JPH07507542A - 負の過剰電荷を有するリポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 負の過剰電荷を有するリポソーム 本発明は、特に細胞増殖抑制剤（Ｃｙｌｏｓｌｓｌｉｋａ）およびサイトカイン （Ｃ７１ｏｋｉｎ）負の過剰電荷を有するリポソームに関する。

リポソームは水性の内部空間（脂質小胞）を有する１以上の脂質二重層からなる 球形の構造体である。この種の小胞は水性媒体中でリン脂質（たとえばレシチン ）を機械的に微細に分散させることにより製造することができる。

Ｂｓｎｇｈｓｏ＋　ｅｌ　ｓｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｈ（１９６ ５）、　２３８−２５２により、リン脂質は水の存在で超格子構造（Ｕｅｔｅｒ ｓ１＋ｕｋｌｕｒｅｎ）を形成することが認められた。圧力、温度およびイオン 濃度のような物理的パラメータに依存して、ミセル、単ラメラもしくは多重ラメ ラリポソームまたは単一の脂質二重層を形成させることができる（リポソーム： 物理的構造から治療的適用まで（Ｌｉｐ。

ｓｏｍｅｓ：　Ｆｒｏｍ　ｐｈ７ｓｉｃｓｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｔｏ　ｌｈ ｓ＋５ｐｅｕｌｉｃ　５ｐｐｌｉｃｕｉｏｎ　（＋９８１）、　Ｋｎｉｇｂ＋、 　Ｃ，Ｇ、　（ｃｄ、）、　Ｅｌｓｃｙｉｅ＋。

Ｎｏ＋ｌｈ　Ｈｏ１ｌｉｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｋｓｐｉ ｌｅｌ　２：　Ｈ，ＥｉＮ）、リン脂質合成（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　５７ ｎｔｈｅｓｉｓ）、　＋９−５０；　Ｋｓｐｉｌｅｌ　３：　Ｆ、　５ｚｏｋｉ およびり、　Ｐａｐｉｈｉｄｉｏｐｏｕｌ。

ｓ、リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：　Ｐ＋ｅｐｓｒｓｌｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃ ｈａｒｓｃｌｃ＋１ｔｓｌｉｏｎ、　５ｌ−１０４）参照）。小さな単ラメラリ ポソームは２０〜２００ｎｍの直径を有する球形の構造体である（Ｂａｒｅｎｈ ｏｌｌｚ　ｅｌ　ｓｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｃｌ、　９９　（＋９７９）　２１０ −２１４参照）。その内部容量は水性媒体からなっており、これは脂質層によっ て外側と区切られている。親油性または親水性に応じて作用物質をリポソームの 脂質二重層でまたは水性の内部容量へ封入することができ、有機体中で体液を介 して輸送させ、分配することができる。

この構造に基づき、リポソームは生化学および分子生物学において膜のモデルと して用いられる。ここ数年において、さらにリポソームの特性についての多くの 研究および医薬の担持剤としてのその使用が発表されている（たとえばＨ，５ｃ ｈｒｅｉｎｅ＋　ｕｎｄ　Ｍ、　Ｒａｅｄｅｒ−３ｃｈｉｋｏｔ【、　Ｐｈｘ＋ ＋ａａｔｉｅ　ｉｎ　ｕｎｓｅｒｅｒ　Ｚｅｉｌ　Ｉ＋　（＋９８２）、　９７ −１０８参照）。今まで公開された動物試験は、一般に、リポソームの吸収に関 して、肝臓および膵臓が他の器官を抑えて優勢である。リポソームの約８％が１ 時間後に、および２４時間後に約１５％が肝臓中で見出される。

医学におけるリポソームの可能な用途は、主に、疾患の選択的な治療を目指して いる。リポソーム中に封入された作用物質の所望の作用は促進されるべきであり 、それに対して不所望な作用は減少させるべきである。このように、治療的指数 の改善を達成すべきである。

ドイツ連邦共和国特許出願公開第４０１３６３２゜９号明細書からは、正の過剰 電荷を有する化合物を少なくとも１モル％を含有するリポソームは公知であるし かし、公知のリポソームの投与の欠点は、その肝臓中での吸収が比較的制限され 、このリポソームは長く血液中で循環することができることにある。このことは 、特にリン脂質、たとえばレシチン、ならびにコレステロールから構成されたリ ポソームに該当する。

