JPH07508163A - イチイ属の体細胞胚形成の誘導及びそれからのタキサン環含有アルカロイドの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生産 発明の分野 本発明は植物細胞培養及び薬理の分野に属される。具体的には、本発明はイチイ 属（Ｔａｘｕｓ）、特にタキサス・プレビフォリア（Ｔ、　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉ ａ）の植物組織培養及び−次外植片における体細胞胚形成の誘導に関する。

本発明はさらに、Ｔ、プレビフォリアの外植片から誘導された体細胞胚がタキサ ン環含有アルカロイドを産生ずるという驚くべき発見と関連する。この観察事項 に基づき、インビトロ増殖させた体細胞胚の培養物からタキソール及びタキソー ル前駆体を生産する方法を開示するものである。

ンテルペンであるタキソールは１９６４年に初めて同定され、その後、卵巣癌、 乳癌、小細胞肺癌、黒色腫及び結腸癌に対して抗癌活性を有していることが示さ れた。タキソ一ル及びタキサン（ｔａｘａｎｅ）環含有アルカロイド前駆体２つ の構造は次の通りである タキソテル タキソールは、パシフィック・ニー（ｐａｃｉｆｉｃ　ｙｅｔ）タキサス・プレ ビフォリアの樹皮及び形成層組織に主として産生される。現在の精製操作を使用 すれば、タキソール１キログラムを入手するのに約１０．０００キログラムの樹 皮を加工する必要がある。これは梼齢６０−７０年の樹木２，０００−’４，０ ００本に相当する。最近の試算では、１年当たり精製薬物約２５０キログラムの タキソールが必要とされている。これは、乾燥構成２５百万キログラム又は約７ ５０，０００本の樹木量に相当する。パシフィノク・ニーは不足していることか ら、タキソールの別の供給源が現在求められている。

既に調査されている、１つの可能性あるタキソールの供給源はインビトロ培養植 物細胞及び組織である。米国特許第５，０１９．５０４号にはＴ、プレビフォリ アの外植片からカルス細胞培養を開始させ、増殖させることが記載されている。

この操作によって調製されたカルス細胞はタキソールを産生ずることが示されて いる。

カルス、即ち未分化細胞培養物をタキソールなどの二次代謝産物を産生させる手 段として使用するには、幾つかの障害がある。通常、二次代謝産物は組織の特殊 化又は分化した組織から産生される；最も顕著には、タキソールの場合は樹皮、 又はバクカチン（ｂａｃｃａ　ｔ　ｉ　ｎ　）などの他のタキサン類（ｔａｘａ ｎｅｓ）の場合は葉。未分化培養物又はカルス培養物はタキサン類と同様に複雑 な分子を構築する必須の生合成能、又は一旦合成されたこれらの分子を隔離する のに必要とされる細胞分化度（ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎ ｔｉａｔｉｏｎ）を欠いていることが多い。殆どの二次代謝産物はカルス培養物 中に見いだされず、またカルス内に検出された場合でもその濃度は植物における よりも非常に低いのが通常である。

それにもかかわらず、カルス培養物は定着、操作の容易さ、及び迅速な発育速度 ゆえに、二次代謝産物の生産のために膨大に試験されている。上記のように低い 濃度でしか見いだされないタキソールなどの二次代謝産物を検出するために必要 な大量の組織を製造するには、迅速に発育しているカルス培養物が最も簡便なイ ンビトロ試験のための手段であることが多い。カルス培養物が迅速な発育速度を 有することから、その培養物を含有する細胞は、遺伝子組換え体の高いレベル及 び不安定な倍数性レベルを表すなど、遺伝学的に不安定であるという傾向を示す 別の欠点が顕著となる。このような遺伝的不安定性は結局、タキソール産生能が 減少している培養物を導く。この問題を回避するため、カルス培養物は遺伝子ス トックから継続的に再構築させる必要がある。

二次植物産物をインビトロにおいて大量に調製するには、分化細胞又は組織の本 来的な二次代謝産物能を有する未分化細胞培養系における迅速な発育速度とその 高いバイオマス濃度とを組み合わせるのが望ましい。研究者らは、未分化細胞培 養物（即ち、カルス又は細胞懸濁液）に類似した態様で増殖するが、代わって分 化細胞又は組織から構成される培養物から、二次代謝産物を生産する可能性を実 現した。例えば、苗条培養物（迅速に増殖する苗条の塊を含有する組織培養物） は葉又は某組織に見いだされる精油及びアルカロイドの供給源として研究されて いる［ＦＩｅｂｌｅ、　ｉｎ：　Ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ 　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃ浮Pｔｕｒｅｓ。

