JPH07507691A - 脱硫用生物触媒をコードする組換えｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化石燃料に含まれる硫黄汚染物質は、精留にコストかががることがあるという精 製プロセスにおける問題を引き起こすことがある。化石燃料に含まれる硫黄汚染 物質は以下の一般的りラス分けのいずれかに分類される。すなわち、ミネラル化 硫黄（たとえば黄鉄鉱硫黄などの無機硫黄）と有機硫黄（炭素分子と共有結合し た硫黄で、有機硫黄化合物という）である。硫黄が含まれていると、パイプライ ンやポンプ、精製装置を腐食させたり、耐用年数以前に燃焼エンジンが使用不能 になったりすることがある。硫黄は、化石燃料の精製に使われる多くの触媒にも 悪影響を及ぼす。さらに、二酸化硫黄なとの硫黄燃焼生成物が大気中に排出され ると、酸性雨と呼ばれる酸降水が起きる。酸性雨は、水生生物や森林の生懸系に 対して長期的な悪影響を及はすだけでなく、燃焼施設の下流域にある農耕地にも 同様の影響を及はす。モンティセロとフィンナーティ−（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ 、　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｗ、Ｒ，Ｆｉｎｎｅｒｔｙ）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３９：３７１−３８９　（１９８５）。１９６４年大気汚 染防止法（Ｃ１ｅａｎ　Ａｉｒ　Ａｃｔ　ｏｆ　１９６４　）などの規制は、実 質的にすへての石炭系および石油系燃料から燃焼前または燃焼後に硫黄を除去す ることを要求する。クリーンに燃焼する低硫黄石油埋ＲＭの減少にともないグレ ードの低い高硫黄含有率の化石燃料の利用の必要性が高まっていることと、規制 当局による硫黄排出量削減の要求が強くなっていることがら、このような法律を 遵守することがますます難しくなっている［モンティセロとキルベイン（Ｍｏｎ ｔｉｃｅｌｌｏ、　Ｄ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｊ、　Ｋ１１ｂａｎｅ　）　、　” Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｃｏｎ５ｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｄｅｓｕｌ ｆｕｒｉｚａｊｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ”、　ＩＧＴ’ｓ　３ｄ　Ｉ ｎｔｌ、　Ｓｙｍｐ、　Ｏｎ　Ｇａｓ、旧１、　Ｃｏａｌ、　ａｎｄ　Ｅｎｖ、 　Ｂｉｏｔｅｃｈ、、　（Ｄｅｃ、　３−５．１９９０）　Ｎｅｗ　０ｒｌｅａ ｎｓ、ＬＡ］　。

石油なとの液体化石燃料を燃焼させる前に有機硫黄を除去する技術として現在使 われているものの一つに、水素化脱硫（ＨＤＳ）がある。ＨＤＳは、硫黄汚染物 質の総量に対する有機硫黄化合物が顕著な比率、たとえば主要な割合、を占める 化石燃料の脱硫に適している。したがって、ＨＤＳは原油または瀝青、石油蒸留 画分または精製中間体、自動車用液体燃料などを処理するのに有用である。ＨＤ Ｓについては、シャイら（Ｓｈｉｈ、　Ｓ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　）によってさ らに具体的に記述されている。”Ｄｅｅｐ　Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｄｊｓｔ目１ａｔｅ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”、Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ 、２６４Ｂ　ＡＩＣｈＥ　Ｃｈｉｃａｇｏ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ。

ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１２．１９９０　（請求に応じて、Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　１ｎｓｊｉ！ｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｓから全文の入手可能）：ゲイリーとハ’７トウエルク（Ｇａｒｙ、　Ｊ、 ｌ（、ａｎｄ　Ｇ、Ｅ、　Ｈａｎｄｗｅｒｋ）、　（１９７５）　Ｐｅｊｒｏｌ ｅｕｍ　Ｒｅｆｉｎｉｎｇ　：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉ ｃｓ。

Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、１１４− １２０　；ンユバイ）　（Ｓｐｅｉｇｈｔ、Ｊ、Ｇ、）　、（１９８１）　Ｔｈ ｅ　Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅａｖｙ　０ｉｌｓ　ａｎｄ　 Ｒｅ５ｉｄｕｅ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　ｐｐ、　１１９−１２７゜ＨＤＳの基礎は、金属触媒の存在下で有機硫黄 を還元的に硫化水素（Ｈ，Ｓ）に変換するものである。ＨＤＳは高温高圧条件下 で実施される。ＨＤＳの結果生成する硫化水素は腐食性のガス状物質であり、公 知技術によって化石燃料から分離される。硫化水素の高レベルやレベルの持続が あると、ＨＤＳ触媒に悪影響を及ぼしく不活性化）、硫黄含有率の多い液体化石 燃料の脱硫を複雑化する。

石炭系と石油系のいずれの化石燃料においても、有機硫黄は多くの化合物として 存在するが、脱硫が容易であるという点て不安定化合物と呼ばれるものもあれば 、たとえばＨＤＳなと従来の脱硫処理に容易に反応しないという点て抵抗性化合 物と呼ばれるものもある。シャイら（Ｓｈｉｈ、　Ｓ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ。

）。そこで、ＨＤＳ処理済みの化石燃料ですら、煙道スクラバーなとの装置を用 いて燃焼後に脱硫しなければならないことが多い。煙道スクラバーは、とくに小 規模の燃焼施設にとっては設置費が高く、維持が困難である。さらに、煙道スク ラバーをＨＤＳと組み合わせて用いるのは、上記硫黄関連問題のなかでも、機械 の腐食や触媒の不活性化などの他の硫黄関連問題対策というよりも環境への酸性 降水の克服を目的とするものである。

多くの研究者らはこれらをはじめとするＨＤＳの問題点に鑑み、微生物脱硫法（ ＭＤ　Ｓ　）の開発を目脂して研究してきた。一般に、Ｍ　Ｄ　Ｓは適当な細菌 の代謝プロセスを化石燃料の脱硫に利用することと定義される。したがって、Ｍ ＤＳは穏やかな条件（たとえば環境条件または生理的条件）下で行なわれるのが 普通で、ＨＤＳにめられるような高温や高圧は不要である。また、生物学的脱硫 剤は適当な条件下で自ら更新または再生しつるという点も有利であると一般に考 えられる。微生物脱硫法については、モンティセロとフィンナーティ−（Ｍｏｎ ｔｉｃｅｌｌｏ　ａｎｄ　Ｆｉｎｎｅｒｔｙ　）　（＋９８５）、３９　ＡＮＮ 、ＲＥＶ、　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ、　３７１−３８９、およびパードラら（Ｂｈ ａｄｒａ　ｅｔ　ａｌ。

）　（１９８７）、　５　ＢＩＯＴＥＣ）１．　ＡＤＶ、　＋−２７＋＝よッテ 検討されテいル。

また、ハートデガンら（Ｈａｒｔｄｅｇａｎ、ｅｔ　ａｌ、）　（１９８４）、 　５　Ｃｔ（ＥＭ、　ＥＮＧ、　ＰＲＯＧＲＥＳＳ　６３−６７　、およびキル ベイン（Ｋｉｌｂａｎｅ）（１９８９’）、　７　ＴＲＥＮＤＳ　ＢＩＯＴＥＣ ）ＩＮＯＬ、　（Ｎｏ、　４）　９７−１０１　も、当該分野における開発状況 について述べている。

数名の研究者らは、天然細菌に突然変異を誘発することでノベノゾチオフエン（ ＤＢＴ）を分解即ち異化する能力を獲得させた変異株の作成を報告している。ハ ートデガンら（Ｈａｒｔｄｅｇａｎ、　Ｆ、Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、）　、　（Ｍａ ｙ　１９８４）　Ｃｈｅｍ、　Ｅｎｇ、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ６３−６７゜ＤＢＴ は、ＨＤＳによる硫黄除去が最も困難な化石燃料に含まれる有機硫黄分子種の代 表的なものである。既報の変異微生物のほとんどのものは、炭素−炭素結合を切 断することによって非特異的にＤＢＴに作用することで、小型の有機分解生成物 として硫黄を遊離する。この微生物作用の一つの結果として、上記処理を受けた 化石燃料の燃料価が低下する。しかしながら、イスビスターとドイル（ｌ５ｂｉ ｓｔｅｒ　ａｎｄＤｏｙｌｅ）は、ＤＢＴから選択的に硫黄を遊離する能力があ り、それによって処理済み化石燃料の燃料価を維持することができると思われる シュウトモナスの変異株を得たことを報告している（米国特許第４，５６２，１ ５６号）。

最近、キルベイン（Ｋｉｌｂａｎｅ　）は細菌混合培養物に突然変異を誘発する ことて、酸化経路によってＤＢＴから選択的に硫黄を遊離する能力があると思わ れる細菌コンソーシアムをされた。本株は、ブダペスト条約の条項に従い、ＡＴ ＣＣ番号５３９６８としてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎに寄託されており、ＩＧＴＳＢとも呼ばれ、本明細書に記載の 生物触媒活性の由来光である。ＡＴＣＣ番号５３９６８株の微生物は、有機硫黄 分子中の炭素−硫黄結合を選択的かつ酸化的に切断することによって、ＤＢＴを はじめとする化石燃料に含まれていることが知られている有機硫黄種から硫黄を 遊離する。キルベイン（にＮｂａｎｅ　）は、米国特許第５，１０４．８０１号 中で本株の単離と特徴を詳細に記載している。

発明の概要 本発明は、−面では、有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫する生物触媒として単 独でまたは互いに共同して作用する、一種以上の酵素をコードする１ｆｌｉ以上 の遺伝子を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に関する。本発明のＤＮＡ分子は天 然資源から精製・単離され得るし、あるいは、例えばヒト以外の生物のゲノム中 へ組み込まれる組換えＤＮＡ分子の一断片または一部分であることもある。本発 明の遺伝子または遺伝ち、本発明の遺伝子または遺伝子群は、ヒト以外の生物、 例えば、単独でまたは互いに共同して脱硫生物触媒として作用するｌＦ！以上の 酵素を発現する微生物から得ることができる。生物触媒は、以下に一層詳細に述 へるように、有機−硫黄化合物中の炭素−硫黄結合の選択的な酸化的切断である 。本発明は、有機硫黄化合物を含む化石燃料、例えばＤＢＴのようなものの脱硫 に特に有用である。

本発明はさらに、有機硫黄化合物を含む化石燃料を脱硫することができる生物触 媒をコートする外来（組換え、異種の’）ＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、 組換えＤＮＡプラスミドおよびヒト以外の生物に関する。このような生物は、こ 二では宿主生物と呼ぶ。

従って、ここで述べられる発明は、本発明の遺伝子または遺伝子群のリボ核酸（ ＲＮＡ）転写物を含み、同様に本発明の遺伝子または遺伝子群のポリペプチド発 現生成物をも包含する。このようなポリペプチド発現生成物は、必要なときは翻 訳後のプロセッシングおよび／または折り畳みを受けた後、そして必要なときは 補酵素、コファクターもしくは補助反応物と共に、化石燃料中に見いだされる有 機硫黄化合物から硫黄の除去を単独てまたは相互に協調して触媒（促進、指示も しくは容易化）する１種以上の蛋白質生物触媒（酵素）を形成する。これは、上 記化合物中の炭素−硫黄結合の選択的、酸化的切断により達成される。本発明の 生物触媒は、ヒト以外の宿主生物であることができ、それは本発明のＤＮＡを含 みそしてその中にコートされている１種以上の酵素を発現している生菌（例えば 培養されたもの）もしくは非−生菌（例えば加熱死菌）であってもよく、また、 本発明の生物触媒は、上記の生物に由来する無細胞調製物であって、１種以上の 生物触媒酵素を含むものであることもできる。

他の局面では、本発明は、上述のヒト以外の生物であって脱硫生物触媒を発現す るものを用いて化石燃料を脱硫する方法に関する。即ち、本発明は、上記生物か ら単離された１種以上の酵素を含む生物触媒調製物を用いて化石燃料を脱硫する 方法に関する。このプロセスは、ｌ）該生物またはそれから得られた生物触媒調 製物を有機硫黄を含む化石燃料と接触させ混合物を形成させる、そして２）該生 物により発現されもしくは該生物から調製された生物触媒が化石燃料を脱硫する のに十分な時間だけその混合物をインキュベートすることを含む。インキュベー ション後に得られる生物触媒で処理した化石燃料は対応する未処理の化石燃料標 品に比べて有機硫黄化合物のレベルが顕著に減少する。

もう一つ別の局面においては、この発明は本発明の組換えＤＮＡにハイブリダイ ズする核酸プローブに関する。

さらに他の、局面では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡを含み、その中にコー ドされている生物触媒を有利に発現する新たなヒト以外の生物の生産に関する。

この発明の組換えＤＮＡを利用することにより、化石燃料脱硫用の生物触媒の生 産および精製が著しく単純化されかつ容易になる。生物触媒の精製に関する操作 で費用と時間のかかるものが減り、一種以上のヒト以外の生物から、その中に自 然に存在する生物触媒あるいは突然変異誘発により作られる生物触媒を調製する 必要がなくなる。より具体的には、本発明の遺伝子または遺伝子群を高レベルで 発現するヒト以外の宿主生物が創られる。これに加えて、ここに記述される発明 は、脱硫生物触媒をコードする遺伝子の別のヒト以外の生物中における発見を促 進する。この目的は、本発明の核酸プローブを用いて、生物触媒機能が知られて いるまたは存在する可能性のある一種以上の別のヒト以外の生物からＤＮＡライ ブラリーを作成し、これをスクリーニングすることにより達成できる。そのよう な生物中に存在しかつ脱硫生物触媒またはその成分をコードしている遺伝子は、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような既知の技術を用いて大量に複製するこ とができる。ＰＣＲは、目的のＤＮＡを大量に得るために、例えば培養等で、ヒ ト以外の生物を増殖させる必要をなくすので有利である。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の組換えＤＮＡを単離するための段階的操作を図示するフローダ イアグラムである。

ｏｃｈｒｏｕｓ）の復製適格およびクロラムフェニコール耐性を有するベクター ｐＲＦ２９を図示したものである。このベクターはロドコッカス　ファシアンス （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉａｎｓ）由来のものである。

図３は、ロドコッカス　ロドクロウスの複製適格およびクロラムフェニコール耐 性を有するベクター１）ＲＲ−６を図示したものである。

図４は、炭素−硫黄結合を切断することができる生物触媒をコートするＤＮＡプ ラスミドｐＴＯＸＩ−１の制限酵素地図を図示したものである。

図５は、プラスミドｐＴＯＸＩ−１由来のサブクローンｐＭＥＬＶ−１の制限酵 素地図を図示したものである。

図６は、ｐＭＥＬＶ−１およびサブ’）ローンｐＳＭＥＬＶ−ＩＡ、ｐＳＭＥＬ Ｖ−２Ａ、ｐＳＭＥＬＶ−３Ａ、オヨヒｐＳＭＥＬＶ−４Ａ中に挿入断片として 存在するそれらの断片の制限酵素地図を図示したものである。

図７は、Ｄｓｚ十表視表現型因となるポリペプチド発現生産物をコートする３個 のほぼ隣接するオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ；特に、０ＲＦＩ、０ ＲＦ２および０ＲＦ３）のｐＴＯＸＩ−１の配列内における予想位置を図示した ものである。

図８は、ｐＴＯＸＩ−１およびサブクローンｐＥＮＯＫ−１、ｐＥＮＯＫ−２、 ｐＥＮＯＫ−３、ｐＥＮＯＫ−１１、ｐＥＮＯＫ−１３、ｐＥＮＯＫ−１６、ｐ ＥＮＯＫ−１８、ｐＥＮＯＫ−Ｎｓ　１１ｐＥＮＯＫ−１９およびｐＥＮＯＫ− ２０中に挿入断片として存在するその断片の制限酵素地図を図示したものである 。

図９は、ｐＲＲ−１２の制限酵素地図を図示したものである。

図１Ｏは、ベクターｐＫＡＭＩの制限酵素地図を図示したちのである。図中にお いて、ｐＫＡＭＩ中に存在する工学的にクローニングされた部位が詳細に示され ている。

図１１は、ｐＳＢＧ−２の制限酵素地図を図示したものである。ｐＳＢＧ−２の 中では、ｐ”ｒｏｘ　Ｉ　−１からのプロモータを有しないＤｓｚ遺伝子クラス ターの発現がクロラムフェニコール耐性プロモータにより駆動される。

好ましい態様の詳細な説明 石油抽出精製技術においては、「有機硫黄」という用語は、Ｉ（ｌｌｉ１以上の 硫黄原子（ヘテロ原子という）が共有結合した炭化水素骨格を有する有機分子を 指すものと一般に解される。これらの硫黄原子は、たとえば１個以上の炭素−硫 黄結合によって炭化水素骨格に直接結合したり、たとえばスルホニル基（炭素− 酸素−硫黄共有結合を有する）のように、分子の炭化水素骨格に結合した置換基 中に存在したりすることができる。ＩｇＡ以上の硫黄へテロ原子を有する有機分 子種一般を「有機硫黄化合物」と呼ぶことがある。これらの化合物の炭化水素部 分は、脂肪族であってもよいし、芳香族であってもよいし、一部が脂肪族で一部 が芳香族であってもよい。

１個以上の硫黄へテロ原子が芳香族性炭素−硫黄結合によ−て炭化水素骨格中の 隣接炭素原子と結合している環式または縮合多環式有機硫黄化合物は、「硫黄含 有複素環Ｊと呼ばれる。多くのタイプの硫黄含有複素環に存在する硫黄は、硫黄 へテロ原子が存在する５員芳香族環に鑑みて「チオフェン硫黄」と呼ばれる。上 記硫黄含有複素環として最も単純なものかチオフェンてあり、Ｃ，Ｈ，Ｓの組成 を有する。

硫黄含有複素環はＨＤＳなとの従来の脱硫処理に対して安定であることが知られ ている。このため、硫黄含有複素環はＨＤＳ処理に対して抵抗性または耐性であ るといわれる。硫黄含有複素環は、比較的単純な化学構造を持つこともあれば、 比較的複雑な化学構造を持つこともある。複雑な複素環では、多縮合芳香族環が 存在し、そのうちの１個以上のものが複素環てありうる。分子の構造が複雑にな ればなるほど、脱硫か困難になる。シャイら（Ｓｈｉｈ　ｅｔ　ａｌ、　）。す なわち、ジヘンゾチオフエン（ＤＢＴ、Ｃ，ｔＨＩ　Ｓ）なとの複雑な硫黄含有 複素環において抵抗挙動が最も顕著である。

