JPH07507923A - ヒトモノクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトモノクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体製造法発明の背景 免疫療法は、癌およびアレルギーを含む様々な症状の成功した治療のための主要 候補である。更に、ヒトに対して投与される免疫学的診断薬および追跡薬が望ま れる。ヒトに対して投与された場合に免疫応答を引起こさないヒトモノクローナ ル抗体の必要性は明らかである。しかしながら、ヒトモノクローナル抗体の製造 には問題が多い。第一に、ヒトのインビボ免疫感作には、考慮すべき重要な倫理 的および医学的問題があり、したがって、ヒト免疫応答の誘発に用いることがで きる抗原の数が制限されている。第二に、ヒトモノクローナル抗体を生産するイ ンビトロでの試みは、インビトロでは一次および二次免疫応答の両方を生じるこ とができないことで厳しく制限されてきたし、そして既知の方法によるモノクロ ーナル抗体の生産は、高親和性抗体を生産する場合において大部分不成功であっ た。

ヒトモノクローナル抗体は、二つの一般的な方法、すなわち、（１）エプスタイ ン・バールウィルス（ＥＢＶ）による抗体生産性ヒトリンパ球の直接的不死化、 並びに（２）不死化されたヒトまたはネズミ細胞系と免疫化宿主からのヒトリン パ球との間のハイブリドーマ形成を用いて生産された。

最も容易に利用可能なヒトリンパ球源は末梢血であるが、末梢血リンパ球（ＰＢ Ｌ）は、ヒトモノクローナル抗体の生産に用いられた場合、−貫して極めて不十 分にしか働かなかったし、そして末梢血は、この目的に関して最適以下のリンパ 系細胞源であると考えられてきた。Ｃボレベツク（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）、Ｊ 、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１２３：１５７〜１６５　（１９８ ９）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。特に、研究音速は、末梢 血中で見出された抗体生産性ヒトＢ細胞が、牌臓およびリンパ節などの他のリン パ系区分のＢ細胞と比較して、リンパ芽球細胞の形成にあまり従わないらしいと 推測した。概して、ヒトの末梢血中のＴサプレッサー細胞対Ｂ細胞の比率は好ま しくない。更に、末梢血は、インビトロ免疫感作を可能にするほど十分な抗原提 示細胞を含んでいないと推測された。

インビトロ免疫感作の際に末梢血リンパ球を活性化させる様々な複雑で且つ時間 のかかる方法が開発されてきた。若干の研究者は、末梢血リンパ球のインビトロ の抗原特異的活性化を促進するために、個々の血球集団を分離し且つ一定比率の Ｔ、Ｂおよび補助細胞の混合物を再構築することを試みた。Ｌ、ダニエルシン（ Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｉｏｇｙ、６１　：　５１　（１９ ８７）および〜１．−に、ホー（Ｈｏ）、［インビトロ免疫感作によるモノクロ ーナル抗体の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５ｅｒｉｅｓ；３０巻、Ｍ、デツカ−（Ｄｅｋｋｅｒ）　 、Ｎ、Ｙ、（１９８７）を参照されたい。インビトロ免疫感作での他の試みにお いて、サプレッサー細胞を物理約分λｌ、抗体による溶解または各種化学物質と の反応によって減少させた。Ｋ、ジェイムス（Ｊａｍｅｓ）およびＧＴ、ベル（ Ｂｅ　ｌ　Ｉ）　、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１００　：５〜４０ 　（１９８７）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。

ＰＢＬの不十分な働きをいかに正確に説明しても、ヒト血球のインビトロ免疫感 作のための十分に確立された技術の不足は、依然としてヒトモノクローナル抗体 の開発にとってかなりの障害のままである。

発明の概要 本発明は、ある選択された抗原に対して特異的な高親和性ヒトモノクローナル抗 体を分泌することができる細胞およびそれら由来の細胞系に関する。本発明は、 更に、これらの細胞系を製造するインビトロ免疫感作法並びにこれらのモノクロ ーナル抗体を用いる治療用および診断用構築物に関する。

本発明は、ある選択された抗原に対して特異的なヒトモノクローナル抗体を製造 する方法を提供する。これを達成するために、混合リンパ球反応混合物を生成す る。この混合リンパ球反応混合物は、ヒトリンパ球調製試料であって、記憶Ｂリ ンパ球を富化された且つ該選択された抗原に関して血清学的陽性であるドナーか ら得られた該調製試料と、第一ドナーに関して同種異系である第二ドナーからの ヒトリンパ球調製試料と、該選択された抗原とを含む。これらの調製試料および 抗原は十分な量で存在し、そして２種類の調製試料のリンパ球間で混合リンパ球 反応が生じるところの、記憶８９２８球の二次リンパ芽球子孫の生産を特徴とす る条件を施される。次に、これらの二次リンパ芽球をヘテロハイブリッド融合パ ートナ−と融合し、そして該選択された抗原に対する高親和性結合特異性を有す る抗体を分泌する融合生成物を単離する。

好ましい実施態様において、ヒト自己抗原、例えば、免疫グロブリン、自己免疫 疾患に関与した抗原および癌抗原に特異性を有する抗体が得られる。更に、異種 抗原、例えば、細菌性、ウィルス性、寄生虫性および他の感染因子に特異性を有 する抗体が得られる。好ましくは、第二ドナーからのリンパ球の調製試料は牌臓 細胞の調製試料であり、そして記憶８９２８球は第一ドナーの末梢血から得られ るのが好ましい。

ヒト哺乳動物から得られる。これは、特定の抗体の調製試料を非ヒト哺乳動物の 免疫感作の結果として得ることを可能にし、それによって考慮すべき倫理的およ び医学的問題が回避される。好ましい方法において、非ヒト哺乳動物は、ヒト記 憶Ｂ細胞を用いて再形成され且つ選択された抗原によって免疫感作されている５ ＣＩＤマウスである。次に、記憶Ｂ細胞を５ＣＩＤマウスから採取する。

図面の簡単な説明 図１は、抗１ｇＥ抗体を含む血清を有するドナー（Ｘ軸）を識別するための酵素 免疫検定法の結果を要約する。

図２は、ヒトＩｇＧ抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を生産するこれらの細胞系 （ウェル１〜２４）の融合生成物スクリーニングの検定結果を示す。

図３は、ヒトＩｇＧ抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を生産するこれらの細胞系 （ウェル２５〜４１）の融合生成物スクリーニングの検定結果を示す。

本発明の抗体は、血清学的陽性ドナーからの記憶８９２８球を活性化して、二次 免疫応答において二次リンパ芽球を生成させるインビトロ免疫感作法において製 造される。次に、二次リンパ芽球を不死融合パートナ−細胞に対して融合させて 、細胞融合生成物を生成する。

を椎動物における免疫は、８９２８球系統の細胞によって分泌される抗原結合抗 体分子によって機能する。Ｂ系統細胞の分化は、二つの一般的な段階に分けられ ると考えられる。第一段階は抗原非依存性であり且つ幹細胞の８９２８球への分 化に関与している。これらの８９２８球は、抗原受容体として機能する表面免疫 グロブリンの存在によって定義される。哺乳動物におけるこの過程は胎児肝脂に おいて生じた後、成体の骨髄中で継続して維持される。抗原に対して暴露された ことがないそれぞれの新しく生じたＢリンパ球細胞およびその子孫は、独特のセ ントの結合特異性を有する新しい種の免疫グロブリン分子をその表面上に発現す る。この表面免疫グロブリンの発現後、８９２８球は末梢リンパ系器官、例えば 、これらの「無経験」リンパ球と循環性抗原との間に接触が生じることができる 牌臓およびリンパ節に移動する。抗原との接触が全（ない場合、これらの８９２ ８球は分裂しない。

Ｂリンパ球分化の第二段階は抗原依存性であり且つ牌臓および／またはリンパ節 の末梢リンパ系器官中の「無経験」の未分化８９２８球の表面免疫グロブリンに 対する抗原の特異的接触および結合に関与している。この過程は、Ｔリンパ球と 、マクロファージと、「サイトカインコと称する可溶性成長因子との間の複雑な 一連の相互作用と共に、その特定の細胞を、牌臓および／またはリンパ節におい て増殖させて一次「リンパ芽球」細胞の増殖性クローンにする。次に、そのクロ ーン中の細胞は、「−次プラスマ細胞」と称する非分裂細胞および／または記憶 ８９２８球に分化する。−次ブラスマ細胞は、牌臓、リンパ節または末梢循環中 の免疫系のエフェクター細胞であり、無経験Ｂリンパ球が様々な可溶性因子に暴 露された場合にはＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが引出されることもあるが、主と してクラスＩｇＭである多量の免疫グロブリン分子を血流中に分泌する。この免 疫グロブリン分子は、無経験Ｂリンパ球の膜上に存在するのと同様の結合特異性 を有する。この過程をクローン選択または「−次免疫応答」と称し、そしてその 個体を、ここで「血清学的陽性」であると定義する。ある個体がある選択された 抗原に対して、記憶Ｂ細胞形成をもたらす十分な量で暴露されても、その個体は もはや、血清中のその選択された抗原に特異的な抗体を検出可能な量で発現しな い場合もあるということは当業者に容易に理解される　したがって、「血清学的 陽性」という用語は、記憶Ｂ細胞を有するが、抗原時４的抗体の血清濃度は検出 不能である個体も包含する意味である。