ニューマンら（編）、スブリンゲルーベルラーグ、ベルリン・ハイデルベルグ、 ｐｐ２８１−２８９（１９８５）］。苗条培養では、葉の精油を産生じ隔離する 特定の組織型を繁殖させ、モして苗条の形態形成に必要な迅速な発育プログラム によって遺伝子不安定性をも最小限に抑える。この態様では、組織培養物は未分 化及び分化系の両者の魅力的な特徴が組み合わされていることが示された。

タキソールは未分化の細胞培養系にて検出されているが、その調製は組織培養系 では記載されていない。１つのこのような系は胚形成組織培養である。

胚形成針葉樹組織培養物は針葉樹カルスとは生化学的、組織学的及び顕微鏡下の 外観的にも顕著に異なっている。「カルス」なる用語は細胞及び組織培養物を説 明するために使用される一般名であるが、針葉樹体細胞の胚形成の分野における 多くの研究者は胚形成針葉樹組織を説明するためにこの「カルス」なる用語を使 用することに対して異議を唱えている［例えば、Ｇｕｐｔａ及びＤｕｒｚａｎ、 　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ。

５：１４７−１５１（１９８７）　；　Ｒｏｈｒら、＾ｒａｅｒ、　Ｊ、　Ｂａ ｔ、７６：１４６０−１４６７（１９８８）　ＨＴａｕｔｏ窒浮唐轣AＣａ ｎＪ、Ｂｏｔ、　６９：１８７３−１８９９（１９９１）を参照のこと］。「カ ルス」なる用語を使用することに対して異議を唱える理由は、胚形成針葉樹組織 培養物が未分化細胞から構成されるということでな（、その組織培養物が分化細 胞（胚柄様細胞）及び、発育している種子に見いだされる初期胚に類似する構造 体から構成されるからである。従って、胚形成針葉樹組織培養物には、カルス又 はその液体対応物である細胞懸濁培養物の定義はふされしくな（、それは、組織 培養系の二次代謝産物産生のための能力を有する細胞培養系の有益な発育特性の 態様に基づき、タキソールを生産するための改善された手段を代表するものであ る。

体細胞胚形成を誘導するための操作は長い間、当業者に知られていたが［Ｔｉ５ ｓｅｒａｔら、　Ｈｏｒｔ、Ｒｅｖ、　１：１−７８（１９７９）］　、針葉樹 種にてその成功が証明されたのはつい最近になってからである［Ｈａｋｍａｎら 、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　３８：５３−５９（１９８５）］　。体細胞胚形成 の誘導に成功した最初の報告以来、ピナス（Ｐｉｎｕｓ）、ピセア（Ｐｉｃｅａ ）、アビセス（＾ｂｉｅｓ）、ラリックス（Ｌａｒｉｘ）、及び／ニードツガ（ Ｐｓｕｅｄｏｔｓｕｇａ）１３ｇ由来の１８の種［Ｔａｕｔｏｒｕｓら、　Ｃａ ｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、　６９：１８７３−１８９９（１９９１）コが体細胞胚を産生 ずる能力を有するものとして証明されている。

針葉樹から体細胞胚を調製する操作は普遍的でない。イチイ属の一員などの幾つ かの重要な変種の培養が既に成功を収めている。

Ｃ，トラ／ス／エニック植物 組換えＤＮＡ及び遺伝子テクノロアーの最近の進歩により、所望の遺伝子配列を 受容植物に導入し、それを発現させることが可能になってきた。この方法を用い て植物は操作され、正常でない又は自然では天然植物に存在しない遺伝子配列を 発現し、又は天然に存在する遺伝子の改変された発現を示すよう操作されている 。組換え手法を用いて作成される植物は、「トランスンエニノク」植物として知 られている。

トランス／エニノク植物は一般に、単一の植物細胞を形質転換し、次いで体細胞 胚形成を介してその細胞から全植物を再生することによって作成される。多くノ 興ノ植物が単一細胞から再生されるので［Ｆｒ１ｅｄｔ、　Ｗ、ら、Ｐｒｏｇ、 Ｂｏｔａｎｙ　４９：１９２−２１５（１９８７）　：　Ｂｒｕｎｏｌｄ、　Ｃ ，らｌＭｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０８：４６９−４７３（１９ ８７）　；@Ｄｕｒａｎｄ、　Ｊ、ら。

Ｐｌａｎｔ　Ｓｃ】、６２：２６３−２７２（１９８９）　：　Ａｔｔｒｅｅら 、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、６７：１７９０−１７９５（１９８X）コ、 広範な種類の植物群からトランスノエニソク植物の作成を成功させることが理論 上可能である。