ＤＢＴは、５員チオフエン環が２個の６員ベンジル環によってフランキングされ て（挟まれて）いる縮合多環式芳香族環構造を有する硫黄含有複素環である。化 石燃料精製中間体および燃焼生成物中に残留するポストＨＤＳ有機硫黄のはとん とのちのはチオフェン性硫黄である。この残留チオフェン性硫黄のほとんとのち のは、ＤＢＴ、および１個または両方のフランキングベンジル環中に存在する１ 個以上の炭素原子と結合した１個以上のアルキル基またはアリル基を有するＤＢ Ｔ誘導体の中に存在する。そのようなりＢＴ誘導体は、これらのラジカルて「修 飾」されているという。ＤＢＴ自体は、チオフェン性硫黄が関与する反応におい てＤＢＴおよびアルキルとアリルの両方または一方で修飾されたＤＢＴ誘導体を 含む化合物種の挙動を説明するモデル化合物として当該分野で認められている。

モンティセロとフィンナーティー（九（０８９、　ａｔ　３７２−３７３　（１ ９８５）　、　Ｄ　Ｂ　Ｔおよびそのラジカル修飾誘導体が、特定の原油、石炭 、瀝青の総硫黄含有量に対してかなりの比率を占めることがある。たとえば、こ れらの硫黄含有複素環は、西テキサス産原油の総硫黄含有量の７０重量％、また 一部中束産原簡の総硫黄含有量の４０重量％という高い比率を占めることが報告 されている。したがって、ＤＢＴは、特定の地理的起源の原油、石炭、または瀝 青などの化石燃料、およびそれらから製造される様々な精製中間体や燃料製品に 含まれるチオフェン性硫黄種のモデル化合物としてとくに重要であると考えられ る［４１］。ＤＢＴおよびそのラジカル修飾誘導体のもう一つの特徴は、環境中 への化石燃料排出後にこれらの硫黄含有複素環があまり生物分解を受ける二とな く長期間残留するという二とである。グントラックら（Ｇｕｎ旧ａｃｈ　ｅｔ　 ａｌ、）　（１９８３）、　２２１５ＣＩＥＮＣＥ　＋２２−１２９゜したがっ て、最も大量に存在する天然微生物が硫黄含有複素環を効果的に代謝分解するこ とはない。

本発明の脱硫処理に適した化石燃料の一つとして、有機硫黄を含有するものが挙 げられる。このような化石燃料を「基質化石燃料」と呼ぶ。チオフェン性硫黄を 多く含む基質化石燃料（総有機硫黄の相当の部分が、たとえばＤＢＴなとの硫黄 含′１ｉｒｒ１１素環中に存在するチオフェン性硫黄であるもの）は、本明細書 て説明する方法による脱硫にとくに適している。

上記基質化石燃料の例としては、セロネグロ（Ｃｅｒｒｏ　Ｎｅｇｒ。

）やオリノコ（Ｏｒｉｎｏｃｏ　）産の重質原油：アタバスカン（Ａｔｈａｂａ ｓｃａｎ）産タールおよびその他のタイプの瀝青：軽質サイクル曲、重質大気ガ ス油、および１号ディーゼル油などの石油精製画分：およびポカホンタス（Ｐｏ ｃａｈｏｎｔａ、ｓ）　３号炭、ルイスストック（Ｌｅｗｉｓ−３ｔａｃｋ　） 炭、オーストラリアグレンコ−（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｌｅｎｃｏｅ）炭、 ワイオダツク（Ｗｙｏｄａｋ）炭などの原料から製造された石炭由来液体製品な どが挙げられる生物触媒脱硫法（バイオ力タリシスまたはＢＤＳ）とは、生物触 媒によって硫黄含有複素環などの安定有機硫黄化合物をはじめとする有機硫黄化 合物の炭素−硫黄結合を選択的に酸化切断することにより、該化合物から硫黄を 取り除くこと（遊離または除去）をいう。ＢＤＳ処理を行なうと、前者の安定有 機硫黄化合物の脱硫済み燃焼性炭化水素骨格ならびに分別蒸留や水抽出などの公 知技術によって容易に相互分離可能な物質である無機硫黄ができる。たとえば、 ＤＢＴをＢＤＳ処理に付すと、ヒドロキシビフェニルやジヒドロキシビフェニル またはそれらの混合物に変換される。ＢＤＳは、単独でまたは互いに共同して硫 黄含有複素環をはじめとする有機硫黄化合物の炭素−硫黄結合を選択的に切断す ることにより該化合物からの硫黄除去を進行させる１種以上の酵素を機能的に発 現する１種以上のヒト以外の生物（たとえば微生物）を含有する生物触媒、上記 微生物から得られる１種以上の酵素、または上記微生物と酵素の混合物によって 行なわれる。

本明細書では、生物触媒活性を示す生物をＣ８＋またはＤｓＺ＋といい、生物触 媒活性を欠く生物をＣ３−またはＤｓｚ−であるという。

以上まとめたように、本明細書て説明する発明は、一つには、有機硫黄化合物を 含有する化石燃料を脱硫する能力のある生物触媒をコードする遺伝子または遺伝 子群を含有するＤＮＡ分子またはその断片に関する。本発明のＤＮＡ分子または その断片は、たとえば天然原料から得られる精製単離ＤＮＡであってもよいし、 たとえばヒト以外の宿主生物中に存在する組換え（ペテロまたは外来’）ＤＮＡ であってもよい。以脱硫用生物触媒をコードするＤＮＡの単離について説明する が、この記述は本発明を限定するものではなく、単に説明を９９２年特許付与） に開示されており、その内容は引例により本明細書に含まれるものとする。また 、該文献中では、ＩＧＴＳ　８と呼ばれている。ＩＧＴＳ８は、イリノイ州シカ ゴのＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇａｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの研究者らによ って開発されたものである。適当な生物触媒活性を発現することから本発明のＤ ＮＡの適当な入手源と考えられるその他の生物としては、米国特許第５，００２ ，８８８号に記載されＡＴＣＣ番号５３９６９としてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、５ｔｒ ａｉｎ　ＳＹＩ、５８　ＡＰＰＬ、ＥＮＶ、ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ、（Ｎｏ。

３）９１１−９１５などが挙げられる。ＡＴＣＣ番号５３９６８の微生物からの 本発明のＤＮＡの単離について、図１に概略を示すとともに以下に説明する。

炭素−硫黄結合を切断する能力のないＲ，ロドクロウスの変異株（Ｃ３−または Ｄｓｚ−）は、生物触媒活性を示す（すなわちＣ８＋またはＤｓｚ＋）たとえば ＡＴＣＣ番号５３９６８などのＲ，ロドクロウス株を、当該分野に習熟せる者に とって公知または容易に確認できる適当な条件下で突然変異原に曝露することに よって製造される。適当な突然変異原としては、たとえば紫外線照射などの照射 、およびたとえばＮ−メチル−Ｎｏ　−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）　、ヒド ロキシルアミン、エチルメタンスルホン酸塩（ＥＭＳ）　、亜硝酸なとの化学変 異原などが挙げられる。このようにして作成された突然変異体を適当な培地中で 生育させ、炭素−硫黄結合切断活性についてスクリーニングする。炭素−硫黄結 合切断活性を欠くと判定された突然変異体をＣ８−という。炭素−硫黄結合切断 活性を正確に検出することのできるスクリーニング法であればいずれも、本発明 の方法において適当である。この活性のスクリーニング方法として適当なものと しては、異なる突然変異体を炭素−硫黄結合を含む分子（たとえばＤＢＴ）に曝 露させ、炭素−硫黄結合切断を測定する方法なとが挙げられる。好ましい態様に おいては、短波長紫外線下で蛍光を発する分解生成物であるヒドロキシビフェニ ル（ＨＢＰ）か生成するように、突然変異体をＤＢＴに曝露する。ＨＢＰはギブ ズ試薬との青色の反応生成物を利用する比色測定法によっても検出することがで きる。その他の方法としては、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ ー、赤外線分光測定法、核磁気共鳴分光測定法などが挙げられる［コダマら（Ｋ ｏｄａｍａ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ ｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｐａｇｅｓ　９１１−９１５　（ １９９２）およびキルベインとヒエラガ（Ｋｉｌｂａｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｅｌａ ｇａ　）　、　Ｆｉｎａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　Ｄ、０．Ｅ。

Ｃｏｎｔｒａｃｔ　Ｎｏ、　ＤＥ−ＡＣ２２−８８ＰＣ８８９１（１９９１）参 照］。Ｃ３−変異体が同定、単離されると、そのクローンを常法により増殖させ 、さらに分析に付す。

ＣＳ　＋生物であるＲ、ロドクロウスの上記培養物の突然変異誘発と並行して、 同じＣ８＋の生物の第２の培養物（＋）を培養維持する。このＲ，ロドクロウス 培養物からＣ８十生物のＤＮＡ　（３）を抽出する。様々なりＮＡ抽出法がこの 生物のＤＮＡ０単離に適している。適当な方法としては、フェノールおよびクロ ロホルム抽出法などが挙げられる。マニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　 ａｌ、　）　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐａｇｅ　１６．５４　（＋９８９）参照 、本明細書中では本文献をマニア）を様々なキロベース長さの断片に切り出すが 、これらの断片が集合的にＤＮＡライブラリー５を構成する。たとえば酵素法や 機械的方法なと探々な方法を用いて、Ｒ，ロトクロウるＤＮＡを精製することが できる。Ｔａｑｌや５ａｕ３Ａなといずれの４塩基認識制限エンドヌクレアーゼ もこのＤＮＡの断片化に適している。適当なりＮＡ断片化方法はマニアナイスら に示されている。

本発明の生物触媒をコートするＤＮＡの断片を単離する目的で、上記様々なりＮ Ａ断片を数種類のＲ，ロドクロウス（２）のＣ８−変異体クローンに挿入する。

Ｃ８−であった変異体菌体がＣ３＋の形質転換菌体へと形質転換されたことは、 挿入されたＤＮＡ断片が生物触媒をコードすることの証拠である。該断片の取り 込みと発現が可能であれば、Ｒ，ロドクロウスへＤＮＡを挿入するいずれの方法 も適している。好ましい態様においては、エレクトロポーレーションを用いてＤ ＮＡ断片をＲ，ロドクロウスに挿入する。マニアナイスら参照。

形質転換Ｃ８十変異体Ｒ，ロドクロウス７を作成し同定したら、Ｃ８十生物触媒 をコートするＤＮＡ断片９を同定、単離することができる。次いて、公知かつ当 該分野に習熟せる者であれば容易に実施できる様々な方法において単離ＤＮＡを 用いて該コードされた生物触媒を製造することができる。

また、単離されたＤＮＡはたとえばマニアナイスらに記載の技術なと公知技術に よって配列決定と複製が可能である。

すてに述へたように、本発明のＤＮＡを単離するための上記方法は、たとえばＡ ＴＣＣ番号５３９６８株の生物などＲ番号５３９６９やコリネバクテリウム　ス ピーシーズＳＹＩを本発明のＤＮＡの入手源生物として使用することができる。

さらに、本発明のＤＮＡを単離したら、人手源生物のｃｓ−変異体と異なるヒト 以外の宿主生物にトランスフェクトする胞生物（たとえば酵母）や多細胞生物が ら培養により樹立した細胞をはじめとするその他のタイプのヒト以外の宿主生物 も使用することができる。

本発明のＤＮＡを単離するだめのその他の方法としては、すてに説明し図１に図 示した原理の変法が含まれる。たとえは、ＲロドクロウスのＣ８＋株のクローン にｃｓ−のＤＮＡプラスミドをランダムに挿入することができるであろう。

次いて、Ｃ３十からＣ８−へと形質転換されたクローンを探すスクリーニングに よって、ｃｓ十生物触媒をコートするＤＮＡを同定することができるであろう。

本発明の組換えＤＮＡ分子またはその断片は、炭素−硫黄結合を選択的に切断す る能力のある生物触媒をコードする１個以上の遺伝子を化学的または生物学的手 段によってその鎖に挿入することて生しるいがなるＤＮＡをも包含するものであ り、該遺伝子は元々その鎖の中に存在してぃなかったものである。組換えＤＮＡ としては、制限酵素、核酸ハイブリダイゼーション、ＤＮＡクローニング、ＤＮ Ａ配列決定、またはこ第１らを組み合わせたものを用いる手順によって作成され たあらゆるＤＮＡを含むものである。構築方法については、マニアナイスらおよ び当該分野に習熟せる者にとって公知のその他の方法に示されている。

本発明のＤＮＡプラスミドまたはベクターの構築の手順としては、マニアナイス らに記載の手順、および当該分野に習熟せる者にとって公知のその他の方法など が挙げられる。適当なプラスミドベクターとしては、それぞれ図２と図３に示し たｐＲＦ−２９とｐＲＲ−６などが挙げられる。ｒＤＮＡプラスミド］および「 ベクター」という用語は、化学的または生物学的手段によって外来または外因性 ＤＮＡを挿入させることができ、続いて適当なヒト以外の宿主生物にトランスフ ェクトされるとその外来または外因性ＤＮＡ挿入断片の生成物を発現（たとえば 本発明の生物触媒を発現）することができるものであれば、いずれの複製能力を 有するプラスミドまたはベクターも包含するものである。また、このプラスミド またはベクターは、本発明の遺伝子または遺伝子群を含有するＤＮＡ分子または その断片の挿入を受けることができるものでなければならず、該遺伝子または遺 伝子群は有機硫黄化合物の炭素−硫黄結合を選択的に切断する生物触媒をコート するものである。ＤＮＡプラスミドベクターの構築の手順としては、マニアナイ スらに記載の手順、及び当該分野に習熟せる者にとって公知のその他の手順など が挙げられる。

本発明のプラスミドとしては、有機硫黄化合物の炭素−硫黄結合を選択的に切断 する生物触媒をコートする遺伝子または遺伝子群を含有するものであれば、いが なるＤＮＡ断片であってもよい。「プラスミドＪという用語は、いがなるＤＮＡ 断片をも包含するものである。ＤＮＡ断片は、形質転換またはコンジュゲーショ ンによって宿主微生物に転移可能なものでなければならない。ＤＮＡプラスミド の構築または抽出の手順としては、マニアティスらに記載の手順、および当該分 野に習熟せる者にとって公知のその他の手順などが挙げられる。

本発明の形質転換されたヒト以外の宿主生物は、当該分野に習熟せる者であれば 様々な方法によって作成することができる。たとえば、マニアティスらによって 記載されているトランスフェクションやエレクトロポーレーソヨンを使用するこ とができる。「ヒト以外の宿主生物」という用語は、外来、外因性、または組換 えＤＮＡ、すなわち本来その生物の核物質の一部ではなかったＤＮＡの取り込み と発現の能力を有するヒト以外のいかなる生物をも指すものとする。

本発明の化石燃料脱硫方法には２つの側面がある。まず、宿主生物またはそれか ら得られた生物触媒調製物を、脱硫しようどする化石燃料に接触させる。これは 、必要に応して攪拌装置や混合装置を取付けた適当な容器中で実施することがで きる。混合物をよく混ぜ合わせ、有機硫黄化合物中のかなりの数の炭素−硫黄結 合を切断することかできるのに充分な時間をかけてインキュベートし、脱硫され た化石燃料を製造する。１つの態様においては、該生物の水性培養物と化石燃料 を混ぜて水性エマルジョンとし、その生物をエマルジョン中て増殖させるととも に発現された生物触媒で炭素−硫黄結合を切断する。

温度、混合割合、脱硫速度なとの変数は使用する生物によって変わる。これらの パラメータは通常の実験法で決定する二とかできる。

脱硫の速度と程度の監視に適した数種の技術が公知であり、当該分野に習熟せる 者であれば容易に実施することができる。ベースライン試料およびタイムコース 試料をインキュベーション混合物から採取し、化石燃料中の残存有機硫黄の測定 に使うことができる。生物触媒処理に付されている試料中のＤＢＴなとの有機硫 黄化合物からの硫黄の消失は、たとえばＸ線蛍光分析（ＸＲＦ）や原子発光分光 分析（フレーム分光分析）なとを用いてモニターすることができる。まず、試料 の分子成分をたとえばガスクロマトグラフィーによって分離するのか好ましい。

本発明の核酸プローブは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズす る能力を有するいかなる核酸物質をも包含する。「核酸プローブ」という用語は 、ＤＮＡとハイブリダイズする能力を有するいかなる核酸物質をも包含する。

以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらの実施例はい かなる意味でも本発明を限定するものではない。

実施例１．脱硫活性生物触媒をコードするＤＮＡの単離本明細書ていうｒＤＳＺ ＋Ｊという用語は、ある生物が炭素−硫黄結合を選択的に切断することによりジ ベンゾチオフェン（ＤＢＴ）などのチオフェン化合物を唯一の硫黄源として利用 することができる能力をいう。ロドコッカス　ロドクＪという用語は、ある生物 が炭素−硫黄結合を選択的に切断することにより該チオフェン化合物を唯一の硫 黄源として利用する能力を欠いていることをいう。

材料 細菌株およびプラスミド Ｉｎ５ｔｉｊｕｔｅ　ｏｆ　Ｇａｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｃｈｉｃａｇｏ 、　ＩＬ）から入手したロドコッカス　ロドクロウス１０７３８株（ＡＴＣＣ番 号５３９６８）を、脱硫表現型を失った（ＤｓＺ−）変異体株の製造のだめの親 株として用いた。１０７３８株は、Ｄｓｚ＋変異体を製造するため、該変異体を 相補する能力のあるＤＮＡ断片を単離することにも使用した。ロドコッカスベク タ−ｐＲＦ−２９をＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇａｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ から入手した。ｐＲＦ−２９の構築については、デソマーら（Ｄｅｓｏｍｅｒ。

ＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮλＩＥＮＴＡＬ旧ＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　２ ８＋８−２８２５゜ｐＲＦ−２９の構造を図２に概示した。

プラスミドｐＵｃ＋８とｐ　Ｕ　ＣＩ　９　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈＬａｈｏｒａｊｏｒｉｅｓ、　Ｂｅ１ｈｅｓｄａ、　ＭＤ）に由来するプラ スミド構築物による形質転換において大腸菌ＪＭ１０９株を宿主として用いｔ二 。

酵素および試薬 制限エンドヌクレアーゼはＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ）社とＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社（Ｂ ｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）から購入した。Ｔ４リガーゼと大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼＩのフレノウ断片はＢＲＬ社から購入した。ＨＫ”ホスファターゼはＥｐｉｃ ｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ　）から購 入した。

す・＼ての酵素は、製造メーカーの推奨事項に従って使用した。酵素測定基質で あるジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、ジベンゾチオフェン５−オキシド（ＤＢＴ スルホキシド）、およびノヘンゾチオフェンスルホン（ＤＢＴスルホン）はＡｌ ｄｒｉｃｈ社（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗ［）から購入した。ギブズ試薬である ２、６−ジクロロキノン−４−クロロイミドはＳ　ｉ　ｇｍａ社（Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、λ１０）から購入した。化学変異原Ｎ−メチル−Ｎ’　−ニトロ− Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もＳ　ｉ　ｇｍａ社から購入した。

て培養した。１．５％寒天を添加し１２５μｇ／ｍｌのアンピンリンを含有する し一プレート上で形質転換株を選択した。大腸菌株は３７°Ｃて培養した。ロド コッカス株を１リツトルあたり８、Ｏｇのニュウトリエントブロス（Ｄｉｒｃｏ 　）　、０換株は、１．５％寒天を添加し２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー ルを含有するＲＭプレート上で選択した。Ｄｓ　ｚ＋の表現型を発現させるため 、１リツトルあたり２．４４ｇのＫＨ２ＰＯ，，５，５７ｇのＮａｇ　ＨＰＯ４ ，２、ＯｇのＮＨ，ＣＩ、０．２ｇのＭｇＣＩｔ　・６Ｈ１０，０，００１ｇの Ｃａ　Ｃｌ　２・２　Ｈ２’　Ｏｌｏ、００１ｇのＦｅＣ１ｇ　・６Ｈ２０，０ ，００４ｇのＭｎＣＩｔ　・４Ｈｔ　Ｏ１６，４ｍｌのグリセリンから成る基本 塩培地（ＢＳＭ）中でロドコッカス株を培養した。ＢＳＭには必要に応じて５． ０ｇ／リットル方法 硫黄生体利用性アッセイ 米国特許第５，１０４，８０１号に記載の硫黄生体利用性アッセイは、生育のた めの唯一の硫黄源として基質（たとえばＤＢＴ、ＤＢＴスルホキシド、ＤＢＴス ルホン）から有機的に結合している硫黄を遊離する生物の能力について調へるも のである。このアッセイでは、硫黄を含まないＢ　Ｓ　Ｍに、たとえばＤＢＴな との硫黄含有基質を１種類以上加える。生物かその基質から硫黄を遊離する能力 は、適当なインキュヘーノヨン条件下で生育する能力を６００ｎｍにおける光学 密度によりモニターすることて測定する。

ＩＧＴＳＢ株とともにインキュベートされたＤＢＴ、ＤＢＴスルホキッド、及び ＤＢＴスルホンの酸化生成物が２−ヒドロキシビフェニル（２−ＨＢＰ）である 。ギブズアッセイは、ＤＢＴおよび上記酸化誘導体から生成した２−ＨＢＰの量 を比色測定法によって定量するものである。アッセイは、ＤＢＴとともにインキ ュベートした後で培養上演中の生成した２−ＨＢＰを測定するものである。培地 は、ギブズ試薬の添加に先立ちｐＨ８，０に調整しなければならない。ギプズ試 薬の２．６−シクロロキノンー４−クロロイミド（１０ｍｇ／ｍｌエタノール） をＩ　：　１００　（ｖ／ｖ）の比率で培養上清に加える。室温で３０分インキ ユベーソヨンした後で、６１０ｎｍにおける吸光度として発色を測定する。

２−ヒドロキシビフェニルのＨＰＬＣアッセイＤＢＴとともにインキュベーショ ンした２−ＨＢＰ生成培養物は、Ｗａｔｅｒｓ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡから入手てきる装置を用いるＨＰ ＬＣによっても検出することができる。試薬アルコールを１　：　ｌ　（ｖ／ｖ ）の比率で培養液に加えて、すべての残存ＤＢＴと２−ＨＢＰを可溶化させる。

試料を２２　Ｏｒ　ｐｍで５分間攪拌する。抽出培養液試料を取り出し、遠心分 離にかけて菌体塊を除去する。次いで、透明上清を以下の条件下てＨＰＬＣによ って分析する。

カラム　ウォーターズ　４μ　フェニル　ツバパック−変異体）を作成する目的 で、生物触媒由来兄妹ＩＧＴＳ８（Ｄｓｚ＋）を短波長ＵＶ線による突然変異誘 発およびＮ−メチル−Ｎｏ　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）によ る化学的突然変異誘発に付した。ＵＶ曝露突然変異誘発ては、９９９６を超える 死滅率を目標とした。光学密度（Ａ６６゜）０３て連続攪拌しつつＲ，ロドクロ ウス菌体を、５５〜６５秒間にわたりｌｏｃｍの距離を隔てたミネラライトラン プモデルＵ　Ｖ　Ｇ　−２５４（Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ 、Ｉｎｃ、。

Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、　ＣＡ）によるＵＶ曝露に付し、この死滅率（９７９ 〜９９９％）を得た。ＮＴＧ突然変異誘発の場合は、菌体懸濁液を３０〜５０％ の死滅率が得られるように設定した期間にわたり５００ｇｇ／ｍｌのＮＴＧで処 理した。ＮＴＧとＵＶの両方を用いる組み合わせ突然変異誘発も行なった。これ らの場合、９９．９！％を超える全体死滅率を用いた。突然変異誘発を生きのび たコロニーをＲＭプレート上で拾い、Ｄｓｚ−の表現型のスクリーニングを以下 のようにして行なったつ スクリーニング例Ａ：まず、ＤＢＴ噴霧プレートスクリーンを用いてＤｓｚ−変 異体を選択した。変異体コロニーを、硫黄を加えていない基礎塩培地（ＢＳＭ） 電気泳動用アガロースプレートにレプリカ移植した。コロニーは３０°Ｃて２４ 時間生育させた。次いてプレートに均一な被膜ができるよう１０９６　Ｄ　Ｂ　 Ｔのエーテル溶液を噴霧し、３０°Ｃで９０分間インキユヘーンヨンした。次い てプレートをきれいにふき取り、短波長ＵＶ標線下観察した。見られたＤＢＴ代 謝最終生成物である２−ヒドロキシビフェニル（２−ＨＢＰ）は短波長ＵＶ標線 下蛍光を発する。このようにして、アガロース上での蛍光スポットによって、２ −ＨＢＰを産生するコロニーを同定した。２−ＨＢＰ　（Ｄｓｚ−）を産生しな いコロニーは蛍光スポットを生じない。

スクリーニング例Ｂ：より単純な形のスクリーニング変法は、生きのびた突然変 異化コロニーを１．２ｍｌ／リットルのＤＢＴ飽和エタノール溶液を添加した８ ３Ｍアガロースプレートにレプリカ移植するものであった。２４時間後、２−Ｈ ＢＰの産生を上記のようにしてＵＶ照射下で可視化することかできる。

上記スクリーニング法て２−ＨＢＰを産生しないと思われる変異体について、Ｄ ＢＴを唯一の硫黄源とする硫黄生物利用性アッセイについて調−一だ。２４穴プ レート（Ｆａｌｃｏｎ＞ｆ）に分注したＢＳＭプラスＤＢＴ培地における１、２ ５ｍ１液体発酵において変異体である可能性のある株の生育を調へた。３０″Ｃ て１日のインキュベーションを行なった後、２−ＨＢＰ産生をギブズ比色測定法 によってモニターした。Ｄｓｚ−表現型を示し続ける株をさらに大量のＢＳＭプ ラスＤＢＴ培地中でインキュベーションし、ＨＰＬＣ法によって２−ＨＢＰまた は中間体を分析した。ＢＳＭは限定的最少培地であるため、作成硫黄を添加した 複製対照培養を行って、真のＤＳＺ−変異体と栄養要求変異体とを区別した。対 照培地と実験培地のいずれにおいても生育しなかった変異体は栄養要求変異体で あると考えられた。

個別に分析した変異体である可能性のある１９７０株のうち、２株がＤｓｚ−と 同定された。そのうちの１つの変異体ＧＰＥ−３６２はＮＴＧ突然変異誘発によ って作られた。もう１つの変異体ＣＰＥ−６４８は、ＮＴＧ／ＵＶ組み合わせ突 然変異誘発によって作られた。ＧＰＥ−３６２とＣＰＥ−６４８はいずれも硫黄 生物利用性アッセイではゆっくりと生育した、おそらくガラス器具上または培地 成分中の微量の硫黄を栄養源としているのであろう。しかし、ＤＢＴとともに６ 〜１０日の長期インキュベーションを行なった後でギブズアソセイまたはＨＰＬ Ｃ法によって測定したところ、検出可能量の２−ＨＢＰはいずれかの変異体によ っても産生されなかった。したがって、独立に作られたＲ、ロドクロウスＩＧＴ Ｓ８変異体であるＧＰＥ−３６２とＣＰＥ−６４８はいずれらＤｓｚ−の生物で あったことになる。

ベクターの横築 ベクター構築物はクロラムフェニコール耐性を付与する。す・＼ての構築物は大 腸菌ＪＭＩ０９株中で作成した。製造メーカーの推奨事項に従いシーンパルサー （Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ） を用いて、ＪＭ１０９の形質転換を行なった。ＪＭＩ０９からのプラスミド単離 は、常法に従って行なった［バーンホイムとドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ 　Ｄｏｌｙ　）　（＋９７９）、　Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔ ｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｃｏ ｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、　７　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳ　 ＲＥＳ、　１５１３−＋５２３　：　７　＝アティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８２）、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡ ＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　］。正しいベクター構築物を含有する形質 転換体を制限酵素分析によって同定した。

ベクター構築物Ａ：ｐＲＲ−６（図３）はロドコッカスの複製起点とクロラムフ ェニコール耐性マーカー（ｃｍ″）を含んている。ｏｒｉとＣｍ’は６．９ｋｂ のＸｈｏｌ／Ｘｂａ（部分）断片としてｐＲＦ−２９から分離された。両端をフ レノウ断片で平滑化し、５ａｉｌ／Ｘｂａｌ切断片ｐＫＦ　３９に連結した。Ｉ ）ＫＦ３９はＳｍａ　１１部位がＢｇ１１１部位で置換されたｐＵＣＩ　８であ る。ｐＲＲ−６中のクローニング用にユニークＮａｒ１部位が利用可能である。

Ｎａｒｌ末端は４塩基性認識エンドヌクレアーゼＴａｑｌと適合するロドコッカ ス　ロドクロウスの形質転換ＩＧＴＳ８およびそのＤｓｚ−変異体の形質転換は エレクトロボーレーションによって行なうことがてきる。ロドコ・ソ。菌体をＲ Ｍ中で中期対数増殖期まで培養し、遠心分離（５０００ｘｇ）によって集菌した 後、冷やした脱イオン蒸留水で３回洗い、１０％グリセリンで５０倍に濃縮した 。得られた菌体濃縮物はそのままエレクトロボーレーションに供してもよいし、 −８０℃で保存してもよい。

シーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）装置を用いてエレクトロボーレーノヨンを 行なった。２ｍｍギャップ付き電気キュベラ）　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中て１０ ０μｌの菌体を形質転換ＤＮＡと混合し、パルスコントローラー（２５μＦキヤ ノくジター、２００Ω外部抵抗）により２．５ｋＶのパルスを与えた。ノくルス を与えた菌体を４００μのＲＭと混合し、規則的に攪拌しなから３０°Ｃて４時 間インキュベートした。次いて、菌体を適当な抗生物質を加えたＲ　Ｍプレート に移植した。

Ｉ　ＧＴＳ　８をｐＲＦ−２９て形質転換したところ、２５μｇ／ｍ　ｌのクロ ラムフェニコールを含有するプレート上で１０５〜１０’個／μｇＤＮＡの頻度 でクロラムフェニコール耐性コロニーが明確に選択された。

Ｒ口ｌ・クロウスからの小規模プラスミド調製ロドコッカス　ロドクロウスの単 一コロニーを用いて、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＲＭの２〜 ７ｍｌに接種した。培養物を攪拌しながら、３０℃で２日間インキュベートした 。菌体を遠心分離によりペレット化し、３０ａｃＩ、＋ｏｍｇ／ｍｌリゾチーム ）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。３００μｌの酢酸カリウム −酢酸溶液、ｐＨ４，８（６０ｍｌの５Ｍ　ＫＯＡｃ、１１．５ｍｌの氷酢酸、 ２８．５ｍ　Ｉ　ｄＨｘ　Ｏ）を加え、混合物を静かに倒置混合した。混合物を 氷上に５分装置いた後、菌体残さを遠心分離によりペレット化した。５００μｌ の上清を新しい試験管に移し、ＲＮアーゼを０．０５μｇ／μｍのｆｉ＆となる よう加え、３７°Ｃて２０分間インキュベートした。次いて、試料をフェノール ・クロロホルムで抽出し、水層を等量のイソプロパツールで一８０℃で沈殿させ た。ＤＮＡを遠Ｉし・分離によりペレット化し、０．３ＭのＮａ０ＡｃＳｐＨ８ ０に再懸濁した。ＤＮＡを等量のイソプロパツールで一８０°Ｃて再び沈殿させ た。ＤＮＡを遠心分離によりペレット化し、０．３ＭのＮａ０Ａｃ　（ｐＨ８， ０）に再懸濁した。ＤＮＡを２倍量の９５％ＥｔＯＨで一８０℃で再び沈殿させ た。ペレット化したＤＮＡを７０％ＥｔＯＨて洗い、５０μｌのＴＥ（１−リス ＥＤＴＡ）に再懸濁した。

ＩＧＴＳ８のゲノムＤＮＡを既報に従い単離した。２０ｍ１のＲＭにＩＧＴＳ８ の単一コロニーを接種し、２２Ｏｒｌ）ｍて攪拌しなから３０°Ｃで４８時間イ ンキュベートした。菌体を遠心分離（５０００Ｘｇ）により集めた。菌体を１０ ０ｍｇのりゾチームとともにｌｏｍｌのＴＥ（１０１ｙのトリス塩基、１ｍＭの ＥＩ）ＴＡ）に再懸濁し、３０°Ｃで３０分間インキュベートした。１ｍｌの２ ０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えることで菌体を溶解した。１０ｍ １のＴＥ飽和フェノールと１．５ｍｌの５Ｍ　ＮａＣ１をただちに加え、混合物 を室温で２０分分間中かに攪拌した。フェノールを遠心分離によって除去し、水 層を等量のクロロホルムで２回抽出した。水層に等量のイソプロパツールを加え てＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡをパスツールピペットにスプールし、ＴＥに再溶 解した。次いで、ＤＮＡを２０μｇ／ｍｌのＲＮＡにより３７°Ｃて１時間ＲＮ アーゼ処理した。試料の最終濃度をｌｏｏｍＭのＮａＣ］と０．４％のＳＤＳと し、１００μｇ／ｍｌのプロテアーゼにでプロテアーゼ処理した。次いで、試料 をフェノールとクロロホルムで抽出し、上記のようにしてイソプロパツールて沈 殿させた。本発明のＤＮＡを含む精製ゲノムＤＮＡをＴＥに再懸濁した。

ＩＧＴＳ８のプラスミドライブラリーの横築Ｄｓｚ＋の由来元生物（ＩＧＴＳ８ ）のゲノムＤＮＡをＴａｑｌて切断して、０．５〜２３ｋｂの長さの断片を作成 した。切断したＤＮＡを０．８９６低融点アガロースで電気泳動し、５ｋｂを越 える長さのＤＮＡ断片を常法［マニアティスら（＆１ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ ｌ、）　（１９８２）、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯ ＲＡＴＯＲＹ　ｋｌＡＮＵＡＬ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）　］に従い単離、精製した。ベクターｐＲＲ −６をＮａｒｌで完全に切断した。ベクター両端をＨＫ７１′ホスファターゼで 脱リン酸化して、ベクターの再連結を防止した。サイズにより分画したゲノムＤ ＮＡを、切断後脱リン酸化したｐＲＲ−６に連結した。

Ｄｓｚ−変異体株ＣＰＥ−６４８の分子相補プラスミドライブラリー結合（上記 ）を利用して、既報に従いエレクトロポーレションによりＤｓｚ−変異体株ＣＰ Ｅ−６４８を形質転換した。ＤＮＡを含まない（モック形質転換）ＣＰＥ−６４ ８陰性対照形質転換も行なった。ＲＭ中で４時間インキユヘーンヨンした後、菌 体を遠心分離により懸濁液から沈殿させ、上清を除去した。菌体を硫黄を含まな いＢＳＭに再懸濁した。これらの菌体を用いて、３００μｍのＤＢＴ飽和エタノ ール溶液を加えた２５０ｍ１のＢＳＭを接種した。この手順により、Ｄｓｚ−突 然変異を相補する能力のあるクローンを硫黄生体利用性アッセイによって選択す ることかできる。相補配列（すなわち本発明のＤＮＡ）を含む株は、ＤＢＴから 硫黄を奪って選択的に生育するはずである３０°Ｃて６日間のインキュベーショ ンを行なった後、ＨＰＬＣによって培養物中の２−ＨＢＰを測定した。２−ＨＢ Ｐの蓄積が実験培養物中に検出されたが、対照培養物中には２−ＨＢＰの蓄積は 検出されなかった。２−ＨＢＰを産生ずる培養物を、クロラムフェニコールを加 えたＲＭプレートに塗布し、プラスミドを保持する単一コロニーを得た。これら のプレートを、ｌ、２ｍｌ／リットルのＤＢＴ飽和エタノール溶液を加えたＢＳ Ｍアガロースプレートにレプリカ移植した。３０°Ｃて２４時間インキュベート した後、短波長ＵＶ照射下で２−ＨＢＰが一部コロニーの周辺に検出された。こ れらのコロニーは、おそらく以前のＤｓｚ＋の表現型を回復することによってＤ ｓｚ−変異体を相補するプラスミドを保持していたのであろう。