「記憶Ｂ細胞」発生は、８９２８球の増殖および（すｒトカインによって刺激さ れた）同一抗原によるクローン選択を必要とする。これらの細胞は抗体を分泌し ない。記憶細胞になるように運命づけられた８９２８球のクローン増殖は、牌臓 およびリンパ節中において「経中心」と称する十分に月確な部位で生じる。

若干の時間後、記憶細胞はリンパ器官をでて末梢循環に入る。非記憶または「無 経験」８９２８球は再循環しない。

記憶８９２８球は、血清学的陽性個体における末梢血リンパ球の主要成分である 。それらは、無経験リンパ球に比べると、−次応答を生じたのと同一の抗原と更 に接触して増殖することによっていわゆる「二次リンパ芽球」になるよう加速度 的様式で応答する用意ができている。増殖性二次リンパ芽球およびそれらの子孫 は、二次プラスマ細胞に分化する。同一の抗原に対する記憶８９２８球のこの応 答を、「二次免疫応答」と称する。

重要なことに、記憶細胞形成は、新しい抗原結合部位セットを生じ、２回目の遭 遇の際に更に効率よくその抗原に対処する。これらの新しい結合部位は、体細胞 突然変異およびいわゆる「アフイニテイーマチュレーション」における選択によ って生じると考えられる。この記憶細胞経路において、８９２８球の集団は、− 次免疫応答において発生した８９２８球からの激しく変化した抗体結合部分を伴 って生じる。この過程から、二次ブラスマ細胞は、二次免疫応答において、−次 免疫応答の一次ブラスマ細胞が発現するよりもはるかに高い親和性の抗体を発現 する。更に、「−次」応答の場合のようなＩｇＭよりもむしろ、主としてＩｇＧ を生産する。

記憶８９２８球は、「無経験」８９２８球から形態学的に区別するのが容易では ない。それにもかかわらず、無経験および記憶Ｂリンパ球上で異なって発現され る多数の非Ｉｇ表面マーカーが存在する。これらとしては、ピーナツ凝集素結合 分子（ＰＮＡ）　、リンパ球付着分子ＭＥＬ−１４および抗原Ｊｌｌｄがある。

ヴイッテタ（Ｖ　ｉ　ｔ　ｔ　ｅ　ｔ　ａ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、（１９９１）を参照されたい。ヴイッテタらからの一部修正した表Ｉに、こ の比較を要約する。

表■、無経験および記憶８９２８球の比較特性　無経験　記憶 表面マーカー １ｇイソタイプ　ＩｇＭ／ＩｇＤ　Ｉ　ｇＧ／ＩｇＥ／Ｉ　ｇＡＪｌｌｄ　高　 低 ＭＥＬ−１４低　高 補体受容体　低　高 ＰＮＡ分子　低　高 再循環　なし　する １ｇ可変部　突然変異なし　突然変異したＡｇ親和性　低　高 本発明は、高親和性抗体が二次リンパ芽球子孫から生じるという事実を利用し、 そして優先的にこのような二次リンパ芽球から細胞系を生じる不死化モノクロー ナル抗体の形成を必要とする。

本明細書中で用いられる「融合生成物」は、ヒト抗体分泌性末梢血リンパ球とヒ ト染色体含有へテロハイブリッド（融合パートナ−）との融合から得られる安定 した不死化抗体生産者を意味する。［ペテロハイブリッド」または「融合パート ナ−」という用語は交換可能に用いられ、検出可能なヒト由来染色体を保持し且 つ免疫グロブリンを分泌しない不死細胞系を意味する。

「細胞系」とは、制限されないが、細胞が言及された細胞系の細胞由来である限 りにおいて、個々の細胞、採取された細胞および細胞含有培養物を含む種々の実 施態様を意味する。「誘導された」とは、子孫または子を意味する。当該技術分 野において、自発的なまたは誘発された変化は、貯蔵または継代中のヒト染色体 において起こりうろことが知られている。したがって、言及された細胞系由来の 細胞は、先祖細胞または培養物と正確に同一でな（でもよく、したがって言及さ れたどの細胞系もこのような変異体を含みつる。

「高親和性」という用語は、結合親和性が１０１１モルより大：好ましくは、１ ０９〜１０”１モルより大のモノクローナル抗体を意味する。

Ｂ、一般的な方法 ヒト染色体含有「融合パートナ−」は、マウスおよびヒト（マウスＸヒト）また はヒトおよびヒト（ヒトＸヒト）細胞系を互いに融合することによって製造され 、それらの細胞対の少な（とも一方は新生物形成リンパ系細胞、例えば、骨髄腫 またはリンパ腫である。

更に、二次リンパ芽球細胞を富化された集団を形成することによって製造された 細胞調製試料を製造する。二次リンパ芽球細胞調製試料は、血清学的陽性ヒトド ナーの記憶Ｂリンパ球を富化されたリンパ球集団に由来することができる。

「富化された」により、それは、血中のＰＢＬ循環中に存在するかまたは扁桃若 しくはリンパ節中に局在しているような比較的高比率の記憶Ｂリンパ球集団を含 む調製試料を意味する。富化された集団は、更に、牌臓の胚中心において見出さ れる（そして例えば、マイクロピペットで採取される）ことがある。「富化され た」集団は、牌臓のそれとは対照的であるべきであり、概して、それは他の細胞 に対して比較的低比率の記憶Ｂリンパ球を含む。

ヒト染色体含有融合パートナ−を二次リンパ芽球細胞と融合し、そして特定の抗 原に対して特定のヒトモノクローナル抗体を分泌するその融合生成物のクローン を分泌させる。

二次リンパ芽球を富化された細胞調製試料は、血清学的陽性ドナーの富化された 記憶細胞調製試料および同種異系ドナーからのリンパ球の間に混合リンパ球反応 を生じることによって提供される。「混合リンパ球反応」という用語は、同種異 系ドナーからのリンパ球の同時培養中に生成される成長因子および他の増殖性物 質による細胞増殖刺激を意味する。

融合は、当該技術分野において知られた標準的な条件、例えば、ポリエチレング リコール（ＰＥＧ）存在下のインキュベーションに続いて、所望の融合生成物の 選択を用いて実施される。

１、適当なドナーの識別： 目的の抗原に対して向けられた血清抗体を有する個体を、予想される個体の血清 を何等かの適当な検定、例えば、酵素結合免疫検定（ＥＬＺＡ）　、酵素免疫検 定（Ｅ　Ｉ　Ａ）　、血球凝集検定（ＨＡ）または補体結合検定（ＣＦ）を用い て最初にスクリーニングすることによって識別する。これらの血清スクリーニン グ法は当業者に周知である。

これらの個体を識別するもう一つの方法は、予想されるドナー集団について実施 されるべき最初の実験のために、具体的な疾患、自己免疫状態、具体的な免疫感 作または、特異的抗体生産のための他の素因を与える因子によって個体を選択す ることである。この種類の特定の個体を以下の０２節において更に詳細に論及す る。

個体の既知の免疫学的履歴基準で選択されるかまたは適当な検定を用いてスクリ ーニングされる個体は、一般的な方法の次の段階に進行する。

２、　活性ＰＢＬのスクリーニング： 選択された抗原に対して抗体を活発に分泌する末梢血リンパ球を個体が有する場 合、それらの個体を決定するためにスクリーニングする。特に好ましいスクリー ニング検定は、概して、Ｃ，Ｃ，ツェルキンスキ（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ）ら、 ＬＩＳＰＯＴ）（酵素結合イムノスポット）検定である。概して、スクリーニン グされた末梢血リンパ球１００万個につきエリスポット陽性細胞が５０個より大 のドナーは陽性であると考えられる。このような末梢血リンパ球を、次の免疫感 作および活性化工程において用いる。

３、ＰＢＬの免疫感作および活性化： 本発明の方法の重要な態様は、ＰＢＬ集団の記憶Ｂリンパ球をインビトロで活性 化して、該リンパ球を選択された抗原および同種異系ドナーからのリンパ球の存 在下で同時培養することによって二次リンパ芽球を生成することである。

