＴＭＶの両株を複製した。バイオアッセーデータによれば、５４ｋＤａ）ラ ンスジェニック植物由来のプロトプラストは、たとえ接種材料濃度が１０から１ ００μｇ／ｍｌのＲＮＡに増加しても、株ＵＩＴＭＶＲＮＡに対し耐性を保持し た。バイオアッセーデータと一致して、プロトプラスト蛋白のウェスタンプロッ ト分析は、同一条件下、これらの細胞が株Ｕ２ＴＭＶ外皮蛋白を、コントロール 、非トランスジェニックタバコプロトプラストでのものと同様の量、蓄積したけ れども、５４ｋＤａトランスジエニツクプロトプラストは検出可能な株ＵＩＴＭ Ｖ外皮蛋白を蓄積しなかった。

これらの結果は、本発明による全無傷５４ｋＤａトランスジエニツク植物により 示される耐性は、それら植物から調製されたプロトプラストにより維持されるこ と、及び耐性機構は単一細胞のレベルで機能することを示す。これは、耐性が、 全植物レベルで、細胞から細胞への、又は長距離ウィルス広がりでの阻止に一次 的に因るのではなく、ウィルス感染の開始を防止することによるか、又は一旦感 染が起きたウィルス複製を阻止することにより作用するに違いないことを意味す る。本結論は、５４ｋＤａ）ランスジェニック植物での原形質連絡（細胞ウィル ス広がりへの細胞の経路）が未修飾であるように見え、正常分子除外限界を有す ることを示すデータと一致する。

１２６ｋＤａ蛋白は、より豊富な二つの既知ウィルスコード化ＴＭＶレプリカー ゼ成分であり、ＴＭＶゲノムＲＮＡの５′近位開いた読み枠により指令されるそ の合成は、多分、ウィルスアンコーテイング後（又は間）複製の第一段階である 。

１２６ｋＤａ蛋白は、株ＵＩＴＭＶに感染した５４ｋＤａのトランスジェニック プロトプラストから抽出した［３６Ｓ］〜標識蛋白間に明白ではながった。しか しながら、同一条件下で、１２６ｋＤａ蛋白は、株ＵＩＴＭＶに感染した非トラ ンスジェニックタバコプロトブラスト由来の［”Ｓ］標識蛋白の抽出物に存在し た。同等物、株Ｕ２ＴＭＶによりコード化されたより速い移動蛋白は、ＴＭＶの 株に感染したトランスジェニック及び非トランスジェニックプロトプラストの両 者で合成された。同様に、株Ｕ２ＴＭＶ外皮蛋白の合成は、両細胞型で観察され た。型ＵＩＴＭＶ外皮蛋白の合成は、それがメチオニンを欠いているので、本方 法では観察できなかった。適当な抗血清との免疫沈降にょる１２６及び１８３ｋ ＤａＷ白の検出の感度を改良する試みは成功しなかった。

直接法は、株ＵＩＴＭＶに感染した５４ｋＤａ）ランスジェニックタバコプロト プラストでウィルスコード化しプリカーゼ蛋白の合成を行うことは成功しなかっ たが、これらの蛋白の存在を検出する間接方法がまだ存在した。特にレプリカー ゼ活性の全ての生成物はｌｊルベルの全てのレプリカーゼ成分の存在を明らかに するであろう。複製の最初の生成物が入刃物から産生じた（−）センスＲＮＡで あるので、（＋）センス、ゲノムＴＭＶ　ＲＮＡ、株ＵＩＴＭＶ感染５４ｋＤａ 　ｌ−ランスジェニックタバコプロトプラストを完全長（−）センスＴＭＶ　Ｒ ＮＡの存在について調査した。２１時間ポストインキュベーションにより、その ｄｓ形は検出できなかったが、痕跡量のＳＳ、（−）センス、完全長ＴＭＶ　Ｒ ＮＡが株ＵＩＴＭＶ感染５４ｋＤａ）ランスジェニックタバコプロトプラストに 存在することが判った。従って、幾つかの少量のウィルスコード化しプリカーゼ 成分が感染後合成され、これらの細胞である程度機能したに違いない。

５４ｋＤａトランスジエニツクタバコプロトプラストでの（−）センスＴＭＶＲ ＮＡの検出は、複製が（−）ストランド合成を越えて進行したかどうかを測定す る研究を促進し、それにより全ての（＋）ストランド合成となった。ＴＭＶＲＮ Ａの（＋）センス、３゛配列に特異的なプローブによるプロトプラストＲＮＡの ノーサン分析は、５時間ポストインキュベーションによる低レベルの（＋）セン スＴＭＶ　ＲＮＡの存在及び株ＵＩＴＭＶ感染５４ｋＤａ）ランスジェニックタ バコプロトプラスト中２１時間ポストインキュベーションによる完全成分の完全 長サブゲノムＴＭＶ　ＲＮＡを検出した。完全成分のｄｓ形の完全長のサブゲノ ムＴＭＶ　ＲＮＡは、ＴＭＶ感染感染シトランスジェニックプロトプラスト観察 された。しかしながら、プロット分析はＴＭＶ感染５４ｋＤａトランスジェニッ クプロトプラストでＴＭＶｄｓＲＮＡを検出するのに十分な感受性ではなかった 。特異的５ｓＲＮＡバンドに結合した放射活性プローブの計算は、株ＵＩＴＭＶ 感染５４ｋＤａｈランスジェニックタバコプロトプラストに蓄積した完全長（十 ）センスＴＭＶ　ＲＮＡが、特異実験に依存する感染非トランスジェニックプロ トプラストのそれらよりも２０ないし８０倍少女いことを示した。同様の結果が 研究室ＵＩＴＭＶ　ＲＮＡ又はクローン指定ＵＩＴＭＶ　ＲＮＡを用いて得られ た。従って、結果は低レベルの株ＵＩＴＭＶ複製が５４ｋＤａｈランスジエニツ クタバコプロトプラストで起きることができることを示す。