Ｄｓｚ−変異体ＣＰＥ−６４８を相補するクローンのキャラクタライセーソヨン 上記のようにして、２つの独立したプラスミドライブラリーか変異体ＣＰＥ−６ ４８をＤｓｚ＋にうまく相補した。２つのライブラリーのそれぞれで形質転換し た培養物からＢ５Ｎ１プラスＤＢＴのプレート（上記）上で２−ＨＢＰ産生を示 すｔｇ−のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスｌ’ＤＮＡを 用いて大腸菌ＪＭＩ０９株の形質転換を行な−た。プラスミドＤＮＡを単離し、 制限エントヌクレアーゼを用いて切断して、クローンの制限酵素地図を作成した 。

この２つのライブラリーのそれぞれが単一の相補クローンをｔした。制限パター ンの類似性により、２つのクローンは重復配列を存すると思われる。次いてこれ らのクローンをそれぞれｐＴＯＸＩ−１（図４）およびｐＴＯＸＴ−２と命名し た。ｐＴｏｘｒ−＋は約６．６ｋｂの挿入断片を有する。ｐＴＯＸ　Ｉ　−２は 約１６．８ｋｂの挿入断片を有する。

Ｄｓｚ−変異体であるＧＰＥ−３６２の相補Ｄｓｚ−変異体ＧＰＥ−３６２をプ ラスミドｐ’ｒｏｘｉ−１とｐＴＯＸＩ−２で形質転換した。対照として、ＧＰ Ｅ−３６２をベクターｐＲＲ−６ても形質転換した。プラスミドＤＮＡを含有す る形質転換体をＲＭプラスクロラムフェニコールのプレート上で選択した。Ｃｍ ’コロニーをＤＢＴ添加Ｂ　Ｓ　Ｍアガロースプレートに移した。３０″Ｃで２ ４時間のインキュベーションを行った後、短波長ＵＶ照射下でｐＴＯＸｌ−１ま たはｐＴＯＸｌ−２を含有するコロニーの周辺に２−ＨＢＰの産生が見られた。

ベクターｐＲＲ−６だけを含有するコロニーの周辺には２−ＨＢＰは検出できな かった。

クローン化ＤＮＡの再導入によるＤｓｚ＋形質の過剰発現プラスミドｐＴＯＸＩ −１とｐＴＯＸＩ−２をＤｓｚ−変異体株ＣＰＥ−６４８に形質転換した。プラ スミドＤＮＡを含有する形質転換体をＲＭプラスクロラムフェニコールのプレー ト上で選択した。個々のクローンの比活性を以下の手順て調べた。

ｐＴＯＸｌ−１またはｐＴｏｘ　Ｉ　−２を含有するＣＰＥ−６４８の単一コロ ニーを用いて、２５０ｍ　ｌフラスコ中の２５μｇ、／ｍｌのクロラムフェニコ ールを含む２５ｍ１のＲＭに接種した。陽性対照として、親株ＴＧＴＳＢも２５ ｍ１のＲＭ中で培養した。２２５ｒｐｍで攪拌しながら３０″Ｃて４８時間生育 させた後、２．５ｍｌの培養物を０．７ｍＭのＤＭＳＯを加えた２５ｍ１のＢＳ Ｍに混合した。培養物を３０°Ｃてさらに４０時間インキュベートした。各培養 物の光学密度を適当なブランクに対して６００ｎｍで測定した。ＤＢＴを最終濃 度１５０μＭとなるように加え、培養物を３０°Ｃて３時間インキュベートシた 。次いで、等容量の試薬アルコール（Ｂａｘｔｅｒ、　ＭｃＧａｉｖ　Ｐａｒｋ 、　ＩＬ）を各培養物に加えて、残存するＤＢＴまたは２．−ＨＢＰを可溶化し た。１ｍｌの試料を取り、遠心分離によって菌体残さを除去した。上記ＨＰＬＣ アッセイによって上演中の２−ＨＢＰを分析した。ｌリットルあたりの２−ＨＢ Ｐのｍｇ数／インキュベーション時間１０Ｄ、。。とじて比活性を計算した。上 記アッセイの結果を表１に示す。

表１・形質転換後変異体の生物触媒脱硫活性脱硫活性生物触媒のＤＮＡ配列決定 材料 菌株、プラスミド プラスミドｐＴＯＸｉｌは、ＤＮＡシークエンシングのための原材料として使用 された。大腸菌ＪＭＩ０９株は、サブクローニングおよびプラスミドの維持のた めの宿主として用いた。ブー７スミトｐＵｃＩ８およびｐＵｃＩ９は、Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｊｏｒｉｅｓ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 、ｌＪＤ　）から購入した。

酵素、試薬 制限エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔ。

ｒｉｅｓ　（ＢＲＬ　）　、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅ ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）より購入した。Ｔ４リガーゼはＢＲＬより購入した。５ｅｑ ｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉ。

ｎ２．０ＤＮＡンークエンシング・キットは、Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ） より購入した。

酵素、キットは総て、業者の使用書に従って用いた。

Ｄｉｆｃｏ　）にアンピシリン１００μｇ　／　ｍ　Ｌを添加して培養した。形 質転換株の選択は、１．５％寒天とアンピシリン１００μｇ／　ｍ　Ｌを添加し たし一プレート上において行なった。大腸菌は３７°Ｃにて培養した。

方法 製した（マニアティスら）。このＤＮＡは、シーフェンシング反応に使用する前 にポリエチレングリコール沈殿によりさらに精製した。

プラスミド・サブクローニング 以下のＩＩＴＯＸ［−１のサブクローンは標準的な手法により作成し、ＤＮＡシ ークエンシングに供した。

Ｖ−１を保持するＪＭ１０９細胞は、プラスミド単離、制限エンドヌクレアーゼ 解析により判別した（マニアティスら）。

ｂ）ｐＳＭＥＬＶ−ＩＡ　（図６）は、ｐＭＥＬＶ−１の５ｐｈｌ／ＸｈｏＩ処 理して得られた１、６にｂの断片をｐＵｃ−１８にサブクローニングＩ処理して 得られた０、　７Ｋｂの断片をｐｕｃ−ｔｓにサブクローニングしたものである 。

ｄ）ｐＳＭＥＬＶ−３Ａ　（図６）は、ｐｋｌＥＬＶ−１の５ａｃｌ／Ｘｈｏｌ 処理して得られた３、　５Ｋｂの断片をｐＵｃ−１８にサブクローニングしたも のである。

ｅ）ｐＳＭＥＬＶ−４Ａ　（図６）は、ｐＭＥＬＶ−１の５ｐｈｌ／ＢａｍＨＩ 処理して得られた１、５Ｋｂの断片をｐＵｃ−１８にサブクローニングしたもの である。

プラスミドＤＮＡを用いたジデオキシ・シーフェンシングａ）ディネイチュレイ ション（変性）。シーフェンシング反応の前に、プラスミドＤＮＡはＮａＯＨ処 理により一本鎖に変性させる必要がある。変性ＤＮＡは塩の添加、エタノール沈 殿により回収される。各シーフェンシング反応ごとに２〜５μｇｃ７）変性ＤＮ Ａを用いるのが好ましい。５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡシ ークエンシング・キットの取り扱い説明書を見ればよい。（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔ ａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）ｂ）ジデオキ シ・シーフェンシング。５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０　（Ｕ、Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて使用書にあるとお りに鎖伸張停止ジデオキシ・シーフェンシングをした。クラスター　（７）　ン −クエンシ：／　’ｙ”　ｌｅｔ　サブ’）　ロー　ンｐＭＥＬＶ−ＩＡ、　ｐ ＭＥＬＶ−２Ａ、　ｐＭＥＬＶ−３Ａ、　ｐＭＥＬＶ−４Ａと”−４０Ｕｎｉｖ ｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ”とを混合することにより開始した。その”−４０ユ ニヴアーサルプライマー”は５’　−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３ °　と規定されており、”　リヴアースプライマー”は５−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴ ＧＡＣＣＡＴＧ−３゛とされている。シーフェンシングは前もって読んだシーフ ェンスに部分的に重なったオリゴヌクレオチドを結合させていくことにより伸長 だ。この過程には、Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　Ｐｌｕｓ　（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ　）を用いた。合成オリゴヌクレオチ ドはシークエンソング反応継続のだめのプライマーとして用いた。ブラスミトｐ ＭＥＬＶ−１は残りの配列縁ての鋳型として用いた。ＤＮＡシークエンスは、適 合性を上げるために、プラスミド・クローンの両鎖を読んだ。

クシコン 材料、方法 ｏ、ＩＬ）より入手して使用した。本文中のＵＶＩはＩＧＴＳ８ＸＬＩ−Ｂｌｕ ｅ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＣＩｏｎｉｎＨＳｙｓｔｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌ ａ、　ＣＡ　）Ｓｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ 　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｍａｎｉｐｕ ｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉａ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｇｒａｍ−ｎｅ ｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ、　ｐ、６４叶６５９．Ｉｎ　Ａ、　Ｗｅｉｓ ｓｂａｃｈ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ　（ｅｄｓ、）、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖａｔ　１１８．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、Ｉｎｃ、、０ｒｌａｎｄｏ、１９８６　］　。

シュードモナス最最小項培地Ｐｕｓ）は、ギウラードとスネル（Ｇｉｕｒａｒｄ 　ａｎｄ　５ｎｅｌｌ　）の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　 ｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ、ｐ、７９−１１１．　［ｎ　Ｐ、Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ， Ｇ、Ｅ、Ｍｕｒｒａｙ、Ｒ，Ｎ、Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ、 　Ｗ、Ａ、Ｗｏｏｄ、　Ｎ、Ｒ，にｒｉｅｇ、　ａｎｄ　Ｇ、Ｂ、Ｐｈ１ｌｌｉ ｐｓ　（ｅｄｓ、）、　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎ ｅｒａｌ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａ ｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ，、１９８１）　に従って調製し、そこに０．２％グ リセリン、４０ｍＭリン酸バッファー（ｐ）（ｆ３．８）、２％ハンターのミネ ラル・ベース、０．１％硫酸アンモニウムを添加した。硫黄塩を欠＜ＰＭＳ培地 は、硫酸塩を塩酸塩に置換して調製した。ルリア・ブロース（ＬＢ）は、１％バ タトトリブトン、０．５％酵母抽出物、１％塩化ナトリウムより成る。培養液の インキュベーションは総て、恒温水槽の中で振盪しながら行った（Ｎｅｗ　Ｂｒ ｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｅｄｉｓｏｎ、　ＮＪ）。アンピシリ ン（５０μｇ／ｍＬ）とテトラサイクリン（１２，５μｇ　／　ｍ　Ｌ　）は選 択試薬として必要に応して培養液中に加えた。ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）は Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｏｎｋｏｎ ｋｏｍａ、　ＮＹより購入した。ＤＢＴ−スルフオキシドはＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ　ｏｆ　［ｒｖｉｎｅ、　ＣＡより、ＤＢＴ−スルフォンはＡｌ ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　。

ｆ　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌより購入した。アガロースはＢＲＬより入手し た。

プラスミド　ヘクター ｐＬＡＦＲ５［キーンら（Ｋｅｅｎ、　ｅｔ　ａｔ、）　、　Ｇｅｎｅ　７０： Ｉ９＋−１９７，１９８８］とｐＲＦ２９　［デソマーら（Ｄｅｓｏｍｅｒ、　 ｅｔ　ａｌ、）　、　＋９８８］高分子量ＤＮＡは、細胞の溶解をリゾチーム（ ５ｍ　ｇ　／　ｍＬ）と５ＤＳ（２％）を含むＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−４１ ＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）溶液中で行ったことを除き、コンスベ ッジら（Ｃｏｎｓｅｖａｇｅに切断し、約２０にｂの断片を塩化ナトリウム勾配 遠心後に分離ｒｇｅ、ａｎｄ　Ａ、Ｒ，Ｋｉｍｍｅｌ　（ｅｄｓ、）、Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｆ　１５２．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ、　＋９８７］　ｏ二ａ ｊａｇｅｎｅ）を用いて行った。構成されたコスミドは大腸菌５Ｉ７−１−＼形 質移入した。

ＤＢＴ　スプレープレート・アソセイ ジヘシノ′チオフェン（ＤＢＴ）を変化させることかできる細菌を選別するため に、キヨハラら（に１ｙｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、）の方法法であるクラビーク （Ｋｒａｗｉｅｃ　）の方法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｓ　：　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　５ｐｅｃｕｌａｔｉｏｎｓ　ｒｅｇａｒｄｉｎｇ 　ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｄｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｂａｓｅｓ、ｐ 、１０３−１１４．　Ｉｎ　Ｇ、Ｅ、Ｐｉｅｒｃｅ　（ｅｄ、）、Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔｓｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏ ｌ　３１．５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、　０ｈｉｏ、　１９９０　）に準じてスブ正を 加えた。ＩＧＴＳ８コロニーの細胞を個別にＬＢプレートに小断片（０，５ｃｍ ）として移して、３０°Ｃて２４から３６時間インキュベートした。次に、この 断片から大量の細胞をそれぞれ硫黄源を欠落させであるＰＭＳ−１％アガロース ・プレート上に移した。直ちにこれらプレート上に０．１％ＤＢＴエチルエーテ ル溶液を噴霧した。ＰＭＳ−ＤＢＴプレートを３０°Ｃて最低１８時間インキュ ベートし、短波長（２５４ｎｍ　）紫外線照射下、断片の周囲の蛍光産物を検知 した。

硫黄生体利用性アッセイ ３０°Ｃて２４から４８時間ＰＭＳ培地中でＩ　ＧＴＳ　Ｆ３をインキュベート し、細胞を遠心分離処理でペレット化し、その後２回、硫留を含まないＰ　Ｍ　 Ｓて洗浄した。洗浄後細胞は、０．２％濃度のＤＢＴ、　ＤＢＴ−スルフ十キサ イド、ＤＢＴ−スルフォンのいずれかを唯一の硫黄源として含む、ｐｈｉｓに接 種した。種培養は６０Ｏｎｍに於ける初期吸光度（Ａ、。、）が０．０２になる ように調整した。培養は３０°Ｃて行い、増殖をＡ、。。で追跡した。ＤＢＴで 培養した細胞については、上清について種々の時間間隔て、短波長紫外線下に蛍 光物質の産生の観察を行った。

肇して単離した。大量のコスミドの調製はビルンボイムとドーリ−（Ｂｉｒｎｂ ｏｉｎ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ　）　（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、　７ ：１４１３−１４２３．１９７９）に従って行った。ＤＮＡハイブリダイゼーシ マー法を用いて、”Ｐ−ｄＣＴＰ（アマジャム）でラベルした。

ＩＧＴＳ８の紫外線突然変異誘発 Ｉ　ＧＴＳ　８はしＢ中３０°Ｃ−晩でインキュベートし、約３０００コロニー フオーミングユニツトを新しいＬＢプレート上に塗布した。これらのプレートは 直ちに３．５ｃｍの距離で短波長（２５４ｎｍ）紫外線を５〜２０秒間照射した 。プレートはさらに３０°Ｃで４８時間又はコロニーが形成するまでインキュベ ートした。スプレー・プレート・アッセイにより、５０％以上の細胞か死滅した プレート上のコロニーについて、ＤＢＴの代謝能あるいは脱硫能を試験した。

ボーレーション（Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ、　Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ。

Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、　ＣＡ　）によって、プラスミドＤＮＡで形質転換した。こ れらの細菌はＬＢ中３０°Ｃて２４から４８時間培養し、Ａ６゜。

が０．１５になるように新しいＬＢで希釈してさらに、４時間３０℃で培養した 。細胞は遠心分離により回収し、４〜５回０．３Ｍのシュークロースで洗浄した 後、０．５Ｍのシュークロースで５×１０’個／ｍＬ程度となるように再懸濁し た。この細菌溶液４０μＬを氷冷した０、　２ｃｍのエレクトロボーレーション ・キュベツト（Ｂｉｏｒａｄ　）に分取した。細胞を８００オームでパルス・コ ントローラーを用いて２５μＦ、２．５ｋｖの条件でパルスした後直ちに０．５ Ｍシュークロースを含むＬＢｌｍｌで希釈した。１時間３０°Ｃて細胞をインキ ュベートした後、適当な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３０℃でコ ロニーが形成するまで培養した。ロドコッカスプラスミドであるｐＲＦ２９の複 製起点をそのプラスミドがもっている場合には４８時間後にコロニーが識別でき た。ｐＲＦ２９の起点をもっていない場合には４から５日間後にコロニーが現れ た。

ンにより形質転換したが、増殖率が低いのてＡ、。。が２程度になるまでＬＢ中 で一晩培養した。この細胞をシュークロースの代わりに蒸留水で洗浄し、再懸濁 した。パルス・コントローラーを４００オームにセットし、回復期間をエレクト ロポーレーノヨン後４時間としてＬＢ中で培養し、選択培地上に展開した。大腸 菌プラスミドを用いたＲ、ファシアンス０１８８−５の形質転換を成功させるに は、操作の前にＤＮＡをＣｐＧメチラ）を用いてインビトロでメチル化する必要 があった。

ガス・クロマトグラフィー、マス・スペクトロメトリーＬＢ中３０°Ｃて、細胞 を一晩培養した後、５０ｍ１のＰＭＳ最小培地に１００μＬを接種した。４日間 ３０°Ｃて培養し、硫黄元素を含まないＰＭＳて２回洗浄後、ペレット化した細 胞を、唯一硫黄源として０．１％のＤＢＴを含む５０ｍＬのＰ　Ｍ　Ｓに接種し た。この細胞を２４時間３０°Ｃで培養し、上清は一２０°Ｃで凍結保存した。