ＰＢＬの同種異系リンパ球に対する比率は約１＝１であるが、この比率は、最適 比率を決定するように容易に調整することができる。選択された抗原の１度は広 範囲にわたって変更することができ、好ましくは、約０．０５〜約１０マイクロ グラム／ｍｌ（培地）である。選択された抗原が膠瘍細胞マーカーである状況下 において、腫瘍抗原は完全な腫瘍細胞の形であってよく、したがって、存在する 抗原の実際量を測定するのは難しいことがある。これらの場合、二次免疫応答に おいて二次リンパ芽球形成を引起こすのに十分な抗原は、増殖および細胞成長を 顕微鏡観察することによって視覚的に決定される。

ＰＢＬおよび同種異系リンパ球の同時培養は３〜５日間達せられるが、４日間が 最適であると考えられる。次に、生存しつるリンパ球を次の融合工程のために回 収する。

４、融合生成物の製造： 本発明の融合生成物を生成する融合は、基本的に、全内容が本明細書中に参考と して包含されているコーラ−（Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒ）およびミルスティン（Ｍｉ 　１ｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５　（１９７５）の方法によっ て行なわれる。簡単には、本発明の融合パートナ−を含む不死化細胞系と、末梢 血リンパ球由来の二次リンパ芽球とを、該リンパ芽球および融合パートナ−の細 胞膜を脱安定化させる融合誘導因子（ｆｕｓｏｇｅｎ）を用いて混合する。融合 誘導因子としては、ホスホグリセリドおよびステロールがある。好ましくは、分 子量約１０００〜４０００のポリエチレングリコール４０％〜５０％を室温から 約３７℃〜４０℃で用いる。融合には約５〜１０分間を要し、次に、細胞を遠心 分離し、再懸濁させ、そして培地中に播種する。

５、ヒトモノクローナル抗体の製造、スクリーニングおよび精製：本明細書中に 記載の手順にしたがってヒト二次リンパ芽球との融合を行なった後に、本発明の 不死化融合生成物を選択する。これは、適当な選択培地を用いることによって達 成しつる。好ましい二次リンパ芽球は正常末梢血リンツク球由来であり、適当な 選択培地は、非融合末梢血リンパ球並びに非融合ヘテロハイブリ、ソドを増殖さ せることがないＨＡＴまたはＡＨ培地でありうる。別の選択法は、融合に用いら れる細胞の性質に応じて可能である。Ｈ１〜ＴおよびＨＡの他に、因子を選択す る他の培地に対して応答すると考えられる不死化融合生成物の別の感受性を突然 変異誘発によって与えることは可能であろう。

選択された抗原に対して要求される特異性を有するクローンは、所望の選択され た抗原に対して結合する能力を有する抗体の存在に関して培地を検定することに よって識別され、そしてモノクローナル抗体の性質は、親和性および免疫グロブ リンクラス（例えば、ＩｇＭ、Ｉ　ｇＧ、ＩｇＡ、Ｉ　ｇＥ）を標準法を用いて 検査をすることによって更に特徴付けることができる。所望の特異性を有するヒ トモノクローナル抗体を生じるクローンは、限界希釈技術によってサブクローン 化され且つ培地中においてインビトロで増殖するかまたは選択された宿主動物中 に注射され且つインビボで増殖することがてきる。

抗体は、得られた培地から慣用的な抗体分別法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿 、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー 等によって分離することができる。

本発明の方法において用いられる融合パートナ−は、融合されている多数の細胞 である。融合した細胞は、不死であり且つヒトからのそれらの染色体のある部分 と、非ヒト哺乳動物、特に、ウサギまたは門歯類動物、更に詳しくは、マウスな どの門歯類動物からのそれらの染色体の別の部分とを有すると特徴付けられる。

或いは、融合パートナ−の染色体全部がヒト由来でありうる。例えば、融合パー トナ−は、米国特許第４，５２９．６９４号明細書で例示されたように、ヒト骨 髄腫細胞と融合されたヒトリンパ球であり得、または融合パートナ−は、米国特 許第４．４３４，２３０号明細書で例示されたように、ヒトプラスマ細胞様細胞 と融合されたヒトリンパ球であり得る。更に、ヒト染色体細胞系を含む種々の融 合パートナ−の概要に関する、ラリツク（Ｌａｒｒｉｃｋ）、（米国特許第５゜ ００１．０６５号明細書）、更には、カブラン（Ｋａｐｌａｎ）ら、（米国特許 第４．５７４．１１６号明細書）およびそこに引用された参考文献を参照された い。

本発明において用いるのに特に好ましい融合パートナ−は、内容が本明細書中に 参考として包含されている、キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら、Ｊ。

夏ｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８９．６１〜７２　（１９８６）で構築され たマウスＸヒトへテロハイブリッドである。この種類の最も好ましいヘテロハイ ブリッドは、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５マウスＸヒトヘテロハイブリッド（ＡＴＣＣ＃ＣＲ Ｌ１８２３）であり、そこにおいて、ネズミ部分は非免疫クロプリン分泌性マウ ス骨髄腫由来であり且つヒト部分は結節型リンパ腫を有するヒト患者の悪性リン パ系細胞由来である。融合パートナ−細胞は、少な（とも１種類の、そして好ま しくは、数種類のヒト染色体を含む。

融合パートナ−および融合生成物の増殖を確実にするスクリーニング法および選 択法は、本発明の方法において重要である。一般的に用いられる融合パートナ− は、細胞のＤＮＡを合成する能力を排除するように選択されたいくつかの選択培 地上で増殖不能である。本明細書の２種類の極めて一般的に用いられる培地は、 ヒポキサンチン−アザセリン−チミジン（ＨＡＴ）培地およびアザセリンーチミ 血リンパ球）は、その正常なりＮＡ合成がＨＡＴまたはＡＨ培地によって阻害さ れている状況下において、ＤＮＡ合成のための別の経路を利用できる能力を利用 する。好ましい融合パートナ−細胞系においては、それらがＤＮＡ合成の別の経 路に必要とされるある特定の酵素（ＨＧＰＲＴ）を欠いているので、この別の経 路は利用できない。正常細胞は、それらの正常なりＮＡ合成経路を用いなくても ＨＡＴまたはＡＨ培培地−増殖しうるし、そして融合生成物はＨＧＰＲＴを生産 する正常細胞の能力を獲得するので、ＨＡＴまたはＡＨ培培地−増殖しつる。し かしながら、融合生成物のみがＨＡＴまたはＡＨ培培地−おいて増殖し且つ反復 継代で生き残ることができる。正常細胞（、Ｐ　Ｂ　Ｌ）はＨＡＴまたはＡＨ中 で増殖しつるが、それらは不死性でないし、したがって反復継代で生き残らない ので、それらは生き残ることができない。

しかしながら、ＰＢＬも、例えば、エプスタイン・バールウィルスによる形質転 換によって不死化されることもできる。次に、これらのＰＢＬを本発明によって 活性化して、二次リンパ芽球を生成することができる。エプスタイン・バールウ ィルスによって不死化された末梢血リンパ球由来の二次゛リンパ芽球に対して融 合パートナ−細胞を融合させるこれらの状況においては、更に別の選択性が要求 される。不死化ＰＢＬは、正常血液リンパ球で考えられるように、多数の継代に よって死滅することはなく、しかもそれらはＨＡＴまたはＡＨ培培地−増殖する 。

したがって、不死化ＰＢＬを用いるスクリーニング法では、これらの不死化リン パ球が選択的である薬剤（例えば、ウアバイン（ｏｕｂａｊｎ））を培地中に含 む必要がある。したがって、融合パートナ−はこの薬剤に対する獲得耐性を有し ているべきであり、その結果として、それが不死化ＰＢＬに対して耐性を転移す ることができ且つ得られた融合生成物を増殖させる。

２、血清学的陽性ドナーからのリンパ球第−の血清学的陽性ドナーからの末梢血 リンパ球を活性化して二次リンパ芽球を生成し、そしてこれらの二次リンパ芽球 を融合パートナ−と融合して融合生成物を生成する。血清学的陽性ドナーにおい て既にアフィニティーマチュレーションを経験した記憶Ｂリンパ球は、アフィニ ティーマチュレーションの結果として生じる高親和性抗体のために特に好ましい 。

最も容易に利用可能で且つ好ましい富化された記憶８９２８球源は、扁桃、リン パ節、リンパ管または牌臓中の胚中心よりもむしろ末梢循環血液である。それに もかかわらず、記ｔ！Ｂリンパ球を富化された細胞調製試料は、肥大したリンパ 節、扁桃、リンパ管または牌臓中の胚中心からも当該技術分野において周知の外 科的方法によって得ることができる。例えば、記憶８９２６球中の富化されたリ ンパ球は、胸管にカニユーレを挿入することによってまたは腹膜洗浄によってリ ンパ管から得ることができる。

