JPH07507683A

JPH07507683A - 真核リボヌクレアーゼｐを用いるｒｎａの標的化切断および外部ガイド配列

Info

Publication number: JPH07507683A
Application number: JP5519468A
Authority: JP
Inventors: ユアン，ヤン; ゲリアー−タカダ，セシリア　エル．; アルトマン，シドニー
Original assignee: エールユニバーシティ
Priority date: 1992-04-28
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2015-03-06
Also published as: DE69303712D1; CA2117903C; EP0638121A1; GR3020859T3; EP0638121B1; ES2093427T3; AU669367B2; ATE140482T1; WO1993022434A3; WO1993022434A2; DK0638121T3; DE69303712T2; JP3015463B2; AU4119893A; CA2117903A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】真核リボヌクレアーゼＰを用いるＲＮＡの標的化切断および外部ガイド配列発明の背景本発明は、核酸配列、特にリボヌクレアーゼＰに対する基質であるＲＮＡ配列の遺伝子工学の一般的分野に属する。

本願は、Ｙａｎ　ＹｕａｎＳＣｅｃｉｌｉａ　Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−ＴａｋａｄａおよびＳｉｄｎｅｙＡｔｔｍａｎによる「真核リボヌクレアーゼＰを用いるＲＮＡの標的化切断および外部ガイド配列」と題した１９９２年８月１８日出願の米国特許出願第０７／９３１．９３７号の一部継続出願であり、この出願は１９９２年４月２８日出願の第０７７８７５．０９９号の一部継続出願であり、この出願は５ｉｄｎｅｙ　Ａｌｔｍａｎらにより１９９０年８月に出願された「治療用リボザイム組成物」と題した米国特許出願第ｏ７７５６８、８３４号（米国特許第５．１６８．　（１５３号として発行された）の一部継続出願であり、この出願は５ｉｄｎｅｙ　Ａｌｔ＋ｍａｎ、　Ａｎｔｈｏｎｙ　Ｃ，Ｆｏｒｓｔｅｒ、およびＣｅｃｉｌｉａ　Ｌ、　Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａにより１９８９年３月２４日出願の「不要なＲＮＡの除去または不活性化Ｊと題した米国特許出願第０７／３２８．３６８号（現在は放棄されている）の一部継続出願である。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　ＨｅａｌｔｈおよびＮａｔｉｏｎａｌ　５ｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎから５ｉｄｎｅｙ　Ａｌｔｍａｎへの助成金ＧＭ　１９４２２およびＤＭＢ９１０１６７０の結果として、米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。

ス配列中で作用する（すなわち、リボザイムが１つのＲＮＡ中へＲＮＡが前もって推測し得なかった一連の異なる能力および生物学的活性を有することが認識された。これらの新規なＲＮＡレベルでの発見のなかで最も重要なことは、ＲＮＡが酵素および情報担体と成り得ることである。

１？ＮＡ鎖の切断および／または連結に含まれる現在既知のりボザイムにはいくつかのクラスがある。リポザイムは、ＲＮＡからなる酵素として定義され、その大部分がＲＮＡ基質に作用する。

リホザイムは、１９８２年から知られている。この年にＣｅｃｈおよび同僚は、単細胞真核生物のテトラヒメナ中でリポソームＲＮＡ前駆体が、ｒＲＮＡ前駆体から成熟ｒＲＮＡへの変換中に除去される！？ＮＡ配列中の成分により触媒されて切断されることを示した（り上１．３１：　１４７−１５７＞。この除去される配列（介在配列またはイントロンと呼ばれる）は、「クラスｌ」イントロンリボザイム活性のおびただしい例として現在知られるものの一つである。

類似の「クラスＩＩＪイントロンリボザイムメカニズムが、つい最近発見され、それは多数の酵母ミトコンドリアＲＮＡの切断および続いておこる連結を含む（Ｎａｔｕｒｅ、　３２４：　４２９−４３３１９８７）。

Ｃｅｃｈおよび同僚は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｔｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、によるＰＣＴ／ＵＳ８８７１０３１６１（１９８８年６月１６日にＷｏ　８８１０４３００として発行）の中で「クラスｌ」リボザイムの特定なインビトロでの適用を記載した。

細胞および患者における治療的適用に対するそれらの潜在的可能性は、依然としてはつきりしない。

１９８３年に発見された第３のクラスのりボザイムは、トラン構築され、同時に、切断される基質が第２の分離ＲＮＡ鎖である条件下で作用する）ことが示された最初のりボザイムである。

このリポザイムは、ＭＩ　ＲＮＡと呼ばれ、１９８３年にＡｌｔｍａｎおよび同僚により、大腸菌中の全てのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の成熟５“末端を形成する切断をし得ると特徴付けられた。ｔＲＮＡ合成に関係する類似のＲＮＡ含有酵素が、探索された全ての細胞中（多くのヒト細胞系を含む）で発見された。けれども今までのところ、関連する原核生物のＲＮＡは、インビトロではそれら自体による触媒性を示していない。

この触媒ＲＮＡの発見および特徴付けは、５ｉｃｌｎｅｙ　ＡｌｔＩＩｌａｎによりＡｄｖ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　６２．１−３６　（１９８９）中の「リボヌクレアーゼＰ：触媒ＲＮＡサブユニットを有する酵素」の中で概説されている。

活性成分はまず大腸菌抽出物から単離され、そして続いて２つの成分（Ｍｌと呼ばれるＲＮＡ成分およびＣ５と呼ばれるタンパク質成分）を有するリボヌクレオタンパク質であることが決定された。このＲＮＡは、ミカエリス−メンテン速度論を用いて測定される典型的な酵素反応で基質を切断した。Ｇｕｅｒｒｉｅｒ− Ｔａｋａｄａら、Ｃｅ１ｌ　３５．８４９　（１９８３）およびＭｃＣｌａｉｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８゜５２７　（１９Ｂ？）、により報告されたように、Ｍｌは、単に基質認識を行い、そしてＣ５はに、ではな（ｋ０８を変えることが決定された。ＨａｎＳｅｎら、Ｇｅｎｅ　３８．５３５　（１９Ｂ？）、により報告されたように、配列決定によりＭＩ　ＲＮＡが３７７ヌクレオチド長、Ｍ、は約１２５、０００、そしてタンパク質が１１９アミノ酸から成り、Ｍ、は約１３、８００であることが示された。

２つの他のりボザイムのクラスは、「ウィロイド様病原体」またはＶＬＰと呼ばれる自己複製ＲＮＡグループの複製サイクルに関係する。植物ウィロイド、植物ウィルスのサテライトＲＮＡ、およびデルタ肝炎ウィルスは、全てＶＬＰグループの一員である。

ＶＬＰは、２つのクラスに分けられ得る二クラスＩ、遊離して生存するウィロイド；およびクラスＩＩ、ウィルソイドおよびサテライトウィロイド（複製するためにヘルパーウィルスを必要とするＲＮＡ分子）を含む。デルタ肝炎ウィルスは、この定義に５５）は、これらの病原体に対する複製サイクルの戦略を発表し、続いて、いくつかの研究室で行なわれた実験により証明された。この「回転サークル」複製戦略の鍵となる要素は、複製を行っているＶＬＰが、その情報の単位長さよりも大きな複製を行い、次いで、ＶＬＰ自身のＲＮＡ中に構築されたりボザイム活性によりモノマーサイズに切断されることである。Ｓｈａｒｍｅｅｒ＋ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６２．　２６７４−２６７９　（１９８８）　；　Ｂｒａｎｃｈら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４３、６４９−６５２　（１９８９）　；および、ＮｕならびにＬａｉ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３゜６５２−６５５　（１９８９）は、デルタ鎖およびデルタ肝炎ウィルスについてデルタ鎖を含むドメインの両方のりポザイム切断点を決定した。

ＶＬＰリボザイムの１つのタイプは、「ハンマーヘッド」と呼ばれる約３０ヌクレオチドのみからなる小さな構造ドメインによって定義される。Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）、は、アボカドサンブロツチウィロイド、およびタバコリングスッポトウイルス、およびアルファルファ一時的画線ウィルスのサテライ１−　ＲＮＡなどの植物ウィロイドがらこれらの小型（１８ヌクレオチド程度の少なさ）で、そして比較的特異的なりポザイム配列を最初に開発した。Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）およびＦｏｒｓｔｅｒならびにｓｙｍｏｎｓ（Ｃｅｌｌ　５０．９−１６．１９８７）は、このリボザイムのクラスによる切断について必要条件を確定した。種々の実施態様および潜在的に可能な適用もまた、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎによるＰＣＴ／ＡＵ８８１００４７８　（１９８９年６月２９日にＷｏ　９０１０５８５２として発表された）中で、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、ＧｅｒｌａｃｈおよびＪｅ＋＋ｎｆｎｇｓにより記載されている。