上記実施例、特に株ＵＩＴＭＶとの５４ｋＤａｌ−ランスジェニックタバコプロ トプラストの実施例■−Ｘに記載した研究は、これらの細胞が痕跡量のＴＭＶ特 異ＲＮＡの合成を可能にすることを示した。次の実験はプロトプラストにより得 られる結果が全５４ｋＤａ）ランスジェニック植物の葉細胞における耐性現象の 特徴を真に反映したかどうかであった。これをなすために、５４ｋＤａｈランス ジエニツクタバコ植物の葉は、それらの上及び下面で０．０５及び０．５＠ｇ／ ｗＬの濃度で株ＵＩＴＭＶ粒子を接種した。これらの高濃度接種材料（非トラン スジェニックタバコ植物を感染するのに典型的に用いられるものより２及び３倍 の大きさ）を用い葉細胞の数を最大にし、そしてウィルス特異ＲＮＡを検出する 機会を増加させた。

ＵＩ　ＴＭＶ株０．０５ｍｇ／ａ１を接種した５４ｋＤａ）ランスジェニックタ バコ葉由来のＲＮＡのノーサン・プロット分析は、如何なるウィルスＲＮＡをも 明らかにしなかった。しかしながら、接種を０．５ｍｇ／ｍｌまで増加させると 、検出可能な濃度の完全長およびサブゲノム（＋）センスＴＭＶ　ＲＮＡの生成 をもたらし、それは期間にわたって増加した。再び、存在し得た全てのＴＭＶ２ 本鎖ＲＮＡは、濃度が低すぎて本方法を使用して検出することはできなかった。

ノーサン・プロットにおける特異的ＲＮＡバンドに結合した放射活性プローブの 量の比較は、濃密接種５４ｋＤａトランスジ工ニツクタバコ葉に蓄積される完全 長（＋）センスＴＭＶＲＮＡは非トランスジェニックタバコ組織に発見されるも のより１７−２０倍低いことを示した。同様の結果が、研究室ウィルス単離物お よび感染性ＴＭＶｃＤＮＡクローンから増殖したウィルス（１ｍｇ／ｍｌの濃度 で適用）の両方で得られた。５４ｋＤａトランスン工ニソクタバコ葉の密に接種 された部分を局所病巣インディケータ−植物のアッセイのための接種材料の根源 として使用する場合、少量の生理学的活性ウィルスがしばしば検出された。クロ ーン由来ウィルスを接種に使用した場合、同じ植物の池の葉または同じ葉の非接 種部分でウィルスは検出されなかった。

総体的に、濃密接種５４　ｋＤａ　トランスンエニックタバコ葉で得られた結果 は、プロトプラストを使用して得られたものと一致するように見え、そこではウ ィルス複写が王に阻害されているように見えるが、完全には停止されていない。

ＵＩ　ＴＭＶ株の複写の阻害がどのようにして本発明による５　４　ｋＤａ　ト ランスジェニックタバコ植物で達成されるか、２つの可能な記載がある。第１に 、５４ｋＤａ蛋白またはそのＲＮＡは直接レブリカーゼ活性を阻害するか、また は第２に５４ｋＤａ蛋白またはそのＲＮＡは、例えばウィルスコード化しプリカ ーゼ成分、１２６および１８３ｋＤａ蛋白の合成を阻害することにより間接的に 作用する。第２の可能性は、５４ｋＤａ蛋白をコードするインビトロ合成ＴＮＡ 転写物によりプログラムまたは前プログラムされたインビトロ翻訳系におけるウ サギ網状赤血球または小麦胚内のＴＭＶ　ＲＮＡｇ訳を扱った。これらの両方の 無細胞翻訳系において、１２６−および１８３−並びに５４ｋＤａ蛋白の合成は １２６−または１８３−ｋＤａ蛋白合成の特異的阻害の示唆を伴うことなく発生 した。従って、本発明の５４ｋＤａ蛋白またはそのＲＮＡが、ウィルスコード化 しプリカーゼ成分に影響を与えるという証拠はない。従って、結果は、最初の可 能性、即ち５４ｋＤａ蛋白またはその対応するＲＮＡがレプリカーゼ活性に直接 影響を与えるということと一致する。