寄生虫、ウィルスまたは細菌などの感染因子に関係したある選択された抗原に対 して特異的なヒトモノクローナル抗体の生産が望まれる場合、一つの可能なＰＢ Ｌ源は、同一の感染因子によって引起こされた感染を有する血清学的陽性個体か らのものである。したがって、ＰＢＬドナーは、特定の寄生虫、細菌またはウィ ルスに対して免疫応答を生じたヒトであることができ、したがって、二次リンパ 芽球細胞を生成する能力を有する記憶Ｂリンパ球による末梢血の富化がもたらさ れる。

この範ちゅうでの他のドナーは、感染因子に予め暴露されたもの、他の非自己抗 原または自己抗原、例えば、妊娠中または輸血の結果としてなどのＨＬＡである 。特に、免疫グロブリン欠損症の患者への輸血は、本発明の方法によって抗体を 産生させるのに特に重要である末梢血リンパ球源を提供−１−ることかできる。

例えば、ＩｇＡ欠損症は、免疫不全症候群、アレルギー性疾患および／または自 己免疫疾患に時々関係する一般的な免疫学的障害である。この欠損のある多数の 被験者は、ＩｇＡ欠損があっても健康である。しかしながら、ＩｇＡ欠損症は、 ■ｇＥ欠損症、Ｉ　ｇＧ２および／または１ｇＧ４欠損症をも引起こしうるＢリ ンパ球分化の欠陥の一つの現われである。Ｍ、　Ａ、　Ｈ，フレンチ（Ｆ　ｒ　 ｅ　ｎ　ｃ　ｈ）およびＲ，Ｌ、ダウキンス（Ｄａｗｋｉｎｓ）　、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、Ｔｏｄａｙ、１１：２７１〜２７３　（１９９０）およびそこに引用され た参考文献を参照されたい。ＩｇＡ欠損個体は、血清１ｇＡを含む血液生成物を 投与後に抗１ｇＡ抗体を産生ずるＢリンパ球を生じる。したがって、血清１ｇＡ （またはＩｇＥ）を含む血液生成物を輸血されたＩｇＡ（またはＩｇＥ）欠損個 体は、モノクローナル性ヒト抗ヒトＩｇＡＣまたはＩｇＥ）抗体を産生ずる本発 明の方法において用いるのに特に好ましい末梢血リンパ球源でありうる。

概していえば、ある選択された抗原を用いるヒトへの慎重な接種も、注射される 物質が適当な量で入手可能であり、無毒性であり、そして免疫応答を開始するこ とができるという条件付きで可能である。注射することができる抗原の範囲は、 適当な免疫感作スケジュールと共に、愉理的および他の考慮すべき問題によって 制限されることがあるが、許容しつる末梢血リンパ球を有する血清学的陽性ドナ ーは、細菌性、ウィルス性または他の因子を用いる立証済みのスケジュールにし たがって個体を免疫感作することによって得ることができる。例えば、ヒトへの 細菌性リボ多糖（ＬＰＳ）の慎重な接種が行なわれた。Ｊ、　Ｄ、バウムガート ナ−（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ）ら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ本発明の他の態 様においては、末梢血リンパ球は、自己免疫疾患に起因する血清陽性のドナーに 由来する。そのような個体は、典型的には「自己」抗原に対して特異的なリンパ 球を有する。

さらに別の態様において、末梢血リンパ球は、例えば卵巣腫瘍等の病気状態に起 因する血清陽性のドナーに由来する。抗原ＣＡ−１２５はそのような癌の細胞マ ーカーである。「自己」抗原の用語は、健康なヒトに特徴的な抗原のみならず、 ある種の不健康もしくは異常状態に特徴的な抗原、例えばｊｑ細胞の細胞マーカ ー並びに当業者に知られている多（の細胞決定（ＣＤ）マーカーを包含する。

ＰＢＬの非ヒト供給源も、感染を生じさせるために意図的接種を行った後に使用 可能である。本発明の方法に用いるために特に好ましい非ヒト動物は５ＣＩＤマ ウス（Ｍ、Ｊ、Ｂｏｓｍａら、ｒＴｈｅ　５ＣＩＤ　ｍｏｕｓｅＪ、Ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１５２：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８９）である。５ＣＩＤ（ｓｅ ｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｊｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：重度複合 免疫欠損）マウスは、Ｂ−およびＴ−リンパ球免疫の両方を欠失していることを 特徴とする。これらのマウスの末梢血はリンパ球を欠いている。リンパ組織は正 常のサイズの１／１０またはそれ以下で、そして牌臓とリンパ節領域のリンパ球 も激しく減少している。そのような５ＣＩＤマウスに対して、機能的ヒト免疫シ ステムを移植および再構成することに成功している。Ｄ、Ｅ、Ｍｏｓ　ｉｅｒら 。

Ｎａｔｕｒｅ、３３５：２５６−２５９　（１９８８）を参照されたい。その内 容は本明細書に含まれていることとする。５ＣＩＤマウスに注射されたヒト骨髄 は、免疫可能なヒトリンパ球を生じる。一般に、ＰＢＬの非ヒト供給源は、治療 用のヒトモノクローナル抗体の製造のためには好ましくない、何故なら、生じる 抗体はその非ヒト的性質を残存し、そのため抗−抗体の形成を誘発する可能性が あるためである。そうは言っても、ヒト免疫システムを移植した５ＣＩＤマウス 、または池の同様な性質を有する非ヒト宿主は、本発明の方法の適当なＰＢＬド ナーである。

本明細書で具体的に例示するモノクローナル抗体はヒトＩｇＧであるが、本発明 はヒトモノクローナル抗体の特定のクラスもしくはサブクラスに限定されるもの ではない。即ち、モノクローナル抗体はＩｇＧ１、Ｉ　ｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＥ およびＩｇＭであってもよい。

３、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）リンパ球本発明の重要な要件は、同種異系 リンパ球を、二次的リンパ芽球の増殖に必要な条件を提供するために、血清陽性 の第一ドナーからの末梢血リンパ球と同時培養することである。第一ドナーから のリンパ球は、遺伝的に異なる第二のドナーからのリンパ球と相互作用して、良 く知られている「混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｒｅ ｓｐｏｎｓｅ）Ｊを生じる。簡単に説明すると、混合リンパ球反応は、二人のド ナーの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質の不適合（ミスマツチ ）のために生じる。

各を椎動物種は、非常に強い移植拒絶を誘発する能力により最初に認識されたＭ ＨＣを有する。各ＭＨＣは三つのクラスターの遺伝子群を含んでいる。クラスＩ 遺伝子群は細胞表面に付随するＭＨＣクラス！ペプチドをコードし、クラス■遺 伝子群は膜貫通へテロダイマーであるクラス■分子をコードし、そしてクラス■ 遺伝子群はコンペルターゼ（ｃｏｎｖｅ　ｒ　ｔ　ａ　ｓ　ｅ）の形成にかかわ るクラス■成分をコードしている。各ＭＨＣ遺伝子クラスターの遺伝子群は通常 は、単一のメンデル特性として承は継がれる。クラス１分子は実質的に体内の全 細胞上に存在し：クラス■分子は特にＢリンパ球およびマクロファージに存在す る。

同種異系個体（即ち第一のドナーと同じ種であるが遺伝的に異なっており、その ために異なるＭＨＣ遺伝子クラスターを有する個体）からのリンパ球を、選択さ れた抗原の存在下に培養すると、−人の個体からのリンパ球が第二の個体からの 細胞上のクラス■分子を主として認識し、そして二次的リンパ芽球細胞として増 殖するであろう。ヘルパーニリン８球もまた発生するであろう。

この過程における８９２８球増殖の性質はまだ完全には解明されていない。しか しながら、いかなる理論にも拘束されることは意図しないが、第一ドナーのＢリ ンパ球は混合リンパ球反応において、選択された抗原の存在下に、（ｉ）非特異 的活性化により、（ｉｉ）マクロファージからの信号に伴う反応により、および ／または（ｉｉｉ）選択された抗原をクラスＩＩ　ＭＨＣと共に認識するヘルパ ーニリン８球からの信号により活性化されると考えられる。１９２８球は一連の 可溶性成長因子（サイトカイン類）を生産し、これらの因子は抗原によって活性 化されたＢリンパ球集団を増大させて、二次的リンパ芽球への増殖および親和性 成熟の能力を有する体細胞変異を引き起こす。リンパ球の混合物中に存在するマ クロファージのような他の細胞もまた、可溶性成長因子を生産する。成長因子に は、種々のインターロイキンおよびインターフェロンが包含されるが、これらに 限定はされない。