インビボにおいてＲＮＡに支配される全ての反応は、ＲＮＡの特定のホスホジエステル結合のエステル交換反応または加水分解に帰する。これらの反応の内のいくつかのクラスにおいて、切断または連結の分子内の部位が、切断部位を含むポスポジエステル鎖のセグメントと塩基対を形成する内部ガイド配列（ＩＧＳ）によって同定される。テトラヒメナ配列、および、その後酵母中で発見された配列は、真の酵素ではない。なぜなら、それは、プロセスにおいて再生されないが、そのかわりに化学量論比で反応するからである。インビトロにおいである条件下で酵素活性を有し、そしてＲＮＡを切断および連結しうろこの配列のフラグメントを設計することは可能であるが、これらの７ラグメントについての欠点は、それらが非常に大きく（元の４１５ヌクレオチド配列の２００残基以上が必要）、そして特異性が制限されることである。それらの本発明での形態では、テトラヒメナリボザイムは４塩基の認識配列を有し、そしてハンマーへッドリボザイムは、約１２塩基の認識配列を有し、相補的な様式によるＲＮＡの切断にこれらのりボザイムが使用され得る。

ＩＧＳは、インビボにおいて酵素的であり、真正細菌のＩ？ＮＡアーゼＰのＲＮＡ成分による前駆体ｔＲＮＡ分子の切断であり、ＲＮＡにより支配されるあるクラスの反応の中には存在しない。これは、　Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅ１ｌ　３５．８４９　（１９８３）、に記載され、そしてＡｌｔｍａｎ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　６２．１　（１９８９）、により概説されている。切断部位を含むホスホジエステル鎖のセグメントのヌクレオチド配列は、ＲＮＡアーゼＰの異なる基質の間では保存されていないので、それは酵素に対する特異的ＩＧＳとして認識され得ない。

５ｉｄｎｅｙ　Ａｌｔｍａｎらによる、１９９０年８月出願の「治療用リボザイム組成物Ｊと題した米国特許出願第ｆ１７７５６８．８３４号、および５ｉｄｎｅｙ　Ａｌｔｍａｎらによる１９８９年３月２４日出願の［不要なＲＮＡの除去または不活性化」と題した米国特許出願第０７７３２８．３６８号は、標的化部位に相補的であり、そして末端の３−ＮＣＣＡを含むヌクレオチド配列部分の形成によって、いかなるＲＮＡ分子をも細菌性ＲＮＡアーゼＰによる切断の標的にし得ることを開示している。ここで、配列は標的化ＲＮＡにハイブリダイズするように設計されているので、細菌性ＲＮＡアーゼＰは基質をハイブリ、ド塩基対合領域で切断する。特異性は、相補的配列により決定される。配列は、好ましくは１ｏから１５ヌクレオチドの長さであり、そして３°末端でＮＣＣＡに続く相補的な配列によるいくつかの塩基対の形成を妨害しない程度まで非相補的なヌクレオチドを含み得る。

一連の研究により、原核ＲＮＡアーゼＰの標的化において有用である外部ガイド配列、またはｒＥＧＳＪは、真核ＲＮＡアーゼＰによる標的化ＲＮＡ鎖の切断をもたらさないことが示された。

従って、本発明の目的は、真核ＲＮＡアーゼＰまたはそれらの機能的等個物を用いて、標的化ＲＮＡ配列を、特異的に切断する方法および組成物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、Ｉ？ＮＡならびにＤＮＡウィルス、およびｍＲＮＡからの過度のタンパク質発現または病原性タンパク質の発現、あるいはＲＮＡ自体の過度の発現または病原性ＲＮＡの発現により引き起こされる疾患のような、ＲＮＡ転写または關訳を包含する疾患状態を処置するために、インビトロおよびインビボの両方での真核細胞内においてｌ？ＮＡを特異的に切断するための方法および組成物を、提供することである。

発明の要旨標的ＲＮＡとハイブリッドを形成するように好適に設計されたオリゴシボヌクレオチド（「外部ガイド配列Ｊ、またはＥＧＳンを用いて、ヒト細胞由来のＲＮＡアーゼＰによる切断に対して、いかなるＲＮＡも標的化され得、それによって、インビトロにおいてＲＮＡアーゼＰによる切断される基質が生成されることが発見された。これらの結果が、あらゆる真核細胞由来のＲＮＡアーゼＰにまで拡張され得ると結論することは、合理的であるということをデータは示している。ヒトＲＮＡアーゼＰによる切断の標的ＲＮＡとなり得る２つのクラスのＥＧＳがある。ｔＲＮＡ様の二次構造を仮定し得るＲＮＡをコードする配列を含む小さいＤＮＡフラグメントからの転写により、これらは調製される。最初のクラスにおいて、構造はｔＲＮＡ様配列の５゛末端から少なくとも最初の１３ヌクレオチド、アンチコドンステムおよびループ、あるいは可変ループまたは可変ループの一部を欠く。ヒトＲＮＡアーゼＰと最も効果的なこの最初のクラスのＥＧＳは、アンチコドンステムおよびループが欠失したＥＧＳである。２番目ののクラスにおいて、ＥＧＳは、ＥＧＳのＴループ、可変ループ、およびｔＲＮＡ様セグメントのアンチコドンステムの相等部分に変化を有する。

選択されたＲＮＡを宿主細胞のＲＮＡアーゼＰによる切断の標的にするために（従って、標的ＲＮＡの機能の発現を妨げる）インビボにおいて使用するための、２番目のクラスの好適なＥＧＳの選択方法もまた開示される。本発明の方法および組成物は、インビボにおいて疾患原因となる遺伝子の発現を予防するのに有用であり得る。

図面の簡単な説明図１は、ＨＩ　ＲＮＡの配列および構造である。

図２は、真核ＲＮＡアーゼＰの標的化において特定の基質を切断するために用いるＥＧＳの、ラベルをつけたｔＲＮＡに独特のアームおよびステムを用いた一般的な図式である。

図３ａは、ｔＲＮＡ”’への前駆体の配列ならびに二次構造、および基質とｔＲＮＡ”’由来のＥＧＳとの複合体である。ｐＴｙｒ　：大腸菌ｔＲＮＡ”’前駆体；ｐＡｖａ＋５°　リーダー配列を有する基質（標的）ＲＮＡおよび大腸菌ｔＲＮＡ”’の最初の１４ヌクレオチドである。

図３ｂは、切断反応のゲル電気泳動分析のオートラジオグラフである。矢印は、予測切断部位を示す。

図４は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡとＥＧＳｅＡ”ＲＮＡとの複合体の模式図である。

図５ａおよび５ｂは、特定の基質を切断するために真核ＲＮＡアーゼＰの標的化において使用されるＥＧＳの１つのクラスの図式である：図５ａは、図２のＥＧＳと一致するＥＧＳである；図５ｂは、アンチコドンステムおよびループが取り除かれたＥＧＳである。

図６ａ、６ｂ、および６Ｃは、特定の基質を切断するために真核ＲＮＡアーゼＰの標的化において使用されるＥＧＳの２番目のクラスの図式であり、ここで、エキストラループ、Ｔループ、およびアンチコドンステムは、改変されている。

発明の詳細な説明大腸菌由来のりボヌクレアーゼＰは、ｔＲＮＡ前駆体のアミノアシルステムおよび５゛末端リーダー配列と似ている水素結合した複合体中で見出されるオリゴリボヌクレオチドを切断し得る。ヒト（ＨｅＬａ）細胞由来のＲＮＡアーセＰは、インビトロにおいてこのような簡単な複合体中の５゛近位のオリゴリボヌクレオチドを切断し得ないが、３′近位のオリゴリボヌクレオチド（外部ガイド配列またはＥＧＳ）がｔＲＮＡ分子部分に似ている場合は切断し得る。