植物細胞に外来遺伝子を供給し発現させるための幾つかの方法が開発されている 。このような方法として、土壌菌であるＡ、ツメファ／エンス（Ａ、　ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）由来の操作されたＴ１プラスミド：Ｃｚａｋｏ、　Ｍ、ら、　 Ｐｌａｎｔ　１ｉｏｌ、Ｂｉｏｌ、　６：１０１−１０９（１９８６）　＋　Ｆ ｅ１ｒｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　２０ｔｈ　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｆｏｒ ｅｓｔ　Ｔｒｅｅ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ@Ｃｏｎｆｅｒｅ ｎｃｅ、　６月２６−３０．１９８９．カールストン、サウス・カロライ九ｐｇ 、　３８１　；　Ｊｏｎｅｓ、　Ｊ。

ＤＧ、ら、　ＥＭＢＯＪ、　４：２４１１−２４１８（１９８５）コ、カリフラ ワー・モザイク・ウィルスなどの操作された植物ウィルス［５ｈａｈ、　Ｄ、　 Ｍ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３＋４７８−４８１（１９８６）　；　Ｓｈｅ ｗｍａｋｅｒ、　Ｃ，Ｋ、ら、　Ｖｉｒｏｌ、１４０：２８１−２８８（１９８ ５）］　、植物細胞への遺伝子配列のマイクロインノエクンヨン［Ｃｒｏｓｓｖ ａｙ、＾、ら、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２０２：１７９−１８５ （１９８６）　；　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、　１　ら、１ｉｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅ ｎｅｔ、１９９：１６９−１７７（１９８５）コ、エレクトロポレーション［Ｆ ｒｏｍｍ、　Ｍ、　Ｅ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１９ニア９ｌ−７９３（１９８６ ）　；　Ｔａｕｔｏｒｕｓら、　Ｔｈｅｏｒ、＾ｐｐP．　Ｇｅｎｅｔ。

７８：５３１−５３６（１９８９）］　、及びＤＮＡ被覆粒子の促進［Ｂｏｌｉ ｋ、　Ｍ、ら、　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ　１６２：６ｌ−６８（１９９１）］ が挙げられるが、これらに限定されない。これらの操作の幾つかは、針葉樹組織 をインヒドロにて形質転換するために使用され、成功を収めている［Ｅ］１ｉｓ ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１９９P年１ ０月６−１１日の会合、ツコラン、アリシナ］。

発明の概要 タキソール及び関連タキサン類を製造するため、針葉樹（即ち、イチイ属）の胚 形成組織培養は魅力的な発育速度及び、分化細胞に本来的な二次代謝産物の蓄積 能ををするカルス培養物のバイオマス産生能を組み合わせる。タキソールはＴ。

プレビフオリアのカルス培養物中に検出されたが［Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、米国特 許第５゜０１９．５０４号コ、その収量は報告されていない。イチイ属の胚形成 組織培養物は、通常のカルス培養物のように発育し、それと同じように操作する ことができるが、それはタキサン類を産生し隔離するための能力を有する組織を 含有しているので、タキサン類の収量が多（なるという能力を有している。

胚形成針葉樹組織は体細胞胚形成の分野においてさえもユニークな組織型であり 、植物繁殖及び二次代謝産物産生におけるこの材料の潜在能力は理解されていな い。従って、本発明はタキソール及び関連タキサン類を調製するために、イチイ 属の胚形成組織培養物のこのユニークな能力をどのようにして使用するかの説明 を提供するものである。

本発明は、イチイ属の植物から入手されるインビトロ培養した一次外植片が体細 胞胚形成を阻害する化合物を産生じ分泌するという観察事項を基礎としている。

この観察事項に基づき、本発明はイチビの培養物及び−次外植片から体細胞胚形 成を誘導する方法を提供する。より詳細には、イチビ外植片をまず培養培地中に て培養し、第２に、その外植片を培養の際に新鮮な培地へ継続的に移して初期体 細胞胚を入手することによって、イチイ属の外植片から胚形成組織を入手するこ とができる。

本発明はさらに、培養されたイチビ胚形成組織を目的とする。

本発明はまた、イチイ属由来の植物をクローンとして繁殖させる方法を提供する 。詳細には、（１）イチビ外植片を培養培地中にて培養し、（２）培養の際にそ の外植片を新鮮な培地中に継続的に移して胚形成組織を入手し、そして（３）得 られた胚形成組織を、そこに含有されている体細胞胚を植物内にて誘導できる培 地に移すこと、によって、イチイ属の植物はクローンとして繁殖させることがで きる。