このようにリポソーム中に含まれる作用物質は身体中に分配され、このことはさ らに作用物質の負所望な副作用の発生を増加させる。

従って、本発明の課題は、先行技術のリポソームと比較して高められた肝臓吸収 を示す新規のリポソームを製造することにある。

前記の課題は、コレステロール、リン脂質およびリポソームの全体の脂質成分に 対して一般式Ｉ：［式中、Ｒ１およびＲ２は同じまたは異なってもよく、水素、 Ｃ３〜Ｃ４アルキル基または飽和または不飽和のＣｌ＝Ｃ２４アシル基を表し、 これは場合により分枝されまたは／および置換されていてもよく、基Ｒ１および Ｒ２の少なくとも１つが前記のアシル基であると仮定される］で示される１種以 上の化合物またはその塩１〜１４モル％を含有することを特徴とするリポソーム の調製により解決される。

前記の化合物（１）は生理学的条件で、一般に部分的にプロトン化されたアニオ ンとして存在し、その結果、本発明によるリポソームは負の過剰電荷を有する。

式（１）による負に荷電された担持物質の割合は、一般にリポソームの全脂質成 分に対して１〜１４モル％、有利に３〜１０モル％にある。式（Ｉ）の化合物の 割合が１５％を越えて上昇すると、凝集にまで至ることがある溶解性の問題が生 じる。従って、原則として、有利な範囲が維持される。

両方の基がＣ８〜Ｃ２４アシル基を表すかまたは一方の基が水素を表し、他方の 基がＣ８〜Ｃ２４アシル基を表すような式ＣＩ）の化合物が有利である。

Ｒ１はＣＩ４〜Ｃ２４Ｉ４用基を表し、Ｒ２は水素を表すような化合物が特に有 利である。それについて、このグループからの有利な例は１−ステアロイル−５ ｎ−グリセロ−３−リン酸、１−バルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−リン酸、 １−ミリストイル−５ｎ−グリセロ−３−リン酸および１−エルコイル−５ｎ− グリセロ−３−リン酸ならびにこれらの塩である。このようなホスファチジン酸 は有利に塩の形、たとえばモノアルカリ金属塩、特に１ナトリウム塩の形で使用 される。

さらに有利な種類の化合物において、Ｒ１およびＲ２はＣ１４〜Ｃ２４アシル基 である。それについて、このような種類からの有利な化合物は、１，２−ジステ アロイル−５ｎ−グリセロ−３−リン酸、１，２−ジパルミトイル−５ｎ−グリ セロ−３−リン酸、１．２−シミリストイル−５ｎ−グリセロ−３−リン酸およ び１゜２−ジェルコイル−５ｎ−リン酸ならびにこれらの塩である。同様に、こ のようなホスファチジン酸は有利にその塩の形で、たとえばモノアルカリ金属塩 の形で、特に１ナトリウム塩として使用される。

意想外に、式（Ｉ）による負に荷電した担持物質を含有するリポソームは、式（ １）による化合物を使用せずに製造された公知のリポソームと比べて著しい利点 を有することが確認された。

先行技術のリポソームの投与の際に、つまり、肝臓中でのリポソームの吸収が比 較的制限され、従ってリポソームはかなり長い問直液中で循環することが確認さ れた。これに対して、本発明によるリポソームは、意想外に著しく改善された肝 臓吸収を有することが見出され、このことは、それについてリポソーム中に封入 された調剤学的作用物質の他の器官中での副作用の著しい減少を引き起す。

このことは特にアントラサイクリン抗生物質ドキソルビシンに対して測定された 。この物質はすでに約２５年前から臨床的に使用されている。しかし、固型腫瘍 、白血病およびリンパ腫の治療の際の抗腫瘍剤としてのその使用は、（Ｂｏｎｓ ｄｏｎｎａ　ｅｌ　ｉｆ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

３０　（１９７０）＋　２５７２−２５８２１Ｍｉｄｄｌｅｍｓｎ　ｅｌ　ｉｔ 、、　Ｃａｎｃｅ＋　２８　（１９７１）、　８４４−８５０ｉ　Ｔａｎ　ｅＩ ！＋、、　Ｃａｎｃｅ【３２　（１９７３）。

９−１７）その高い心臓毒性（Ｌｅｆｒｉｋ　ｅｌ　ｉｆ、、　Ｃａｎｃｅ＋　 ３２　（＋９７３）、　３０２−３＋４；　Ｒｉｎｅｈａｒｌ　ｅｌ　ｓｌ、、 　Ａｎｎ、　Ｉｎ１ｅ＋ｎａ１、　Ｍｅｄ、　８１　（＋９７４）、　４７５− ４７８：　ｖａｎ　Ｈｏｆｆ　ｅｌ　ａｌ、、　Ａｎｎ。