ＴＭＶに加えて、研究をキュウリモザイクウィルス（ＣＭ　Ｖ　）でも行い、同 様の結果であった。これらの実験において、ニコチアナ・タバクム（Ｖターキッ ンユ・サムサンＮＮ植物を、ＣＭＶサブグループ■株Ｆｎｙのレプリカーゼ要素 の転写物をコードするＲＮＡ−２の修飾ｃＤＮＡクローンて形質転換した。遺伝 子はヌクレオチド１８５７から１９５０の範囲の９４ｂｐ部分の欠損により修飾 されていた（図２）。更に具体的には、実施例ＸＩＩに記載のように修飾され、 ９４ｂｐの欠損を生産するのに使用するＮｃｏｌｔよびＢｓｔＥＩＩ部位を有す るＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチドは：ＡＡ ＩＪＡＣＣＡ［Ｘ：ＧＬＸ：Ｉ（シ（ニー１νＬにｉ−１〕（１ｊＧＡＧ［ＸＪ ＧＣＣ［ＸＥＧＵＧＪＵＡＵＧＡＣ４２ＡＯ：　ＧＡＣＣＭ　ｔＪｔｃ　ＧＭ　 ＡＡＧαＪＪ　ｔＪＩＪＡ　ＩＪ［ＪＣｔＪｃＡ　ＧＧＣＧＡＩＪ　ＧＡＩＪ　 ＬＣｔｌ　Ｅ１４〔式中、最初の下線部分はＮｃｏｌ制限部位に対応し、太字の “Ｇ”はヌクレオチド１８５６に対応し、２番目の下線部分はＢｓｔＥＩＩ制限 部位に対応し、太字の“Ｇ”はヌクレオチド１９５１に対応する。〕　１および アミノ酸配列は。

一度９４ヌクレオチド欠損を実施例ＸＩｆ記載のように行えば、修飾１’ｙｎ− ｃＤＮＡクローンのカルボキン末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は。

〔式中、下線部分は最初の下線制限部位に対応し、太字の”Ｇ”は元のヌクレオ チド１８５６および１９５１を表わす〕　；およびアミノ酸配列は 本９４ｂｐの回りおよびこれを含む部分は、多くの陽性センスＲＮＡ植物および 動物ウィルス中の配列をコードする推定レプリカーゼの間に密に保存されている ４つのドメインを含む。本欠損９４ｂｐ部分はまた第３のドメイン、Ｇｌｙ−Ａ ｓｐ−Ａｓｐドメインを含み、それはバクテリオファーンＱβの複写に必要であ ることが示されている。上記の配列に示されるように、本欠損はまた、先を切り 取った翻訳生産物による開いた読み枠で／フトを起こした。元の被形質転換体由 来のＲ１世代植物は、ウィルス感染に対する耐性を試験した。１８個の形質転換 系のうちの２個由来の植物は、Ｆｙｎ−ｃＤＮＡピリオンまたはＲＮＡの何れか を５００μｇ／ＩＮ１の高濃度で接種した場合でも、全体性疾、”！’に耐性で あった。耐性は、保毒アブラムノを植物に接種し、植物を非常に関連のあるサブ グルー１１株０．５ｙｎＹおよびＶｅ８５を接種して維持した場合に見られたが 、ＬＳ、サブグループ■株を接種した場合は見られなかった。

実施例Ｘ キュウリモザイクウィルス株 キュウリモザイクウィルス株Ｆｎｙ、Ｏ，５ｎｙＳＶｅ８５、ＹおよびＬＳを、 ニコチアナ・タバクム（Ｖターキノ／ユ・サムサンから、パルヵイティス［メソ ッズ・フォー・プラント・バイオロジー、ワインユバツバおよびワインユバツバ 編、アカデミツク・プレス、ニューヨーク（１９８８）参照］により記載された ように精製した。ウィルスＲＮＡを無傷キュウリモザイクウィルスがら、フェノ ール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱により単離した。植物に通常通り 、５０ｗＭ　リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２中のウィルスまたは５０＋ｅ Ｍトリスリン酸緩衝液、ｐＨ８，９中のＲＮＡを、研磨セライトを使用して接種 した。ニコチアナ・タバクムＣＶターキッシュ・サムサンＮＮを、植物形質転換 およびキュウリモザイクウィルス感受性全体的宿主として使用した。植物を２４ ℃で、１６時間／８時間明暗サイクルの温室中または成育室中で育てた。

実施例■ キュウリモザイクウィルスＲＮＡ−２の修飾およびサブクローニング完全長非感 染ＲＮＡ−１をコードするＦｎｙ−ＣＭＶｃＤＮＡクローンｐＦｎｙ２０６　［ Ｊ・イン、ピロロジー、６９　：　１７７７（１９８８）参照コを修飾し、図２ に記載のように２成分性植物形質転換ベクター中へサブクローニングした。ＲＮ Ａ−２クローンを、ｐＦｎｙ２０６を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌで消化す ることにより修飾し、フェノール／クロロホルム抽出してこれらの酵素を除き、 エタノール沈澱した。ＤＮＡを、プラント末端分子を得るという試みにおいてヌ クレオチド不存在下クレノー断片で処置した。ＤＮＡを、次いで、制限エンドヌ クレアーゼＢｓｔＥＩＩで消化し、ヌクレオチド存在下クレノー断片で処理して プラント末端分子を得、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した 。本直線分子を、次いでＴ４　ＤＮＡリガーゼで再び環状にし、ヌクレオチド１ ８５７からヌクレオチド１９５０　（両端を含む）の９４が欠損しているＦｎｙ −ＣＭＶＲＮＡ−２のｃＤＮＡクローンを含むプラスミド（ｐＦｎｙＮ／Ｂ　４ ）を産生した。