本発明はさらに、イチイ属の遺伝子的に改変された植物を作成する方法を提供す る。体細胞胚形成を誘導するために本発明の方法を利用すれば、遺伝子的に改変 された単一のイチビ細胞から全植物を再生させることが可能である。この態様に よって作成される植物は、タキソール及びタキサン環含有アルカロイドを上昇レ ベルで産生できる能力又は特定の生理学的条件下で増殖できる能力に関して選択 することができる。詳細には、本発明はタキサン環含有アルカロイドを過剰産生 ずるイチビの変種植物を創製する方法に関する。これらの変種は、インビトロ繁 殖の際に現れる天然に存在する変種から選択することができ、化学的又は物理的 突然変異によって創製することができ、又は外因的に供給されたＤＮＡによる形 質転換の結果として入手することができる。

本発明はさらに、インビトロ増殖したイチビの体細胞胚がタキサン環含有アルカ ロイドを産生ずるという驚くべき観察事項を基礎としている。この結果は、タキ ソールは胚には存在しないと報告されていることから、驚くべきことである。

さらに、体細胞胚はタキソール環含有アルカロイドなどの二次代謝産物を産生ず るための必須の生化学的メカニズムを欠いていると考えられているので、体細胞 胚にてそのような二次代謝産物が産生できるであろうことは期待されていなかっ た。

胚形成組織のインビトロ培養物を利用すれば、大量のタキサン環含有アルカロイ ドを製造することができる。胚形成組織は、大量の組織を調製するためのカルス 培養に伴われる迅速な発育速度という利点を提供し、また同時に、タキサン類を 隔離する構造体（体細胞胚）の増殖を可能とする。イチビの体細胞胚形成物から タキサン環含有アルカロイド化合物を入手するには、体細胞胚を産生ずる条件下 にイチイ属由来の外植片を培養培地中にてまず培養し、第２に、得られた体細胞 胚又は培養培地からタキサン環含有アルカロイド化合物を単離すればよい。

図面の簡単な説明 第１図は、コニフエラレス（Ｃｏｎｉｆｅｒａｌｅｓ）の胚の典型的な発育の段 階を示している。

第２ａ図及び第２ｂ図は、体細胞胚（ａ）及びタキサン環含有アルカロイド（ｂ ）を調製するための連続フロー液体培養システムを示している。

第３図は、イチビの多くの変種由来の体細胞胚形成の誘導を概略的に示すもので ある。

第４図は、一連の３つのＨＰＬＣトレースを示している。トレース１はタキサス ・プレビフォリアを液体培地中にて培養することによって得られる抽出物の成分 分離を示すＨＰＬＣのトレースである。トレース２は、タキサス・ブレビフオリ ア抽出物及びタキソール標品の混合物（３：１、約２０．０００分のピークを参 照のこと）のＨＰＬＣｌ−レースである。トレース３はその抽出物及びタキソー ル標品の１−１混合物のＨＰＬＣトレースである。

発明の詳細な説明 本発明は、イチイ属、特にＴ、プレビフォリアの植物から誘導される一次外植片 及びインビトロ細胞培養物が体細胞胚形成を阻害する化合物を産生ずるという観 察事項に基づいている。この観察事項に基づき、タキサン環含有アルカロイドが 産生されていると推察することができる。従って、本発明はイチビ、特にＴ。

プレビフォリアの変種の一次外植片から体細胞胚形成を誘導する方法を提供する ものである（第３図）。

詳細には、本発明の方法は次の工程からなる　イチイ属の植物由来の外植片を、 体細胞胚形成の誘導を促進できる培地中にて培養し、その外植片を培養の際に新 鮮な培地中に移すことにより、産生されるインヒビターから培養細胞を取り出し 、培養物中にて産生される体細胞胚を単離する。

本明細書にて使用している「体細胞胚」は、接合子胚が種子内で受ける発育段階 を模擬する経路に沿って植物に成長する可能性を有している細胞又は細胞のグル ープから構成されるものである。針葉慴における体細胞胚形成細胞は、殆どの植 物におけるように２つの段階に分類することができる（第１図）。第１の段階は 、前胚形成塊（ｐｒｅ−ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｍａｓｓ）及び初期形成体細 胞胚から構成され（第１図の段階１を参照）、第２の段階は初期形成胚が胚へと さらに分化及び発育するものから構成される（段階３−６）。前胚形成塊は胚に なる可能性のある細胞のグループであるが、規定された分裂組織器官原基（ｄｅ ｆｉｎｅｄ　ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ　ｏｒｇａｎ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａ）を 欠いている。これは、培養物を２．４−Ｄ及びＢＡを含有する培地に維持する場 合にしか増殖しない胚発育の発育不全段階にある。

胚の成軌を支持する培地に胚形成組織培養物を移すと、胚の発育は種子内で見い だされるものと同様の経路に沿って進行する。この経路における段階は第１図に 示している。

潜在的な分裂組織及び原生の子葉を一端に及び他端に可能性ある基部を含有する 、充分に規定された伸長した双極構造を有する熟した子葉の胚が、胚形成の最終 段階（段階７）までに産生される。この胚内の細胞は通常、種子貯蔵タンノ々り 質、脂質を含有するものとして特徴付けられ、また細胞質が稠密である。

