JPH07507570A - 治療剤の卵巣への送達のための抗透明帯抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療剤の卵巣への送達のための抗透明帯抗体Ｉユ立ユＩ この発明は、透明帯に特異的に結合する抗体及びそれらの抗体から作られる免疫 化学薬剤、並びにかがる免疫化学薬剤を用いる治療方法に関するものである。

ｌ１立１１ 卵巣の病気特に卵巣癌は、好ましくは、特異的に卵巣を標的とする薬剤により治 療する。更に、受精率制御のための薬剤は、かかる薬剤が特異的に卵巣に向けら れて分配され、他の卵巣でない組織で希釈されないときに一層効果的であり得る 。

嗜乳動物の透明帯は、卵巣中にある卵母細胞を囲んでいる。その独特の構造は、 新規な糖蛋白質ネットワークを含む。透明帯蛋白質の独特の性質の故に、これら の蛋白質に対して高められた抗体は、一般に、？ｉ（巣に対して特異的である。

従って、抗透明帯抗体は卵巣を標的とする治療剤のキャリアーとして理想的に適 している。

腫瘍組織を標的とした細胞毒性剤の送達の目的のために、細胞毒性剤が卵巣腫瘍 細胞及び特異的な腫瘍細胞の抗原に結合された（例えば、Ｂｊｏｒｎ等の米国特 許第４゜９５６．４５３号、Ｐａ５ｔａｎ等の第４．８０６．４９４号及びＢｙ ｅｒｓ等の４．９２５，９２２号を参照されたい）。この卵巣への薬剤の送達は 、卵巣組織が抗体により認識される特異的な腫瘍抗原を含むことを必要とする。

かかる抗体認識は、抗体が患者自身の腫瘍細胞に対して高められたときに期待さ れるが、腫瘍抗原は、−人の患者と他の者とで変わり、単一抗体がすべての患者 の卵巣に細胞毒性剤を運ぶことは期待出来ない。更に、卵巣の非発癌性条件は、 治療剤の標的への送達から恩恵を得るであろう。治療剤の標的への特異的な送達 は、一層少量の治療剤及び非特異的薬剤の特異的な卵巣作用を可能にすることが 望まれる。治療剤の標的への特異的な送達は、治療剤特に正常組織に有害であろ うものを一層少量で使用することを可能にし及び非特異的薬剤の特異的な卵巣作 用を可能にすることが望まれる。治療剤を特異的に卵巣を標的とすることにおい て用いるための抗体であって患者間で変わる抗原の認識に依存しない抗体を提供 することは非常に有用なことである。

ｌユニｌ上 透明帯抗原に対して高められたモノクローナル及びポリクローナル抗体は、所望 の治療剤を卵巣以外の組織への有意の損失を伴わずに特異的に卵巣に運ぶという ことが見出された。かかる抗体は、卵巣間で有意の認識の変動を伴わずに治療剤 を特異的に卵巣に向けるために用いられる。好適具体例において、抗透明帯抗体 は、特定の受精及び避妊効果のために薬剤を卵巣を標的として送達する。

日の６細なｆ日 抗透明帯抗体は、哨乳動物の全透明帯若しくは細分した透明帯に対して高められ た抗体及び特定の透明帯蛋白質に対して高められた抗体（天然若しくは組換え体 又はそれらの断片）を含む。これらの抗体は、ゲラ歯頚以外が好適であるが、任 意の哨乳動物種の透明帯に対して高めることが出来る。ゲラ菌類以外の透明帯抗 体はゲラ歯頚の透明帯と交差反応性でないが、非ゲッ巾動物種間では交差反応性 であることが報告されている。

抗体（モノクローナル又はポリクローナルのもの）は、一般にこの分野で公知の 方法によって調製することが出来る。一般に、ポリクローナル抗体は、宿主動物 において透明帯抗原を宿主動物に注射することによって高められる。宿主動物の 血清を取り出して分画して抗血清を得る。抗血清を、透明帯及び透明帯抗原との 示された反応性により抗透明帯抗体の存在についてスクリーニングする（例えば 、公知のイムノアッセイ技術による）。