Ｉｎｔｅ【ｎａｌ、　Ｍｅｄ、　９１　（１９７９）、　７１０−７＋７）に基 づき著しく制限される。

本発明を生じさせる作業において、ドキソルビシンを作用物質として含有する本 発明によるリポソームは、一方で公知のリポソームと比較可能な血漿安定性を示 し、他方ではしかし意想外に薬物動態学において著しく異なっていることがマウ スの実験によって、確認された。本発明によるリポソームの使用の際に、著しく 少ない量のドキソルビシンが血漿中、肺中、腎臓中および特に心臓中に確認され た。リポソームの所望の目的器官である肝臓においては、それに対して本発明に よるリポソームの使用の際に、先行技術のリポソームの使用の場合よりもまたは 遊離ドキソルビシンの使用の場合よりも著しく高い濃度のドキソルビシンが確認 された。

本発明によるリポソームのさらに意で外の利点は、その中に含まれる作用物質の 代謝がリポソームなしで投与された作用物質の代謝と異なることにある。ドキソ ルビシンの市販の調製剤（リポソームなし）の形での投与は、すでに肝臓中で１ 時間後にドキソルビシンの２０％のみが存在し、残りはすでに代謝されることに つながる。それに対して、本発明によるリポソーム中の同じ作用物質の投与は、 同じ条件下で１時間後に９７％までの作用物質が代謝されていない形にあり、そ の結果３％の代謝が行われた。それとは反対に、市販の組成物（リポソームなし ）の場合では、肝臓中ですでに１時間後に作用物質の約８０％が代謝された。

本発明によるリポソームは、一般式（Ｉ）の化合物の他に、他の脂質成分として なおコレステロールおよびリン脂質を含有する。このリポソームは有利にコレス テロール３０〜５０モル％およびリン脂質４９〜５６モル％を含有する。荷電さ れていないリン脂質が特に有利である。［荷電されていないリン脂質」とは、外 側へ荷電されていない様なリン脂質であると理解される（つまり、この概念は分 子内両性イオンであるようなリン脂質である。本発明によるリポソーム中のリン 脂質の有利な種類は、ホスホグリセリド、たとえばグリセリン基を含有し、その 際、グリセリンの２個のヒドロキシル基は脂肪酸基（有利に０８〜Ｃ２４アシル 基）により置換えられ、かつ第３のヒドロキシル基はホスホリル化アルコールに より置換されている化合物である。特に適当なアルコールの例は、正の電荷を有 するようなもの、たとえばエタノールアミンおよびコリンである。特に有利なリ ン脂質は、一般式（ＩＩ）＋Ｅ式中、Ｒ３およびＲ４は同じまたは異なっていて もよく、飽和または不飽和の０８〜Ｃ２４アシル基を表し、これは場合により分 枝されているかまたは／および置換されていてもよい］で示されるレシチンであ る。有利には、Ｒ３およびＲ４はＣＩ４〜Ｃ２４Ｉ４用基である。

特に有利には、Ｒ３およびＲ４はステアロイル−、バルミトイル−、ミリストイ ル−またはエルコイル基である。

本発明によるリポソームの成分は、市販のものであるかまたは公知の方法により 製造することができる。

式（１１）のレシチンは、たとえばＷｏｏｌｌｅｙおよびＥｉｂｌ、　Ｃｈｅｍ 、　Ｐｌ＋ｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ　４７　（１９８６）、　５５−６２および・ Ｅｉｂｌおよび’＊ｏｏｌｌｅｙ、　Ｃｈｅｗ、　Ｐｈ７ｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ　 ４１　（１９ｔ１６）、　５３−６３により製造することができる。さらに、ホ スホグリセリドの製造は、ドイツ連邦共和国特許出頼公開第３２２５２１３．７ 号明細書およびその中で引用された文献に記載されている。一般式（１）の化合 物は、たとえば、相応するレシチンからホスホリパーゼＤを用いたコリン基の分 解により製造することができる（Ｅｉｂｌ　およびＷｏｏｌｌｅ７．　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｘｙｍｏｌ、　７２（＋９８１）、　６Ｈ−６３９）。