本９４ヌクレオチド部分は、多くの陽性センスウィルスのレブリカーゼ蛋白の中 で非常に保存されているＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐドメインを含んだ。本欠損はま た、欠損部位から１５コドン下流の枠内翻訳停止コドンをもたらす開いた読み枠 内のンフトの原因となった。本欠損は、従って、９４ｂｐ部分の欠損だけでなく 、先を切り取った開いた読み枠をもたらした。クローニングはまた、蛋白のアミ ノ末端の２９個の付加的なアミノ酸の有効な翻訳をもたらす、ＲＮＡ２遺伝子中 のＡＵＧの８９個上流の有効な翻訳イニノエーターとしてのＡＵＧの保存をもた らした。本修飾遺伝子によりコードされる蛋白は、従って、９６．７ｋＤａの野 生型蛋白と比較してサイズは約７５ｋＤａである。

本修飾Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２ｃＤＮＡクローンを２成分性植物形質転換ベ クターにサブクローニングするために、ｐＮ／Ｂ−４を、ＲＮＡ−２ｃＤＮＡ欠 損クローンのプラスミドのＮ末端の５°部位で本プラスミドを切断する５ｐｈ１ で消化した。５’Ｂａ畦１１突出および３’５ｐｈｌ突出を含むアダプターを、 本部位にライゲートし、次いでＣ−末端の３°部位で切断するＢａｍＨｌで消化 させ、それにより完全修飾ｃＤＮＡ分子を遊離させた。３ｋｂフラグメントを、 標準的技法により２成分性植物形質転換発現ベクターｐＲｏｋ２のＢａｍＨ１部 位へサブクローニングし［ネーチャー、３２１　：　４４６（１９８６）参照］ 　、ｐＣＭＶ　Ｎ／Ｂ−２３を産生じた。構築物を、アグロバクテリウム・ツメ ファシェンス株ＬＢＡ−４４０４へ、エンエリキア・コリ株ＭＭ２９４−ｐＲＫ ２０１３により媒介される二親交配［メソソズ・イン・エンザイモロノー、１１ ８：６２７（１９８６）ｖ照］により移入した。トランスコンシュゲイトを、そ れぞれ５０および１２５４ｇ／ｍｌのカナマイシンおよびストレプトマイノンに より選択した。ｐＦｎｙ２０６およびｐＣＭ〜’　Ｎ／Ｂ−２３中のＦｎｙ−Ｃ ＭＶ　ＲＮＡ−２のヌ’）し：ｔチＦ配列を図２に示す。

実施例■ 植物形質転換 ニコチアナ・タハクムＣ〜・ターキソノユ・サムサンＮＮの形質転換を、実施例 １１Ｔ中のようなホルンユが記載したアグロバクテリウム・フメファンエンス媒 介葉ディスク形質転換により行った。葉ディスクとｐＣＭＶ　Ｎ／Ｂ−２３との 共培養の２日後、葉ディスクを、カルベニノリン５００Ｉ１ｇ／醜１、カナマイ シン３００　ｇｇ、／ｍｌ、６−ペンシルアミツブリン（Ｂ　Ｐ　Ａ）　１　ｍ ｇ／　ｌおよびナフチル酸（ＮＡＡ）Ｏ，１ｍｇ／ｌ含有発芽再生培地に移した 。培地中で成育した葉ディスクを、７から１４日毎に新鮮培地に移した。約４週 間で芽が形成され、それを、カナマイノン３００Ｍｇ／ｍＬ　ＢＡＰｏ、２ｍｇ ／ｌおよびＮＡＡＯ，１ｍｇ／Ｉ含有根誘発培地に移した。これらの芽は、約２ −３週間で根を形成し、その時にそれらをバーミキュライトに２週間移し、土壌 に再び鉢植えし、成育室に移した。１８個の独立したカナマイシン耐性被形質転 換体を、更なる分析のために選択した。

実施例ＸＩＶ 耐性の評価 １８個の独立した形質転換体を、始めはＦｎｙ−ＣＭＶ感染に対する耐性の分離 菓検定によりスクリーニングした。葉を各々ＲＯ世代トランスジェニック植物か ら離し、Ｆｎｙ−ＣＭＶ５０μｇ／ｍｌを表皮の上部および下部に接種した。葉 茎を水に浸し、葉を６日間、２５℃でインキュベーションし、その後直径２ｃ鵬 の葉ディスクを除去した。本組織の抽出物を５２Ｐ−標識ｃＤＮＡでＦｎｙ−Ｃ ＭＶに対して試験し、ウィルスＲＮＡが存在するかどうか測定した（パルカイテ ィス、１９８８）。ウィルスＲＮＡの不存在および存在は、それぞれウィルス感 染に対する耐性または感受性を示唆した。これらのトランスジェニック植物を、 花を咲かせ、Ｒ１世代の種子を集めて、植えた。