これらの抗体は又、この分野で公知の方法例えば免疫細胞化学又はウェスタンプ ロット分析によって、卵巣組織に対する特異性についてもスクリーニングする。

モノクローナル抗体は、この分野で公知の方法によってハイブリドーマ細胞がら 生成される。一般に、宿主動物に透明帯抗原を腹腔内注射する。免疫化動物の肺 臓を採取し、これを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　 １９７５゜２５６：４９５−４９７の一般的な細胞雑種形成技術を用いて、マウ ス腫瘍パートナ−と共に用いてバイブリドーマを調製する。この技術は、腫瘍細 胞と肺臓細胞とをポリエチレングリコール等の融合剤を用いて融合させることを 含んでいる。融合の後に、雑種細胞を融合培地から分離し、選択成長培地（例え ば、ＨＡＴ培地）にて成長させて雑種形成してない親細胞を除く。所望であれば 、ハイブリドーマを増殖させて条件培養培地を、抗透明帯活性について従来のイ ムノアッセイ手順（ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は蛍光イムノ アッセイを含む）をによってアッセイする。

モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、公知の手順を用いて、イン・ ビトロ又はイン・ビボで成長させることが出来る。好ましくは、これらのバイプ リドーマをマウスの腹水として維持する。これらのモノクローナル抗体を培養培 地又は体液から硫安沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー及び所望で あれば限外濾過等の従来の免疫グロブリン生成手順によって単離することが出来 る。

本発明のモノクローナル及びポリクローナル抗透明帯抗体の重要な性質は、それ らの透明帯抗原との反応性及び卵巣組織に対する特異性を含む。本発明の抗体は 、治療される種と同じ種の透明帯抗原に対して高めることが出来（自己抗原）、 又は第２の種の透明帯に対して高めることが出来る（外来抗原）（種は、抗原性 交差反応性を示す）。例久ば、第２の宿主棟内で第１の種の透明帯に対して生成 されたポリクローナル抗血清は、ウェスタンプロット、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ又は免疫 組織化学的技術により試験した際に、第１、第２及び更なる種の透明帯を認識す ることが出来る。抗体は、第１、第２又はその他の種の卵巣へのかかる薬剤の特 異的送達における利用のために、標識し又は治療剤と結合することが出来る。同 様に、組換λの透明帯蛋白質（外来又は自己抗原）及び合成により生成した透明 帯ペプチドを抗原として用いてこの方法の発明において有用な抗体を生成するこ とが出来る。

所望の免疫化学剤を形成するために、抗透明帯抗体を公知の方法によって化学治 療剤に結合する。この結合は、種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて行 なうことが出来る。かかる試薬の例は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ ジルジチオ）プロピオネート、イミノチオラン、イミドエステルの二官能性誘導 体、アルデヒド例＾ばグルタルアルデヒド、ビス−アジド化合物例えばビス（Ｐ −ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン、ジイソシアネート例λばトリ レン２．６−ジイソシアネート、及びビスー活性フルオレン化合物例えば１．５ −ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等である。

抗透明帯抗体に結合するための所望の治療剤の例は、放射性同位体、化学療法剤 、細胞毒素等を含む。放射性同位体は、好ましくは、高い線エネルギー放射性の 同位体例えば、Ｙ、Ｐｒ等である。この細胞毒素は、細胞毒性薬剤又は細菌、カ ビ又は植物起源の酵素的に活性な毒素であってよい。かかる酵素的に活性な毒素 の例は、ジフテリア毒素Ａ、外毒素Ａ、リシンＡ、アブリンＡ、モデシンＡ、ア ルファサルシン イシンである。好ましい細胞毒素は、リポソーム阻害蛋白質例えばりシンのＡ鎖 又はアブリンのＡ鎖である。リシンのＡ鎖は、米国特許第４，５９０，０７１号 で開示されているように細胞毒性結合体に用いられている。

本発明の治療用免疫化学剤は、卵巣を特異的に標的とする治療剤の送達が望まし い種々の治療応用に用いることが出来る。かかる治療応用の例は、卵巣癌、受精 率制御等を含む。好適具体例において、リシン結合した抗透明帯抗体を用いて， 標的の卵巣中の原始濾胞の補充を加速する。加速した補充は，例えば、後期ステ ージ例えば第三次濾胞に有効な避妊方法において有用である．この抗透明帯抗体 は、細胞毒性削りシンを特異的に卵巣へ送達する．リシン処理は、卵巣からの大 型濾胞（例えば、第三次濾胞）の消失を生じ且つ成長プールへの濾胞（例えば、 原始濾胞）の補充をも生じる（該プールにおいてそれらは排卵誘発剤により作用 を受け得る）。