以下に示す実施例は、ヒｌ−ＲＮＡアーゼＰによるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対するｍＲＮＡの切断の有効性を示す。このような複合体において、５°オリゴリボヌクレオチドの配列およびＥＧＳの配列は、ｍＲＮＡ中の標的部位の選択に依存する。適切に設計されたＥＧＳの存在は、インビボにおけるＣＡＴ酵素活性を効果的に減少させ、そしてインビトロにおいてＣＡＴｍＲＮＡの切断を促進し、この方法が遺伝子の不活性化に一般的に使用されるべきであることを示す。

リボヌクレアーゼＰ。

リボヌクレアーゼＰは、タンパク質およびＲＮＡサブユニ、トから成る酵素であり、ｔＲＮＡ前駆体を切断してｔＲＮＡの５゛末端を生成する。この本質的な酵素活性は、試験した全ての細胞タイプ、原核細胞および真核細胞の両方において見出された。

ＲＮＡアーゼＰによる基質認識に関する研究中に、大腸菌ＲＮＡアーゼＰが正常なｔＲＮＡ構造の特定のドメイン（Ｄ、Ｔおよびアンチコドンステムならびにループ）を欠＜　ｔＲＮＡに関連する合成基質を切断し得ることが見出された。ＲＮＡヘリックスのｌ＼−フターンおよび３゛近位のＣＣＡ配列は、十分な認識要素を含み、反応を促進させる。ＲＮＡヘリックスの５°近位の配列は、ヘリックスの３°近位配列に共有的に結合はしていない。ステムの３近位配列は、「外部ガイド配列Ｊ　（ＥＧＳ）とみなされ得る。なぜならそれは５゛近位領域から塩基対合領域までの切断部位を認識するためである。

理論上、既知の配列のＲＮＡはどれでも、ＲＮＡアーゼＰによる特異的切断用に特別設計されたＥＧＳ　ＲＮＡにより標的化され得る。

ＥＧＳで指定されるｍＲＮＡの切断は、インビトロにおいて大腸菌のＲＮＡアーセＰて達成された。

大腸菌およびヒト細胞由来のＲＮＡアーゼＰは、似てはいるが生化学的には同一でない性質を有する。それらのＲＮＡ成分は、類似の二次構造を有する。しかし、ヒトのＲＮＡアーゼＰの基質範囲は、大腸菌のそれの範囲よりもずっと狭い。

例えば、大腸菌ＲＮＡアーゼＰは、正常なｔＲＮＡ構造の３つの特定のドメイン（Ｄ、可変、およびアンチコドンステムならびにループ）を欠＜　ｔＲＮＡに関連する合成基質を切断し得るが、これはヒト酵素または酵母Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の酵素に対する基質ではない。

従って、ヒトおよびおそらく他の真核細胞由来のＲＮＡアーゼＰによるＲＮＡの切断のためのＥＧＳの最も簡単な設計は、大腸菌ＲＮい。

本明細書で用いるように、特に特定されない限り、ＲＮＡアーゼＰは、内因性であるか、細胞に付加されるか、またはインビトロにおいて用いられるかのいずれにおいても、切断されるＲＮＡがある細胞中のＲＮＡアーゼＰを指す。本明細書中に記載された多くの技法は、試薬の製造方法、および試薬の原料として当業者に公知である。方法および試薬に関して、本明細書中に引用したあらゆる参考文献の技法は、当業者の目的および水準を証明する目的で特に本明細書中に援用される。

外部ガイド配列Ａ、ＲＮＡアーゼＰ標的化配列図２．３．４．５および６に示すように、ヒトＲＮＡアーゼＰに対するＥＧＳは、標的基質分子との複合体に含まれる場合、ｔＲＮＡクローバ−リーフまたは実質的にその一部と類似する二次構造を形成する配列から成る。本明細書で用いる用語「類似する前駆体ｔＲＮＡＪは、ＲＮＡアーゼＰによる標的ＲＮＡの切断を生じる複合体を形成するｔＲＮＡの二次構造の十分な部分を意味する。

ＥＧＳ配列は、あらゆるｔＲＮＡ由来であり得るが、Ｄステムおよびアミノアシルステムは、標的基質配列と相補的であるように改変されなければならず、そして見かけのＤステムは４塩基対を含む点は除かれる。３−ＣＣＡの存在は、ヒ）　ＲＮＡアーゼＰとの反応効率を約３５％増大する。アンチコドンループおよびステムおよびエキストラループは、それぞれ別々に欠失され得、Ｔループおよびステムは、ＥＧＳの有用性を減少することなく改変され得る。そしてアンチコドンステムおよびループが欠・失する場合、反応効率が約１０倍増加する。ＥＧＳの他の部分での変化（図６参照）は、効率を約１００倍増加させ得る。

所望の二次構造は、ｔＲＮＡに類似する構造を形成する従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合図式を用いて決定され、以下に記載の構造を有する。水素結合領域の特定の配列は、所望の構造が形成される限り、それほど重要ではない。多くの種類の細菌および真核細胞由来のｔＲＮＡを包含する全てのｔＲＮＡは、同じ一般的な二次構造と一致する。典型的にはこれはクローバ−リーフの形態で書かれ、短い相補的領域の間の水素結合塩基対合により維持される。４つの主アームは、それらの構造または機能で命名されている：受容アームは、３°末端ｃｃＡｏｌｌとその分子の５゛および３°セグメントが塩基対合して形成されるステムをこえて伸びる可変の４番目のヌクレオチドから成る。

他のアームは、塩基対合したステムおよび非塩基対のループから成る。ｒＴＪアームは、リボチミジンヌクレオチドの存在に対して命名され、そして７つの対合していない塩基を含む。

アンチコドンアームは、通常ループの中央にトリブレットアンチコドンを含み、そして７つの対合していない塩基から成る。Ｄアームは、ｔＲＮＡ中の別の改変塩基である塩基のジヒドロウリジンの存在に対して命名され、そして対合していない８〜１２の塩基を含有する。位置は５°から３′方向に番号付けされるが、最も一般的なｔＲＮＡ構造、これは７６残基を有する、に従っている。ｔＲＮＡの全体の長さ、７４〜９５塩基である。長さの違いは、２つのアーム、Ｄアームおよびエキストラアームの構造の違いから生じる。この２つのアームは、Ｔアームとアンチコドンアームとの間にあり、３塩基と５塩基との間、または約５塩基のステムを有する１３塩基と２１塩基との間の塩基を含有し得る。二次構造を維持する塩基対は、事実上変化しない：受容アームには通常７塩基対があり、Ｔアームには５塩基対、アンチコドンアームには５塩基対、そしてＤアームには３または４塩基対がある。

本明細書中で使用するように、塩基対合領域の５°末端のヌクレオチドで、ＲＮＡアーゼＰによる基質の切断を促進する条件下で、前駆体ｔＲＮＡに類似する二次構造を有するノ・イブ１ルノド構造は、好ましくはＤループおよびステム、アミノアシルステム、アンチコドンループおよびステム、可変ループオヨヒステム、およびＴループおよびステムを包含し、ここで、後者の３つは、親分子に見られる配列および詳細な構造と比較して改変され得る。

ある少数のヌクレオチドは通常、９０〜９５％のｔＲＮＡにおいて同じ位置に見出され、それには生保存された（または半改変）ヌクレオチドがいくつか付加している。配列が標的物と相補的であり、ｔＲＮＡを特徴付ける二次構造を形成する限りは、これはＥＧＳにおける必要条件ではない。図２に示したように、アミノアシルステムおよびＤループおよびステムを形成する配列は、標的ＲＮＡと相補的となるようにＥＧＳ中で変化される。

二次構造の塩基対合した二重らせんステムは、三次構造中に維持されており、互いに直角な２つの二重らせんを作り出す。受容ステムおよびＴステムは、一つのギヤ・ノブのある１つの連続した二重らせんを形成する；Ｄステムおよびアンチコドンステムは、また１つのキャップを有する別の連続した二重らせんを形成する。不変の塩基または準不変の塩基のほとんどは、三次構造中に包含される。

Ｂ、相補的配列相補的な配列は一般的に、図に示す２つのプロ、り中の１１ヌクレオチド（図２参照）から成り、標的配列中の２つの対合していないヌクレオチド、好ましくはＵＵ、により分けられている。ここで、２つのブロックは、開裂のための標的部位の３°側の配列に相補的である。