本発明によるリポソームの製造のために、リポソームの個々の脂質成分（つまり 、一般式（Ｉ）の化合物１〜１４モル％および他の脂質成分は式（１）の化合物 と一緒に１００モル％になる量で）、適当な溶剤中で、有利に加熱しながら溶解 させ、成分の均質な混合が達成される。この溶剤は真空中で除去され、微細に分 散された脂質フィルムに水性緩衝溶液（水性緩衝溶液として全ての生理学的にし よう可能な溶液を使用することができる）が添加される。引続き、この混合物を 軽度に攪拌しながら約１時間、一般に脂質の主要転移温度を約５℃上回る温度で 、たとえば５０℃で保持される。

前温度処理したこの脂質懸濁液を、次いで、適当な公知の処置、たとえばフレン チプレス（Ｆｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓ；Ｆ目ｍｓ　Ａｍ１ｎｃｏ、　５ｉｌｖｅ ＋ｓｐ＋ｉｎｇ、　ＵＳＡ）の耐圧容器中でリポソームに移行させる。このフレ ンチプレスは液圧プレスおよび鋼製の標準耐圧容器からなる。耐圧容器を閉鎖し た後、圧力を高め、生じるリポソーム分散液を一定の圧力下で狭い出口を加圧し て通過させる。この工程を少なくとも３回繰返す。リポソーム分散液の遠心分離 により堆積物から上澄み液を除去する。これはリポソームを含んでおり、このリ ポソームは、たとえば１種以上の調剤学的作用物質を含有するリポソームの製造 のための多様な用途および試験を提供する。

しかし、本発明によるリポソームは同様に他の方法でも製造することができる。

従って、本発明の対象は、一般式ＣＩ）の化合物１〜１４モル％を、リポソーム の他の脂質成分と共に、一般式（Ｉ）の化合物と合わせて１００モル％になる愈 で、脂質懸濁液に移行させ、この脂質懸濁液を前温度処理し、こうして前温度処 理された脂質懸濁液を次に公知の適当な手段によりリポソームに移行させるリポ ソームの製造方法である。

本発明のもう一つの対象は、本発明によるリポソームと、リポソーム中に封入さ れた１種以上の調剤学的作用物質、場合により調剤学的に常用の希釈剤、助剤、 担持剤および充填剤を含有する調剤学的調製剤である作用物質として、原則とし て、リポソームを用いて一般に血漿中へ導入することができる全ての作用物質を 使用することができる。有利な作用物質のグループは、細胞増殖抑制剤、特にア ントラサイクリン抗生物質、たとえばドキソルビシン、エビルビシンまたはダウ ンマイシン、その際、ドキソルビシンが特に有利である。さらに有利な細胞増殖 抑制剤はイダルビシン、ヘキサデシルホスホコリン、１−オクタデシル−２＝メ チル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、５−フルオロウラシル、シス−白 金錯体、たとえばカルポプラチンおよびノバントロンである。

さらに、有利な作用物質の種類は、免疫調整物質、たとえばサイトカイン（この 場合、これにはインターフェロンおよび特にα−インターフェロンが特に有利で ある）、抗菌性作用物質（たとえばアムホテリシンＢ）および原生動物疾患（マ ラリア、トリパノゾーマ感染およびレーシュマニア感染）に対する作用物質であ る。同様に作用物質としてタキソールが有利である。

従って、本発明のもう一つの対象は、抗腫瘍剤の製造のための本発明によるリポ ソームの使用であり、その際、作用物質は特にドキソルビシンが有利である。

本発明のもう一つの対象は、細胞増殖に影響するための薬剤の製造のための本発 明によるリポソームの使用であり、その際、作用物質はサイトカイン、特にα− インターフェロンが有利である。

本発明によるリポソーム中に封入される１種以上の作用物質を含有する調剤学的 組成物の製造のために、次のような方法が行われる。

不水溶性物質の封入のために、作用物質を脂質と一緒に適当な溶剤、たとえば塩 化メチレンまたはクロロホルム中に溶かし、引続きリポソームの製造のための前 記の方法に従って作業する。

