JPH07507877A - 流動式サイトメーター用測定チャンバー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 流動式サイトメーター用測定チャンバー本発明は、個々の細胞及び他の顕微鏡的 粒子の蛍光と散乱との光線の測定するための流動式サイトメーター（血球計算器 、ｃｙｔ。

ｍｅ　ｔ　ｅ　ｒ）用の測定チャンバーが、平面部を有する主要部と、前記平面 部に開口する主要部内の入口側チャンバー及び出口側チャンバーであって、これ らチャンバー同士は、互いに前後に並んで位置しかつ前記主要部内のチャンネル により接続しており、 入口管と注入管とを備えた前記入口側チャンバー及び排出管を備えた前記出口側 チャンバーと、 前記平面部の前面に配置する透明プレートであって、前記プレートが前記平面部 から離れて１１の位置から前記チャンバーと前記チャンネルとを閉鎖するため密 閉して第２の位置へと移動可能であるプレートと、 前記チャンネル内に収容されている前記粒子に光線を向けるためかつ前記同一の 粒子により輻射される蛍光光線を受光するため透明プレートの前面に位置する光 学手段に関する。

流動式サイトメーターおいて、ある生物学的細胞或いは他のタイプの顕微鏡粒子 は、高強度の発光源の焦点を通る水のような液体の層流により観察する。細胞が 焦点を通って通過するとき、各々の単一のｌｉＥｍから輻射される蛍光と散乱し た光線は、適切な光学的な手段により集束され、適当な光検出器に向けられる。

このような方法で得られた散乱光線は、細胞の大きさ及び構造についての情報を もたらし、蛍光光線が細胞の含有量の尺度になるので、特別な方法で細胞を包ん で蛍光色の物質と好ましく着色されている。

励起可能な最大水準を焦点で得るため、結果として、最大感度にするため、光線 は非常に細くして、一般には約１００μｍの長さに焦点を集中させる。再現可能 な状懸で分析するために、細胞は焦点を通る同一の経路を流れる必要がある。こ れを得るため、［流体式焦点合わせの原理Ｊ　（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ　ｆ ｏｃｕｓｓｉｎｇ）を使用する（Ｐ、Ｊ、Ｃｒｏｓｓ　１ａｎｄ−Ｔａｙｌｏｒ によるＮａｔｕｒｅの第１７１巻、第３７〜３８ページ、１９５３年）。

流体式焦点合わせは、水をろ過した円錐形のノズル内で得られる。ノズル内に揚 水されたこの水は、毎秒数メートルの典型的な速度の層流噴出流を形成するよう に、ノズルの先端チップの開口部に向かって層流で流れる。この試料、すなわち 、分析する細胞の懸濁液は、細い管を通りノズルに注入され、この管はノズルの 軸或いは非常に近くにその端部開口部の一つを有する。ノズル内部の流れは層流 なので、ノズルと噴出流内の双方の流れの中央部分に試料は、限定される。結果 として、厳密に見れば常に再現可能な噴出流経路を流れる。この噴出流が励起焦 点を貫いて通過するとき、細胞が測定される。流体式焦点合わせの原理は、この 種の流動式サイトメーターの全てに用いられる。ある流動式サイトメーターにお いては、ノズルの開口部は大気に接触しているので、放出噴出流は前記大気に接 触するであろう。この種のサイトメーターの欠点は、使用者が有害で汚染した物 質に接触することである。

その他のサイトメーターにおいては、開口部が、狭い管に好ましくは矩形断面に 接続され（閉鎖測定チャンバーとして公知である）。この後者の著しい不便さは 、細い管は洗浄が困難なことである。

しかしながら、これは、使用者が消毒及び／または試料中に存在する有毒薬剤に さらされることから保護される利点を有する。

流動式サイトメーターには基本的に二つの形式があり、すなわち、励起された光 源としてレーザーを用いるもの及びキセノン或いは水銀を含む高圧アークランプ を用いたものである。

レーザーを用いるサイトメーターにおいては、光の散乱はレーザービームのそれ に近い方向で測定することができる（低角度光散乱法）。これはまた、この蛍光 は直角で集光されるのに対し、またレーザービームに関して直角で測定すること ができる（高角度光散乱法）。前記装置は、エアー噴出流を放出するノズル或い は閉鎖した測定チャンバーの中のいずれでも用いることができる。

アークランプを使用するサイトメーターは、試料を含む流れにできるだけ多くの 励起光線を集中するために、オイル浸漬の顕微鏡レンズをしばしば用いる。通常 蛍光光線は、同一の顕微鏡レンズで集光するので、このレンズはエピモダル（ｅ ｐ　ｉｍｏｄａ　１）と称され、試料から放射される蛍光光線も集光するために 適し、一方で試料の散乱光はサイトメーターの下部の暗視野内でハイライト部分 い成りうる（参考文献：ヨーロッパ特許Ａ−０，２２９，８１５号、米国特許Ａ −４，９１５，５０１号）。