胚形成針葉樹組織はカルス細胞培養物と有意に異なっており、多（の者はそれを カルス培養と呼ぶことはできないと主張している。カルス培養は接着していない か又は緩やかにしか接着していない未分化細胞の非有機的な発育であると考えら れ、一般には種々の外植片を培養することによって調製することができる。胚形 成培養物に見いだされる細胞とは異なり、カルス細胞は丸（、等直径であり、非 稠密原形質によって高度に液胞化する傾向がある。カルス細胞は分化した植物外 植片の迅速な細胞分裂から誘導されるので、脱分化した又は未分化の植物細胞で あると考えられる。

他方、胚形成組織は（１）極めて初期の段階の胚、（２）初期段階の胚の産生過 程における細胞（即ち、前胚形成塊）、又は（３）初期段階胚が抜は落ちた胚子 型の細胞、の塊から構成される。従って、この培養物はカルス培養物への組織化 という局面を有し、また低倍率顕微鏡の検査に基づき顕著に異なっている細胞及 び組織型から構成される。

物理的外観に加え、カルス細胞及び胚形成細胞はエチレン放出速度、グルタチオ ンの濃度、第二鉄イオンの還元能、タンパク質合成速度及びブラスチド（色素体 ）構造などの多くの生化学的マーカーの相違によって示されるように、生化学的 及び組織学的レベルで異なっている［Ｗａｎｎら、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ ｅｐｏｒｔｓ　６：３９−４２（１９８７）　；　Ｗａｎｎら、　Ｔｒｅｅｓ　 ３：１７３−１７８（１９８９）］。

本明細書にて使用している「−次外植片」は、植物から入手されるあらゆる組織 又は細胞である。これには接合子肝組織、根又は苗条の分裂組織、及び形成層組 織が包含されるが、これらに限定されない。最も好ましい組織は未成熟の種衣か ら入手され、接合子胚ならびに子葉及び！シボ子葉（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｅｄｏ ｎｏｕｓ）細胞から構成される。

外植片の供給源としてはあらゆるイチビ変種を使用することができる。これには 、Ｔ　ブレヒフオリア、Ｔ、バカタ（Ｔ、　ｂａｃｃａｔａ）、Ｔ、キメディア （Ｔ、ｘ　ｍｅｄｉａ）、及びＴ　カスピダタ（Ｔ、　ｃｕｓｐｉｄａｔａ）が 包含されるが、これらに限定されない。

外植片は培養する前に、表面滅菌して、外植片表面に存在しているかもしれない 細菌又は真菌などの可能性ある夾雑体を殺す。最も普通に使用される方法は、漂 白剤及びＴｗｅｅｎ　２０　”などの水和剤の溶液中に外植片を浸漬させること を包含する。このような浸漬により、下部細胞には影響を与えずに外植片の表面 が滅菌される。表面浸透の滅菌を補助するため、浸漬の際に減圧を使用すること ができる。外植片が得られ、処理したなら、それを液体培養培地中に入れ、又は 固体培養培地上に置く。

一般に、イチビの変種から体細胞胚を創製するには、他の針葉樹にて体細胞胚形 成を誘導するのに有効であることが示されている殆どの植物発育培地を利用でき る。これには、ＢＬＧ　［Ｗａｎｎら、　Ｔｒｅｅｓ　３：１７３−１７８（１ ９８９）、これを引用によって本明細書に包含させる］　、ＭＳ　［Ｇｕｐｔａ ら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：１４１（１９８７）、　これを引用 によって本明細書に包含させる］　、ＢＭ　Ｉ　［Ｋｒｏｇｓｔｒｕｐ、　Ｃａ ｎＪ、Ｆｏｒ、Ｒｅｓ。

１６：６６４−６６８（１９８６）　これを引用によって本明細書に包含させる ］、及びＤＣＲ［Ｇｕｐｔａら、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．Ｒｅｐ、　４：１７ ７（１９８５）、これを引用によって本明細書に包含させる］が例示されるが、 これらに限定されない。最も好ましい培地は、植物ホルモン、２．４−７クロロ フエノキノ酢酸（２，４−Ｄ）及びベンジルアデニン（ＢＡ、）ならびにカセイ ン加水分解物を含有するものである。当業者ならば、特別の実験操作無くして本 発明に使用できるこのような培地を容易に改作できるであろう。以下の実施例で は、ＢＬＧ培地を使用している。