Ｒ、ファシアンス旧８８−５のアッセイにはインキュベージヨ一時間を２から３ 倍にした。

簡単に述・＼ると、サンプルの上清（５０ｍｌ程度）を融解し、残存不溶性物質 は遠心処理により取り除いた。透明な上ｉｎは、塩酸を用いてｐＨ１，０に酸性 化し、ついて５０ｍ１の酢酸エチルで３回抽出した。遠心処理時の不溶性物質も また酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせて無水塩化カルシウムて 乾燥し、濾過後口−タリー・エバポレーターで酢酸エチルを除去した。既知量の 内標準物質（オクタデカンのクロロホルム溶液）をサンプルに加え、ＧＣ／ＦＩ Ｄ　（ガス・クロマトグラフィー／フレーム・イオニゼイシコン・ディテクショ ン）およびＧＣ／ＦＴＩＲ／ＭＳ　（ガス・クロマトグラフィー／赤外フーリエ 変換／マス・スペクトロメトリー）を用いて分析した。ジアゾメタン・エーテル 溶液で処理することにより、酢酸エチル抽出液中のまたは抽出後の水層中の酸性 成分のメチル化をいくつかのサンプルで行った。

分析は先に述べた連動ＧＣ／ＦＴＩＲ／λＩＳシステム［ディールら（３−４４ ８，１９８７］で行った。このシステムはＡＧＣで稼働するＦ１ｎｎｅｇａｎイ オン・トラップ（ＩＴＤ　８００　）とＮ１ｃｏｌｅｔ　２０ＳＸＢフーリエ変 換赤外吸収計から成る。ガス・クロマトグラフィーは、３０ｍｘ０．３２ｍｍの ＤＢ５カラム（１，０ＭｍＮ厚）、３３０°Ｃて計測した流速が２．０ｍｌ／分 のヘリウム・キャリアーを用いた。ニスルフォキサイドや、スルフォンは熱に不 安定で、分流、非分流インジェクター中で分解するために、サンプル下に示す。

注入時は４０℃、８０℃までは２０℃／分、２００℃までは５°Ｃ／分さらに３ ３０″ＣまてｌＯ°Ｃ／分の速度で温度を上昇させ、そして５分間保持した。Ｇ Ｃ／ＦＩＤでの分析もＨＰ　５８８０Ａを用いて同様のカラムと同様の流速、オ ーブン温度プログラムで行った。

結果 ての遺伝子が発現するとは限らず、またすべての蛋白生成物が活性を保持してい るものでもない。クローン化脱硫遺伝子の宿主細胞での発現を確実にするために 、ＤＢＴの脱硫不可能なＲロドクロウスＩ　ＧＴＳ　８の変異体を単離した。こ の変異株をクローニングの受容体として用いることにより、細胞環境か遺伝子の 発現と蛋白質の機能に対して適当であることを保証し、これによってその相補性 によるクローン化脱硫遺伝子のスクリーニングが可能となった。

ＲロドクロウスＩＧＴＳ８を紫外線への曝露によって変異させ、１０００個の生 存株についてＤＢＴスプレー・プレート・アッセイにより紫外蛍光産物の産生能 をスクリーニングした。３個の脱硫活性を保持していない可能性のある変異株を 選ひ出し、硫黄生体利用性アッセイで再評価した。２個の変異株（ＵＶ１．　Ｕ Ｖ２３と呼ぶ）はＤＢＴまたはＤＢＴ−スルフォンを唯一硫黄源として利用でき ない株であったためＤｓｚ−のように思われた。ＤＢＴの存在下で培養したとき ても変異株ＵＶＩは、ＧＣ／ＭＳ角￥析したところ、ＤＢＴを２−１（ＢＰまた は他の中間体に代謝することができなかった。従って、ＵＶ１株をＤｓｚ−とみ なして、脱硫遺伝子を持つクローンを識別するための相補研究用の宿主として用 いた。

脱硫遺伝子のコスミト・クローニング Ｄｓｚ＋由来元生物である１ＧＴｓ８のＤＮＡを、コスミド・ベクター、　ＰＬ ＡＦＲ５におけるライブラリー構築に利用した。このライブラリーを大腸菌５Ｉ ７−１に移植し、約２５．０００のコロニーからプラスミドを単離した。このコ スミドをＲ，ロドクロウスＵＶｌにエレクトロポーレーションすると、ＤＮＡ　 Ｉμｇ当たり３００程度の形質転換体が得られる効率でＩＧＴＳ８の変異種Ｄｓ ｚ−か得られた。種々の数のＵＶＩ形質転換体を保存し、３０°Ｃて１８時間イ ンキュベートした後、細胞を硫黄フリーのＰＭＳで２回洗浄し再懸濁した。約７ ＸＩＯ”個の保存細胞を唯−硫黄光源としてＤＢＴを含むＰＭＳｌｏｏｍｌに接 種した。ＤＢＴの脱硫反応によって２−ＨＢＰが生成すると考えられ、それは紫 外線下で蛍光を発する。従ってバッチ毎に３０°Ｃて培養し、上清を蛍光判別に 用いた。約３３００のＵＶＩ形質転換体が４バツチ中に見いだされた。１バツチ （約６００の形質転換体に相当）中にその上清に紫外線蛍光物質が見いだされて くるのは５日間培養してからてあった。個々のコロニーを単離した。これらのう ち１２個がＤＢＴを添加すると蛍光物質を産生じ続けた。

これらの単離株からコスミトＤＮＡを回収する試みは失敗した。そこでコスミド が既にＵＶ１株の染色体中に組み込まれているかとうかを決定するために、サザ ン・ハイブリダイゼーションを行った。７個の形質変換法より単離した染色体を グの後、その断片をｐＬＡＦＲ５由来２２Ｐｆｆ識プローブを用いてハイブリダ イズした。テストした形質転換株総てにおいて、ｐＬＡＦＲ５プローブは、約２ ０ｋｂのＤＮＡ断片にハイブリダイズされた。一方、対照Ｉ　ＧＴＳ　８ゲノム には、ベクター由来のプローブはハイブリダイズしなかった。従って、脱硫陽性 コスミドクローンはＵＶ１株の染色体中に組み込まれていることが明らかになっ た。

プラスミドが染色体に岨み込まれていることがら、プラスニドのクローニング・ サイトの一端と結合しているゲノムＤか相同組換えによるか異質組換えによるか にがかわらず、これは正しい）。３種の脱硫陽性の形質転換体から、挿入され第 １ら酵素はＰＬＡＦＲ５の挿入されたプラスミドポリリンカー領域１箇所のみを 切断するので、Ｉ　ＧＴＳ　８由来近傍の染色体断冷と結合した無傷のｐＬＡＦ Ｒ５を得ることができた。切り出さ第１たＤＮＡ断片を自己接合（約２０ｎｇ／ μＬの濃度）さ１−しスキュークｏ−ンはＴＧＴｓ８ＤＮＡ（７）２．ｌｋｂ断 片を、ＢａｍＨ）レスキュークローンはＩＧＴＳ８ＤＮＡの１．６５ｋｂ断片を 保持していた。

ＥｃｏＲＩレスキュー実験により得た２、ｌｋｂのＩ　ＧＴＳ　８ＤＮＡは、標 識ＤＮＡプローブ合成の鋳型として用いた。そのプローブは、大腸菌中の元のイ ンタクトなコスミド・ライブラリーのコロニーにハイブリダイズした。５０００ ｆｌｌのコロニーのうち１７個がＩＧＴＳ８プローブとハイブリダイズした。そ れぞれのクローンから単離したコスミドＤＮＡは、［ＵＶ１株に形質転換された 。１７８のＤＮＡ調製物中の３ｇがＤｓｚ−表現型を相補した。

ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌｌｒを用いることによりこの領域の制限酵素地図を作成 した。２．　ＩｋｂのＩ　ＧＴＳ　８ＤＮＡプローブは、４．５ｋｂのＥｃｏＲ Ｉ断片とハイブリダイズした。Ｄｓｚ十表視表現型与した総てのコスミト・クロ ーンは、４．５ｋｂ　（７）　Ｅ　ｃｏＲＴ断片と、４．５ｋｂのＥｃｏＲｌ− Ｈｌｎｄｌｌ［断片の一部および、＋８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の一部を持ってい た。これらの結果より、脱硫遺伝子旧５ｋｂ領域中に存在していることが示され た。

−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片をＰＬＡＦＲ５にサブクローニングしたが、いず１５．０ ｋｂ断片とＧＥｉＫのＥｃｏＲＩＩ８ｋｂ断片をＰＬＡＦＲ５にサブクローニン グした結果、それぞれがら、プラスミドｐｓＡＤ６０−２８．　ｌ］５ＡＤ４８ −１２．１］５ＡＤ５６−６７’ｌ＜　得うｈ　タ。ソコでＵｖｌニ形質転換す ると、制限酵素地図により決定されたＤｓｚ十表視表現型置と一致して、これら ３種全てがスプレー・プレート・アッセイにおけるＤＢＴ由来の蛍光物質を生成 した。さらにこの領域のザブクローニングを続けることにより、関連遺伝子した 。一方ＵＶｌＤＮＡに対してはハイブリダイズしなかったことより、二のＵ■１ 変異は単純なポイント・ミュウテーションではなくて、ある一定値域の欠落によ ることが示された。

ＰＳＡ０４８−１２を用いるＵＶＩのエレクトロボーレーションの結果は、典型 的な低い形質転換効率（５５０／μｇＤＮＡ程度）であり、形質転換体の約５０ ％のみがＤｓｚ十表視表現型した（恐らくクロモソームとの組換え中にＤＮＡを 欠損したか、さらなる組換えによるものであろう）。形質転換効率を改善す断片 はロドコッカスプラスミドの複製起点を含んでおり、ｐＳＡＤ７４−１２がプラ スミドとしてＵＶ１株中で複製することを可能にした。このクローンは、１０４ 形質転換体／μｇＤＮＡ以上の効率てＵＶＩを形質転換した。これら形質転換株 はほぼ１００％、Ｄｓｚ十表視表現型した。ＵＶＩより直接プラスミドを調製す るとその収率は期待に反して極めて低く、微量標品ＤＮＡはアガロース・ゲル上 で認められなかった。しかしながら、Ｕｖ用でき、それから大量のプラスミドが 調製された。

レー・プレート・アッセイて測定した。陽性を示すコロニーは認められなかった 。その可能性として、Ｉ　ＧＴＳ　８　ＤＮＡ８のプロモーターを認識できなか ったからではないかと考えｋｂ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ＳＫ− とＫＳ−、にサブクローニングしたが、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅで、どのクロー ンもＤｓＺ十表視表現型現していなかった。導入した遺伝子の転写あるいは翻訳 か非効率であることによるのか、または過剰に発現である。

クローニングされた遺伝子が大腸菌において発現しないか識配列を複数個有して いることから、イン・ヒドロで、ＣｐＧｇＤＮΔの効率て得た。これら形質転換 株はスプレー・プレート・アッセイでＤｓｚ十表視表現型察され、そして液体培 地上清のＧＣ分析によりＤＢＴから２−ＨＢＰの生成が明らかにされた。

第２の種としてＲロドクロウスＡＴＣＣｌ３８０８にｐＳＡＤ７４−１２の形質 転換を試みたが、非メチル化またはＣｐＧメチル化プラプラスミド用にもかかわ らず効果はなかった。広範囲の条件でテストしたにもかかわらず、ＡＴＣＣｌ３ ８０８に対するエレクトロポーレーンヨンの条件が不適当であったためてはない かと考えられる。より可能性のあることとして、ＡＴＣＣｌ３８０８にはＣｐＧ メチル化によっても阻害されない何らかの制限系か存在するのではないか。

２−ＨＢＰは主要な脱硫産物である Ｒ　ロドクロウスＩＧＴＳ８にょるＤＢＴの主代謝物は２−ＨｅＰであり、小量 の２−ヒドロキシビフェニル−２−スルフィン酸（ＤＢＴ−スルティン）と２− ヒドロキシビフェニル−２−スルフォン酸（ＤＢＴ−スルトン）が存在すること がＧＣ／λ１ｓ分析により同定された［オルソンら（Ｏｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 ）　、　Ｅｎｅｒｇｙ　＆Ｆｕｅｌ辷印刷中、　１９９３］。これらの産物はこ の実験においてＩＧＴＳ８によっても産生された（表２）。Ｒ，ファシアンス０ １８８−５とＲ，ロドクロウスのＤｓｚ−変異株ＵＶＩは、ＤＢＴがらこれらＤ Ｉ８８−５をプラスミドｐＳＡＤ７４−１２で、Ｒ，ロドクロウスＵＶｔ変異株 をプラスミドｐｓＡＤＩ０４−１０て形質転換すると、これらの細菌はＲロドク ロウスＩＧＴＳ８て同定されたものと同一のＤＢＴ由来の生産物を産生じた（表 ２）。特に２−ＨＢＰが大量に得られる二とから、ＩＧＴＳ８由来の導入遺伝子 の産物により炭素−硫黄結合に特異的な脱硫が媒介されていることが示された。

”ｊ　フクローンノ−ッｐｓＡＤ９０−１＋　１；を恐ら＜　ｐｓＡＤ１０４− １０中に導入されたものと同一の断片を保持していると考えられるが、Ｒロドコ ッカスＵＶＩに導入するとこの二つのプラスミドは異なる結果を産みだす。プレ ート・アッセイにおいて、ｐＳＡＤ＋０４−１０を含むコロニー付近からＤＢＴ の被膜が消失し、澄み切−た領域（ｃｌｅａｒ　ｚｏｎｅ）が現われ、蛍光光幅 がコロニーの周囲光物質は産生されてなかったが、コロニーの周囲にはＤＢＴの 明瞭な領域が認められた。ＧＣ／＆ＩＳ分析より、ｐｓＡＤ９０−１１を含む細 胞は、２−ＨＢＰを産生しないが、顕著なりＢＴ−スルトンを蓄積することが認 められた（表２）。スルトンは親株であるＵ■ｌでは蓄積しない（データは示し ていない）。これらの観察は、ＥｃｏＲＩ９．Ｏｋｂ断片をｐｓＡＤ９０−１＋ 　１ニーｔブクローニンクすることによりこのＤＮＡが損傷し、スルトンを２− ＨＢＰに変換する酵素をコードしている遺伝子群を不活性化してしまうことを意 味する。以上から、脱硫には少なくとも２種の酵素がかかわっていること、スル トンはこの経路の中間体である二とが示唆される。この結果は、最初の単離株で あるＲ、ロドクロウスｌ　ＧＴＳ　Ｂ中で検出された代謝物の種類と一致しａ　 生成物：　ＤＢＴ、ジベンゾチオフェン：　ＤＢＴＯ，ジベンゾチオフェン５− オキシド（スルフオキシド）；ＤＢＴＯ，ジベンゾチオフェン５．５−ジオキシ ド（スル）オン）；ＤＢＴ−スルトン、２−ヒドロキシビフェニル−２−スルフ ォン酸（ジベンズ［ｃ、　ｅ］［１，２１−才キサチイン６．６−ジオキシドと して検出された）；ＤＢＴ−スルチン、２−ヒドロキシビフェニル−２−スルフ ィン酸（ジベンズ［ｃ、　ｅ］（＋、　２］−才キサチイン６一才キシドとして 検出された）、ジベンゾチオフェン・スルフォン；　２−ＨＢＰ、　２−ヒドロ キシビフェニル（Ｋｒａｗｉｅｃ、　ｐｇ、　＋０３−１１４．　Ｉｎ　Ｇ、　 Ｅ、　Ｐｉｅｒｃｅ（ｅｄ、）、　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕ ｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ　３１、５ｏｃｉｅｔｙ　 ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ 、　０ｈｉｏ。

１９９０　）。

にサブクローニングし、さらに複製起点はｐＲＦ２９由来。

Ｃ変異させた、ＩＧＴＳ８由来のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　ＤＮＡ９．Ｏｋｂ断片をｐ ＬＡＦＲ５にサブクローニングし、さらに複製起点はｐＲＦ２９由来。

ｄ　ＩＧＴＳ８由来のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ［１５，０ｋｂ ＤＮＡ断片をｐＬＡＦＲ５にサブクローニングし、さらに複製起点はｐＲＦ２９ 由来。

ｅ　代謝物存在は、相対的な量を過剰量（＋十＋＋＋）から極めて少量（＋）、 すなわち微量として表した。

唯一硫黄源として含む最小培地中でインキュベートした。その化合物は、ＤＢＴ 、　ＤＢＴ−スルフオキシド、あるいはＤＢＴ−スルフォンである。ＩＧＴＳ８ はＤＢＴ−スルフオキシドにより供給される硫黄を利用できなかったが、ＤＢＴ またはＤＢＴ−スルフォンの存在下では盛んに増殖した。ＤＢＴ−スルフオキシ ドは、リッチ・メディウム（ＬＢ）中で成育させた細胞に対して無害であった。

よって、ＩＧＴＳ８には、ＤＢＴ−スルフオキシドの輸送能や、利用能が欠損し ているのかまた別の要因としてＤＢＴ−スルフオキシドは脱硫経路の真の中間体 ではない可能性が考えられる。

実施例４．　サンガーらの方法による、ＴＧＴＳ８の脱硫生物触媒をコードする 遺伝子または遺伝子群を含むＥＣＯＲｌ−３ＡＵ３Ａ　１９７６３ヌクレオチド 断片のＤＮＡシークエンシング 由来元生物（Ｉ　Ｇ　Ｔ　Ｓ　８　５ｏｕｒｃｅ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）より単離 された。サンガーらのジデオキシ・チェーン−ターミネータ−法（＋９７７）　 、チェーン−ターミネーション阻害剤によるＤＮＡシー　’）　エンシンク７４ 　ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、　ＡＣＡＤ、　ＳＣ１，ＵＳＡ　５４６３−５４６７、 修飾されたＴ７Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（ＵＳＢ）および［α−３ＳＳ　］　− ｄＣＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってＤＮＡの両鏡よりその断片のＤＮＡ配 列を決定した。ＤＮＡシークエンシングのための欠失クローンは、ｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中において、エキソヌクレアーゼＩＮと ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）の方法（１９ＧＥＮＥ　３５１−３５９、を用い て行った。

１４１種の個々の欠失クローンの配列を、９７６３ヌクレオチド断片の完全な再 構築に用いた。コンピューター化シークエンス・アッセンブリーはＤＮＡ　１ｎ ｓｐｅｃｔｏｒｌｌ　（Ｔｅｘｔｃｏ、　Ｈａｎ。