アークランプを使用してサイトメーターに用いる開放測定チャンバーの存在は、 既に公知である（ヨーロッパ特許Ａ−０，０２６゜７７０号）。この測定チャン バー装置においては、液体の流れは、顕微鏡カバーグラスの開放表面部上に水の 平らな層に限定している。この流れは、オイル浸漬の顕微鏡レンズを介して、反 対側から観察する。

この種の測定チャンバーは、使用者を有害及び／又は汚染物質の汚染の危険にさ らされる重大な欠点を有する。さらにその上に、機能要因が、試料の流動比率を 制限するので、場合によっては、それによって測定速度が限定される。

一方、この測定チャンバーは、アークランプを使用するサイトメーターにおいて 散乱光線の正確な測定を可能にする唯一のものである。

この種の設備のための他の測定チャンバーは、散乱光線の十分な測定を可能にで きなく、これらの願書はそれらの可能性の重大な制限を示している（参考文献： 米国特許Ａ−４，２２５，２２９号及び米国特許Ａ−４．９５４，７１５号）。

本発明の目的は、注入管の軸が光学手段の光学軸とチャンネルの外部の点で交差 させたことにより、入口管と注入管を通して、入口側チャンバー内へとそれぞれ 注入する液体及び粒子がチャンネルを通り層流として流れるようにしたことを特 徴とする流動式サイトメーター用の測定チャンバーを実現することである。

本発明の利点は、後述することと本装置を軸断面で図示した唯一の添付した模式 図により明らかにする。

図面を参照し、参照符号（１）は流動式サイトメーターを示す。

サイトメーターの基本部分は、測定チャンバーであり、実質的には主要部（４） を含んで成り、好ましくは下部の平面部（６）を有し環状である。主要部には、 平面部（６）の上に開口している入口側チャンバー（８）と出口側チャンバー（ ｌＯ）を存する。チャンバー（８，１０）は、互いに前後に並んで位置し、かつ 各々のチャンバーは、前記別のチャンバーが近づく場合、次第に減少する断面部 を有する。特に、図面に図示された本発明の形状においては、各々のチャンバー は半円錐形の形状を有する。チャンバーは、主要部（２）内部にあるチャンネル （１２）を通して接続される。

チャンネル（１２）は、好ましくは矩形の横断面を有する。チャンネルの底部の 上には人造石英で一般に作られる透明素子（１３）がある。

入口側チャンバー（８）は、前記チャンバーへと圧力でもって液体を注入するに 役立つ入口管（１４）を備える。通常、この液体は、蒸留或いはろ過した水から 成る。さらにその上、チャンバー（８）は、測定チャンバー内部で分析するため 、細胞及び他の顕微鏡的物質を導入するに役立つ注入管（１６）を備える。以降 に説明する理由で、管（１６）は、軸（１７）に沿い主要部（２）の内部へと移 動可能である。

出口側チャンバー（１０）は、水の排出と、それぞれの管（１４）と（１６）と を通って入れられる細胞を分析するに役立つ排出管（１８）を備える。

透明プレート（２０）は、主要部（２）の平面部（６）の前面に配置される。ま た、このプレートは、好ましくは人造石英から作られる。プレートは、平面部（ 図面に図示されるように）から離れて第１の位置から表面部に対峙して横たわる 第２の位置まで移動可能であり、かつ入口側チャンバー（８）、出口側チャンバ ー（ｌＯ）及びチャンネル（１２）とを密閉して封鎖する。

サイトメーターは、チャンネル（１２）内に含まれる粒子に対して光線を向ける ため、及び同一試料により輻射される蛍光光線を受光するためにさらに光学装置 を備える。通常、これらの光学装置は、透明プレート（２０）の前面に配置した 顕微鏡対物レンズ部（２２）を含んでなる。顕微鏡レンズはレンズ（２４）を備 え、このレンズは、この場合光源であるアークランプ（図示せず）から、チャン ネル（１２）内に含まれる粒子上で輻射される光源を集中するに役立つ。レンズ の焦点がチャンネル（１２）の内部に入るように、主要部（２）の位置は、適切 な方法によりレンズに接近したり或いはレンズ（２４）からさらに離して移動で きるようになっている。

透明プレート（２０）と顕微鏡対物レンズ部（２２）の先端の間にある容積は、 プレートを形成している物質の屈折率に合わせてレンズ（２４）の屈折率を調整 するのに役立つ相当の浸漬オイルで充満させる。

さらに、サイトメーター（１）は、主要部（２）の第１の顕微鏡対物レンズ部（ ２２）に対しもう一方の側に配置した第２の顕微鏡対物レンズ部（２６）を備え る。顕微鏡対物レンズ部（２６）は、また透明素子（１３）の前面に配置した対 物レンズ（２８）を備える。レンズ（２４）とレンズ（２８）は同一の光学軸（ ３０）にある。第２の顕微鏡対物レンズ（２６）の性能は以下で明らかにする流 動式サイトメーターの測定チャンバーの操作は次のようになる。すなわち、蒸留 或いはろ過した水は、入口管（１４）を通り導入し、かつ分析する少量の細胞は 注入管（１６）を通して注入する。