混合リンパ球反応を引き起こすために必要なリンパ球は、任意の同種異系ドナー からのものでよい。混合リンパ球反応を引き起こすことができるリンパ球は、同 種異系ドナーからのＰＢＬ、リンパ腺、または扁桃に由来することができる。

好ましい細胞は同種異系の牌臓細胞である。これらのリンパ球が混合リンパ球反 応を引き起こす能力は、モノクローナル抗体を実際に製造する前に、二つのセッ トのリンパ球を一緒に培養し、そして放射活性チミジンのＤＮＡへの取り込みを 用いて第一ドナーのリンパ球の増殖の程度を測定することにより（これは当業者 に良（知られている技術である）、容易に調べることができる。

本発明の方法で混合リンパ球応答を用いることの格別の意義および有意な利点は 、本発明の方法が、リンパ芽球形成のために末梢血リンパ球へ成長因子を提供す るための、従来技術の時間を浪費し複雑な方法を避ける点である。即ち、本発明 の方法は、末梢血リンパ球からのＴ細胞またはＴサプレッサー細胞の除去操作； 末梢血リンパ球の種々の成分をカラムで分離する事、モノクローナル抗体でサプ レッサー細胞を特異的に溶解する必要性；リンパ球を種々のフラクションに分離 して、それらを再構成する必要性：および／または毒性のＴ細胞の不活性化；を 避けることができる。他の利点は所望のヒトモノクローナル抗体製造細胞ライン の製造の驚くべき成功率である。

４、抗原 本発明の方法において二次的免疫応答を引き起こすために用いる抗原は、第一の ドナー内で一次免疫応答を開始させた抗原と実質的に同一であってもよい。抗原 は、広範囲のバクテリア、ウィルスまたは他の体外由来の供給源のもの（即ち外 来抗原）に由来することができる。バクテリア外来抗原の例は、ジフテリア毒素 、緑膿菌（ＰｓｅｕｄｏＩｌｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、破傷風毒素 （ｔｅｔａｎｕｓ　ｔｏｘｏｉｄ）　、ヘモフィルス菌ｒｌ’ｌａｅｍｏｐｈｉ ｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）その他を含む。

ウィルス外来抗原は、肝炎Ａおよび／またはＢ、ＨＩＶ−１、インフルエンザ、 および風疹その他を含むものから由来することができ：寄生性抗原は、マンソン 住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏａ＋ａ　ｍａｎｓｏｎｉ）　、リーシュマニア属 （Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｓｐ、　）、ト１ツノくノゾーマ静ブルセイ（Ｔｒｙ ｐａｎｏｓｏＩｌｌｅ　ｂｒｕｃｅｉ）、肝吸虫（Ｃ１ｏｎｏｒｃｈｉｓ　５ｉ ｎｅｎｓｉｓ）　、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐ ａｒｕｍ）およびその他由来のものを含みうる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫のために用いる免疫方法および抗原の総説に関しては、Ｋ 。

Ｊａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｔ、　Ｂｅ１ｌ　（Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ、　１００：５−４０　（１９８７）を参照され■■A。

その内容は本明細書に含まれることとする。

前記のとおり、末梢血リンパ球は自己免疫疾患を有するドナー由来であってよい 。従って、特定の抗原は自己抗原（即ちドナー自身の細胞および／または組織構 成分の一つ）である。広範囲の自己免疫疾患が存在するから、抗体を生じうる具 体的細胞成分は、チログロブリン（）１シモト甲状腺炎の場合）のような特異的 分子からＤＮＡ　（全身性紅斑性狼蒼の場合）のような特定の器官に限定されな ０抗原にまで及ぶことができることに留意すべきである。自己免疫疾患およびそ れに付随する自己抗原の例を、表■に記載する。

表■　自己免疫病をおよび自己抗原 ハンモト甲状腺炎　チログロブリン 原発性粘液水腫　第２コロイドＡｇ　（ＣＡ２）チロイドペルオキシダーゼ：細 胞質 細胞表面 甲状腺中毒症　細胞表面ＴＳＨリセプター成長リセすタ−（Ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅ ｃｅｐｔｏｒｓ）アジラン病　副腎細胞の細胞質 早発性閉経開始　ステロイド生産細胞の細胞質男性型不妊症（あるもの）　精子 インシュリン依存性（若年性）糖尿病　島細胞の細胞質細胞表面 Ｂフィンシュリン耐性　Ｃ黒色表皮腫　インシュリン　リセブターアトピー性ア レルギー（あるもの）　β−アドレナリン　リセブター重症筋無力症　骨格筋お よび心筋 アセチルコリン　リセプター イートン−ランバートシンドローム （多発性硬化症）　神経末端のＣａ　”？ヤンネル脳 グツドパスチャーシンドローム　糸球体および肺基底膜尋常天庖癒　表皮内の突 起細胞（ｐｒｉｃｋｌｅ　ｃｅｌｌ）間のデスモゾーム 庖瘉　基底膜 水晶体ブドウ膜炎（Ｐｈａｃｏｇｅｎｉｃ　ｕｖｅｉｔｉｓ）　レンズ交感性眼 炎　ブドウ膜 自己免疫性溶血性貧血　赤血球 特発性血小板減少性紫斑病　血小板 原発性胆汁性肝硬変　ミトコンドリア（ピルビン酸脱水素酵素）（ＨＢｓ　−ｖ ｅ）　細胞表面リポタンパク質潰瘍性大腸炎　結腸のりボポリサツカライド結腸 の上皮細胞表面タンパク質 シエーグレンシンドローム　５Ｓ−Ａ　（Ｒｏ）；　５Ｓ−Ｂ　（Ｌａ）管／ミ トコンドリア／核／甲状腺 ｇＧ 関節リウマチ　ＩｇＧ コラーゲン 円板状エリテマトーデス　核／ＩｇＧ 硬皮症　核／ＩｇＧ／セントロメア 核／ＩｇＧ／５ｃ−７０ 皮膚筋炎　核／ＩｇＧ／Ｊｏ−１ 複合性の結合組織病　抽出可能な核成分全身性エリテマトーデス　ＤＮＡ Ｓｍ　リポ核タンパク質 核タンパク質 細胞質の可溶性抗原 血液／凝固因子／ＩｇＧ　カルシオリピンの形成要素を含む他の抗原群 ウエーゲナー肉芽腫症　好中球細胞質（Ａ　Ｎ　Ｌ　Ａ）本発明の方法に用いる 抗原の濃度は、生じるヒトモノクローナル抗体の親和性に影響する。一般には、 抗原に対する抗体リセブターのｊ１°治力は、通常どおり抗原と表面抗体の反応 の平衡定数により決定されるであろう。適切な数の抗原分子が末梢血リンパ球表 面の抗体リセブターに結合すると、そのリンパ球は刺激されてリンパ芽球を形成 することができる。抗原が少量しか存在しないと、高親和性抗体リセブターを持 つリンパ球のみが刺激を生じるために十分な抗原に結合できるであろう。勿論そ れらの娘細胞もまた高親和性抗体を生産するであろう。抗原−抗体平衡式を考慮 すると、抗原の濃度が増大するにつれ、比較的低い親和性を持つ抗体もより多く の抗原と結合するであろう。従って、抗原の量が多いと、低親和性抗体リセプタ ーを持つリンパ球も刺激されるであろう。そのため、高親和性抗体を生産するク ローンを製造するためには、一般に低い抗原量が好ましい。

高い抗原濃度は、低ないし生親和性の抗血清を生じる。本発明の方法で用いる好 ましい抗原濃度は、培養物１ｍ１（約３Ｘ１０’　リンパ球を含む）当たり約５ ０ｎｇの抗原から培養物１ａｌ当たり抗原１０μｇ未満までに渡っている。特に 好ましい濃度範囲は培養物１ａｌ当たり約５０ｎｇないし約２．５μｇの範囲で ある。

Ｄ　ヒトモノクローナル抗体の用途 本発明の方法で製造されるヒトモノクローナル抗体は、ヒト患者に投与したとき 免疫反応を引き起こさないので、ヒトの治療法に特に好ましい。