本アッセイは、これらのトランスジェニック系のうち７個がＦｎｙ−ＣＭＶ感染 に対して耐性であり、分離葉アッセイにより耐性を示した各７個の形質転換系由 来のＲ１世代実生（Ｎ／Ｂ１−１．１−２．１−８．２−３．２−５．２−６お よび２−７）および分離葉の測定では耐性を示さなかった一つのトランスジェニ ック系（Ｎ／Ｂ２−１）および非形質転換ニコチアナ・タバクムｅＶ、ターキッ シュ・サムサンＮＮ植物に、Ｆ　ｎ　ｙ−ＣＭＶｏ、　２．１．０．５．１０お よび１１００ａ／１１１を接種した。推定耐性系の総ての植物は、Ｒ１世代トラ ンスジェニックタバコ植物のＣＭＶ感染に対するレブリカーゼ媒介耐性の評価を 提供する以下の表１に記載のように０．２および１０μｇ／ｍｌの接種材料用量 の範囲では耐性かもしくは症状を遅延した 上記表１において、 ０初期分離講アッセイは、この系の総て（Ｎ／Ｂ　２−１およびＮ／Ｎ以外）が Ｆｎｙ−ＣＭＶ感染に対して耐性であることを示した；１植物を５０ｍＭ　Ｎａ ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７，２中のＦｎｙ−ＣＭＶで、研磨剤としてのセライトと共 に接種した。これらのデーターは、接種後２週間で症状を示した植物の数を、接 種植物の全数の関数として示した：°これらの数は、全体症状を示す植物の散開 る接種した植物の全数を示す；’ＮＤ±測定せず； Ｉ温度が耐性に影響を与えるか否か測定するために、植物はＦｎｙ−ＣＭＶ２０ ｇｇ／醜１を接種し、２週間３０℃でインキユペーンヨンした；そして曾植物は 、１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，９中のＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ　 ５０　ａｇ／菖１を接種した。

個々の植物がこれらのウィルス濃度で耐性である２種の系（Ｎ／Ｂ　１−２、Ｎ ／Ｂ　１−８）を、５００　ｐｇ／ｍｌのウィルス濃度のＦｎｙ−ＣＭＶ接種材 料に対して耐性であるか試験し、系Ｎ／Ｂ　１−８にＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ５ ０＋＋ｇ／園１を接種した。これらの系由来の総てのＲ１集団が、これらのＲ１ 集団中の本耐性形質のメンデル分離によりか耐性であるということではない。植 物を、症状の進行の毎日の観察により得点を付した。ある場合には、接種植物中 のウィルスＲＮＡの存在を、葉抽出物のｓ！Ｐ−標識Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ｃＤＮＡ による試験により測定した。系Ｎ／Ｂ　１−２．１−８．２−３および２種の対 照系のＲ１実生をＦｎｙ−ＣＭＶ５００μｇで、表１に記載のように接種し、３ ２個の接種されたＮ／Ｂ　１−８植物のうち１４個および２６個の接種されたＮ ／Ｂ　１−２植物のうち２１個は、病気の症状が進行した。従って、非常に高い 接種材料用量は、低い接種材料用量では耐性であろうある植物を壊滅させるよう に思われる。本過程は、１００μｇ／■１では耐性で劣ったいくつかの植物（３ ５のうち３）が、５００Ｉ１ｇ／１１１で超感染した場合に症状を示したＲ２世 代植物による実験で確認された。

しかしながら、ウィルスＲＮＡも子孫ウィルスも、耐性植物の未接種葉では、ド ツト・プロット・ハイブリダイゼーションおよびバイオアッセイを使用して検出 できず、これらの植物は、真の耐性を示し、単に症状を抑制しているだけでなな いことを示唆する。

２種の系（Ｎ／Ｂ　１−２およびＮ／Ｂ　１−８）、分離葉アッセイにおいて耐 性を示さなかったトランスジェニック系（Ｎ／Ｂ　２−１）および非形質転換ニ コチアナ・タバクムＣν、ターキッンユ・サムサンＮＮ植物由来のＲ１世代実生 は、また、保毒アブラムノ（ミザス・ベルンカエ）によりＦｎｙ−ＣＭＶ感染に 対する耐性を試験した。Ｆｎｙ−ＣＭＶにより全体に感染したニコチアナ・フレ ブランディは、これらのアブラムシが実験植物を食べる前に食べるウィルス源植 物として作用した。源植物に関する３０分間の給食期間後、アブラムノをトラン スジェニツクおよび対照植物に、各々の植物に１０匹のアブラムシかつ（ように 移した。

アブラムシに約１５時間食べさせ、その後、植物をアブラムシを殺すために殺虫 剤で消毒した。得られた植物は、アブラムシにより伝達するとすぐに、Ｆｎｙ感 染に対して耐性であった。

実施例ＸＶ ゲノムＤＮＡ分析 ゲノムＤＮＡを、マーレイおよびトンプソン（１９８０）の変法により葉組織か ら単離した。高分子量ＤＮＡを制■酵素で消化し、０．８％アガロースゲル上で 分離し、／−ン・スクリーン・プラス（デュポン）ナイロン膜へ移した。膜を５ ＸＳＳＣ１５×デンハード、５％デキストラン硫酸および２％ＳＤＳ中で、Ｆｎ ｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２遺伝子配列に特異的な３２ｐ−標識ＤＮＡプローブとノ ）イブリダイズした。総てのＤＮＡプローブは、ランダムヘキサマープライマー 反応［アナリイティカル・バイオケミストリー１３２：６（１９８３）参照］に より調製し、少なくとも５　Ｘ　１０　’ｃｐｓ／　ＩＩｇのＤＮＡに特異的活 性である。