管（１６）は、チャンバー（８）内部に位置して、その軸がチャンネル（１２） 外部の点（３２）で光学軸（３）と交差するようにし、かつチャンネル（１２） 内の液体と少量の粒子で形成する層流が、実現できるようにする。層流であるた め、顕微鏡対物レンズ部（２２及び２６）を介して、同一のチャンネルの内部の 細胞を順次分析することが可能となる。実際に、細胞はチャンネルを通って通過 するので、その上で輻射する光線は第１の顕微鏡対物レンズ部（２２）により集 中される。細胞は、光線を全ての方向に回折し、かつ第１の顕微鏡対物レンズ部 により再び集束される蛍光光線を放射する。回折した光線の一部分のみ、すなわ ち、光学軸（３０）に関して特別な角度を形成するそれらが、透明素子（Ｉ３） を貫通して通過することができ、そして第２の顕微鏡対物レンズ部（２６）によ り集束される。公知の装置で測定するこれらの光線を次々と透過し、第２の顕微 鏡対物レンズ部が、この大きさ、顆粒及び構造のような細胞の特徴を分析する。

管（１６）の軸（１７）と光学軸（３０）との交差点はチャンネル（１２）の外 部に存在するので、チャンネル内で分析するため細胞の流れを光学軸の方向に移 動することが可能であり、その軸に沿って管（１６）を移動する。すなわち、こ の顕微鏡対物レンズ部に対して細胞を動かすこと無く、顕微鏡対物レンズ部（２ ２）の焦点距離を通り正確に通過するように、流れは位置することができる。

この方法で、顕微鏡対物レンズ部（２２）と透明プレート（２０）の間に設けら れる浸漬オイル層が、同一のオイルから輻射する背景の蛍光光線を減少するため 非常に薄く維持され、すなわち、これによって生じる妨害を減少する。すなわち 、本発明の目的は、チャンネル（１２）内にある測定点でなく、透明プレートに 向かって流れを送ることで達成される。この方法においてのみ、層流を得ること 力呵能であるので、したがって、焦点面に沿う粒子の動きを正確：；読み取れる 。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．個々の細胞及び他の顕微鏡的粒子の蛍光光線及び散乱光線の測定のための流 動式サイトメーター用の測定チャンバーは、平面部（６）を有する主要部（２） と、前記平面部（６）に開口する主要部（２）内の入口側チャンバー（８）及び 出口側チャンバー（１０）であって、これらチャンバー同士は、互いに前後に並 んで位置しかつ前記主要部内のチャンネル（１２）により接続しており、 入口管（１４）と注入管（１６）とを備えた前記入口側チャンバー（８）及び排 出箸（１８）を設けた前記出口側チャンバー（１０）と、 前記平面部（６）の前面に配置する透明プレート（２０）であって、前記プレー トが前記平面部から離れて第１の位置から前記チャンバー（８、１０）と前記チ ャンネル（１２）とを閉鎖かつ密閉する第２の位置へと移動可能であるプレート （２０）と、前記チャンネル（１２）内に収容されている前記粒子に光線を向け るためかつ前記同一の粒子により輻射される蛍光光線を受光するため前記透明プ レートの前面に位置する光学手段とを含んで成る測定チャンバーにおいて、 前記注入管（１６）の軸（１７）が前記光学手段の光学軸（３０）と前記チャン ネル（１２）の外部の点（３２）で交差させたことにより、前記プレートが前記 第２の位置にあるときに、前記入口管（１４）と前記注入管（１６）を通して、 前記入口側チャンバー（８）内へとそれぞれ注入する液体及び粒子が前記チャン ネル（１２）を通り層流として流れるようにしたことを特徴とする流動式サイト メーター用の測定チャンバー。 ２．前記注入管（１６）が、前記入口管（８）内部の軸に沿って移動可能である 請求項第１項に記載のチャンバー。 ３．各チャンバー（８、１０）が、前記一つが他のチャンバーに近づくにしたが って減少する横断面部を有することを特徴とする請求項第１項に記載のチャンバ ー。 ４．各チャンバー（８、１０）が半円雌形状を有することを特徴とする請求項第 ３項に記載のチャンバー。 ５．前記液体が蒸留或いはろ過した水であることを特徴とする請求項第１項に記 載のチャンバー。 ６．前記主要部（２）の位置が、前記光学装置の焦点にチャンネル（１２）があ るように、前記光学軸（３０）に垂直な面に調整できることを特徴とする請求項 第１項に記載のチャンバー。 ７．前記光学装置が顕微鏡対物レンズ部（２２、２６）であること特徴とする請 求項第１項に記載のチャンバー。