水溶性の物質の封入のために、前記したように、脂質フィルムに水溶性作用物質 を含有する溶液を添加する。引続き、前記したように、さらに作業する。遠心分 離による上澄み液は、充填されたリポソームの他に、さらに封入されていない水 性作用物質も含有する。この遊離した作用物質成分はリポソーム中に封入された 成分から、たとえばダイアフィルトレージョンにより分離することができる。リ ポソームの使用の前に、有利に膜濾過器を備えた滅菌濾過を実施するのが有利で ある（ザルトリウス社（Ｆｉ＋ｍｉ　Ｓａｒ＋ｏ＋１ｕｓ）、孔の輻０・２μｍ ）Ｉｌ 従って、本発明による対象は、調剤学的組成物の製造方法でもあり、その際、リ ポソームの前記した製造方法に従って作業され、不水溶性作用物質の封入のため に作用物質は脂質成分と一緒に溶かされ、水溶性の作用物質の封入のために脂質 フィルムに水溶性作用物質を含有する水溶液を添加する。

本発明を次に実施例につき詳説する。

例１ リポソームの製造 １．２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）はＳ ｙｇｅｎａ　ＬＴＤ　（Ｌｉｅｓｌａｌ、　ＣＨ）からおよびコレステロール（ Ｃｈ）はＦｌｕｋａ　（Ｂｕｃｈｓ。

Ｃ１，）から取寄せた。１．２−ジステアロイル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホ コリン（Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｃ）は、１．２−システアロイルーｓｎ−グリセリンを介 して製造した（ＥｉｂｌおよびＷｏｏｌｌｅｙ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌ ｉｐｉｄｓ　４１（１９８６）、　５３−６３）　、１．　２−ジステアロイル −５ｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）は、ホスホリパーゼＤを用い て１．２−ジステアロイル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを加水分解する ことにより製造した（Ｅｉｂｌ　およびＷｏｏｌｌｅ７．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｔ７ｍｏｌ。

７２　（１９８］）、　６３２−６３９）。水素化されたダイズーホスファチジ ルイノシトール（ＨＰＩ）はダイズレシチン（Ｐ５６３８）（シグマケミ−社（ Ｓｉｇｍ＠Ｃｂｅ＋＋＋ｉｅ　ＧｍｂＨ；Ｓｌｅｉｎｈｅｉｍ、　ＢＲＤ））か ら製造した。ダイズレシチンは約１０％のホスファチジルイノシトールを含有し 、これはシリカゲルクロマトグラフィーにより単離した（ＶｏｌｌｅｙおよびＥ ｉｂｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｐｈ７ｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ　４７　（１９８８）、　５ ５−６２）　、　、：うして得られた生成物をＣＨＣｌ３／ＣＨ３０Ｈ（１：　 １、ｖ　／　ｖ　）　１００　ｍ　ｌ中で、Ｐｄ／Ｃ触媒１０％を用いて水素化 した。

次の組成を有する小さな単ラメラリポソームが製造された（ダラム分子量ベース ）：ＤＰＰＣ／Ｃｈ　（６：４）；ＤＳＰＳ／ＤＳＰＡ／Ｃｈ　（５：　１　： ４＞　；ＤＰＰＣ／ＨＰ　Ｉ／Ｃｈ　（５：　１°４）。脂質懸濁液５ｍ　ｍ　 ｏ　ｌをクエン酸緩衝液５０ｍ　ｌ　（３００ｍｍｏ　ｌ／１．ｐＨ４）中で、 ３時間回転蒸発器中で、最高の層転移温度（Ｔ２）を有するリン脂質の層転移温 度（ＴＭ）を５℃上回る温度で機械的に分散させた。この均一な溶液から、２０ ０００ｐｓ　ｉでフレンチプレスを使用しながらリポソームを製造した。こうし て得られたリポソームを３０分間３００００ｇで遠心分離した。その中に粉末状 のドキソルビシン１００ｇを添加し、マイヤーはか（Ｍｓｙｅｒ　ｅｔ　！＋、 ）　（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ１１８５７　（＋９８６）、 　１２３−１２６）の負荷手段によりｐＨ８で封入した。リポソーム中に封入さ れなかったドキソルビシンをダイアフィルトレージョン（Ｐｏｌｙｓｕｌｌｏｎ 　Ｕｌ目ｘｓａｒｌ　Ｍｏｄｕｌ、除外限界２０　ｋ　Ｄ、　Ｓａ＋１ｏｃｏｎ 　Ｍｉｎｉ　ＳＭ　１７５２１．　Ｓａ＋１ｏｒｉｕｓ、　ＢＲＤ）により除去 した。全てのリポソームは使用の前に滅菌される。