本発明の免疫化学剤は、公知の従来の方法例えば注射、吸入又は卵巣への送達用 に改変した方法によって生者に投与することが出来る。好ましくは、この薬剤を 、非経口で、例えば、静脈経由、腹腔経由等によって投与する。この薬剤を、製 薬上許容し得るキャリアー中、例文ば、水性媒質例えば水、緩衝液、塩溶液、グ リシン、又は油ベースのキャリアー中で、特異的抗体−薬剤カップルに適するよ うに調製する。治療上有効な量即ち患者のＩｌｌ　ｆｌの成長を除き、減じ若し くは遅らせるか又は所望の受精率効果を誘導する量を投与する。治療上有効な投 与量及び投与量養生法は、患者の特定の特性、治療適応症及び治療剤の性質によ って変化する。この投与量及び養生法は、治療する内科医が、この分野で公知の 許容し得る手順によって計算することが出来る。

一般に、治療上有効な投与量は、愚者の体重に対して計算した治療剤の計算され たＬＤ、。より少ない。薬剤の量は、典型的に、約０．Ｏｌ　〜１００ｍｇ／ｋ ｇ体重（好ましくは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋ　ｇ）の範囲内にある。

この発明は、下記の実施例をづ照することにより、−暦良く理解され得る。

夫１０１± 一゛０刊″Ｉこの１−。

熱可溶化したイヌの透明帯（Ｈ５ＤＺ）にヌ・ｊする抗透明帯抗体を、一般に、 Ｄｕｎｂａｒ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　１９：３５６−３６５．１９８ ０）により記載された手順に従って調製した（イリし、揃えたカミソリの刃を用 いて卵巣をミンスした）、Ｈ３ＤＺ　（２５０ＩＬｇ）とＭＤＰ　（２５０ｕｇ ）との混合物でウサギを免疫化した。約３週間の間隔で更なる２回の増強を追加 した。その結果生じたウサギ血清を、次いで、ＩｇＧ分画のために用いた。

ザイムド（Ｚｙｍｅｄ　）プロティンＡカラムと共に与えられた指示に従って、 ＩｇＧ画分を採取した。集めた抗血清を１時間プロティンＡカラム上でインキュ ベートした。次いで、カラムをＰＢＳで４回洗い、ＩｇＧを０．１Ｍ酸性酸（ｐ Ｈ２，８）を用いて溶出し、直ちに１Ｍトリス（ｐＨ９，５）で緩衝した。集め た試料を、次いで、ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）に対して長（透析した。

このＩｇＧ画分のＥＬＩＳＡ力価は、ＨＳ　Ｄ　Ｚに対して６４により大きかっ た。

見立±１ ｚｐ　木−リシンＡ士ム 実施例１について記載したように生成した抗体を脱グリコジル化したりシンＡ鎖 に結合した（　Ｒ，Ｆｕｌｔｏｎ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４８ ：２６１８−２６２５．１９８９に記載された手順に従い、テキサス州、Ｄａｌ ｌａｓ、　Ｉｎ１ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによる）。結合した抗体を 、続いて、動物研究において用いた。

上記のように調製したりシン結合した抗体（１ｍｇ）を０．５ｍｌ　ＰＢＳ中に 置いた。この溶液を、次いで、７月齢の雌イヌに静脈注射した。最初の４８時間 にわたって、注射されたイヌは、高体温、嗜眠及び幾らかの嘔吐を示したが、そ の後、正常な健康に戻った。注射の７日後、このイヌの片方の卵巣を摘出した。

摘出した卵巣を組織学的分析のために切片化して染色した。この卵巣の染色した 切片の分析は、対照の未処理の卵巣と比較して、処理した卵巣内で第三次濾胞の 促進された閉鎖を示し、た。驚くべきことに、原始濾胞及び第二次濾胞の補充が 、対照に比較して、処理した卵巣内で促進された。灯明の及び処理した組織学的 切片を、図１〜９に示す。図１〜４は、それぞれ、７５．１０．３０及び１００ 倍の倍率の対照の未処理の卵巣の切片を示している。図５〜８は、処理した卵巣 の切片を、それぞれ、７．５．１０．３０及び１００倍の倍率で示している。