本発明のヒトモノクローナル抗体の対象にできる潜在的標的には実質的に制限が なく、特定の抗原が第一のドナーに免疫応答（即ち、メモリＢ−リンパ球）を引 き起こす能力、および本発明の方法によりＰＢＬに二次的免疫応答を開始できる 能力のみにより拘束される。潜在的ヒト標的には、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３３お よびＣＤ３４のようなリンパ球や骨髄細胞の決定因子；バクテリア毒素；耽溺性 薬剤；麻酔剤：薬剤：腫瘍細胞マーカー、細胞発達のマーカー；ウィルスや寄生 虫の抗原：免疫グロブリンのエピトープやイディオタイプ：Ｔ細胞抗原リセブタ ーのエピトープやイディオタイプ：アセチルコリンリセプターのような神経学的 マーカー、ＧＡＢＡリセブターおよびミニリンおよび細胞接着性分子（例えばＩ ＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１）が含まれる。Ｍ、　ｌ５ｏｂｅ　ｅｔ　ａｌ、、 　”５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｅｅｐｔａｎｃｅ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ａｌｌ ｏｇｒａｆｔ　ａｆｔｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ　ｔｏ@ＩＣＡＭ−１ａ ｎｄ　ＬＦＡ−１”、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５５：１１２５−１１２７　（１ ９９２）を参照されたい。

本発明の方法で製造されるヒトモノクローナル抗体は、免疫毒素として細胞毒素 と結合させることができる。従って、本発明の免疫毒素は三つの重要成分を有し 、それらは、標的指向モノクローナル抗体分子、抗体と毒素を保持する結合（好 ましくは共有結合）、および細胞毒素である。

本発明の方法で製造されたヒトモノクローナル抗体は、特定の標的マーカー抗原 を有する細胞を他の因子から保護するためのブソロキング抗体として用いること もできる。本発明のヒトモノクローナル抗体は、放射線造映剤として用いること もできる。抗体、またはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’　フラグメントおよびＦ （ａｂ’　）！フラグメントのような抗体フラグメントは、インジウム−■およ びテクネチウム−９９ｍのような放射性金属アイソトープで標識でき、何れも外 部からのシンチグラフィーによる検出に適している。そのようなガンマ線放射体 は、ガンマ線カメラで検出可能で、しかもｉｎ　ｖｉｖｏにおける好ましい半減 期を有するために好ましい。本発明の抗体は当業者に知られている任意の技術で 放射標識することができる。Ｂｅｒｇｅｒらの米国特許５．０２４．８２９号を 参照されたい；その内容は本明細書中に含まれるものとする。

る薬剤または治療剤に結合させることもできる。

五塵男 次の実施例ではヒトＩｇＥに対するヒトモノクローナル抗体の産生（こつＬ％て 説ドナーの抗ＩｇＥ血清検出のための典型的なＥＩＡを、まず９６穴平底ＥＩＡ プレート（コーニング・グラス・ワークス社、ニューヨーク州コーニング、カタ ログ＃２５８０１）にＩｇＥ　（０，１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，４中の１００ μｇ　／　ｍ　ｌ　）を塗布することによって行った。好ましいヒトＩｇＥは、 細胞系Ｕ２６６Ｂ１（ＡＴＣＣ＃　ＴＩＢ　１９６）の培養上澄み液から得た。

約５０μｌの抗原溶液を穴毎に加え、−晩約４℃に保った。

次に、各穴をリン酸塩緩衝剤含有生理食塩水（ｐＨ７，２）−０，０５％Ｔｗｅ ｅｎ２０　（シグマ・ケミカル社、ミズリー州セントルイス、カタログ＃Ｐ１３ ７９）の溶液で３回洗浄した。この後、１００μＩの１％ウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ、シグマ社、カタログ＃Ａ−７０３０）−リン酸塩緩衝剤含有生理食塩水 を各穴に加え、湿潤インキュベーターで１時間約３７℃１こ保った。穴を上記の ようにＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。

約５０μｍのドナー血清希釈液（二連）を穴に加え、２時間上言己のよう薯二約 ３７°Ｃに保った。希釈液はＰＢＳ−０，５％ＢＳＡ中に希釈したものである。

穴を上記のようにＰＢＳ−０，０５％ＴＷｅｅｎ２０で洗浄した。

次に、約５０μｌの抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合物（シグマ社カ タログ＃Ａ−３１５０）を１：２．５００でＰＢＳ中に希釈したものを各穴（こ 加えた。穴を２時間３７°Ｃに保った。次に、上記のよう１こＰＢＳ−０，０５ ％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。

各穴に、０．０１％のＭｇＣ１□および０．　２％のアジ化ナト１ノウムを補っ たソレンセンのグ１ルン緩衝液■に１ｍｇ／ｍｌで溶解したシグマ１０４ホスフ ァターゼ基實（シグマ社、カタログ＃１０４−０）約５０μｌを加えた。Ｂｉｏ ｔｅｋ　２０００　（フイシャー・サイエンテイフ什ツク社、マサチューセ・ソ ′ン列１メ・ラドフォード）マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を／４０ ５　ｎ　ｍで読み取つた。

この分析結果を図１に示す。文字（ＢＧＧ以外）はヒトのドナーを表す。異なる 希釈溶液の吸光度値をＹ軸にプロットする。ＴＢおよびＨＢは自己免疫症状の患 者であり、従って陽性の結果となり、ＢＷおよびＪＷＨはそうではないことが予 想された。ＢＧＧは陰性対照としてのウシのガンマグロブリンである。

２゜　活性ＰＢＬのスクリーニング ＩｇＥ特異的末梢血液リンパ球を検出しそして数えるための典型的なＥＬＩＳＰ ＯＴ分析では、まず６ｃｍベトリブレート（Ｆａｌｃｏｎ　１００７）に１０μ ｇ／ｍｌ滅菌ＰＢＳの濃度のヒトＩｇＥ溶液２ｍ１（スクリップス・ラボラトリ ーズ、カルフォルニア州すンジエゴ、カタログ＃１０２２４）を塗布する。プレ ートを一晩４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅｅ ｎ２０で３回洗浄した。

次に、プレート上の過剰の結合部位を、プレートを約６時間約３７℃にて、滅菌 ＰＢＳ中の２％ＣＰＳＲ−３３ｍｌ／プレートを用いてインキュベートすること によりブロックした。プレートは上記のようにＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅ　ＣＤ ２０で３回洗浄した。

次に、２または４ｍｌのＰＢＬを各プレートに加えた。ＰＢＬは、１０％のＣＰ ＳＲ−３，２ｍＭのし一グルタミン（シグマ社、カタログ＃Ｇ−７５１３）、１ ００μｇ／ｍ＋のゲンタマイシン（シグマ社カタログ＃Ｇ　１３９７）　、２ｍ Ｍのピルビン酸ナトリウム（シグマ社、カタログ＃Ｓ−８６３６）　、２ｍＭの 非必須アミノ酸（メジアチック社、カタログ＃２５−０２５−ＬＬ）および１− ５×１０−Ｓモルの２−メルカプトエタノール（シグマ社、カタログ＃Ｍ−６２ ５０）を補ったＲＰＭＩ−１６４０（メジアチック社、カタログ６Ｏ−００２− ＰＥ）中に含まれていた。プレートを５％ＣＯ□湿潤インキュベーター中で一晩 ３７℃でインキュベートした。次に、プレートを上記のようにＰＢＳ−０，０５ ％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。

約３ｍｌの水冷１０ｍ１ＥＤＴＡを各プレートに加えた。プレートを４℃に約１ ０分間保ち、次いでＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。

次に、各プレートに１　：　２５０で希釈した抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファ タ−ゼ（シグマ社、カタログ＃Ａ　３１５０）を２．５ｍｌ加えた。希釈剤は滅 菌ＰＢＳであった。プレートを室温に約６時間保ち、次いでＰＢＳ−０，０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。

次に、各プレートにＢＣＩＰ／ＮＢＴ　（ストラタジェン社、カルフォルニア州 うホヤ、カタログ　ピコブルー＃２００３７２）を加えた。混合物を２４時間、 冷却／反応させた。この後、プラークを読み取り／拡大レンズを用いて数えた。

５０個プラーク／１０６平板培養ＰＢＬを越えるものは、免疫化／融合工程に用 いるのに十分に高い反応性を有すると考えられる。

３、　ＰＢＬの免疫化および活性化 末梢血液リンパ球はドナーの静脈血液からヘパリン化ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ−ｔ ｕｂｅ　（ベクトン・ディキンソン社、カタログ＃６４８２）に得た。約１５本 のチューブに血液を採取した。血液をプールし、Ａｃｃｕｓｐｉｎｎ−ｔｕｂｅ （シグマ社カタログ＃Ａ７０５４）で製造業者の指示に従って処理した。遠心分 離は１１００Ｏｘ　（２３０ＯＲＰＭ）で１０分間、２５℃にて行った。