−次外植片を培養するには種々のの条件を使用できる。温度及び光り照射などの 条件は、植物変種ごとに、及び組織供給源によって若干変動する。Ｔ　ブレビフ ォリアは、約２０−２５℃の温度、暗所で培養を行うのが最も好ましい。当業者 ならば、細胞増殖と胚産生の両者が最適となるための培養条件を容易に変動させ ることができる。

体細胞胚形成を誘導する前に外植片を培養するに必要な時間は外植片の供給源、 培養条件及び移動の回数によって変動する。ＢＬＧ−カゼイン培地中、２２℃、 光りの無い状態で培養し、およそ２−４週ごとに移動させるＴ、プレビフォリア の未成熟な胚外植片では、胚形成組織はおよそ６週間で誘導される。

本明細書にて使用している「該外植片を移す（移動）」とは、新鮮な培地を外植 片に供給する工程を意味する。移動により、イチビの変種から分泌される胚形成 のインヒビターからその外植片が有効に取り出される。体細胞胚形成を誘導し維 持するため、移動が必要であるのは、針葉樹の間ではユニークである。

培養組織を移動させる操作は使用する培地の型に応じて変動する。外植片を固体 培地上にて維持させる場合、移動は、古い培地から新しい培地へと外植片を取り 出すことを意味する。イチビの培養物を増殖させることによって産生される胚形 成のインヒビターは固体培地を通って迅速に拡散することはない。従って、培養 平板の新鮮な表面に培養外植片を単に置くだけで、分泌されたインヒビターから 外植片を取り出すことができる。

体細胞胚形成はイチビの液体培養においても誘導することができる。胚形成組織 は、新鮮な培地が供給できるよう、濾過又は沈降分離によって液体培地から取り 出すことができる。あるいは、連続フローンステムを使用し、培養組織に新鮮な 培地を供給することができる。このシステムでは、培地が流動できる環境に組織 を維持しつつ、培養細胞の流動を制限する（第２ａ図）。

移動間の時間の長さは外植片の供給源、培養条件、培地、及び培養物内の細胞密 度によって変動する。一般には、固体培地を使用すれば、約２−３週ごとにこの ような移動を行う。当業者ならば、体細胞胚の産生速度を視覚的に観察すること により、移動間の時間を容易に決定できるであろう。

体細胞胚を産生ずる培養物を入手したなら、胚を成熟化し、単離し、発芽させて 、実生を形成させる。胚の成熟化のための当業者に知られているあらゆる操作を 使用できる。典型的には、これらの操作には、浸透性が増大しかつアブシジン酸 （ＡＢＡ）を含有する培地に胚形成組織を移すことが包含される［Ｂｅｃｗａｒ ら。

Ｔａｐｐｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ　７０（４）：１５５−１６０（１９８７）を参照 ］。

本発明はさらに、培養されたイチビ胚形成組織を提供する。このような組織は上 記の方法を使用することによって入手される。あらゆるイチビ変種を利用できる 。これには、Ｔ、プレビフォリア、Ｔ、バカタ（Ｔ、　ｂａｃｃａｔａ）、Ｔ、 キメディア（Ｔｘ　ｍｅｄｉａ）、及びＴ、カスピダタ（Ｔ、　ｃｕｓｐｉｄａ ｔａ）が包含されるが、これらに限定されない。

上記の手法を利用することにより、イチイ属由来の植物は体細胞胚からクローン として増殖させることができる。

クローンの子孫が望まれている植物を一次外植片として使用することができる。

継続的な培養物移動により、−次外植片の体細胞胚形成を上記のようにして誘導 することができる。このようにして産生された胚は全植物に容易に再生すること ができ、従ってその外植片からクローンとして誘導される植物が創製される［Ｂ ｅｃｗａｒら１丁ａｐｐｉ　Ｊｏｕｒｎａｌ　７０（４）：１５５−］６０（１ ９８７）　ＨＤｕｒｚａｎら、Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　T２：２２ ９−２３５（１９８７）　；　Ｋｒｏｇｓｔｒｕｐら、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ 　Ｒｅｐｏｒｔｓ　７：５９４−５９７（１９１１ｉ８）、■黷■■p によって本明細書に包含させる］。

さらに、上記の方法は外植片供給源の変種である植物を繁殖させるために使用す ることもてきる。

本明細書における「変種」とは、外植片を誘導する植物内には存在しない遺伝子 改変を含有する植物又は組織として定義される。これには、倍数レベルの変化、 特定のＤＮＡセグメントの配列の変化、又は外因的に供給されたＤＮＡ配列の導 入などを挙げることができる。変種は組織培養の過程にて自然に生じる場合があ り、又は生化学的、物理学的、又は分子操作によって創製することができる。