五五玉ユ 目５■−゛　０帯 実施例１について記載した手順に従って、ネコのハ可溶化透明帯（Ｈ５ＣＺ）に 対して抗体を生成した。アフィニティー精製したウサギ抗Ｈ３ＣＺ■ｇＧをネブ ラス力大学のＲ，Ｋｉｔｔｏｋｅ博士によって、ヨードケン法を用いてヨウ素化 した６２＝１の　＋ｚ５Ｉ、蛋白質のモル比を用いた。反応生成物をＢｌｏ−Ｇ ｅ１　Ｐ−６０カラム上で分離し、ヨウ素化蛋白質をボイドボリュームに溶出し た。約１２４百万ＤＰＭの放射能が、１５μｇの回収した蛋白質に結合した。

Ｏ１％ゼラチンを含む０．５９ｍ１．ＰＢＳ中の放射能櫻識した蛋白質（２，９ ５μｇ、１０９９マイクロキユリー）を、雌ネコに静脈注射した。この動物に、 ５０ｍ１ＰＢＳ中の５０μｇのナトリウムイオディクル（Ｉｏｄｉｃｌｅ　）を も注射した。この量のナトリウムイオディクルは、モルベースで計算した場合、 放射能標識した蛋白質中の　１２　ｊ　■の量の１０，０００倍であった。

注射の２４時間後、この動物を安楽死させて、種々の組織を取り出した。組織を ホモジェナイズして、マイクロメゾイック（Ｍｉｃｒｏ−Ｍｅｄｉａ　）ガンマ −カウンターを用いて放射能を分析した。表１に示すように、２４時間以内にお いて、卵巣内の放射能ｆｆｉ（ＣＰＭ／ｇ）は、他の再生性組織のそれの４倍で あった。

表１ ■　二し鉱ユ 心臓　２５３４ 腎臓　５０３４ 肝臓　５５３７ 脳　４１５ 筋肉　８８２ 肺臓　３２０２ 子宮　７９８１ 卵巣　３１３４８ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　５１１００ ＣＯ７Ｋ　１６／１８　８３１８−４Ｈ（７２）発明者　ボウマン、ディピッド アメリカ合衆国　７７３８１　テキサス、ザウッドランズ、ヒースストーン　ブ レイスＩ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．抗透明帯抗体、 該抗透明帯抗体に結合させた治療剤 を含む製薬組成物であって、該抗透明帯抗体が卵巣組織に特異的に結合し、それ により結合させた治療剤を卵巣に送達する、上記の製薬組成物。
2. ２．前記の抗体がポリクローナル抗体である、請求の範囲第１項に記載の製薬組 成物。
3. ３．前記の抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲第１項に記載の製薬組 成物。
4. ４．前記の抗体が組換え透明帯ポリペプチドに対して高められたものである、請 求の範囲第１項に記載の製薬組成物。
5. ５．前記の治療剤が細胞毒素である、請求の範囲第１項に記載の製薬組成物。
6. ６．前記の治療剤が放射性同位体である、請求の範囲第１項に記載の製薬組成物 。
7. ７．前記の治療剤が受精率制御剤である、請求の範囲第１項に記載の製薬組成物 。
8. ８．前記の治療剤がリシンである、請求の範囲第５項に記載の製薬組成物。
9. ９．治療剤を卵巣に送達する方法であって、治療剤を、卵巣透明帯に対する特異 性を有する抗体に結合し、 治療上有効な量の治療剤を卵巣に送達するための抗体一薬剤結合体を個人に投与 する ことを含む上記の方法。
10. １０．前記の治療剤が細胞毒素である、請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．前記の治療剤がリシンＡである、請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．前記の治療剤が放射性同位体である、請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．前記の治療剤が受精率制御剤である、請求の範囲第９項に記載の方法。
14. １４．卵巣の病気を治療する方法であって、かかる治療を必要とする患者に治療 上有効な量の請求の範囲第１項の製薬組成物を投与することを含む、上記の方法 。
15. １５．卵巣の濾胞の補充を誘導する方法であって、有効量の抗透明帯抗体に結合 したリシンを投与することを含む、上記の方法。
16. １６．動物に避妊を誘導する方法であって、第３次濾胞への原始卵巣濾胞の補充 を、抗透明帯抗体に結合したリシンを投与することによって誘導し、そして 第３次卵巣濾胞の閉鎖を誘導する ことを含む、上記の方法。