ＰＢＬ層（バフィーコート）を分離し、細胞をさらに２５０ｘｇの遠心分離によ って１縮した。細胞はＰＢＳ中で２回洗浄し、上記のように遠心分離によって集 めた。

牌臓細胞を手術後６時間以内の牌臓摘出患者から得た。単細胞懸濁液を、牌臓組 織フラグメントを５０番メッシュワイヤスクリーンに通すことによって製造した 。次に、細胞を２５０ｘｇの遠心分離を１０分間行うことによって集め、赤血球 を塩化アンモニウム溶解によって除去した。残りの細胞を洗浄し、１００−３０ ０ＸＩＯ’細胞／ｍｌの濃度で４０％ＲＰＭＩ、５０％ＦＣ８および１０％ＤＭ ＳＯよりなる培地に再懸濁し、１．５ｍｌのアリコートに小分けして凍結し、液 体窒素中で貯蔵した。

凍結牌臓細胞を３７℃で解凍し、１５ｍ１のＲＰＭＩで２回洗浄した。遠心分離 を１０分間２５０ｘｇで行った。第２の洗浄を行った後、はぼ同数の牌臓細胞お よびＰＢＬを混合し、２４穴組織培養皿の内側の穴に２ｍｌ／穴で３Ｘ１０’細 胞／ｍｌにて分配した。使用培地は以下の融合法で示されているものであるが、 選択的ＨＡＴ成分は含まれていない。培地に２−メルカプトエタノールを存在さ せると、免疫グロブリン合成に必要な硫黄含有アミノ酸を取り込むためのＢ−リ ンパ球の能力が増す。Ｈ，Ｏｈｍａｒｉおよび１．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、、１５５　：１２７７−１２９０　（１９８２）。

免疫化抗原（ヒト■ｇＥ）をただちに組織培養皿の培養物に記載の濃度で加え、 次いで、培養物を融合する前に３７℃で３−５日間イン４ユペートした。

次に、ヒｈＩｇＥ免疫化同系異種牌臓×末梢血液リン球培養物を、穏やかにこす りそして５ｍｌピペットの先端で出し入れすることによって２４穴プレートから 収穫した。同じプレートからの細胞を５０ｍ１円錐遠心管にプールし、そして５ 分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。次に、これらの細胞を２回洗浄し、融合培 地に再懸濁し、数えた。生存率はトリパンブルー染料排除によって測定した。

４、　融合産物の産生 ４２％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　１４５０）（アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション、メリーランド州ロックビル）７１５％ジメチルスルホ キシド（ＤＭＳＯ）（シグマ・ケミカル社、ミズリー州セントルイス、カタログ ＃Ｄ−８７７９）の溶液を、４ｇのＰＥＧを１．４ｍｌのＤＭＳＯに加え、そし て最終体積をＲＰＭＩ　１６４０　（メジアチック社、ワシントンＤ、　Ｃ，、 カタログ＃１５−０４０−ＬＶ）で９．５ｍｌに調整することによって製造した 。

数滴のＧａｙＣ（炭酸水素ナトリウム領　６６Ｍ）を加えることによってｐＨを ７．２に調整した。２．５％ＣＰＳＲ３（シグマ社、カタログ＃Ｃ−０７Ｃ−０ ７８６）−ＩＤメジアチック社、力９ｏグ＃１５−０１６−ＬＶ）／ＲＰＭ１１ ６４０　（５０１５０）溶液を融合培地用に製造した。

ｌＱｍｌのＩＤＭＥＭを５０ＸＨＴ培地補充物（シグマ社、カタログ＃Ｈ−０１ ３７）に加え、次にこれを５０×アザセリン（シグマ社、カタログ＃Ａ−１１６ ４）に加えることによって、５ＱｘＨＡＴ　（ヒポキサンチン、アザセリン、チ ミジン）培地補充物を製造した。最終ＨＡＴ培地は５０１５０　ＩＤＭＥＭ／Ｒ ＰＭｌ　１６４０からなっていた［最終培地成分：２５ｍＭの緩衝剤成分ＨＥＰ ＥＳ（メジアチック社、カタログ＃６Ｏ−００２−ＰＥ）、２ｍＭ　Ｌ−グルタ ミン（シグマ社、カタログ＃Ｇ−７５１３）　、１００ｕμ／ｍｌ　ゲンタマイ シン（シグマ社、カタログ＃Ｇ−１３９７）　、２ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム （シグマ社、カタログ＃Ｓ−８６３６）　、２ｍＭ　非必須アミノ酸（メンアテ ・ツク社、カタログ＃２５−０２５−Ｌｌ）、１０％　ＣＰＳＰ３、５Ｘ１０− ’モル２−メルカプトエタノール（シグマ社、カタログ＃Ｍ−６２５０）　、１ ３６ｕｇ／ｍｌ　ヒポキサンチン、ｌｕｇ／ｍ＋　アザセリン、３．８８ｕｇ／ ｍ＋　チミジン］。

ログ期のに６Ｈ６／Ｂ５異種骨髄腫細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション＃ＣＲＬ　１８２３）を、５分間１５００ｒｐｍで遠心分離すること によって得た。細胞をＲＰＭＩ　１６４０で１回洗浄し、次に数えるために融合 培地に再懸濁した。生存率はトリパンブルー染料排除によって測定した。

細胞カウントを調整して牌臓細胞／ＰＢＬ：に６１１６／Ｂ５の比を２：１ない し４：１にした。細胞を５０ｍ１円錐遠心管にプールし、５分間、８００ｒｐｍ で遠心分離した。この細胞懸濁液を２０ｍ１の融合培地に再懸濁し、Ｑ、５ｍｌ を取ってこの後の融合の対照（ＰＥＧないとして用いた。細胞を再び５分間、８ ００ｒｐｍで遠心分離した。培地を吸い出して細胞ペレットを得、ペレットをや さしくたたいて、細胞を再懸濁した。

５０ｍ１円錐管を回転して内容物をやさしく撹拌しながら、１分間にわたって１ ｍｌのＰＥＧ／ＤＭＳＯを細胞ペレットに加えた。円錐管はさらに２分間回転さ せた（Ｕ集が目で見えなければいけない）。１分間にわたって１ｍｌの２，５％ 培地を回転させながら加えた。１分間にわたってさらに１−ｍｌの培地を回転さ せながら加えた。次の１分間、円錐管を回転させながら、２ｍｌの培地を滴加し た。２分間にわたって、５ｍｌの培地を加えた。最後に、１２ｍ１の２．５％培 地を回転させながら滴加した。次に、細胞を５分間、８００ｒｐｍで遠心分離し た。培地をデカントし、融合産物を、平板培養１ｍｌ当たり約２．５Ｘ１０’細 胞のに６Ｈ６／Ｂ５濃度でＨＡＴ培地に再懸濁した。

融合産物を９６穴組織培養プレート（コーニング、コーニング・グラス・ワーク ス社、ニューヨーク州コーニング、カタログ１２５８６０）に１つの大当たり２ ００μｌにて接種した。対照細胞を５ｍｌのＨＡＴ培地に再懸濁し、第１融合プ レート１つ当たり２つの穴に接種した。プレー：・を５％ＣＯ２インキュベータ ー内で３７℃にてインキュベートした。４日後、各穴に１滴の新しい培地を加え た。次に、いくらかの培地を吸い取りそして１滴の新しい培地を加えることによ って、穴に規則的にほぼ５日毎に供給を行った。クローンは倒立顕微鏡観察によ って５日目に見えた。

融合に成功したものを含む穴を、位相差顕微鏡を使用して増殖が陽性の穴を調べ てスクリーニングした。：れらの増殖陽性の穴に存在するハイブリドーマを、免 疫化抗原に反応性であることをねらったＥＬＩＦＡによる抗体産生用にスクリー ニングする。

典型的なＥＬＩＦＡ法では、蒸留水であらかじめ湿らせたＢｉｏｄｙｎｅ　Ａ膜 （ピアス・ケミカル社、イリノイ州ロックフォード、カタログ＃７７０１５）を 用いて、製造業者の指示に従ってＥＬＩＦＡ装置（ピアス社、カタログ＃７７０ ００）を組み立てる。残りの水は吸引によって除く。

次に、各穴に、２．５μｇ／ｍｌの領　１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，４のヒトＩ ｇＥ（スクリップス・ラボラトリーズ、カルフォルニア州すンジエゴ、カタログ ＃１０２２４）１００μｌを加えることによって、膜を塗布した。そして過剰の 結合部位を、２００μｌのＰＢＳ−２％ＢＳＡ　（シグマ社、カタログ＃Ａ７０ ３０、使用前に滅菌濾過した）を各穴に加えることによってブロックした。この 後、約５０μｌの試験上澄み液または対照溶液を各穴に加えた。