リボザイム活性全ての細胞が、それらの核中にＲＮＡアーゼＰを含有しているので、仮に、切断が核内で細胞内的に生じるとすれば、リボザイム活性を有する必要はない。仮に、切断が細胞質でおこるのであれば、ＲＮＡアーゼＰが供給されなければならない。簡便であるが故に本明細書中で用いるように、ＲＮＡアーゼＰは、大腸菌Ｃ５タンパク質およびＭＩ　ＲＮＡの真核類似体から成るリボヌクレオタンパク質を指し、そして、単離されたのか否か、化学合成により生成されたのか否か、またはＲＮＡの場合は、遺伝子からの転写であって、本明細書中ではＨＩ　ＲＮＡと言われるものであるか否かという起源には関係がない。ＭＩ　ＲＮＡを指す。

ＲＮＡサブユニットは、インビトロでタンパク質サブユニットが存在しない時に触媒活性を必ずしも明示する必要はない。

Ａ、内因性ＲＮＡアーゼＰヒトＲＮＡアーゼＰのＩＩＮＡ成分である、旧ＲＮＡの配列および悲定される二次構造は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８　（１）、９７−１０３（１９８９）中でＢａｅｒらにより報告されており、その教示は本明細書中に援用されている。ＨＩ　ＤＮＡの配列（配列番号ｌ）を、以下に示す：ＨＩ　ＤＮＡのヌクレオチド配列を、ｃＤＮＡ配列から決定した。配列の下線部分は、ＲＮＡ配列分析により決定した。

多様な起源のＲＮ＾アーゼＰは、二次構造および基質特異性が類似するので、触媒的活性ＲＮＡサブユニットが、明確に異なる配列を有するとしても、あらゆる細胞においてあらゆるＲＮＡを標的として本明細書に記載した技術を用いて、当のＲＮＡアーゼＰの配列の効果が最大となるように設計したＥＧＳを用いることは可能である。Ａｌｔｍａｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　６２．１−３９　（１９Ｂ９）　；　Ａｌｔｍａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５．２００５３−２００５６　（１９９０）を参照のこと。二次構造は、相補的配列の分子内会合により決定される。塩基対は、規定されたＡ／ＵおよびＧ／Ｃ，または規定されていないＧ／ＵＳＡ／Ｇなどであり得る。

Ｂ、触媒性活性を有する外因性ＲＮＡＥＧＳもまた、タンパク質の存在または非存在下で酵素活性を示すＲＮＡ配列と組み合わせて用いられ得る。そのＲＮＡ配列はＨＩＲＮＡ全ＲＮＡたはそのいずれかの部分のようなタンパク質、あるいは真核細胞起源あるいは誘導体の機能的に等価な分子と共同して、触媒活性を有する分子として表され得る。

触媒活性を有する外因性ＲＮＡまたはＲＮＡアーゼＰをＥＧＳとの組み合わせて利用する場合、２つの主要な状況がある：っまり細胞または細胞性ＲＮＡアーゼＰが存在しないインビトロにおいて、および、切断されるべきＲＮＡが、内因性１？ＮＡアーゼＰを含有しない細胞の部分に位置している環境にある場合である。

後者の場合、ＭＩ　ＲＮＡの類似体およびｃ５タンパク質（上記で定義した）あるいはそれらのヒトまたは他の真核生物の等価物をコードする遺伝子は、細胞導入されるが、細胞に遺伝子を導入し、発現させるための当業者に公知の、好適なベクターまたは他の方法により、開裂するための所望の位置に挿入される。

実験試薬または臨床試薬としてのＥＧＳの応用外部ガイド配列は、制限酵素と同様の方法でインビトロ試薬として、治療薬として応用され得る。応用は特定の宿主細胞ＲＮＡ、あるいは細菌またはウィルスなどの病原性生物によりコードされるＲＮＡの切断および不活性化である。外部ガイド配列は、所望の切断部位の３ °側の配列に相補的な１１塩基と標的化ＲＮＡおよび３゛末端ＮＣＣＡ配列に特異的な配列の組み合わせから成る。この外部ガイド配列は、ＲＮＡアーゼＰ存在下で、ＥＧＳに相補的な配列を有する全てのＲＮＡに添加され得、そしてそのＲＮＡは標的化部位で切断される。このように、全ての細胞、例えばヒト細胞のＲＮＡアーゼＰなどの内因性のＲＮＡアーゼＰは、好適なＥＧＳ　ＲＮＡを使用することにより、ウィルスまたは他のＲＮＡといった特定のメツセンジャーを破壊するようにし得る。

１、インビトロで応用するための試薬ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、分子生物学者にとって非常に価値のある試薬である。制限フラグメントの大きさのパターンを用いて、ＤＮＡ分子間の配列関係が確立される。そして大きなりＮＡは、遺伝子工学、配列決定、およびタンパク質結合の研究に有用な大きさのフラグメントに切断され得る。ＲＮＡプロセッシング酵素は、かなり配列特異的にＲＮＡを切断する条件下で利用され得る。

特定のガイド配列と真核ＲＮＡアーゼＰまたはそれらの機能的等価物とを結合させることにより、特定のりボザイムが調製され得る。好ましい実施態様では、外部ガイド配列およびＲＮＡアーゼＰのＲＮＡサブユニット（例えば、旧ＲＮＡ）は、分離している；あるいは、２つの配列は、オリゴヌクレオチドリンカーを用いて結合され得、このことにより、標的配列とＨＩ　ＲＮＡ（あるいは等価な）配列との間で標的化ガイド配列が結合するのに、あるいは触媒配列が、Ｃ５プロティンの類似体と結合しているか否かに関係なく結合するのに十分な柔軟性を与える。

２、治療法ａ、相補的配列の決定および調製ｍＲＮＡおよび構造ＲＮＡ自体によりコードされるタンパク質を包含する、ＲＮＡ、！−シて発現する全ての細胞性遺伝子生成物は、標的化ＲＮＡおよび所望の切断部位に結合する配列および／または構造の好適な領域を含むように設計された配列を用いるＲＮＡアーゼＰにより不活性化のために標的化され得る。細胞性遺伝子生成物は、癌遺伝子の改変生成物（ｒａｓ遺伝子生成物など）であり得る；ここで、生成物は正常細胞成分でなく、ウィルス性タンパク質（ＨＩＶ複製に不可欠な遺伝子によりコードされているタンパク質など）；または細菌性タンパク質である。

多くの場合、感染性のまたは病理学的因子における重要な遺伝子が、単離され、そして配列決定されている。適切な相補的配列は、標準的な技術、試薬、およびこれらの公知の配列に基づく装置を用いて合成され得る。

ｂ、標的化ＲＮＡへＥＧＳを送達するための好適な薬学的組成物の調製切断するために標的化した細胞内ＲＮＡへＥＧＳを送達するための２つの主要なメカニズム：拡散およびベクター媒介がある。

上記のように、疾患過程において重要である全てのＲＮＡを標的化し得、そして好適な相補的配列を合成的に、またはクローン化配列をコピーすることにより作成した。ＲＮＡアーゼＰは、真核細胞の核中に主に見出されるので、感染した細胞へ好適なＥＧＳを投与することによりほとんど阻害されるような感染性の要因は、核中で重要なＲＮＡ配列が転写されることである。細胞核中で複製するウィルス性要因の重要な例は、庖疹ウィルス（単純庖疹ウィルス、水痘状帯状庖疹ウィルス、サイトメガロウィルス、およびエプスタイン−バーウィルスを包含する）、Ｂ型肝炎ウィルス、アデノウィルス、パラミクソウィルス（麻疹など）、およびレトロウィルス（ヒト免疫不全ウィルス（旧■１、　）ｌｉｔ／　ＩＬ　Ｈ１ｌ／　ＩＩ＋、および）ＩＴＬＩ／−１）など）を包含する。

ＥＧＳのベクター介在送達好適なベクターは、核中へ直接ＥＧＳを挿入するウィルス性ベクター（レトロウィルスなど）であり、核中でベクターは転写され、そして核中に放出される。好適な条件下で、ＥＧＳは標的化ＲＮＡとハイブリダイズし、そして内因性ＲＮＡアーゼＰは、ノーイブリッド領域の５°側でハイブリダイズしたＲＮＡを切断する。

遺伝子治療へのレトロウィルスベクターの使用方法は、米国特許第４．８６８．１１６号、および第４．９８０．２８６号、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＪＳ８９１０３７９４およびＰＣＴ／１ｌｓ８９１００４２２に記載されており、その教示は本明細書中に援用されている。