ｖｅｒ、　ＮＨ）を用いて行った。ＤＮＡ配列は、各々の鎖について独立に決定 したが、両鏡共に９７６３ヌクレオチド断片の完全な配列決定はできなかった。

一方のＤＮＡＩから決定された配列は、９７６３ヌクレオチドのうちの９５％を カバーした。他方のＤＮＡ鎖からは、９６％の配列が決定された。９７６３ヌク レオチド断片の全配列は、少なくとも２種の独立した欠失クローンから決定され た。

実施例５　：　ＰＴＯＸ［−１の塩基配列とそこにコードされたオーブンリーデ ィングフレーム（０ＲＦＳ）のさらなる解明；　ＤＳＺ＋プロモーターの工学技 術：異種の宿主微生物でのＤＳＺ十表視表現型現；脱硫遺伝子発現の産物ツマキ シセル分析（ＭＡＸＩＣＥＬＬ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ） 脱硫クラスターの構成 ｐＴＯＸＩ−１の塩基配列決定から、これは下の配列リストに結果を示している が、クローンの一つの鏡上に三つのほとんど隣接するオーブンリーディングフレ ーム（ＯＲＦｓ）が予想された（図７）。それぞれのＯＲＦの大きさは、ＯＲＦ 　１については１３５９塩基（塩基対７８６−２１４４）　、ＯＲＦ　２　ｉ： ツィテ１ｔ１０９５塩基（塩基対２１４４−３２３８　’）　、ＯＲＦ　３につ いては１２５１塩基（塩基対３２５２−４５０２　’）と予想された。以下に述 べられているサブクローン分析によって、ＯＲＦ　１．２．３はＤＢＴの２−Ｈ ＢＰへの変換に必要であり、これらのＯＲＦによってコードされたすべての遺伝 子は一個のオペロンとして単一の転写産物に転写されることが明らかとなった。

以下に述べられているすべてのサブクローンは、大腸菌−ロドコッカスのシャト ルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ）　ｐＲＲ−６中に維持されている 。それぞれのサブクローンの活性は、Ｄｓｚ−株ＣＰＥ−６４８の形質転換株を 栄養物豊富な培地（ＲＭ）で４８時間成長させることによって測定した。培養物 １　ｍｌは、１００μＭ以上の濃度のＤＢＴまたはＤＢＴ−スルフォンを補った ＢＳＭ　２５　ｍｌに接種するのに用いた。培養物は４８−１２０時間後に脱硫 産物について分析した。それぞれのサブクローン化された断片の一覧図は、図８ に示しである。

続く研究では、サブクローンはクロラムフェニコールを含んだ栄養物豊富な培地 中で培養し、それから１００μＭのＤＢＴまたはＤＢＴ−スルフすンを補ったＢ ＳＭに変更した。培養物は３ｏ″Ｃで２−５日振盪し、）ＩＰＬＣで脱硫産物を 分析した。

Ａ、ｐＥＮＯＫ−１：　ｐＴＯＸＩ−１（７）４．Ｏｋｂノｓ　ｐ　ｈ　１断片 ヲ含ムサフクローンを構築した。この断片はＯＲＦ　１と２にわたっているがＯ ＲＦ　３は途中て切れている。ｐＥＮＯＫ−１を含む形質転換株の分析によって 、ＤＢＴとインキュベートしたときに生産物の産生がないことが明らかとなった 。しかしながら、これらの形質転換株はＤＢＴ−スルフォンから２−ＨＢＰを産 生できた。

Ｂ、ｐＥＮｏに−２：　ｐＴＯＸｌｌの３．６ｋｂの５ａｃｌ断片を含むサブク ローンが横築された。この断片はＯＲＦ　２と３を含んでいるが、ＯＲＦ　Ｉは 途中で切れている。ｐＥＮＯＫ−２形質転換株の分析によって、ＤＢＴ又はＤＢ Ｔ−スルフォンのどちらからも、との脱硫産物もつくられないことが明らかとな った。ＯＲＦ　２又は３から検出可能な活性が全く欠損していることは、転写が 単一の上流プロモーターによって媒介されているオペロンとしてＯＲＦが配置さ れていることを示唆している。推定できるように、このプロモーターはこのサブ クローンでは除かれている。

Ｃ，ｐＥＮＯＫ−３：　ｐＴＯＸ［−１の１．１ｋｂのＸｈｏｌ欠失変異体を構 築した。ＯＲＦ　Ｉ　と２の両方が切られている。ＯＲＦ　３は完全な状態で残 っている。ｐＥＮＯＫ−３を保持している形質転換株は、ＤＢＴからＤＢＴ−ス ルフォンの産生を示す。ＤＢＴまたはＤＢＴ−スルフォンのいずれからも、２− ＨＢＰの生成は検出されなかった。

また、ヌクレオチドレベルでは、この蟹の欠失は中心的な変異とはならないこと を注意すべきである。塩基配列は、おそらく不活性な融合蛋白質を生成するＯＲ Ｆ　ｌと２のフレーム内のスプライシングを予想させる。しかしながら、終止コ ドンを避けることによって、推定的な単一のｍＲＮＡ転写がリボゾームによって 保護されて残存し、ＯＲＦ　３の翻訳を可能としている。０ＲＦ−３の産物の、 ＤＢＴからＤＢＴ−スルフォンを生成する能力によって、ＤＢＴ−スルフォンが ＩＧＴＳ８の炭素−硫黄結合に特異的な生物触媒による脱硫経路における真の中 間産物であることが明らかとなる。

Ｄ、ｐＥＮＯＫ−１１：　ｐＴＯＸ［−１からの３．４ｋｂのＮｃｏｌ断片が、 ｐＲＲ−６の唯一のＮｃｏ１部位へサブクローン化された。この断片は、すべて の０ＲＦ２と３を含むが、ＯＲＦ　１の５゛末端が切れている。ｐＥＮＯＫ−１ １を導入した形質転換株は、ＤＢＴ　−ＰＤＢＴ−スルフォンに対して脱硫に特 異的な酵素活性を示さなかった。これはコードされている必須の領域がこの断片 に接していることを示している。これは全クラスターが、サブクローンｐＥＮＯ Ｋ−２で議論されたように単一の転写産物上に発現しているという予測と一致す る。もう一度、遺伝子の転写のためのプロモーターはこのサブクローンには存在 しない。サブクローンＩ）ＥＮＯＫ−１３（下記）は、この予測を確証する。

Ｅ、ｐＥＮＯＫ−１３：　２．６　ｋｂの５ｐｈＩ−Ｘｈｏｌ欠失のあるｐｒｏ ｘ＋−１のサブクローンか構築された。このサブクローンは完全なＯＲＦ　３の みを含んでいる。ＯＲＦ　１は完全に欠損しており、ＯＲＦ　２は途中で切られ ている。このサブクローンは、ＤＢＴまたはＤＢＴ−スルフォンに対して脱硫特 異的酵素活性を全く示さなかった。この結果は、ＤＢＴからＤＢＴ−スルフォン の生成を示したｐＥＮＯＫ−３の表現型と比較すべきである。ｐＥＮＯＫ−１３ はより小さな５ｐｈｌ／Ｘｈｏｌ断片の欠失が加わっているという点でｐＥＮＯ Ｋ−３とは異なっているので、このことは、遺伝子発現に必要なのは１．６ｋｂ の５ｐｈｌ／Ｘｈｏｌ断片の中の要素であることを示している。塩基配列決定か らこの領域には重要なＯＲＦが含まれていないことが明らかとなったので、この 領域にはプロモーターエレメントが存在するかもしれないと仮定される。

Ｆ、ｐＥＮｏに−１６脱硫クラスターからほとんどすべての不必要な配列を除去 したｐＴＯＸＩ−１のサブクローンが設計された。この構築物は、配列の上流の ２３４塩基対に加えＯＲＦ　１．２．３のすべてを含む、おそらく完全な脱硫の ために必要なすべてのる。このプラスミドを保持するＣＰＥ−６４８は、ＤＢＴ とＤＢＴ−スルフォンを２−ＨＢＰに変換する能力を持っていた。ｐＥＮＯＫ− １６は従って、完全な脱硫の表現型を示す、今までのところ観察された最も少量 のクラスターを示している。

Ｇ、　ｐＥＮＯＫ−１８：　：ノ”ｌ−ブｌ）　ロー　ンｌ；！、ｐＴＯＸｌｌ 　（７）Ｎ　ｓ　ｉ　Ｉ　−Ｂｆａｌ断片を含んでいる。Ｎｓｉ１部位はＯＲＦ 　１の予想された開始部位の２３塩基対下流に存在する。このサブクローンを保 持するＣＰＥ−６４８は、ＤＢＴとＤＢＴ−スルフォンの両方の脱硫活性を欠損 している。このサブクローンは、おそらくプロモーター領域が除去されており、 最初の構造遺伝子が短く切られている。

Ｈ，ｐＥＮＯＫ−Ｎｓ　ｉ　：　ＯＲＦ　１の開始部位をより深く解明すること を助けるため、ＯＲＦ　Ｉの予想される開始部位の２３塩基対下ＤＮＡポリメラ ーゼで両端を平滑化することによって作成した。もしＮｓｉ１部位が最初の構造 遺伝子の中にあるならば、このフレームシフトを伴う変異はＯＲＦ　Ｉで早い終 止シグナルを起こすであろう。ｐＥＮＯＫ−Ｎ　ｓ　ｉの形質転換株はＤＢＴか らＤＢＴ−スルフォンを産生ずることが可能であった。しかしながら、２−　Ｈ Ｂ　Ｐの生成は全く検出されず、これは変異が必須の構造遺伝子を破壊したこと を示している。

続く研究においては、０ＲＦ−３にコードされたオキシダーゼの明らかな発現に より、このクローンではおそら＜　０ＲＦ−２の産物もまた発現していることが 考えられた。従って、０ＲＦ−２単独てはＤＢＴ−スルフォンの更なる代謝は不 可能である。

サブクローンが構築された。このサブクローンはＯＲＦ　＋の活性のみを示すは ずである。このサブクローンを保持するＣＰＥ６全く示さなかった。

ｐＥＮＯに−ＮｓｉとｐＥＮＯＫ−１９の結果は、両方併せると、０ＲＦ−１と ０ＲＦ−２の産物がＤＢＴ−スルフォンをさらに代謝するためには同時に発現し ていなければならないことを示唆している。

Ｊ、ｐＥＮｏに−２０：　ＯＲＦ　ｌから分離してＯＲＦ　２と３の機能を評価 するために、ＯＲＦ　２と３に及ぶＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で 増幅した。プライマーＲＡＰ−１（５雷−ＧＣにＡＡＴＴＣＣＧＣ八ＣＣＧＡＧ ＴＡへＣ−コ嘲　、　２０６２−２０８２　塩基対）　とＲＡＰ−２（５菅−Ａ ＴＣＣＡＴＡＴＧＣにＣＡＣＴＡＣＧＡＡＴＣＣ−３１，４９０８−４８８６塩 基対）は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９２　ＤＮＡ／ＲＮＡ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。太字のヌクレオチドは、サブクローニング のための制限部位を作成するために鋳型の配列から変更した。従ってプライマー ＲＡるＧｅｎｅＡｍｐにＮ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）とＰｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ９６００　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒて行っ た。パラメーターは次の通りであっｔこ。

鋳型　ｐＭＥＬＶ−１プラスミドＤＮＡ　０．２　又ハ２．　Ｏｎｇプライマー 　ＲＡＰ−１０，５又は０．２μＭＲＡＰ　−２０，５又は０，２μＭ サイクル：　ＩＸ＠　９６°Ｃ２分 ２５Ｘ＠　９６℃　３０秒 ５２°Ｃ３０秒 ７２℃　２分 増幅によって、予想された２８４６塩基対の断片が生じた。ＯＲツマ−ら：　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（＋９９２）　６　（１６）、 　２３７７−２３８５１　、プラスミドｐＯＴＴｏ−１を得た。最後に、工学技 術でつくった制限部位を用いた連結は不成功であったという事実のため、平滑末 端連結を増幅した産物のサブクローニングに用いた。この融合体は、シャトルベ クターρＲＲ−６に連結し、プラスミドｐＥＮＯＫ−２０を作成した。ｐＥＮＯ Ｋ−２０のＣＰＥ６４８形質転換株は、プロモーター誘導のためＤＢＴと２５μ ｇ　／　ｍ　Ｌのクロラムフェニコールの存在下で増殖させた。すべての形質転 換株は、おそらくサブクローンｐＥＮＯＫ−３で示されたように、０ＲＦ３の活 性により、ＤＢＴをＤＢＴ−スルフォンに変換した。０ＲＦ２の存在下てＤＢＴ −スルフォンをさらに処理することができないことは、ＯＲＦ　２の産物が単独 ではＤＢＴ−スルフォンを基質として用いることができないことを示唆している 。これはｐＥＮＯＫ−Ｎｓｉから得られた結果と一致しており、０ＲＰ−２単独 ではＤＢＴ−スルフォンを基質として用いることができないことを示唆している 。

ＯＲＦ　１．２．３の遺伝子産物の割当て先のサブクローン分析に基づいて、ｐ ＴＯＸ１１配列中に存在するそれぞれのＯＲＦに対して機能が仮定的に割当てら れた。

ＯＲＦ　３はＤＢＴをＤＢＴ−スルフォンに変換させることが可能なオキシダー ゼについて責任を持つと同定できる。サブクローンｐＥＮＯＫ−３はこの活性を 非常にはっきりと示している。ＯＲＦ　１と２は、ＤＢＴ−スルフォンの２−Ｈ ＢＰへの変換に責任があるよってある。このアリルスルファターゼ活性は、サブ クローンｐＨＮ０Ｋ−１で証明される。しかしながら、サブクローンｐＥＮＯＫ −１９とｐＥＮＯに−２０は、ＯＲＦ　Ｉ　と２のどちらも単独では中間体ＤＢ Ｔ−スルフォンを同等変換できないことを示している。これは０ＲＰｌと２の蛋 白質産物が炭素−硫黄結合の両方を切断するのに共同して働くことを示唆してい る。たぶん、これは蛋白質のへテロニ量体の配置を通して、または一つの蛋白質 のもう一方の蛋白質への制御機能を通して達成されているのであろう。実施例３ に示されている平行した研究の結果は、０ＲＦ−１がＤＢＴ−スルフォンをＤＢ Ｔ−スルトンに変換する酵素をコードしていることを示唆している。ｐＥＮＯＫ −１９（完全な本来のプロモーターと０ＲＰ−１）を保持するＣＰＥ−６４８の 長時間のインキュベーションは、ＤＢＴ−スルフォンの消失も新しい産物の産生 も全く示さなかった。これは実施例３から導かれた示唆と矛盾する脱硫の比活性 を増加させることは、本明細書に述べられている研究の重要な目的である。この 目標を達成する方法の一つは、本来のプロモーターを脱硫遺伝子クラスターのよ り高い発現、構成的な発現を作り出すことのできるものと置き換えることである 。ロドコッカスのプロモーターで報告され特性が調べられたものはほとんどない ため、ランダムなゲノムライブラリーを作成し、二つの系でプロモーター活性を スクリーニングにかけた。一つでは、このレポーター（伝達するもの、ｒｅｐｏ ｒｔｅｒ）は上で議論されたプラスミド構築に用いられたクロラムフェニコール 耐性遺伝子である。他方では脱硫クラスターそれ自身がレポーターとして用いら れている。

プロモータースクリーニング例Ａ、　クロラムフェニコール耐ツムのＤＮＡが、 プロモーターを持たないクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にクローン化さ れた。その結果得られたライブラリーは、次いでロドコッカスに導入して形質転 換を起こさせ、クロラムフェニコール選別にかけた。プラスミドは、おそらくベ クターの不安定性のため、これらの中の一つからのみ単離されたにもかかわらず 、四つの明らかなプロモーターエレメントがｐＲ）ＩＯＤＯＰＲＯ−２によって レスキューされた。安定なプラスミドＲＰ２−２Ａは配列分析にかけた。技術的 な問題か、これらのベクターの中で用いられたＮａｒ■のクローニング部位の制 限酵素による処理で認められた。不幸にもＮａｒＩ酵素は厳格な部位−選択性を 示し、ベクターをあまり分解しないよってある。簡便さおよび唯一の制限部位と いう条件を欠いたことがこれらの研究の進行を遅くしたにもかかわらず、新しい ベクターがこの問題を解決するために構築された。ロドコッカスの複製起点に関 する最近の観察は、以下議論されているように、より効果的なプロモーターのプ ローブを構築する助けとなるであろう。

近年、１．４　ｋｂのＢｇｌＩ［断片がｐＲＲ−６から除かれ、Ｂｇｌ■部位を 含まないｐＲＲ−１２（図９）を作るためにその両端を平滑にして再連結させた 。デソマーら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９２） 　６　（＋６）、　２３７７−２３８５）は、この領域がプラスミドの復製に必 要であると報告した。従って、この構築物がＣｍ’の形質転゛換株を産生するこ とができたことは驚きてあり、このことは、本研究で用いた微生物の株において は、この領域がプラスミドの複製には必須でないことを示している。この結果は 、ランダムなゲノムの断片をクローニングするための、分解されたＤＮＡを受け 付ける。これらの構築物は、より良い、より代表的なランダムゲノムライブラリ ーの産生を可能とすることが期待される。

プロモータースクリーニング例日。脱硫クラスターのレポーター 適当な代替プロモーターを見いだすために、ベクターｐＫＡＭ１が二番目に直接 的な「ショットガン」の方法として用いらツムＤ　Ｎ　Ａ　（ＧＰＥ！−３６２ ，ＣＰＥ−６４８，Ｉ　Ｇ　Ｔ　Ｓ　８株からのもの）の挿入部位として機能さ せるため、Ｎｄｅ１部位をプロモーターのないＤｓｚのクラスターの上流に工学 技術で作成した。