これらの７種のトランスジェニック系および系Ｎ／Ｂ　２−１およびｐＲＯＫ２ ベクター単独で形質転換した対照系（ＲＯＫ９）由来のゲノムＤＮＡを、上記の ように試験した。ササンブロソトハイブリダイゼーション分析は、これらの７系 がハブロイドゲノム当たり約１ないし７コビーを含むことを示した。最も高いコ ピー数を含む系、系Ｎ／Ｂ１−２および１−８は、約３−５および５−７コピー をそれぞれ含んだ。分離葉アッセイで耐性でない系Ｎ／Ｂ　２−１は、ノ１プロ イドゲノム当たり１コピーを含んだ。対照ＲＯＫ９系はＦｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ −２相同性配列を含まなかった。

耐性が温度感受性か否かを測定するために、耐性系Ｎ／Ｂ　１−２および１−８ および対照系Ｎ／Ｂ　２−１および非形質転換ニコチアナ・タバクムＣＶ、夕一 キッンユ・サムサンＮＮのＲ１苗を、Ｆｎｙ−ＣＭＶ２０ｇｇ／ｍｌ接種し、す ぐに３０℃に維持した成育室に移した。接種後４日間の間、総ての対照植物は全 体症状が進行したが、一方多くのＮ／Ｂ　１−２および１−８耐性植物が得られ 、本耐性が温度感受性でないことを示した（表１参照）。

先行研究［ＥＭＢＯ・ジャーナル６　；　１８４５（１９ｇ？）　；バイオ／テ クノロジー８　：１２７　（１９９０）およびピロロジー１５９　：　２９９（ １９８７）参照］は、コート蛋白がＴＭＶの保護を媒介し、アルファルファ・モ ザイク・ウィルスがウィルスＲＮＡ接種に打ち勝つことができる場合があること を示している。従って、系Ｎ／Ｂ１−８、非耐性Ｎ／Ｂ　１−２対照系および非 形質転換ニコチアナ・タバクムｃｖ、ターキッシュ・サムサンＮＮ系のＲ１苗を 、Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ５０１１ｇ７ｍｌで接種した。対照系は全体的症状が ４日間で１００％の植物において進行したが、Ｎ／Ｂ　１−８植物から分離した 僅か３６％は、１４日後でさえ症状が進行した（表１）。これらのデータから、 ＮＢ　１−２および１−８系は、ウィルスおよびウィルスＲＮＡの両方に、高接 種材料レベルで耐性であることが明白である。

耐性の特異性は、耐性Ｎ／Ｂ　１−２および非形質転換ニコチアナ・タノくクム ＣＶ、ターキッンユ・サムサンＮＮのＲ１苗を３種のサブグループ１株（０、Ｓ ｎｙ。

）′、Ｖｅ８５）および１種のサブグループＩＩ株（ＬＳ）２０ｐｇ／ｍｌで攻 撃することにより測定した。対照系は、試験した総ての４種の株で、接種後７日 まで１００％の植物で症状が発展した。耐性Ｎ／Ｂ　１−２および１−８植物は 、３種のザブグループ１株で攻撃した場合得られたが、サブグループＩＩ株で攻 撃した場合得られなかった。これは、耐性が本発明を行った結果得られるもので ありグループＩＣＭＶウィルス株による感染に対する耐性を提供する修飾キメラ Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ−２遺伝子で形質転換した植物を得ることを示す。

耐性のレベルは、ゲノム中に挿入された欠陥ＣＭＶレプリカーゼ遺伝子のコピー 数により影響されるようである。分離葉アッセイで試験された起源の形質転換植 物のコピー数は、耐性でない５系ではハブロイドゲノム当たり１−３コピー、耐 性Ｎ／Ｂ　１−２および１−８系では、それぞれ３−５コピーおよび５−７コピ ーの範囲であった。これらの２種の耐性系はまた異なつた数の耐性Ｒ１植物を、 種々の接種材料濃度で示しく表１）、それは、与えられた全ての植物の耐性レベ ルが、特に非常に高い１００から５００μｇ／■１の接種材料１度では、植物ゲ ノム中に存在する修飾ＲＮＡ−２Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ　２配列のコピー数に より影響され得ることを再び示唆する。

耐性レベル測定するのにコピー数が有しうる可能性のある役割を評価するために 、非耐性および耐性Ｒ１世代Ｎ／Ｂ　１−２および１−８植物両方を分析した。

非接種葉におけるウィルスの存在、コピー数および転写物物の存在を、これらお よび２種の対照植物で測定した。これを、レプリカーゼ遺伝子コピー数と、それ ぞれＦｎｙ−ＣＭＶウィルス１００　ｇｇ／ｍｌおよび５００　ｇｇ／ｍｌを接 種したＮ／Ｂ１−２および１−８の分離系のＲ１世代植物でのＣＭＶに対する耐 性との相互作用を提供する以下の表２に示す。

表２ 全体症状“　ウィルス　不完全レブリ　耐性遺伝系　の存在５　カーゼコピー数 ゛子転写物６１−２　−　２　ＮＤ ＋　＋　０またはＩ　ＮＤ “３種の症状的（感受性あり）および３種の無症状（耐性）植物を、Ｎ／Ｂ　１ −２および１−８系で試験した。