膜に結合したヒトＩｇＧ抗体は、ＰＢＳ−０，５％ＢＳＡで１　：　１０００に 希釈した１００μｌのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（オルガノ ン・テクニカ社、ペンシルバニア州ウェストチェスター、カタログ＃５９２８９ ）を各穴に加えることによって検出した。次に、各穴を２００μｌのＰＢＳ−０ ，５％ＢＳＡで２回洗浄した。

工程１のＥＩＡのように製造した２００μｌのシグマ１０４基質（シグマ社、カ タログ＃１０４−０）を加えることによって発色させた。穴を１０分間室温でイ ンキュベートした。次に、発色をバイオチック２０００マイクロプレートリーダ ーで読む。

抗原特異的であり、そして移植後も陽性である培養物を、モノクローナル性を確 実にするために１７３の細胞／穴の比でサブクローニングした。細胞は、液体窒 素に貯蔵した２ｍｌ凍結バイアル中の増殖培地に細胞２百万−１子方個／バイア ルで凍結貯蔵することができる。

抗体産生の確認は、先の工程１に記載のＥＩＡを用いることによって行う。

抗体を精製するには、選択されたハイブリドーマをサブクローニングし、そして 標準増殖培地中の２５０−１０００ｍｌの撹拌培養器中で増やした。全ての精製 工程は４℃で行った。培養上澄み液を１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６）と混合して 約０．１Ｍの最終濃度にし、そしてプロティンＧセファロース（ファーマシア・ ファイン・ケミカル社、ニュージャジー州ビス力タウエー）のカラムに０．５− １．０ｍｌ／分で施した。加えた後、カラムを０．１Ｍリン酸カリウムで洗浄し 、０．１ＭグリシンＭＣＩ、ｐＨ２，８の４倍カラム容量で溶離した。フラクシ ョンを直接中和緩衝液に集めた。ピークのタンパク含有フラクションをプールし 、アミコンミクロ濾過器（マサチューセッツ州ベバリー）で限外濾過することに よって濃縮した。精製ＩｇＧは一２０℃の４０％グリセロール、４℃のＰＢＳに 貯蔵するか、または長期貯蔵には凍結乾燥しそして窒素下、アンプルに封入した 。

図２および３は、ヒトの抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（ＩｇＧ）の産生のた めの増殖陽性の穴のスクリーニングの結果を示す。融合産物を接種した２８８０ の穴から、約１５００　（５２％）がＨＡＴ培地における増殖を示した。これら のうち、４１がスクリーニングされ、２９（７０％）がバックグラウンド以上の ＩｇＥ結合レベルを示す（図２＝　サンプル１−２４　；図３＝　サンプル２５ −４１）。陰性の対照は、Ｂｏｅｒｎｅｒ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、　、１４７ ：８６−９５　（１９９１）によって使用された培地および上澄み液である。こ のスクリーニングの陽性の対照は、血清陽性のドナーの１人から得た血清である （ＢＷ二図１参照）。

以下の表■は、上記Ｂｏｅ　ｒｎｅ　ｒ等によって製造された融合産物および本 発明によって製造された融合産物の比較を行ったものである。

穴数／　クローン　抗原特異的　抗原 融合　融合　数　クローン数　特異性 Ｂｏｅｒｎｅｒ等”−６７８４０，５８（牌臓×牌臓） 本発明 （牌臓×牌臓）’　９６０　３７８　２７４　７２．４（牌臓ｘＰＢＬ）ｅ　９ ６０　１８４　９５　５１．６（牌臓ｘＰＢＬ）’　９６０　８６　５６　６５ ．１ａ、抗原としてのヒトのフェリチン（Ｂｏｅｒｎｅｒ等　表ＩＶ−ｐ、９１ 参照）。

ｂ、　抗原としてのヒトＩｇＥ０培地に２−メルカプトエタノールが存在する他 はＢｏｅｒｎｅｒ等と同様な融合。

Ｃ１抗原としてのヒトＩｇＥ　；　ＰＢＬドナーＪＷＨ（図１参照）。

ｄ、　抗原としてのヒトＩ　ｇＥ　；　ＰＢＬドナーＢＷ（図１参照）。

この表から、Ｂｏｅｒｎｅｒ等によって報告された同様の培養よりも、２−メル カプトエタノールが牌臓×牌臓ハイブリッドの産生の改良に著しい効果を示すこ とが分かる。機能性ハイブリッドを産生した全クローンの割合は、Ｂｏｅｒｎｅ ｒ等の場合よりも２桁以上増加した。同系異種牌臓ＸＰＢＬ融合ではまた、全ク ローンの少なくとも５０％が抗原特異的活性を示す。

曳！蛙 これまでの記載は本発明の説明のためのものであり、具体例は例を示したにすぎ ず、本発明の精神を逸脱することのない他の変更、具体例および均等のものが当 業者にとって明らかなことは無油のことである。

ＦＩＧ、　７Ａ ＦＩＧ、　ＩＢ ＥＬＩＦＡ単位 ＥＬＩＦＡ単位 国際調査報告　。Ｍ／ｌＩＣ０ｔ／Ｉ’ｌ２１、フロントページの続き （５１月吐Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／３０ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｃ１２Ｎ　１５１０２ Ｉ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）選択した抗原に対して陽性の血清を持つドナーから得て、メモリーＢ リンパ球を豊富化させたヒトリンパ球調製物；（ｉｉ）上記のドナーに対して同 種異系である第二のドナーから得られたヒトリンパ球の調製物；および （ｉｉｉ）選択した抗原； の混合物を調製し、その際、各調製物および抗原が十分な量で存在して、各調製 物のリンパ球の間に、該メモリーＢリンパ球の二次的リンパ芽球子孫が生産され ることを特徴とする混合リンパ球反応が引き起こされる条件を与え；二次的リン パ芽球子孫の少なくとも一部をヘテロハイブリッド融合相手と融合させ；そして 生じた融合細胞から選択した抗原に結合特異性を有する抗体を分泌するものを単 離する； ことからなる、選択した抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体の製造方法。
2. ２．ヒトの自己抗原に対して結合特異性を有する抗体を分泌する融合生産物を選 択する、請求項１の方法。
3. ３．融合細胞が、ヒトＩｇＡおよびヒトＩｇＥからなる群から選択されるヒト免 疫グロブリンに結合特異性を有する抗体を分泌する、請求項２の方法。
4. ４．融合細胞が、ヒトのＣＤ抗原に結合特異性を有する抗体を分泌する、請求項 ２の方法。
5. ５．融合細胞が、癌抗原に結合特異性を有する抗体を分泌する、請求項２の方法 。
6. ６．メモリーＢリンパ球が自己免疫疾患をもつドナーから得られたものであり、 そして抗原が該自己免疫疾患に関与する自己抗原であって、表ＩＩの自己抗原か らなる群から選択される、請求項２の方法。
7. ７．融合細胞が、ヒト免疫グロブリンに結合特異性を有する抗体を分泌する、請 求項６の方法。
8. ８．ヒト免疫グロブリンが、ヒトＩｇＡおよびヒトＩｇＥからなる群から選択さ れる、請求項７の方法。
9. ９．陽性血清ドナーが外来抗原に対して血清陽性である、請求項１の方法。
10. １０．外来抗原が感染因子のエピトープであり、そしてメモリーＢリンパ球が該 感染因子に暴露されたドナーから得られるものである、請求項９の方法。
11. １１．外来抗原が環境中の毒素でありそしてメモリーＢリンパ球が該環境毒素に 暴露されたドナーから得られるものである、請求項９の方法。
12. １２．第二のドナーからのリンパ球調製物が脾細胞を含む請求項１の方法。
13. １３．メモリーＢリンパ球が、ヒト免疫システムを有する非ヒト哺乳類から得ら れるものである、請求項１の方法。
14. １４．ＳＣＩＤマウスを選択した抗原で免疫し、そして該ＳＣＩＤマウスからメ モリーＢ細胞を集めることをさらに含む、請求項１３の方法。
15. １５．メモリーＢ細胞が豊富化されたヒトリンパ球調製物が、第一のドナーの血 液またはリンパ節から得られる末梢血リンパ球の調製物である、請求項１、２、 ３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の方法。
16. １６．選択した抗原に高い親和性をもつ抗体を分泌する融合細胞が得られる請求 項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の方法。
17. １７．混合リンパ球反応の条件を用いてメモリーＢリンパ球の二次的リンパ芽球 増殖を開始させ、メモリーＢリンパ球を選択した抗原に再暴露し、そして二次的 リンパ球芽球を不滅化させて、選択した抗原に高親和性を有するヒトモノクロー ナル抗体を生産するモノクローナル抗体分泌細胞ラインを生じさせる、ことより なる、選択した抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体の製造方法。
18. １８．二次的リンパ芽球の増殖を、ヒト末梢血リンパ球の調製物中で開始させる 、請求項１７の方法。