例２ ドキンルビシン含有すボンームを用いたマウスの治療 メスのＮＭＲ−１マウス（２８〜３２ｇ、６〜８週）をハノーバー動物飼有機関 （ＢＲＤ）から取寄せた。

マウスの尾の静脈に、同じ投与量（５，７ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ注射した。そ れぞれの処理グループは３匹からなる。１時間、２４時間および７２時間後に、 マウスをＣ０２で麻酔した。血液をマウスから心臓穿刺により採取し、ヘパリン 処理したエツベンドルフ容器（Ｅｐｐｅｎｄｏ＋ｌ−Ｇｅ１ａｅｓｓ）中に貯蔵 した。マウスからの組織試料（肝臓、心臓等）を０．９％のＮａＣ１溶液中で洗 浄し、−７０℃で貯蔵した。

血漿試料を、ムロスほか（Ｍ＋ｏｓｓ　ｅｌ　ａｌ、）　（］、　Ｃｈ＋ｏ１＋ ｏＨｉｐｈ、　５３０　（１９９０）、　１９２−１９９）の方法により分析し た。このために、血漿１００μｌを活性化したボンドエルートＣ１８−カラム（ Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔ　Ｃｌ３−５ａｅｕｌｅｎ）　（ＩＣＴ、　Ｆｒａｎｋｆｕ ｒｔ、　ＢＲＤ）上に載せ、緩衝液４　ｍ　ｌ（０，０２ｍｏ　ｌ／ｌ　Ｎａ− リン酸塩、ｐＨ３，９）で洗浄した。このカラムを１０分間１０ｍｂａｒで乾燥 させた。ドキソルビシンおよびその代謝物をメタノール／クロロホルム（１：１ 、ｖ／ｖ）４℃上で溶離した。溶離液を窒素雰囲気下で蒸発乾固した。残分を５ ０ｐｌ（Ｎａ−リン酸塩／アセトニトリル、ｐＨ３゜９；７：３、ｖ　／　ｖ　 ）に収容し、ＨＰＬＣで分析し、その際、４．６ｍｍＸ２５ｃｍのメルクーリク ロカルトＣ（Ｍｅ＋ｃｋ　Ｌｉｃｈ＋ｏｃａ＋＋　Ｃ１８ＲＰ　５　ｐ　ｍ）カ ラムを使用した。流速は１．５ｍｌ／分であった。励起波長は４８０ｎｍであり 、放出波長は５８０ｎｍであった。

目的器官中でのドキソルビシンおよびその代謝物の検出のために、組織試料（そ れぞれ約２００　ｍ　ｇ　）をミクロディスメンブラトーア（Ｍｉｋｒｏ−Ｄｉ ｓｍｅｍｂ＋ａ＋ｏ＋）（Ｂｒａｕｎ　Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ　ＡＧ、　ＢＲＤ） を用いてホモジナイズドした。ドキソルビシンおよびその代謝物を、ｐＨ３で抽 出溶液（アセトニトリル／水：６°４、ｖ　／　ｖ中のＡｇＮＯ３１６，５％ｗ ／ｖ）で処理し、ＤＮＡとの複合体からアントラサイクリンを遊離させ、タンパ ク質を沈殿させた。内部標４！！（エビルビシン）の添加および遠心分離の後、 上澄み液を直接ＨＰＬＣカラム上に置いた。

Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／Ｃｈ−リポソームは、６４ｎｍの平均直［−有し、ＤＰＰＣ／ ＨＰ　Ｉ／Ｃｈ−リポソームは９１ｎｍの平均直径を有し、本発明にょるＤ　Ｓ 　Ｐ　Ｃ／ＤＳＰＡ／Ｃｈ−リポソームは８８ｎｍの平均直径を有する。

ドキソルビシン対リン脂質の平均的割合は、ＤＰＰＣ／Ｃｈ−リポソームについ て１７０　ｐ　ｇ　／　μｍ　ｏ　１（封入物９５％）、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＡ／ Ｃｈ−リポソームについて７８μｇ／μｍｏｌ（封入物６５％）およびＤＰＰＣ ／ＨＰ　Ｉ／Ｃｈ−リポソーム（封入物７１％）である。３種類のリポソームは 血漿中で少なくとも２４時間安定である。４℃で３力月の貯蔵の後でもリポソー ムからドキソルビシンの漏出はなかった。