ウィルス自身のＲＮＡ配列をＤＮＡの形態で宿主の染色体中に取り込む不完全なレトロウィルスベクターは、宿主にＥＧＳが取り込まれるように設計され得、宿主中で複製され、そして細胞質中に放出されて標的ヌクレオチド配列と互いに影響し合う。

標的化治療手段のように、細胞のウィルス起因性疾患（ＡＩＤＳなど）にかかっている患者の造血細胞中に、特異的に設計した核酸配列を導入する能力は、大きな可能性を有する。ヒト細胞へ特定の遺伝子配列を導入するために現在利用し得る最も有効な方法論は、ヒト細胞への高効率の遺伝子運搬のための担体またはベクターとして作用するＲＮＡ含有レトロウィルスの使用を包含する。

ＲＮＡアーゼＰに基づく治療もまた、ＨＩＶ−１の拡散を防止する手段、および／または感染した個人に免疫機能を与え得るＴ細胞の旧Ｖ−１抵抗群を提供する手段として用いられ得る。最近ＨＩＶ−１に対する抗体を有していると診断されたが、ＡＩＤＳの徴候をまだ示していない患者は、治療に対する最高の候補者であろう。この手順には、数個の患者の骨髄幹細胞の除去、および続いてサイトブレーション（ｃｙｔｏｂｌａｔｉｏｎ＞が必要である。除去された細胞は、実験室で好適なＥＧＳ組成物（不完全なウィルスベクターなどの適切なウィルスベクターを介する）で処置され得、次いで、同じ個体へと戻される。処置した細胞は、患者の中でＴ細胞を包含する成熟造血細胞へと発達する。これらのＴ細胞は、正常な免疫機能を有し、そして最も重要なことには、細胞内での免疫化を行い、患者の中に存在し続けている全ての旧Ｖ−１による細胞破壊を防ぐことである。

骨髄幹細胞および造血細胞は、比較的簡単に除去され、置換され、そして運搬された遺伝子の増殖のための自己再生する細胞群を提供する。上記のように、［（ＩＶ−１およびＨＴＬＶ−１は、これらの研究法に従いやすくなければならない。さらに長い期間、ＲＮＡアーゼＰに基づく治療法を使用すると、細胞中の他の望ましくない遺伝子（癌細胞の原因および維持に関連する活性化癌遺伝子など）を選択的に不活性化させる。

ＨＩＶに感染することを防止または制限することを目的として使用する現在の研究法と比べて、ＲＮＡアーゼＰに基づく技術を使用して、ＨＩＶ疾患、およびＥＧＳを運ぶレトロウィルスベクターにより形質転換される白血球細胞の関連疾患を処置し、そして治療し得なければならない。ＲＮＡアーゼＰによる切断のための標的ＲＮＡに対してＥＧＳを用いて処置され得る疾患の特定の例は、ＨＴＬｖ −１のみならず、キメラＲＮＡを生成する染色体転座から得られる種々のレトロウィルス誘導白血病をも包含し、ここで、キメラＲＮＡは、これらの細胞に特有なタンパク質を生成し、そして成長刺激剤または癌遺伝子として作用し得る。処置され得る形質転換された組織の他の型は、公知の配列の同定された癌遺伝子を運ぶ全ての癌細胞を包含する。

局所投与および直接投与のための他のＥＧＳ組成物ＥＧＳはまた、適切な薬学的キャリア中で局所的または全身に投与され得る。Ｅ、　Ｗ、　Ｍａｒｔｉｎ編Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ第１５版（Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７５）の教示は本明細書中に参考として援用されており、これは典型的なキャリアおよび調製方法を開示している。ＥＧＳはまた、食作用細胞に対して標的化するために、適切な生体適合性マイクロカプセル中またはリポソーム中にカプセル化され得る。このような／ステムは、当業者に公知である。

治療上、オリゴリボヌクレオチドは、標的化ＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的な量のＥＧＳと、薬学的に受容可能なキャリアとからなる薬学的組成物として投与される。単一でまたは組み合わせて使用される薬学的キャリアの典型的な例は、１つ以上の固体、半固体、液体希釈物、賦形剤、および処方用アジュバントを包含し、これらは非毒性であり、不活性であり、そして薬学的に受容可能である。このような薬学的組成物は、好ましくは投与量単位形態、すなわち、所望の治療応答を生み出すように計算された、投与量の１画分または複数量と一致する薬剤の前もって決定された量を含有する物理的に考慮された単位であり、慣例的には、錠剤、砥削、カプセル剤、散剤、水性または油性懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、および水性液剤として調製される。オリゴヌクレオチドは、意図した標的部位に到達する前に、オリゴヌクレオチドが分解されるのを防止する形態で送達されることが不可欠である。

送達のための好ましい手段の例は、生体分解性ポリマーのポリ乳酸およびプルロニクス（Ｉ’１ｕｒｏｎｉｃｓ）などのポリマー性マトリックスである。

好ましい組成物は、例えば単純庖疹ウィルスにより生成されるようなウィルス性病変へ適用するための局所用組成物である。これらは一般的に１μＭと１ｍＭとの間のオリゴヌクレオチド／単位の担体を含有し、または処置されるべき細胞の部位においてｌμＭとＩｎ＋Ｍとの間の濃度となる。好ましくはないが、経口用組成物は、錠剤またはカプセル剤の形態であり、そして結合剤（例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニルピロリドン）、賦形剤（例えば、ラクトース、砂糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、またはグリシン）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルり、ポリエチレングリコールまたはンリカ）、崩壊剤（例えば、デンプン）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの通常の賦形剤を含有し得る。ＥＧＳの溶液または懸１ＩｊＪ液を、従来の薬学的賦形剤とともに非経口用組成物（静脈注射のための水性溶液または筋肉注射のための油性懸濁液など）に用いる。

臨床での適用のためには、受容者の年齢、体重、および状態、投与層および病気の性質および重症度の十分な専門家による判断および考慮を利用して、それぞれの場合における投与量および投薬養生法は、注意深く調整されるべきである。

本発明は、つまり真核ＲＮＡアーゼＰによる切断のためのＲＮＡ配列標的化二次ＲＮＡ配列は、以下の制限のない実施例を参考としてさらに理解され得る。

Ｘ施ｆｌｌ　ｌ：　ＥＧＳ存在下でのヒ）　ＲＮＡアーゼＰによるｔＲＮＡ前駆体フラグメントの切断。

ヒトＲＮＡアーゼＰによる切断のためのＲＮＡを標的とし得るＥＧＳを、５°前駆体配列およびｔＲＮＡの５゛末端から最初の１４ヌクレオチドを含む、小さいＲＮＡフラグメントから調製した（図３ａに示した配列番号２）。図３ａおよびｂに示すように、ｔＲＮＡｒｙ゛配列の残りの３°近位配列を含むＲＮＡの他の部分が、標的物にハイブリダイズするとき、大腸菌ｔＲＮＡ”’前駆体のリーダー配列を、正確に切断し得、このことは、ＥＧＳ　ＲＮＡの存在下または非存在下における、ヒトＲＮＡアーゼＰによる基質の切断を示す。

ヒトＲＮＡアーゼＰを、Ｂａｒｔｋｉｅｖｉｃｚら、（１９８９）　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　３：４８８−４９９に従ってＨｅＬａ細胞から部分精製した。

基質を、［α−”ＰＩＧＴＰの存在下でインビトロでの転写により調製した。［ α−”ＰＩＧＴＰで標識したｐＡｖａ　Ｉ　ＲＮＡ（２１１ｎｔ）を、非標識ＥＧＳ　ＲＮＡと混合し、そして混合物を５０ｍＭ　トリス−ＣＩ　（ｐＨ７゜５）、ＩＱＯｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、および１０ｍＭ　ＭｇＣ１ａ中で酵素と３０分間、３７°Ｃてインキュベートした。標識したｐＡｖａ　Ｉ　ＲＮＡ単独もまた、酵素と、または酵素なしでインキュベートした。ゲル電気泳動による分析は、ＥＧＳプラス酵素によりＲＮＡの切断が生じたことを示す。