ゝ未接種つィルス葉におけるウィルスＲＮＡの存在を、Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ｃＤＮ Ａプローブを使用するドツト・プロット・ハイブリダイゼーション［バルヵイテ ィス、メソッズ・フォー・プラント・モレキュラー・バイオロジー、アカデミツ ク・プレスにューヨーク）、４８７−５０６頁（１９８ｇ）参照コにより測定し た；゛ハブロイド遺伝子当たりの不完全レプリカーゼ遺伝子コピーの数を、各々 の植物から単離されたゲノムＤＮＡの、３５Ｓ　ＣａＭＶプロモータをプローブ として使用するササン・プロット・ハイブリダイゼーション分析により測定した 。これらのゲノムＤＮＡを、２．７５ｋｂ断片を遊離するＨｉｎｄｌ［［／　Ｅ ｃｏＲ１，４，１ｋｂフラグメントおよびメチル化ＤＮＡの不完全消化により、 より高分子量のフラグメントを遊離するＰｓｔｌおよびゲノム中の修飾レプリカ ーゼ遺伝子の挿入部位に依存して種々の分子量のフラグメントを遊離するＨｉｎ ｄｌｌ＋で消化した；１全ＲＮＡを各々の植物から単離し、４０ａｇをフォルム アルデヒド１．２％アガロースゲルに流し、シーンスクリーン・プラス（デュポ ン）に移し、ＮＯＳターミネータ−配列をプローブとして使用してハイブリダイ ズした；’ＮＮ対照系は、ニコチアナ・タバクムＣＶ、ターキッシュ・サムサン ＮＮであった： １未接種植物；および ”１００ｇｇ／ｍｔＦｎｙ−ＣＭＶ接種植物。

表２に示すように、ウィルスは、全体性症状を示す植物にのみ存在することを示 した。感受性Ｎ／Ｂ　１−２植物中のコピー数は、ハブロイドゲノム当たり０ま たは１であり、一方耐性Ｎ／Ｂ　１−２植物は、各々ハブロイドゲノム当たり２ コピーを含んだ。これは、遺伝子のコピーが必要であるが、耐性を確実にはせず 、遺伝子の多コピーの存在は特異的植物が耐性であることを保証するものでない ことを示唆した。これは、それら総てかつハブロイドゲノム当たり３個または４ 個のコピーを含むことを示したＮ／Ｂ　１−８耐性および感受性植物の分析によ り、実証された（表２）。更に、殆どこれらの挿入体が、耐性または感受性植物 のいずれの由来であれ、ゲノム内の同様の位置にあるように思える。これらの感 受性および耐性Ｎ／Ｂ　１−８植物のノーサン・プロット分析は、本修飾ＲＮへ −２Ｆｎｙ−ＣＭＶ　ＲＮＡ　２が、耐性植物のみに存在することを示した（表 ２）。これらの結果は、耐性がタバコゲノム内の遺伝子配列の存在およびその活 性転写物により生じることを示す。

多くの耐性植物は、接種葉に退緑病巣を有するか、耐性植物の接種葉におけるウ ィルスＲＮＡのレベルは、非耐性植物と比較してドツト・プロット・ハイブリダ イゼーションで非常に低いかまたは分析不可能であり、加えて、耐性植物の未接 種葉ではウィルスＲＮＡはドツト・プロット・ハイブリダイゼーションで検出さ れない。これらの観察は、耐性が感染部位におけるウィルス複写の阻害によるも のであることを示唆する。ＣＭＶ−接種葉に見られる拡大症状から判断して、幾 つかのウィルスは細胞から細胞へ動き得るが、植物の導管系を侵略できずまたは 導管内で生存できない。

結論として、本明細書に示したデータは、修飾ＣＭＶ−レプリカーゼ遺伝子を含 んでいるトランスジェニックタバコ植物が、ＣＭＶによる感染に非常に耐性であ ることを明白に示す。更に、耐性を媒介するＣＭＶレプリカーゼの濃度は、５０ ０ｇｇ／ｍｌの接種材料用量を維持し、それはＣＭＶコート蛋白媒介保護［バイ オ／テクノロジー６　：　５４９　（１９８８）参照コて既に示されたものより １０倍高い。データはまた、レプリカーゼ蛋白を経由した読み取りをコードする ５４ｋＤａ遺伝子で形質転換されたトランスジェニックタバコ植物もまたＴＭＶ 耐性を表すことを示す。本明細書に記載さねている両方の場合、レプリカーゼ配 列は植物形質転換に使用される。両方ともウィルスレブリカーゼ配列による形質 転換を含む本明細書に例示されている２つの系は異なる機能により作動し得るが 、レプリカーゼー媒介耐性が他の植物および動物ＲＮＡウィルスに対して一般的 で適用可能であるように思える。

従って、我々は、本発明の好ましい態様を説明し記載で来たが、本発明は変形お よび修飾が可能であり、従って我々は、ここに記載された精密な用語に制限され ることを望まずまたは意図するものでもなく、本発明を種々の使用法および状態 に当てめるためになされ得る変化および修飾を利用することを従って希望し、そ して！！図するものである。従って、このような変化および修飾は同等な完全な 範囲内、従って以下の請求の範囲の範囲内であることを当然意図する。これまで の記載で用いられた用語および表現は、記載のために一貫として使用されたので あって、限定の一貫としてではなく、従って、このような語および表現の使用に は、示され、記載された特性、またはその一部の同等物を排除する意図はなく、 本発明の範囲は以下の請求の範囲のみによつて定義され限定されることが認識さ れる。