投与形態に依存するドキソルビシンの薬物動態学は次のような結果となった１１ 時間後に、遊離ドキソルビシン（リポソームなし）の添加の場合の血漿値は、０ ．５μｇ／ｍｌであり、ドキソルビシンの痕跡が２４時間後に見つけられるにす ぎない。Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／Ｃｈ−およびＣＰＰＣ／ＨＰ　Ｉ／Ｃｈ−リポソーム は１時間後に著しく高い血漿濃度（５９，３もしくは４２゜９μｇ　／　ｍ　ｌ 　）を示し、２４時間後には比較的高い濃度（５，５もしくは４．９μｇ　／　 ｍ　ｌ　）を示した。それに対して、本発明によるＤＳＰＣ／ＤＳＰＡ／Ｃｈ− リポソームの場合、１時間後に血漿中でドキソルビシン７−　７μｇ／ｍｌが検 出されたにすぎない。２４時間後にはドキソルビシンの痕跡が検出された。

心臓中での遊離ドキソルビシンの濃度は、１時間後に１３μｇ／ｇであったが、 本発明によるＤＳＰＣ／ＤＳＰＡ／Ｃｈ−リポソームの場合１．０μｇ／ｇ心臓 組織が検出されただけであった。Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／Ｃｈ　−およびＣＰＰＣ／Ｈ Ｐ　Ｉ／Ｃｈ−リポソームに対する相応する値は、約３．５μｇ／ｇ心臓組織で あった。

肺中および腎臓中では、１時間後に、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＡ／Ｃｈ−リポソーム中 でのドキソルビシンの投与の場合、同様に、他の投与形態の場合よりも明らかに 少ない作用物質濃度が検出された。

肝臓中では、同様に投与形態に依存してドキソルビシン濃度おける差異が見出さ れた。１時間後に、相応するドキソルビシン値は次の値であった。遊離ドキソル ビシンに対して１１．０μｇ／ｇ、本発明によるＤＳ　Ｐ　Ｃ／Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ａ ／Ｃｈ−リポソーム４２．８μｇ／ｇ、ＤＰＰＣ／ＨＰ　Ｉ／Ｃｈ−リポソーム に対して３０μｇ／ｇおよびＤ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／Ｃｈ−リポソームに対して１２， ２μｇ／ｇ、本発明によるリポソームは２４時間後で肝臓中ドキソルビシン２５ ．１μｇ／ｇの高い値を示した。７２時間後にでさえこの組織中でのドキソルビ シンの濃度はなお顕著に高かった。

肝臓中でのドキソルビシンの代謝のために次のことが確認された１１時間後に、 遊離ドキソルビシンの投与の際に、不活性な代謝物（アグリコン）７７％に対し て活性の薬剤２３％が見出された。これに対して、本発明によるＤＳＰＣ／ＤＳ ＰＡ／Ｃｈ−リポソームについては不活性なアグリコン３％に対して活性ドキソ ルビシン９７％が観察された。相応する値はＤＰＰＣ／Ｃｈ−リポソームについ て９６％、４％およびＤＰ　Ｐ　Ｃ／Ｃｈ−リポソームについて９０％＝１０％ であった。

肺臓中では、１時間後に、肝臓の場合と同様に、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＡ／Ｃｈ−リ ポソームの使用の際にドキソルビシンの高い吸収が確認された。

総括して、本発明によるリポソーム中でのドキソルビシンの投与は、遊離した形 での作用物質の投与ならびに他のリポソーム中での作用物質の投与よりも、特に 高い組織特異性の点で優れている。

国際調査報告　ＯＦＴ／ｃＤ０１１＾０にｏｒ。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

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ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。

、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ。

ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　カウフマン−コレ、　ペトラドイツ連邦共和国　Ｄ　−３４０ ７グライヒエンーディーマルデン　ゲーレンヴエーク（７２）発明者　クラニッ ヒ、　アンネリーゼドイツ連邦共和国　Ｄ−７８００フライブルク　ヌスマンシ ュトラーセ　１４ （７２）発明者　ウンガー、　クレメンスドイツ連邦共和国　Ｄ　−３４００ゲ ッチンゲン　へルツベルガー　ラントシュトラーセ２ベー