植物培養物は遺伝子的に不安定であるので、天然に存在する変種は長期培養の際 に産生される場合がある。このような変種は生理学的特性の変化、例えば促進さ れた発育、植物代謝産物又はアルカロイドの産生レベル、又は倍数レベルの変化 に関して検定することができる。好ましくは、このような変種はタキソール又は タキソール前駆体の産生が増大しているものである。同定されたなら、変種細胞 又は細り色群を単離し、それを使用して、タキソール又はタキソール前駆体の量 が増大している植物を上述のようにしてクローンとして繁殖させればよい。

天然に存在する変種に加え、当業者に既知の種々の方法によって変種を創製する ことができる。これには、物理的又は化学的突然変異誘発、プロトプラスト融合 、又は外因性ＤＮＡの直接的移入が挙げられるが、これらに限定されない。この ような方法を使用すれば、上述の方法によって創製した体細胞胚又は体細胞胚形 成が開始する前に一次外植片の変種を誘導することができる。

物理的及び化学的突然変異誘発では、ＤＮＡ障害を誘発し又は減数分裂もしくは 有糸分裂の際の染色体分離を阻害できる因子（ａｇｅｎｔＳ）に培養細胞又は− 次外植片を暴露させる。このような因子にはＵＶ光、エチルメチルスルホネート 、亜酸化窒素、アクリンンオレンシ、コルヒチン、及びニトロソグアニジンなど が包含される。このような物質は変種を創製するうえで、生物のＤＮＡ内に無作 為な変化を導入する種々ノ系に使用されている［Ｃｈａｌｅｆｆ、Ｒ，Ｓ、、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２１９：６７６−６ｇ２（１９８３）］。

突然変異誘発の部位及び産生される変種は予め決められないが、当業者ならば、 既知の突然変異誘発及び選択操作を本発明の外植片及び胚形成培養向けに容易に 改作することができる。

得られた突然変異細胞は、本発明のタキサン環含有アルカロイドなどの二次代謝 産物の産生における変化についてスクリーニングすればよい。このような突然変 異体はタキサン環含有アルカロイドを過剰産生ずるものが好ましい。タキサン環 含有化合物のレベルを検出する方法にはＨＰＬＣ（実施例を参照のこと）があり 、またこのようなタキサン環含有アルカロイドに特異的な抗体と培養培地の試料 とを免疫学的に反応させることに基づくものがある。５ｔｅｐｈｅｎ　Ｍ、Ｅｄ ｉｎｇｔｏｎ、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：９３３−９３８（１９９ １）を参照のこと。

プロトプラスト融合は、倍数レベルが増大した変種を創製し、また他の変種由来 の染色体を含有する植物を作成するために利用することができる。例えば、タキ ソール又はタキソール前駆体を産生ずるイチビの変種を非産生性の変種と融合さ せることにより、両変種の特性を備えた変種を創製することができる。

外因的に供給されるＤ　Ｎ　Ａを導入することによっても、変種を作成すること ができる［Ｅｌｌｉｓら、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏ ｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１X９１ 年１０月６−１１日の会合、ツクラン、アリゾナコ。先に説明したように、ＤＮ Ａを植物細胞に導入するための多くの手法が開発されている。これには、土壌菌 であるＡ、ツメファシェンス（＾ｔｕｍｅｆａｃｉｃｎｓ）由来の操作されたＴ ｉプラスミド［Ｃｚａｋｏ。

に　ら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、６：１０１−１０９（１９８６）　； 　Ｊｏｎｅｓ、Ｊ、Ｄ、Ｇ、ら、ＥＩＩＢＯＪ、４：２４１P−２４ １８（１９８５）　：　Ｆｅ１ｒｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　２０ｔｈ　 ５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｔｒｅｅ　Ｉｍｐｒｏｖ■高■獅煤@Ｃ。

ｎｆｅｒｅｎｃｅ、　６月２６−３０．１９８９．　カールストン、サウス・力 ロライ九ｐｇ、３８１］　、カリフラワー・モザイク・ウィルスなどの操作され た植物ウィルス［５ｈａｈ、　Ｄ、　Ｍ、ら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：４７８−４８１（１９８６）：　Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ 、Ｃ，に、ら、Ｖｉｒｏｌ、１４０：２８１−２８８（１９W５）コ　、 植物細胞への遺伝子配列のマイクロインジェクション［Ｃｒｏｓｓｗａｙ、　Ａ 、ら、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、２０２：１７９−１８５（１９ ８６）　：　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、　Ｉ　ら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 １９X：１６９−１７７ （１９８５）］　、エレクトロポレーノヨン［Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、　Ｅ　ら、　 Ｎａｔｕｒｅ　３１９ニア９ｌ−７９３（１９８６）；　Ｔａｕｔｏｒｕｓ、　 Ｔ、　Ｅ　ら、Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、７８：５３１−５３６（１ ９８９）、　ＴａｕｔｏｒｕｓらAＴｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｃｎｅｔ、　７８：５３１−５３６（１９８９）コ、及びＤＮＡ 被覆粒子の促進（ＤＮＡ　ｃｏａｔｅｄ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｃｃｅｌｅｒａ ｔｉｏｎ）　［Ｂｏｌｉｋ、Ｍら、　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ　１６２：６ｌ− ６８（１９９１）］があるが、これらに限定されない。