このような修飾の中で、例えば上記実施例中で具体化されたちの以外の植物形質 転換ベクターの置換がある。例えば置換体または同等物の範囲内のベクターは、 ｐＢＩＮ１９、ｐＢｌｌｏｌ、ｐＲｏｋｌ、ｐＡＧｓ１３５、ｐＡＲｃ１２、Ｐ ＧＡ４７０、ｐＲＡＬ３９４０およびｐｃＴＩＴ３等であル、本発明はＴＭｖお よびＣＭＶで例示されているが、他の植物ウィルス、例えばウィルスレブリカー ゼ部分をそのゲノム内にも含むアルファルファ・モザイク、ポテックス・ウィル スの群、ブロモウィルス、ボチウィルスおよびルテオウィルス群が、それらのウ ィルスのレブリカーゼ部分に関連する遺伝子配列で形質転換された宿主植物であ るので、本発明に含まれる。ある植物および動物ＲＮＡウィルスの間の類似性を 含む多（の″未関連”植物ウィルスのＲＮＡのレブリカーゼ（ポリメラーゼ）部 分に配列の類似性が存在することが知られているため［例えばＮ・ハビリら、ヌ クレイツク・アシッズ・リサーチ１７　：　９５４３（１９８９）］、これらは 当然同等物と見なされ、従って本発明の範囲内に含まれる。

本明細書に含まれる総ての核酸およびアミノ酸配列を、以下の配列表に再現する 。

配列表 （１）一般的情報 （ｉ）出願人：ミルトン・ザイトリン、ダニエル・ゴレンボスキおよびジョージ ・ロモノソフ （１、発明の名称、植物を植物ウィルスゲノムのレプリカーゼ部分で形質転換す ることによるウィルス疾患に対する耐性の導入（ｉｉｉ）配列の数　８ （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ　６塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種ｉ：ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載、配列番号１゜ ＣＡＧＧＡ （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トボロノー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： ＣＡＡＡＧＡＣＵＧＧ　ＵＧＡＵＡＵＵＵＣＵ　ＧＡＵＡＵＧ　２６（２）配列 番号３の情報： （１）配列の特性 （Ａ）長さ、９塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー＋ｉ！！鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載　配列番号３ ＡＧＵＵＧＵＬＪＡＡ （２）配列番号４の情報。

（ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ・１４２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）！ＩＩの数、１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載二配列番号４゜ （２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ　１３２塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載　配列番号５ ＭＩＪ　ＫＣＡ［ＪＣＧＩＪ：　ＡＣＣＡＩＪＧ　ＧＣＵ　ＧＡＧ　ＵＵＵα： Ｃ（ＤＧ　ＬＪＧＩＪ　ＵＡＵ　ＧＡＣ４２Ａａ：　ＧＡＣＣＡＡ　（ＪｔＪＣ ＧＡＡ　ＡＡＧαＪＪ　ｔ、ｔｉ　ｕｕｃ　ｕｃｘαＺ　ＧＡＵ　ＧＡＵ　ＬＣ ｔＪ　８４０込αスＵＵＵ　ｔＪｆ？Ａα心αルα℃α刀０ルα刀弘ＣＣＣＧ　 ＡＧＵ　ＡＪ晩１２６ＩＪＬＣＡＣＡ　１３２ （２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ　４４アミノ酸 （Ｂ）型　ペプチド （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロ／−直鎖状 （１１）配列の種類　ペプチド （Ｘ］）配列の記載　配列番号６ （２）配列番号７の情報 （１）配列の特性 （４へ）長さ　６３塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロン−１直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載　配列番号７： （２）配列番号８の情報。

（ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ　２０アミノ酸 （Ｂ）型　ペプチド （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類　ペプチド （ｘｉ）配列の記載　配列番号８： このように、それが属し、またはそれが最も緊密に関連する分野の技術者が、同 じものを製造し、そして使用できるようにするために、我々の発明およびをれを 行いそして使用する操作及び方法を完全、明白、簡潔且つ正確な用語で記載した 。

フロントページの続き （７２）発明者　ロモノソフ、ジョージイギリス国エヌアール２４ジエービー ノーウイツチ、アゾレード・ストリート１２８番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）ウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と関係するウイルスＲＮＡ又はＤ ＮＡの断片を分離すること（２）分離断片又はその部分のＤＮＡコピーをレピシ エント植物のゲノムに、植物が挿入断片で形質転換される方法で組込むこと、を 含む、ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス病原性の植物宿主の耐性を植物に伝える方法。
2. ２．そのゲノム又は部分がウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と関係している、 ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスゲノム又はその部分の断片のＤＮＡコピーを含んでい る病原植物。
3. ３．そのゲノム又は部分がウイルスゲノムのレプリカーゼ部分と関係している、 ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスゲノム又はその部分の断片のＤＮＡコピーを含んでい る病原植物種子。
4. ４．ウイルスに対し耐性であって、ウイルスゲノムのレプリカーゼ遺伝子部分を 含んでいるゲノムを有することを特徴とする植物及びその子孫。