はじめはこの連結物の混合物は直接ＧＰＥ−３６２細胞に導入して形質転換させ 、それからＤＢＴを含む２５０　ｍｌ　ＢＳＭにその全体を接種した。これらの 努力は、唯一の硫黄源としてＤＢＴを用いる能力のために優位にあるＤｓｚ十株 を増幅させるということを目標にして行われた。現在のところ、この種の形質転 換が１４回行われた。これらのうち、２回を除きのすべででＤｓｚ十の培養物を 産生した。１１の個々のクローンが単離され特徴が調べられた。これらは低レベ ル（０，６〜１．　Ｏｍｇ／Ｌ　２−ＨＢＰｌｏｏｓ　ｏ。

／ｈｒ）で脱硫特性の構成的発現をすることが可能であった。これら１１のクロ ーンから単離されたプラスミドの制限分析から、一つ（ＫＢ４−３）以外のすべ てではｐＫＡＭ［のバックボーンの単純な転位であることが明らかとなり、結果 としてベクターが生んだプロモーターからの余計な発現を引き起こした。多くの レスキューされたプラスミドは、別々の連結から生じてきているにもかかわらず 、同一の制限パターンを示し、ベクターとして固有の不安定性を示した。それは まるで、この種の選別においては、ベクターのプロモーター配列を利用するｐＫ ＡＭＩの転位か強く選別されているように思われる。

上で述べた選別操作は、このように、プラスミドの転位を最小限にするために組 み込まれたプロモータースクリーニングの方法を提供した。この方法では、ｐＫ ＡＭ＋／ゲノムライブラリーが最初に大腸菌で増幅され、次いで個々のＪＭＩ０ ９コロニーが一緒にプールされる。プラスミドが抽出され、Ｄｓｚ−株ＧＰＥ− ３６２を形質転換させるのに用いられる。ひとまとめに増やす方法を用いる代わ りに、プラスミドを含む細胞を選別するため、クロラムフェニコールを含む栄養 物豊富な培地にＧＰＥ３６２形質転換株を培養する。結果として生じたコロニー はＤＢＴを加えた８３Ｍアガロースのプレートにレプリカ培養し、次いで紫外線 による蛍光産生で脱硫活性を確認する。７．０００を越えるＧＰＥ−３６２形質 転換株が、この方法でスクリーンされた。これらから、ＤＢＴを含むＢＳＭプレ ート上で紫外線による蛍光を産生ずるものが３６個単離された。現在の努力は、 これら３６個の形質転換株から工学技術的に作られたプラスミドの同定と特性解 明に焦点が絞られる。

代替プロモーターの工学技術 ｐＴＯＸｌ−１の三つのＯＲＦの接近した物理的配置は、ＯＲＰ　２と３のどち らに対してもプロモーターのために十分な空間を与えない。この事実は、完全な ＯＲＦ　２と３が全く活性を示さないというサブクローン分析の結果と併せて（ ｐＥＮＯＫ−２，ｐＥＮＯＫ−１１，ｐＥＮＯに＝１３を参照）、遺伝子群のこ のクラスターが三つの遺伝子の発現のためのただ一つのプロモーターしか持たな いオペロンとして構成されていることを示唆している。ＩＧＴＳ８の脱硫特性が 硫酸塩で抑制されるとすれば［キルパンとビーラガ（Ｋｉｌｂａｎｅ　ａｎｄ　 Ｂｉｅｌａｇａ　）　、　Ｆｉｎａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　Ｄ、　Ｏ。

Ｅ、　Ｃｏｎｔｒａｃｔ　Ｎｏ、　ＤＥ−ＡＣ２２−８８ＰＣ８８９１（１９９ １）］　、このオペロンプロモーターが硫黄の量によりきつく制御されている可 能性がある。脱硫クラスターの分子配置の解明で、代替プロモーターは硫黄によ る抑制を除去するために合理的に工学技術によって作り出し、脱硫遺伝子の発現 を上昇させ、そしてそれによってＤｓｚ十の特性の比活性を上昇させることが可 能である。

可能性のある代替プロモーターの例として、ロドコ、ツカスフアシアンスからの クロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモーター［デソマーら：　ＩＪｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９２）６　（１６）、　２３７７ −２３８５１　、ロドコッカス　ロドクロウスからのニトリルヒドラターゼ遺伝 子プロモーター［コバヤシら：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ ｃａ　Ａｃｔａ、　１１２９　（１９９１）　２３−３３１　、または［ショッ トガン」プロモーター・ブロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）によってロドコッカス 　スピーシーズから単離される他の強いプロモーターといった、他の公知のおよ び文献記載のプロモーターが含まれる。他の可能性のある代替プロモーターとの を含む。

プロモーター工学技術例Ａ：ロドコッカス　ファシアンス由来のクロラムフェニ コール耐性遺伝子プロモーターからの発現 ｐＳＢＧ−２（図１１）。プロモーターのない脱硫クラスターは、４．Ｏｋｂの Ｄｒａｌ／５ｎａＢＩ断片としてｐＴＯＸＩ−１から単離され、そしてｐＲＲ− ６の唯一の平滑化されたＡｆｌｌＩ部位に連結した。この連結によって、クラス ターはクロラムフェニコール耐性遺伝子プロモーターの下流でその耐性構造遺伝 子の上流に挿入された。従って、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の転写は 、Ｄｓｚ遺伝子のクラスターを通って進行し、耐性遺伝子へと進むはずである。

しかしながら、形質転換株のクロラムフェニコール上での最初の選別では、形質 転換株は生じず、転写のリードスルーが不十分であったことを示唆している。プ ラスミドを保持するＤＳＺ＋の形質転換株は、最初に硫黄生体利用性アッセイに より、そして第二番目ににクロラムフェニコールを含むプレート上で選別された 。ＩＧＴＳ８とは違い、ｐＳＢＧ−２の形質転換株は、２０　ｍＭ　Ｎａ２５Ｏ ａ補った８３Ｍ培地中てＤＢＴを２−ＨＢＰへ変換させることが可能であり、そ れはプロモーターの置換によって硫酸塩による抑制が除かれたことを示す。形質 転換株の比活性は、２５μｇ　／　ｍ　Ｌのクロラムフェニコールを補った栄養 豊富な培地（ＲＭ）中で１６時間培養したものについて、０．９から１．７　ｍ ｇ　２−ＨＢＰ／Ｌ１０Ｄ　ｇｏ。／ｈｒの間で測定した。

ｐＳＢＧ−３゜　ロドコッカスの複製起点は、４．ＯｋｂのＸｂａｌ断片の除去 によってｐｓＢＧ−２から除かれた。起点がないので、形質転換は組み込み（ｉ ｌｅｇｒａｔｉｏｎ）によってのみ得られる。

二のプラスミドを持ったＣＰＥ−６４８形質転換株は、クロラムフェニコールを 含むＲＭ上で選別され、ＤＢＴを含むＢＳＭのプレート上でレプリカ培養された 。３０℃で１８時間インキュベートした後に蛍光で検出することにより、２−Ｈ ＢＰを産生ずるコロニーが得られた。

それぞれのＯＲＦの個々の発現 最近、それぞれ代替プロモーターで工学技術によって作られた三つのＯＲＦを別 々に発現させるという研究が始められた。これらの研究では、次のことを解明す ることが期待されている：まず、脱硫過程の中で、律速段階の可能性のあるもの はいずれも同定し、克服することである。オペロンの発現の可能性のある極性（ ｐｏｌａｒｉｔｙ）効果、すなわち下流にある０ＲＦ２と３の発現が不十分であ ることが、このような律速の原因となっているかもしれない。また、ＯＲＰ　１ 　と２の個々の機能の未解決の問題があるので、これらの研究はＯＲＦ　１　と ２の別々の発現によるＤＢＴ−スルフォンから２−ＨＢＰへの変換の再構成を明 らかにすることが期待されている。

すべてのＯＲＦはＰＣＲ増幅とそれに続くサブクローニングにより単離された。

典型的なシャイン・ダルガルノ配列と代替プロモーターの唯一のクローニング部 位が、それぞれのＯＲＦの上流に工学技術でつくられた。すべてのリーディング フレームの中にある終止コドンは、リードスルーを防ぐためにそれぞれのＯＲＦ の下流に工学技術でつくられた。それに加えて、プロモータ−１０ＲＦ融合体の 移動のための、都合のよい隣接する制限部位が、それぞれのプライマーに加えら れた。それぞれのＯＲＦの増幅に用いられたプライマーを、下に挙げている。フ レーム内の終止コドンは、星印（ネ）で印を付けている。ｐＴＯＸ［−１鋳型Ｄ ＮＡと同一の配列は、太字で示している。

０ＲＦＩ上： サイクリングパラメーターは：　＋ｘｍ°Ｃ２，０分２５Ｘ９６℃　３０秒 ５０℃　３０秒 ７２°Ｃ１，０分 よｔ　ｈ　Ｚ中ての発現のためロドコッカス−大腸菌のシャトルヘクターｐＲＲ −６へ移される。

Ｄｓｚ＋特性の異種発現 ブラスミｌ”ｐＴＯＸＩ−１がＤｓｚ十特性に必要な遺伝的材料のすべてを含ん でいるかどうかを決定するために、ｐＴＯＸ［−１の異種発現か、ＤＢＴを代謝 しない（Ｄｓｚ−）関連微生物であるロトコソｐＴＸｌ用によって形質転換され た。一つの形質転換株は、ＤＢＴを含む８３Ｍプレート上で紫外線による蛍光を 示し、ＨＰＬＣによる更なる分析で、ＤＢＴか基質として供給されているときに ２−ＨＢＰの生成をはっきりと示した。このように、ｐＴＯＸｌｌには異種のＤ ｓｚ−株をＤｓｚ＋の表現型に変換するための十分な情報か含まれている。

Ｂ、大１１！菌ＪＭＩ０９株はまりｐＴＯＸＩ−！　ｆ：よッテ形質転換され、 最小培地（ＢＳＭ）あるいは栄養豊富な培地（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）の中で 、ＤＢＴまたはＤＢＴ−スルフォンをそれぞれ基質としてインキュベートした。

どの場合ても）ＩＰＬｃ分析て２−ＨＢＰの生成が観察されなかった。グラム陽 性遺伝子は、プロモーターの置換なしには大腸菌中て普遍的発現可能ではないの で、大腸菌が脱硫遺伝子を発現させる能力のないことは予期しないことではなか った。

脱硫クラスターのプロモーターを置換するために、Ｉ）ＴＯＸｉｌから４．Ｏｋ ｂのＤｒａｌ／５ｎａＢＩ断片が単離された。この断片はすべての必要な構造遺 伝子を含むが、プロモーター配列を欠損している。このプロモーターのない脱硫 クラスターは、ＢａｍＨＩで切断しそしてフレノウで両端を平滑化した大腸菌の 発現ベクターｐＤＲ５４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　 ＮＪの中て抑制されている。ｔａｃプロモーターからの発現は、イソプロピル　 β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（［ＰＴＧ）の添加によって誘導可能である。

３０°Ｃでループリアブロスで成長させた、ｐＤＲＤｓｚを保持するＪＭＩ０９ の形質転換株は、ＤＢＴとイ、キュヘートし、［ＰＴＧて誘導するとＤｓｚ＋の 表現ｙを示す。１．６９　ｍｇ　２ＨＢＰ／ｌ１０Ｄ　＠ｏ。／ｈｒもの高さの 比活性が、ｐＤＲＤｓｚで観察された。形質転換株を３７°Ｃて成長させたとき は、活性が非常に減少した。活性の最高レベルは、誘導の１時間後に観察された 。

縁上で述へた、関連性を存する及び有さない異種宿主の両方におけるＤｓｚ＋特 性の発現は、ｐＴＯＸＩ−１がＤＢＴの２−ＨＢＰ・＼の変換に必要なすへての 遺伝情報を持っていることを示し一トされる蛋白質の同定および特性解明を可能 とする、実行可能な系が与えられたことになる。ＪＭ１０９のＤｓｚ十細胞（ｐ Ｄ　ＲＤ　ｓ　ｚ　）からのすべての蛋白質は、単離され、変性アクリルアミド ゲルで調べられた。クーマシー染色では目新しいバンドは検出されなかった。蛋 白質を原形質膜（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ）　、細胞質、膜の成分に細胞分画し たものもまた、クーマシーで染色されたゲルで分析した。ここでも、目新しいバ ンドは検出されなかった。精製なしでは、新しく発現した蛋白質は、簡単に検出 しバックグラウンドから解明するには明らかに発現量か低すぎた。

９、９．６９２＝６９３　）。この技術は、マキシセル分析として知られている 。簡単に言えば、プラスミドをもつＪＭ１０９等の培地（マニアティスら）中で 増殖させた。次いで、連続的に撹拌しながら細胞を、ｌ０ｃｍの距離から０．５ 　Ｊｏｕｌｅｓ−ｍ−”　ｓ−１の強さくｆｌｕｅｎｃｅ　ｒａｔｅ）てミネラ ライトランプ（Ｍｉｎｅｒａｌｉｇｈｔ　Ｌａｍｐ）モデルＵＶＧ−２５４（Ｕ ｌｔｒｏｖｉｌｅｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ、、　５ａｎＧａｂｒｉｅ１． 　ＣＡ）から紫外線照射にさらした。細胞は、６０．９０．１２０秒間のいずれ かでさらされた。細胞はそれから３７°Ｃで１６時間インキュベートされ、その 後Ｍ９緩衝液で洗浄し、硫酸塩を含まない最小培地に懸濁した。３７°Ｃでの１ 時間の飢餓の後、［”Ｓ］　メチオニン（＞　１０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　（ ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を最終 的な濃度が５　ｕ　Ｃｉ／ｍｌ　となるように加え、１時間インキュベーション を続けた。細胞は遠心分離で回収し、蛋白質は細胞を沸騰させる方法（マニアテ ィスら）で単離した。蛋白質はアクリルアミドゲルで分離した。泳動後、ゲルを 乾燥し、３日間オートラジオグラフィーにかけた。

ベクターｐＤＲ５４０を持つＪＭＩ０９のマキシセルは、ベクターのマーカーで あるガラクトキナーゼ蛋白質のみを示した。

ベクターｐＤＲＤｓｚをもつＪＭ１０９のマキシセルは、オーブンリーディング フレーム分析で予想されたように、Ｄｓｚ十特性に責任のある三つの蛋白質の予 想された分子量とよく相関する大きさの、三つの新しい蛋白質のバンドの存在を 示した（表３参照）。

表３ マキソセル分析から得られたデータは、このようにｐＴＯＸ　Ｉ　−１の三つの 予想されたオーブンリーディングフレームが脱硫の表現型を構成する三つの構造 遺伝子をコードすることを示唆した。

三つの新しいバンドの相対的な強度は、メチオニン残基の数とそれぞれの蛋白質 の転写レベルの両方を反映している。

明らかに、一つのメチオニンしか持たない０ＲＦ−２は最もかすかなバンドしか 示さない。単一のメチオニン残基のみの組み込みに加えて、大腸菌は単一の末端 のメチオニンをプロセシング（ｐｒｏｃｅｓｓ）　シ、さらにラベルされた蛋白 質の量を減少させるかもしれない。従って、０ＲＦ−２のバンドの強度が低いの は、おそらく蛋白質の翻訳の低レベルを厳密に示唆している訳ではない。

興味あることに、プロモーターから最も遠いＯＲＦ　（ＯＲＦ−３）は、０ＲＦ −１と同程度のレベルで存在するよってあり、大腸菌て発現させたときにはこの オペロンは極性効果を示さない。

蛋白質レベルに関するより重要な情報が、プラスミドｐＴＯＸｌル分析から得ら れることが期待される。それに加えて、上で仮定された０ＲＦ−１１０ＲＦ−２ へテロニ量体の存在は、変性しない条件下で観察できるかもしれない。

３７　Ｃ，Ｆ、　Ｒ，５ｅｃｔｉｏｎ　１．８２１（ｆ）で要求されているよう に、出願人の代理人はこれによってこの論文形式の本明細書の中の「配列表」の 内容と、コンピューターで解読可能な形式（ディスク）の「配列表」の内容が同 一であることを明言する当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに 述パ＼た発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、また確認し得るであ ろう。これらの及びそのような他のすへての均等物は下記のクレームの範嗜に含 まれるものである。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：エナジー　バイオシステムズコーポレーション （Ｂ）ストリート：　３６０８　リサーチ　フォレストドライブ　ビー−７ （Ｃ）市：ザ　ウッドランズ （Ｄ）州：テキサス （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　７７３８１ （Ｇ）　を話：　７１３−３６４−６１００（Ｈ）ファクシミリ：　７１３−３ ６４−６１１０（］１、発明の名称：脱硫用生物触媒をコードする組換えＤＮＡ （ｉｉｉ）配列の数＝５ （ｉｖ）　連絡先住所： （Ａ）宛名・ハミルトン、プルツク、スミス　アンドレイノルズ、ピー、シー。

（Ｂ）ストリート・ツー　ミリティア　ドライブ（Ｃ）市、レキシントン （Ｄ）州：マサチューセッツ （Ｅ）国＝アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　０２１７３ （Ｖ）コンピュータ可読フォームニ （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター　ＩＢＭ　ＰＣ互 換機（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯＳ／５−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン　リリース＃１．０．バージョン　＃ｌ、２ ５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願口： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）氏名ニブルツク、　ディビット　イー（Ｂ）登録番号：　２２．５９２ （Ｃ）参照／ファイル番号：　ＥＢＣ９２−０３Ａ（１ｘ）テレコミュニケーシ ョン情報：（Ａ）　を話番号：６１７−８６１−６２４０（Ｂ）ファクシミリ： 　６１７−８６１−９５４０（２）配列番号＝１の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　５５３５ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　２本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（■ｘ）配列の特徴。