３°フラグメントは、外部ガイド配列（ＥＧＳ）である。リーダーおよびそれらの配列の長さ、および成熟ドメインの配列が、異なる前駆体ｔＲＮＡの中に保存されていないので、ヒ）　ＲＮＡアー七Ｐの切断に関する主要な決定要因は、種々のｔＲＮＡの保存さ的な概念は、ｔＲＮＡの部分の構造（すなわち、Ｄまたはアミ／ア／ルステムにおいて可能な塩基対の数の変化、成熟ｔＲＮＡ配列の８位および９位での変化、およびシトシンからウラシルへの５７位での変化）を正確に模倣していない他のいくつかのＥＧＳか、相補的ＲＮＡを標的化しなかったという事実により支持される。しかし、アンチコドンステムおよびループ、または可変ステムおよびループを欠＜　ＥＧＳにより、効果的な切断を生じ、このことは、ＥＧＳのこれらの部分が別々に酵素による標的複合体の認識に不可欠ではなかったことを示す。

おそらく、前駆体ｔＲＮＡ配列の部分よりはむしろｍＲＮＡが、推定上の標的複合体の二本鎖ステム領域へ杷り込まれ、そして得られたハイブリッドがヒトＲＮＡアーゼＰ活性に基質が必要とする構造上の特徴を含むとき、ｍＲＮＡはヒトＲＮＡアーゼＰにより切断されなければならない。

実施例２：外部ガイド配列を用いるヒトＲＮＡアーゼＰによるインビトロでのＣＡＴ　ｍＲＮＡの特異的切断。

クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の遺伝子に対するｍＲＮＡを、プラスミド上で簡単に操作し得、そして酵素活性を、組織培養細胞中で容易に発現させて、標的基質として用いた。以下に証明するように、ＥＧＳは、ヒトＲＮＡアーゼＰによる特異的切断のためにＣＡＴ　ｍＲＮＡを標的とし得る。

図４は、ＥＧＳ　（配列番号３）が、ＣＡＴ　ｍＲＮＡの６７位〜７９位のヌクレオチドと塩基対合し得、そしてヒトＲＮＡアーゼＰを６７位のヌクレオチドでｍＲＮＡを切断させ得る複合体を示す（転写開始コドンの最初のヌクレオチドは、ｌと番号付ける）。ＥＧＳＣＡＴ構築物は、大腸菌ｔＲＮＡ”’遺伝子に由来し、これは、５°末端から最初の１８ヌクレオチドが欠失し、そしてＤループおよび受容ループ上の配列を変えて、ＣＡＴ　ｍＲＮＡと塩基対合している。Ｔ７プロモーターと上流方向で融合したＥＧＳＣＡＴを、ｐＵｃ１９ベクターに入れテクローニンクシタ。ＥＧＳｃＡＴＲＮＡヲ、Ｔ７　ＲＮＡ；ｔ！　’Ｊ　ｌ　ラ−セ（！：インビトロにおいて転写して調製した。ＣＡＴ遺伝子（ｐＣＡＴ” “、Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｂａｍ　ＨＩ　ＤＮＡフラグメントを、ｐＧｅｍ−２でクローニングした。ＣＡＴ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで直鎖状にし、そして［３２Ｐ−α］　ＧＴＰの存在下で、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。

！！したＣＡＴ　ｍＲＮＡを、変性またはアニーリングの特別な処理をせずに、種々の量のＥＧＳｃＡＴ分子と遺伝子と混合し、そしてインビトロにおけるＲＮＡアーゼＰによる切断され易さを、ＨｅＬａ細胞から部分精製したヒトＲＮＡアーゼＰで試験した。

ＣＡＴ遺伝子（ｐＣＡＴ”、Ｐｒｏｍ＋ｅｇａ）の旧ｎｄ　［Ｉ［−Ｂａｍ旧フラグメントを、ｐＧｅｍ−２でクローニングした。プラスミドをＥｃｏ旧で切断し、そして［α−”ＰＩＧＴＰの存在下で、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロでの転写により、２６０ヌクレオチド長の転写物を得た。大腸菌ｔＲＮＡ”’遺伝子をテンプレートとして用い１、ｌ−１７ゴヌクレオチド　５　’ 　−ＧＣＣＡＭＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＴＣ−３’　および５　’　−ＧＣＧＣｇｇｔａｃｃＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡ？ＧＡＡＧＧ−３’　と共に、ポリメラーゼチェーンリアクションによりＥＧＳ配列を合成した。

ここで、オリゴヌクレオチド配列中の太文字は、ＣＡＴ　ｍＲＮＡと塩基対を作るのに必要な塩基を示し、下線を引いた文字は、転写終結シグナルに相捕的な配列を示し、そして小文字は、エキストラリンカ−配列を示す（二番目のオリゴヌクレオチドの５゛末端のＧＣＧＣは、エキストラヌクレオチドである）。ＰＣＲフラグメントを、Ｈ４ｎｄ　ＩＩＩて消化し、そしてＥＧＳ配列がら上流のＴ７プロモーターと共にｐＵｃ１９中にクローニングした。プラスミドをＤｒａ　＋で直鎖状にした後、ＥＧＳｃＡ’　ＲＮＡをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼで転写した。非標識ＣＡＴ　ｍＲＮＡフラグメントと［α−”Ｐ］ＧＴＰで標識したＣＡＴ　ｍＲＮＡフラグメントとの混合物（全部で０．２μｍｏｌ）を、４　ｐｉｏＬ　１　ｐｍｏｌ、１　ｐｍｏｌ、０．４μｍｏＬおよび０．２μｍｏｌの量のＥＧＳＣＡＴＲＮＡと混合した。それぞれの混合物を、５０Ｍｌ１１トリス−ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮＨ，ＣＩ、および２５ｍＭ　ＭｇＣ１＊中で酵素ととともに１時間、３７°Ｃでインキュベートした。過剰量のＥＤＴＡと共に等量の染料溶液を添加することにより、反応を停止した。

次いて、５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルにのせた。

ＣＡＴ　ｍＲＮＡ単独を、酵素なしで、または酵素とともにインキュベートし、そしてゲルにのせた。

ヒトＲＮＡアーゼＰによる、ＥＧＳｃＡＴに導かれる切断の正確な部位を決定するプライマー伸長分析を、以下のように行った。

ＣＡＴ　ｍＲＮＡのヌクレオチド１２９位〜１０７位に相捕的なオリゴデオキシリボヌクレオチド　５１　ＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧ　３１を用いて、逆転写反応を非切断ＣＡＴ　ｍＲＮＡおよび切断ＣＡＴ　ｍＲＮＡで行った。反応は、１００ｍＭ　トリス、ＨＣｌ（ｐＨ８，３）、１０ｍＭ　ＫＣＩ、６ｍＭ　ＭｇＣＩｘ、１０ｍＭ　Ｃ７丁、および２ユニットＡＭＶ逆転写酵素中で、４６°Ｃで２時間インキュベートした。標識したＧ、Ａ、Ｕ、Ｃを、ＣＡＴ　ｍＲＮＡテンプレートと一致するＤＮＡ配列の参照分析物として使用した。

ＣＡＴ　ｍＲＮＡの切断の正確な部位を、ＲＮＡの１２９〜１０７位のヌクレオチドに相捕的なオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを用いる、プライマー伸長分析により決定し、これは、予想通りに・、６６位のヌクレオチドと６７位のヌクレオチドとの開で切断を生じることを示す。

ＥＧＳｃＡ”　ＲＮＡがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ｍＲＮＡの切断を導いた結果を、ゲル電気泳動により分析した。ＥＧＳＣＡ”分子の存在下で、ＣＡＴ　ｍＲＮＡを切断し、予想通りのサイズの２つの生成物を得た。反応の生成物を分析すると、ＲＮＡアーゼＰにより生じた正常な末端と同様に、末端基が５゛ホスホリルおよび３°ヒドロキシル末端を含有することを示した。この結果は、ＣＡＴ　ｍＲＮＡの特異的な切断がＥＧＳが導くＲＮＡアーゼＰ加水分解反応に起因することを、決定的に示す。

ｍＲＮＡに対するＥＧＳｅＡ’　ＲＮＡを５倍モル過剰まで上げると、切断効率は添加したＥａｓｅＡＴの量に比例する。しかし、さらに１０倍以上過剰なＥＧＳｃＡＴ分子は、切断効率の低下の原因となった。

酵素に対してｍＲＮＡ−ＥＧＳ複合体と競合することにより、Ｅ　ｃ　ｓ　ＣＡ　Ｔのみが酵素活性を阻害するというのが、このことに対する説明の１つである。反応を３７°Ｃで３時間以上直線様式で行う。