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．コレステロール、リン脂質およびリボソームの全体の脂質成分に対して一般 式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、Ｒ１およびＲ２は同じまたは 異なってもよく、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基または飽和または不飽和のＣ８〜 Ｃ２４アシル基を表し、これは場合によリ分枝または／および置換されていても よく、基Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つが前記したようなアシル基であると仮 定する］で示される１種以上の化合物またはその塩１〜１４モル％を含有するこ とを特徴とするリボソーム。
2. ２．一般式（Ｉ）の化合物またはその塩３〜１０モル％を含有する請求項１記載 のリボソーム。
3. ３．Ｒ１はＣ１４〜Ｃ２４アシル基を表し、Ｒ２は水素を表す請求項１または２ 記載のリボソーム。
4. ４．式（Ｉ）の化合物が、１−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１ −パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１−ミリストイル−ｓｎ−グリ セロ−３−リン酸および１−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ならびに これらの塩からなるグループから選択される請求項３記載のリボソーム。
5. ５．化合物が前記のホスファチジン酸の１ナトリウム塩である請求項４記載のリ ボソーム。
6. ６．Ｒ１およびＲ２はＣ１４〜Ｃ２４アシル基である請求項１または２記載のリ ボソーム。
7. ７．式（Ｉ）の化合物が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン 酸、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、１，２−ジミリス トイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸および１，２−ジェルコイル−ｓｎ−グリ セロ−３−リン酸ならびにこれらの塩からなるグループから選択される請求項６ 記載のリボソーム。
8. ８．化合物が前記のホスファチジン酸の１ナトリウム壇である請求項７記載のリ ボソーム。
9. ９．他の脂質成分として、コレステロール３０〜５０モル％およびリン脂質４９ 〜５６モル％を含有する請求項１から８までのいずれか１項記載のリボソーム。
10. １０．リン脂質がホスホグリセリドである請求項１から９までのいずれか１項記 載のリボソーム。
11. １１．リン脂質として一般式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、Ｒ３およびＲ４は同じまた は異なってもよく、飽和または不飽和のＣ８〜Ｃ２４アシル基を表し、これは場 合によリ分枝または／および置換されていてもよい］で示されるレシチンを含有 する請求項１から１０までのいずれか１項記載のリボソーム。
12. １２．Ｒ３およびＲ４はＣ１４〜Ｃ２４アシル基である請求項１１記載のリボソ ーム。
13. １３．Ｒ３およびＲ４はステアロイル−、バルミトイルー、ミリストイル−また はエルコイル基である請求項１２記載のリボソーム。
14. １４．付加的に１種以上の調剤学的作用物質を含有する請求項１から１３までの いずれか１項記載のリボソーム。
15. １５．請求項１から１４までのいずれか１項記載のリボソームおよびリボソーム 中に封入された１種以上の調剤学的作用物質を、場合によリ調剤学的に常用の希 釈剤、助剤、担持剤および充填剤と一緒に含有することを特徴とする調剤学的組 成物。
16. １６．作用物質が細胞増殖抑制剤である請求項１５記載の調剤学的組成物。
17. １７．作用物質がアントラサイクリン抗生物質である請求項１６記載の調剤学的 組成物。
18. １８．作用物質がドキソルビシンである請求項１７記載の調剤学的組成物。
19. １９．作用物質がイダルビシンである請求項１６記載の調剤学的組成物。
20. ２０．作用物質がカルボブラチンである請求項１６記載の調剤学的組成物。
21. ２１．作用物質がタキソールである請求項１５記載の調剤学的組成物。
22. ２２．作用物質がサイトカインである請求項１５記載の調剤学的組成物。
23. ２３．作用物質がα−インターフェロンである請求項１５記載の調剤学的組成物 。
24. ２４．抗腫瘍剤の製造のための請求項１から１４までのいずれか１項記載のリボ ソームの使用。
25. ２５．作用物質がドキソルビシンである請求項２４記載の使用。
26. ２６．細胞増殖に影響する薬剤の製造のための請求項１から１４までのいずれか １項記載のリボソームの使用。
27. ２７．作用物質がα−インターフェロンである請求項２６記載の使用。
28. ２８．一般式（Ｉ）の化合物１〜１４モル％を、一般式（Ｉ）の化合物と合わせ て１００モル％になる量のリボソームの他の脂質成分と一緒に脂質懸濁液に移行 させ、この脂質懸濁液を前温度処理し、こうして前温度処理された脂質懸濁液を 公知の適当な処理によリリボソームに移行させる請求項１から１４までのいずれ か１項記載のリボソームの製造方法。
29. ２９．請求項２８による方法に従って作業するが、非水溶性の作用物質の封入の ために作用物質を脂質成分と一緒に溶かし、および水溶性の作用物質の封入のた めに脂質フィルムに水溶性作用物質を含有する水溶液を添加することを特徴とす る請求項１５〜２３までのいずれか１項記載の調剤学的組成物の製造方法。