（＾）特徴を表す記号；　Ｃ０５ （Ｂ）存在位置　７！］０．．２１５１（ｉｘ）配列の電、＋１ｒ１１゜ （＾）特徴を表す記’ｔ　：　ＣＤ５ （［１）　ｒｒ在位ＦＬ：　３２５１ｉ、、４５０Ｇ（ｘｉ）配列　配列番号・ １゜ ＡτＧ　にＣＣＧＣＧ　ＧＴに　ＡＣＣにＡＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＧにＴ　ＣＴＴ 　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＡＣＣＡ丁Ｔ　ＴＣＧ　ＧＣＧ　１１１U ）ｌｅｔ　ｋＬａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ 　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓａｔ　Ａ１■ ９５　Ｚｏｏ　１０５ ＣＣＧＡＣＴＴＣＣＡ　ＧＣＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＧＧＡ丁 ＣＡＣＧＡ　ＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣｃＴＧＯＡＧＣコP３８ ＧＣＡＣＡｅＡＧＣＡ　ＡＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴ　ＴＧＣＴ ＧＣＡＧＧＡ　ＡＣＣＣＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧｋＴＣＡＧＴ@３１９８ 八τＧ　Ａ（：Ａ　ＣＴＧ　丁Ｃλ　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＣ ＧＴＴ　ＣＧＡ　Ｃ（：Ａ　ＣＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣ３３O３ ）４ｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＬｙＩＩ　Ｇｉｎ　Ｈｉ ｓ＋　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｍｐ　Ａｌａ　`ｌ畠 Ｉ　Ｓ　ｎｏ　１５ ＧＡＣＡＡＣＣＡＴ　ＣＣＣＧＴＣ（、ＣＧ　ＧＴＴ　ＧＣＣＣＧＴ　ＧＧＧ　 ＣＴＡ　ＧＣＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＴにＧ　ＣＧＡ　３３５１Ｍｐ　Ａｓｎ　Ｍｐ 　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　入Ｌａ 　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　丁ｒｐ　入ｒ９ＧＣＣＡ（：ＣＧＣＣＧＴＣＣＡＣ；　ＣＧ Ｔ　ＧＡＴ　ＣＧＣＧＣＣＧＧＧ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　ＧｅＡ　ＡＣＡ　ＧＣＣＧ ＡＧ　ココ９９Ａｌａ　丁ｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａ ｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＧｌｕＣＧ ＣＧＡＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　τＣＧ Ｃ丁ＣＣ丁ＣＧＴＣＣＣＧ　ＣＧＣ３４４７Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＳｏ　５５　６０ Ｇ入入　７八ＣＧＧＣＧＧＣＴＣ，Ｇ　ＧＧＣＧＣＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＣＣＣＡ ＣＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣ３４９５Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ 　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ 　にｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａ１６５　〕Ｏ７５８０ ＣにＧＣＧＭ　ＡＴＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＣｒ　ＴＴＧ 　ＧＧＡ　ＣＡＣＣＴＣＴＴＣＧＧＡ　ＴＡＣ３５４３Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ 　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｍｐ　ＧＬｙ　５ｅｒ　Ｌｅｕ　ｃｌｙ　ＨＬｓ 　Ｌｅｕ　ｐｈａ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＡＣＡＣ ＣＣＡＧ　ＡＴＣＧＣＧ　ＣＡＧ　八＾ＣＡＡＣＴＧＧ　ＴＧＧ　ｋｃｃ　ＧＧ Ａ　３６３９Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＨＬｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌ ｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　丁ｒｐ　Ｔｒｐ　丁ｈｒ　ＧｌｙｌユＳ 　１２０　１２５ ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＡＧ　ＧＣ；Ｇ　ＴＣＧ　ＣＡＣＣＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＴＴＣＣＴＧ　丁ＴＣＧＧＣＣＴＣ３７８３Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃ １ｙ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈ＠　Ｖ ａｌ　Ｐｈｅ　にＧＬｙ　ＶａP ＧＴＣＣＡＧ　ＧＡＴ　ＯＡＴ　丁ｃＴ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　Ｇ ＣＧ　ＡＴＣ＾ＴＴ　ＧＣＴ　ＧＣＣＧｃ′Ｔ　ＡＴＣ３ＢR１ ｖａｌ　にｉｎ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ｃｌｙ　 Ａｌａ　Ｘｉ＠　Ｘｉ＠　Ａ１１ｌ　Ａ１１ｌ＾１ｍ　Ｘ１■ １８０　１ＢＳ　ユ９０ 丁？ＣＣＣＡＡＣＣＧ　ＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡ　ＡＡＣＧＴＣＧＡＴＴ　ＣＧＡ ＴＣＧＧｈＴＴ　ＣＧＴＡＩＩ；ＴＧＣＣＣＡＡにＴＧＧＡsＣＣ４９１６ ｈＧＴＧｃＴｃＧＧｃ　ＣＧＧＧＴｋＣＣＧＧ　丁ＡにＡＡＣ’ｒＣＣＡ　ＧＧ ＡＧＣＡＣＧＴＣＧＣ，ＣＧＴＣＧＴＣＧ　ＡＣＧＡＴＣＴ窒fＧ　４９７６ Ｃ１ｙ　Ｃ１ｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕｌツユ　ユ３５　１ ４０ Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　）Ｉｉｓ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　八ｒｇ　Ｔｙ■ １４’ｌ　１５０　１ｓｓ　１６０ Ａｍｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ｕｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ＾ｓｎ　５ｓｒＴｒｐ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕ 　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　ｔＪｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　ＡＬａ　Ａｌａ 　Ｇｌｙ　ＶａＩ　Ｐｈｅ　Ａｌａｌｌｉｌｏ　１８５　１９０ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　Ｖａｔ　ＨＬｍ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　 Ｈｌｍ　１（ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　！、ａｕ　＾|ｎ Ｖａｌ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　 Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｖａ１Ｘｌｅ　Ｌｅｕ　に ｉｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　５ｔｓｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ 　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌ凾■ Ｔｒｐ　八Ｌａ　Ｇｌｕ　八ｌａ　ＶａＩ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　 Ｐｒｏ　Ｊｖｎ　Ｌｅｕ　ｃｌｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇ１ｎＡｌａ　Ｔｈｒ　Ｔ ｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃ１ｙ　ＸＬｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａ ｌａ　入Ｌａ　Ｇｌｙ　八ｒ９　八５ｐｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙ ｓ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅ ｕ　（！ＡＹ　（ｌ■ ｓｅｒ　ｃｌｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｃ１ｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌ＠ｕ　Ｖａ１）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｘｉｓ　Ａｓ■ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｘｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＡｓｎＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌ＠ｕ　Ｈｉｓ　Ｍ ｅｔ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ａｌａ＾１ａ丁ｈｒ　Ｈｉｓ　５ｅｒ　にｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ 　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ丁ｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ｌ１ｅ３ ７０　３フＳ　３８０ λｌａ　Ａｓｐ　にｌｕ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　）ｌｉｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｈ■ コ１３５　３９０　３９５　４００ Ｘｉｓ　１ｆｌａ　Ｓｕｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｐｈ＠Ｌ＊ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓ ｉｒτｙｒ八ｓｐ　Ｇへｕ　ＰＭ　Ｖａｌ＾＄ｐＧｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒ ｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ 　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　ＴｙｒＧｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｕｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　 Ｌｅｕ（２）配列番号　３のｔｌ１１報。

Ｍｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　ｘｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　丁ｒｐ　ｘｒｇ２０　２５　、　３０ Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　八ｒｇ　Ａｌａ　 Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　５ｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＧｌｕＡｒｇ　Ｇｌｕ＾ｓ ｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌ＠ ｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ＾ｒ９Ｓｏ　５５　６０ Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　τＩｐ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａ１ｘｒｇ　Ｃ＋ｌｕ　 ＸＬｅ　Ａｌａ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　 ）Ｉｔｓ　Ｌｓｕ　Ｐｈａ　Ｇａｙ　丁凾■ Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＣＬｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 ＶａＩ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＨＬｍユ４５　１５０　１ ５５　１６０ Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　 Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠にｌｙ　Ｖａ１１６５　１７０　１７ ％ ＶａＩＧｉｎ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａ ｌａ　Ｘｉｓ　Ｉｌｅ＾ｌａ　Ａｌｍ、ＡＬａ　Ｘ１ｓ１８０　１ａｓ　１９０ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　 Ａｓｎ　Ｍｐ　Ａｓｐ　丁ｒｐ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ｘｌ＊Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｒ ｇ　Ｇｉｎ　丁ｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈ ｅ　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＬｙｓＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ 　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ 　Ｌｅｕ＾１ａ２２５　２３０　２コ５　２４０ １’ｈ＠工１ｅ　（ｉｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌ＠ｕ 　Ｐｈ＠ＡＬａ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＬａｕＸｉｓ　Ｐｈｅ　Ａ ｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　Ｘｌｅ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｃ １ｙ　ＡＬａ　Ｌ＠ｕ　ｐｉｓｐ　ｌ１■ Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　丁ｈｒ　Ｃ１ｎ　ＡＬａ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　ｃｌｙＡｌａ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｃ１ｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　 Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓ■ コア０　３７５　３８０ Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　１４ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ 　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓ■ ３０５　コ９０　３９５　４００ 丁ＴＣＣＴＣＧＣＡ（、ＡＴＣＧＧＣＴにＡＴ　ＧＴＴＧＣＣＧＡＴＣＧｋＣＧ ＴＧＧＴＣＧ　ＡＣＧＧにＡＣＡＣＧ　ＣＴＣＧＣＧ八Ｔτf　へ　４２０ ＣＣ＾τＧＧＣＧＴＣＣＧＧＴＧＣ＾丁ＡＣＡＣＧＡＣ（ｉＡＴＣＴ　ＡＡＣＣ Ａに＾丁ＣＧ　ＡＣＧＧＴＴＴ’ＴＧＡ　ＧＣＧＴＣＧＧＴbＡ　４８０ ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＣＧＣＣＡＧ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＣＴＴ　ＧＴ Ｔ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＡＣＧＣＧ　２９７Q Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　八ｓｐ　Ａｌａ２６０　２６５　２ フ０　２７５ ＧＣＣＧＴＣＧＡＧ　ＧＣＣＧＧＣ；　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＣＧＣＣＡＴ 　ＣＡＴ　ＴＣＣＧＡＣＧＣＧ　ＧＴＧ　Ａｃｅ　３０２０ＡｌａＶａｌＡｓｐ ＡｌａにｌｙＬｅｕＴｒｐＡｌａＡｒｇＡｍｐＨＬｍＳｉｒＡｓｐＡｌａＶａｌ Ｔｈｒ丁ＧＣＡＧｋＣＧＧＴ　ＧｉＴＧＧＯＡＣＡＡＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣ ＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡ　ＧＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧ入＾ＣＴＧ＾丁Ｇf　４２８２ 丁ＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＧＧＡＣ，ＴＣｋＡＡ　ＧＣＧＴＴＧＧＣＣＡ　ＣＣｋ ＡＣＣ，ＣＣＧＣＣＣＴ（：ＡＡＣＡ丁（：　ＡＧＣＡＧＣfＧＣＧ　４３４２ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＳｅｒユＳＳ１０１ ｓｌ　１１ｅ　八ｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａ ｓｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　入１ａＬ＠ｕ　Ａｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｈｌ ｓ　ｔｈｅ　丁ｈｒ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＳｏ　５５　６０ Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　 Ｇｌｕ　！ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　５ｓｒＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　丁ｈｒ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌ ＠ｕ　Ｏｌｙ　！ｌ＠　丁ｈｒ　Ｐｒ。

ａｓ　９０　、　９５ Ｌ＠ｕ　Ｌ＠ＩＪ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｏｌｙ　Ｐｈｅ　ｔｈｅ　ν１１ 　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｔ　Ｐｔｏ　！ｌｅ　丁ｈ■ １００　１０５　１１Ｇ Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌ偕ｕ＾Ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ＾ｒｇ　Ｅｌ ＠Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｓｕｒ＾１１Ｆ／θ３ Ｆ／θ４ ｐＭＥＬＶ−１挿入断片 ｐｓＭＥＬＶ−３Ａ 挿入断片 Ｆ／θ６ Ｆ／θ９ ＦＩＧ　ＩＩ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成７年１月１０日４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒をコードする 遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子。 ２．化石燃料が石油である請求項１記載の組換えＤＮＡ分子３．ロドコッカスロ ドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）細菌の一株の遺 伝子を含む組換えＤＮＡ分子であって、該遺伝子が有機硫黄分子を含む化石燃料 を脱硫することができる生物触媒をコードするものである組換えＤＮＡ分子。 ４．遺伝子がロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである請 求項３記載の組換えＤＮＡ分子。 ５．該化石燃料が石油である請求項３記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株に由来する精製ＤＮＡであって、該Ｄ ＮＡが有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒をコードす るものである精製ＤＮＡ。 ７．該ＤＮＡがロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである 請求項６記載の精製ＤＮＡ。 ８．該ＤＮＡが有機硫黄分子を含む石油を脱硫することができる生物触媒をコー ドするものである、ロドコッカスロドクロウス細菌の一株由来の精製ＤＮＡ。 ９．該ＤＮＡがロトコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである 請求項８記載の精製ＤＮＡ。 １０．有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒をコードす る遺伝子を含有するＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡベクター。 １１．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株の遺伝子を含有するＤＮＡ分子を含 む組換えＤＮＡベクターであって、該遺伝子が有機硫黄分子を含む化石燃料を脱 硫することができる生物触媒をコードするものである組換えＤＮＡベクター。 １２．遺伝子がロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである 請求項１１記載の組換えＤＮＡベクター。 １３．微生物由来のＤＮＡを含むＤＮＡプラスミドベクターであって、該ＤＮＡ が有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒をコードするも のであるＤＮＡプラスミドベクター。 １４．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株に由来するＤＮＡを含むＤＮＡプラ スミドベクターであって、該ＤＮＡが有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫するこ とができる生物触媒をコードするものであるＤＮＡプラスミドベクター。 １５．ＤＮＡがロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである 請求項１４記載のＤＮＡプラスミドベクター。 １６．微生物の遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡプラスミドであ って、該遺伝子が有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒 をコードするものであるＤＮＡプラスミド。 １７．ロトコッカスロドクロウス細菌の一株の遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分 子を含むＤＮＡプラスミドであって、該遺伝子が有機硫黄分子を含む化石燃料を 脱硫することができる生物触媒をコードするものであるＤＮＡプラスミド。 １８．該遺伝子がロトコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものであ る請求項１７記載のＤＮＡプラスミド。 １９．ロドコッカス ロドクロウス細菌の一株に由来する単 離ＤＮＡを含むＤＮＡプラスミドであって、該ＤＮＡが有機硫黄分子を含む化石 燃料を脱硫することができる生物触媒をコードするものであるＤＮＡプラスミド 。 ２０．単離ＤＮＡがロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のもので ある請求項１９記載のＤＮＡプラスミド。 ２１．ブラスミドｐＴＯＸＩ−１ｏ ２２．プラスミドｐＴＯＸＩ−２ｏ ２３．有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒を発現する 遺伝子を含有する組換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物。 ２４．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株の遺伝子を含む組換えＤＮＡプラス ミドを保持し、有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒を 発現する微生物。 ２５．遺伝子がロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである 請求項２４記載の微生物。 ２６．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株に由来するＤＮＡを含み、こうして 形質転換された結果、有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物 触媒を発現する微生物。 ２７．ＤＮＡプラスミドがロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来の ものである請求項２６記載の微生物。 ２８．プラスミドｐＴＯＸＩ−１を保持する相補された宿主生物ＣＰＥ−６４８ 。 ２９．プラスミドｐＴＯＸＩ−２を保持する相補された宿主生物ＣＰＥ−６４８ 。 ３０．有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒を発現する 遺伝子を含む祖換えＤＮＡプラスミドを保持する生物を利用することにより、有 機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫する下記の工程よりなる方法：ａ）化石燃料を 微生物と接触させる工程；およびｂ）有機的な炭素一硫黄結合を触媒的に切断す るのに十分な条件下で化石燃料と微生物との混合物をインキュベートする工程、 これにより、化石燃料中の有機硫黄含量は顕著に減少する。 ３１．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株の遺伝子を含む組換えＤＮＡプラス ミドを保持する微生物を用いることにより有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫す る方法であって、該微生物が有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができ る生物触媒を発現するものであり、下記の工程よりなる方法： ａ）化石燃料を微生物と接触させる工程；およびｂ）有機的な炭素一硫黄結合を 触媒的に切断するのに十分な条件下で化石燃料と微生物との混合物をインキュベ ートする工程、 これにより、化石燃料中の有機硫黄含量は顕著に減少する。 ３２．該遺伝子がロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものであ る請求項３１記載の形質転換された微生物。 ３３．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株に由来するＤＮＡを含むＤＮＡプラ スミドを含む微生物を利用することにより有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫す る方法であって、該微生物が有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができ る生物触媒を発現するものであり、下記の工程よりなる方法： ａ）化石燃料を微生物と接触させる工程；およびｂ）有機的な炭素一硫黄結合を 触媒的に切断するのに十分な条件下で化石燃料と形質転換された微生物との混合 物をインキュベートする工程、これにより、化石燃料中の有機硫黄含量は顕著に 減少する。 ３４．化石燃料が石油である請求項３３記載の化石燃料を脱硫する方法。 ３５．ＤＮＡがロドコッカスロドクロウス細菌のＩＧＴＳ８株由来のものである 請求項３３記載の化石燃料を脱硫する方法。 ３６．有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒の遺伝子を 含む組換えＤＮＡ分子の全体または一部にハイブリダイズすることができる核酸 プローブ。 ３７．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子の 全体または一部にハイプリダイズすることができる核酸プローブであって、該遺 伝子が有機硫黄分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒をコードす るものである核酸プローブ。 ３８．ロドコッカスロドクロウス細菌の一株に由来するＤＮＡの全体または一部 にハイプリダイズすることができる核酸プローブであって、該ＤＮＡが有機硫黄 分子を含む化石燃料を脱硫することができる生物触媒をコードするものである核 酸プローブ。 ３９．配列番号１で表される核酸配列。 ４０．配列番号２で表される核酸配列。 ４１．配列番号３で表される核酸配列。 ４２．配列番号４で表される核酸配列。 ４３．配列番号５で表される核酸配列。 ４４．ＯＲＦ−１のＤＮＡ配列。 ４５．ＯＲＦ−２のＤＮＡ配列。 ４６．ＯＲＦ−３のＤＮＡ配列。 ４７．ＯＲＦ−１に対するアミノ酸配列。 ４８．ＯＲＦ−２に対するアミノ酸配列。 ４９．ＯＲＦ−３に対するアミノ酸配列。 ５０． ページ６６からページ８０までに表されたＤＮＡ配列