標的複合体におけるオリゴヌクレオチドの変性および再アニーリングは、切断効率を改善しなかった。反応は、最適濃度の２５ｍＭのＭｇ２＋の絶対必要条件を有するが、これに比べて、基質としてｔＲＮＡ”’前駆体を用いる場合は、２〜１０ｍＭの最適Ｍ　ｇ　２３１度を有する。

実施例３　：　ＥＧＳｅＡ”によるミドリザルｃｖ−ｉ細胞中のＣＡＴ活性発現の阻害。

ＥＧＳがインビボにおいて機能し得るかどうかを試験するために、Ｅ　ｃ　ｓ　ＣＡ　Ｔ配列をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”ベクターのマウスＵ６５ｎＲＮＡ遺伝子プロモーターの下流に挿入した。ＥｃｓｅＡ？配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写し得、そして転写物をＴ、クラスター、次いで、５１００抽出物または生きている細胞のどちらかの中のＥＧＳ配列において終結し得る。ミドリザル線維芽細胞ＣＭ−１を、ｐＣＡＴおよびｐＥＧＳＣＡＴプラスミドと共トランスフェクトした。ｐＣＡＴおよびｐＥ　ｃ　ｓ　ＣＡ　Ｔとのトランスフェクションの後、細胞を回収し、モしてＣＡＴ活性をアッセイした。

ＣＶ−１細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地中に保持した。トランスフェクションの１日前に、細胞を１・１０に分け、そして６０ｍｍのベトリブレートにまいた。

トランスフェクションの２時間前に、細胞を１０％のウシ胎児血清を含有する４、　５ｍｌの新鮮な培地で培養した。２．５μｇのｐＣＡＴ　ＤＮＡ、および１〜６．２５μｇの範囲の種々の量のｐＥＧＳＣＡ”　ＤＮＡを用いるリン酸カルシウム沈降法を用いて、トランスフェクションヲ行った。トランスフェクションの２４時間後に、細胞ヲ回収し、そして細胞抽出物をＣＡＴ活性についてアッセイした。

ＥＧＳＣＡＴ構築物と共トランスフェクトした細胞からの抽出物は、クロラムフェニコールからそのアシル化形への変換が明らかに減少した。阻害の程度を、ＴＬＣプレートから削り取ったスポットを数えることにより、定量的に測定した。

ＥＧＳＣＡＴの共トランスフェクションは、ＥＧＳＣＡＴの共トランスフェクションを行わなかったコントロールに比べて、５０％以上阻害した。

ｐＣＡＴに対する。Ｅａｓ　ＣＡ　Ｔのより高い比を導入した場合、ＣＡＴ発現を阻害する能力に実質的な損失があった。組織培養におけるヒト細胞で行った同様の実験でもまた、約７０％のＣＡＴ活性が得られた。

実施例４　：　Ｉ？ＮＡアーゼＰによる標的ＲＮＡの分解を増強する改変ＥＧＳの調製。

図５および６に示すように、ＥＧＳの２つのクラスを設計した。

第１のクラスは、実施例１で示唆し、そして実施例２および３に記載したように、ＥＧＳの大きなセグメントの欠失を包含する。図５ｂに示すように（配列番号４）、アンチコドンループおよびステムを欠失し得、そしてＥＧＳがＲＮＡアーゼＰによる標的ＲＮＡの切断をやはり促進することを見出した。あるいは、可変ループおよび可変ループの一部を、ＥＧＳから欠失し得、そしてＥＧＳは親ＥＧＳ分子より高い効率で切断を促進する。最も効果的なＥＧＳは、アンチコドンステムおよびループを欠失したＥＧＳであった。このＥＧＳは、親ＥＧＳよりも１０倍高い速度で標的ｍＲＮＡ（ＣＡＴ　ｍＲＮＡ）のヒトＲＮＡアーゼＰによる切断を促進した。しかし、これらの欠失を組み合わせても、効果的なＥＧＳを作り得ない。

ＥＧＳの第２のクラスは、Ｔループおよび可変ループの等個物、およびＥＧＳのｔＲＮＡ様セグメントのアンチコドンステムの両方の変化を有する。３つのＥＧＳを、図６ａ（配列番号５）、６ｂ（配列番号６）、および６ｃ（配列番号７）にそれぞれ示す。図６０は最も効果的なＥＧＳを示し、それは、親ＥＧＳより約５０〜１００倍高い速度の好適な複合体において、ヒ）　ＲＮＡアーゼＰによる標的ＲＮＡ（ＣＡＴ　ｗ＋ＲＮＡ）の切断を導く。

これらの結果を、標的ｍＲＮＡ中の特定の部位での切断の相対的な速度に適用する。全ての特定部位での切断の絶対速度は、やはり特定部位へのＥＧＳの接近に依存する。

実施例５：ランダム化ヌクレオチドを用いるＲＮＡの調製二本鎖ＤＮＡテンプレートを２つの重複合成オリゴヌクレオチドのアニーリングおよび酵素的伸長により作製した：（配列番号８）およびＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＮＮ’ＮＮＧＡＡＣＣＴｒＣＮＮＮＮＮＧＣＡＧＡＴｒＴＡＧＡ虹＝四に級＝ｚｉ囚（配列番号９）、ここで相補配列に下線を付し、ランダム化ヌクレオチドＮを等モル量の４つのヌクレオチドの取り込みに子をつくり、これはＣＡＴ　ｍＲＮＡおよび大腸菌由来のｔＲＮＡ”’由来の配列を含む。Ｔ７バクテリオフアージＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターは、配列番号８に含まれる。伸長はＡＭＶ逆転写酵素を用いて４６°Ｃで２時間行った。変異体ＲＮＡのプールを、３７ ℃で、２０μＣｉ［”−αＩＧＴＰを含む４０ｍＭ　トリス、ＣＬ　ｐＨ７，９，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭスペルミジン、１ｍＭＮＴＰ中でＴ７ポリメラーゼを用いる転写により調製した。

選択手順、　ＲＮＡ基質を、選択手順の最初の３ラウンドにおいて３０ユニツト（１ユニツトは３７℃で３０分にｌｐｍｏｌのｔＲＮＡ前駆体を消化するヒ）　ＲＮＡアーゼＰの量として定義される）で２時間消化した。選択の次のラウンドについて、酵素の量を減らし、そしてインキュベーション時間を減らして、２０％未満の基質を切断した。切断生成物を８％のポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上の電気泳動により未切断基質から分離した。精製ＲＮＡ生成物を逆転写し、そして配列番号８およびＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧ　（配列番号１０）をプライマーとしてＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＲＮＡ　ＰＣＲキットを用いてＰＣＲで増幅した。選択増幅の各ラウンド後に、ランダム変異を各ヌクレオチド位置あたり０．１％のエラー率でＰＣＲを行うことにより導入した。ＰＣＲ生成の二本鎖ＤＮＡは、Ｔ７プロモーターおよびリーディング配列を配列番号８のプライマーから再獲得し、選択の次のラウンドについてＲＮＡの転写に用いた。

選択したＲＮＡおよびそれら由来のＥＧＳ　ＲＮＡの特徴付け。選択の８サイクル後、得られた二本鎖ＤＮＡをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。１８のプラスミドＤＮＡを５ｅｑｕｅｎａｓｅ２．０　（υ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を用いて配列決定した。

ＣＡＴ　ｍＲＮＡの標的化に上記で選択された個々の変異体由来のＥＧＳの能力を試験するために、各キメラｔＲＮＡのＥＧＳセグメントに一致する配列を、配列番号８およびＴ７ポリメラーゼのプロモーター配列を含むＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣ（配列番号１１）のプライマーを用いてＰＣＨにより増幅し、ＲＮＡをＴ　７　ＲＮＡポリメラーゼで転写した。ＥＧＳに導かれたＣＡＴ　ｍＲＮＡ切断を、０．２５ｐｍ。

１　（１０００ｃｐｍ）の基質ＲＮＡ、および、ｌまたは５ｐｍｏｌのＥＧＳ　ＲＮＡを倉む１０μｌの５０ｍＭ　トリス、ＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ、１００ｍＭ　ＮＨ、ＣＩ中でアッセイした。反応混合物を３７°Ｃで３０分間ｌＯユニットのＨｅＬａ細胞由来のＲＮアーゼＰとインキュベートし、次いで５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル中で電気泳動した。

ゲルは、新たに選択されたＥＧＳが反応混合物中に含まれたレーンに基質ＲＮＡの切断が予測される位置に移動するＲＮＡ種を示す。

本方法は、いかなるＲＮＡアーゼＰについても、さらに有効でさえあり得る本明細書に記載の他のＥＧＳ以外の配列を有するＥＧＳについて選択するために、親ＥＧＳ配列の他の部分をランダム化することにより有効なＥＧＳを生成するのに有用であり得る。

実施例におけるデータの総括。

メツセンジャーＲＮＡはＲＮＡアーゼＰの天然の基質ではないが、ｍＲＮＡ−ＥＧＳの複合体はＲＮＡアーゼＰによるＲＮＡ切断の特異性の基礎を形成する二次構造または三次構造におけるｔＲＮＡの前駆体を有する共通の特徴を有する。ＲＮＡ分子に関連のある二次構造を与えると、標的部位の選択は、基質がＥＧＳ結合に接近し得るかどうかを決定する重大な役割を果たし得る。いくつかの標的領域は、ｍＲＮＡがＥＧＳを結合するのを妨げる高次構造に関係し衛る。高次構造はＥＧＳへの潜在的標的中のある配列の接近を妨げ得るため、いくつかの一般の方法、例えば一本鎖領域に特異的なヌクレアーゼへの感受性および翻訳装置の成分への接近を必要とする領域の配列の分析が、ｍＲＮＡ中の適切な標的部位をスキャンするのに必要であり得る。

本発明で確立された方法は、ヒトＲＮＡアーゼＰがインビボで適切に設計された適切な外部ガイド配列（ＥＧＳ）を用いていかなる標的ＲＮＡをも切断することに関連し得る。本方法は、特異的なＲＮＡの機能を遮断する強力な新規のツールを提供し得る。理論的には、ＲＮＡアーゼＰは、標的化ＲＮＡを不可逆的に破壊し、そしてＲＮＡアーゼＰは何回もリサイクルし得るためＥＧＳと同様に触媒作用的に作用するので、あるＲＮＡのＲＮＡアーゼＰによる特異的分解はアンチセンスＲＮＡ技術よりさらに強力であるべきである（Ｌｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８９．３１８５−３１８９（１９９２）ならびにＰｅｒｒｅａｕｌｔおよびＡｌｔｍａｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２２６．３９９−４０９（１９９２）。

真核ＲＮＡアーゼＰによる切断のためにあらゆるＲＮＡを標的にする方法および組成物の改変および変更は、上記の詳細な説明から当業者に明らかである。そのような改変および変更は添付の請求の範囲の範囲内であることを意図する。

ＬＩ　ＣＣ１１Ｆ／６２ＱＵ」ＦＩＧ、３ｂ補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims

【特許請求の範囲】

１．真核ＲＮＡアーゼＰによる切断のためのＲＮＡ基質を標的にする組成物であって、切断標的配列、および該基質に相補的なヌクレオチド配列を含む組換え外部ガイド配列分子を含み、ここで該外部ガイド配列が、該基質に塩基対合して、前駆体ｔＲＮＡに類似する二次構造を有するハイブリッド構造を、該ＲＮＡアーゼＰによる該基質の塩基対合領域の５′末端のヌクレオチドでの切断を促進する条件下で形成する、組成物。
２．前記切断標的配列が、Ｄループおよびステム、Ｔステムおよびループ、アミノアシルステム、および、アンチコドンステムおよびループまたは可変ループのいずれかを含む、請求項１に記載の組成物。
３．前記相補的配列が、少なくとも１１ヌクレオチドの長さであり、そして前記標的配列と塩基対合する７個のヌクレオチド、その次に該標的配列と塩基対合しない２個のヌクレオチド、その次に該標的配列と塩基対合する４個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
４．前記ＲＮＡアーゼＰが、酵母および哺乳類のＲＮＡアーゼＰからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
５．前記外部ガイド配列のＤステムおよびアミノアシルステムが、標的化ＲＮＡの配列と塩基対合し、そして２個の非対合ヌクレオチドにより分断される、請求項１に記載の組成物。
６．前記外部ガイド配列が、アンチコドンステムおよびループ、またはそれらの部分を含む、請求項２に記載の組成物。
７．前記外部ガイド配列が、可変ステムおよびループ、またはそれらの部分を含む、請求項２に記載の組成物。
８．前記外部ガイド配列が、前記丁ループ、アンチコドンステムおよびループ、または可変ステムおよびループからなる群から選択される領域において改変される、請求項１に記載の組成物。
９．前記ＲＮＡアーゼＰが、該ＲＭアーゼＰによる配列の切断により、ＲＮＡの不活性化が生じるような配列に対して標的化され、そして該配列が、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ウイルス遺伝子、および細胞性ｍＲＮＡからなる群から選択され、ここで該細胞性ｍＲＮＡが、酵素、ホルモン、補因子、抗体、および成長因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の組成物。
１０．局所投与、皮下投与、非経口投与、および腸内投与に適切なキャリアからなる群から選択される薬学的キャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
１１．切断に対して標的にされるＲＮＡを含む細胞中に前記外部ガイド配列を導入するためのベクターをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
１２．前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１１に記載の組成物。
１３．特異的にＲＮＡを切断する方法であって、ＲＮＡアーゼＰと組み合わせて、切断標的配列、および前記基質に相補的なヌクレオチド配列を含む外部ガイド配列分子を提供する工程を包含し、ここで該外部ガイド配列が、該基質に塩基対合して、前駆体ｔＲＮＡに類似する二次構造を有するハイブリッド構造を、該ＲＮＡアーゼＰによる該基質の塩基対合領域の５′末端のヌクレオチドでの切断を促進する条件下で形成する、方法。
１４．前記切断標的配列が、Ｄループおよびステム、Ｔステムおよびループ、アミノアシルステム、および、アンチコドンステムおよびループまたは可変ループのいずれかを含む、請求項１３に記載の方法。
１５．前記相補的配列が、少なくとも１１ヌクレオチドの長さであり、そして前記標的配列と塩基対合する７個のヌクレオチド、その次に該標的配列と塩基対合しない２個のヌクレオチド、その次に該標的配列と塩基対合する４個のヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
１６．前記外部ガイド配列が、アンチコドンステムおよびループ、またはそれらの部分を含む、請求項１４に記載の方法。
１７．前記外部ガイド配列が、可変ステムおよびループ、またはそれらの部分を含む、請求項１４に記載の方法。
１８．前記外部ガイド配列が、前記丁ループ、アンチコドンステムおよびループ、または可変ステムおよびループにおいて改変される、請求項１４に記載の方法。
１９．前記ＲＮＡアーゼＰが、酵母および哺乳類細胞のＲＮＡアーゼＰからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
２０．前記標的化ＲＮＡが細胞内にあり、そして前記ＲＮＡアーゼＰが該細胞に対して内因性である、請求項１．３に記載の方法。
２１．前記外部ガイド配列を有するＲＮＡアーゼＰの機能的等価物を提供する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
２２．前記ＲＮＡアーゼＰが、該ＲＭアーゼＰによる配列の切断により、ＲＮＡの不活性化が生じるような配列に標的化され、そして該配列が、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ウイルス遺伝子、および細胞性ｍＲＮＡからなる群から選択され、ここで該細胞性ｍＲＮＡが、酵素、ホルモン、補因子、抗体、および成長因子からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１３に記載の方法。
２３．前記外部ガイド配列を、局所投与、皮下投与、非経口投与、および腸内投与に適切なキャリアからなる群から選択される薬学的キャリアと組み合わせて提供する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
２４．前記外部ガイド配列を、切断に対して標的化されるＲＮＡを含む細胞中に該外部ガイド配列を導入するためのベクターと組み合わせて提供する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
２５．ＲＮＡアーゼＰによる標的ＲＮＡの切断のための外部ガイド配列の集団を、開始外部ガイド配列よりも効率よく選択する方法であって、以下の工程を包含する方法：該開始外部ガイド配列の断片をランダム化する工程；該ランダム化配列の下位集団を該ＲＮＡアーゼＰにより効率的に切断されるそれらの能力に対して選択する工程；該開始外部ガイド配列より効率的に切断するそれらの配列を増幅する工程；および該選択工程および該増幅工程を繰り返す工程。