当業者ならば、これらの操作の１つを利用し、外因的に供給される遺伝子構築物 を含有する変種を容易に創製することができるであろう。このような態様によっ て、抗生物質に対する耐性など、予め決められた特性を含有する変種を作成する ことができる。このような特性についてのスクリーニングは、当業者によって特 別の実験を要することなくルーチン的に実施することができる。

ＩＩ　肝組織におけるタキサン環含有アルカロイドの調製本発明のさらなる態様 は、インビトロ増殖させたイチビの体細胞胚がタキサン環含有アルカロイドを産 生ずるという観察事項に基づ匂このことは、タキソールは液胞内に隔離されるの が正常であり、体細胞胚は高度には液胞化していないので、驚ベベき観察事項で ある。さらには、タキサン環含有アルカロイドなどの二次代謝産物がこのような 生化学的に未成熟な細胞から得られるとは予期されていなかったであろう。この ようなインビトロ培養物を利用することにより、大量のタキサン環含有アルカロ イドを調製することができる。さらにまた、イチビの実生を大規模に調製し、ま たそれからタキサン環含有アルカロイドを単離することができる。これは、実生 がタキソール及びその前駆体の供給源として樹皮にしか劣っていないことから、 意義ある事項である［Ｖｉｄｅｎｓｅｋ、　Ｎ、ら、　Ｊ、Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐ ｒ。

ｄ、５３：１６０９−１６］０（１９９０）コ　。

具体的には、タキサン環含有アルカロイドはイチイ属、特にＴ、プレビフオリア 、Ｔ　バカタ（Ｔ、　ｂａｃｃａｔａ）、Ｔ、キメディア（Ｔ、Ｘ　ｍｅｄｉａ ）及びＴ８　カスピダタ（Ｔ。

ｃｕｓｐｊｄａｔａ）の外植片由来の体細胞胚の培養物から入手することができ る。

詳細には、所望のタキサン環含有アルカロイドを産生ずるイチビの変種から外植 片を入手する。この外植片を使用し、上述の操作により体細胞胚を含有する培養 物を調製する。次いで、カラムクロマトグラフィーなどの当業者に周知の手法に よって、培養培地又は組織のいずれかから、タキサン環含有アルカロイドを単離 することができる［萱ａｎｉら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　９３ ：２３２５（１９７１）　；　Ｍ、Ｂｏｙｄ、　Ｐｅｒｓ盾獅■ ｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　（１９９１年８月）　：　（Ｗｉｔｈｅｒｕ ｐ、　Ｋ、　Ｍ　ら、１Ｌｉｑ、ｃｈｒｏｍａｔｇｒ、１２F２１１７− ２１３２（１９８９））］。このような系の１つを第２ｂ図に示す。

好ましくは、オートクレーブ処理した真菌細胞又はエキスを培養培地に添加し、 タキサン環含有アルカロイドの産生を刺激する。このような真菌細胞エキスを培 地に加えると、胚形成組織はタキサン化合物を産生ずることによって、考えられ る感染を防ぐよう機能する。

タキサン環含有アルカロイドを単離するために最も好ましい胚は段階７の胚及び 発芽している胚である（第１図）。段階１及び２の胚はタキサン環含有アルカロ イドを含んでいることがあるが、非胚形成組織から分離し単離するのが困難であ る。段階７の胚は非胚形成組織から容易に分離され、従って好ましい。タキサン 環含有アルカロイドの製造に使用する個々の段階の胚を入手するため、当業者な らば、胚を単離する既知の操作を容易に改変できるであろう。

あるいは、タキサン環含有アルカロイドの供給源としては、胚形成組織から産生 される完全に発育した実生が使用できる。

タキサン環含有アルカロイドはバッチ毎に、又は連続して交換される培地から単 離することができる。胚形成培養物は自由に懸濁して発育させることができ、あ るいはホローファイバ（中空繊維）などの担体内に固定化させることもたぶん可 能である。このような担体はＤｕｒｚａｎら、　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　 ５２：２２９−２３５（１９８７）に例示されている。

ここまで本発明を一般的に説明してきたが、以下に記載する実施例を参照すれば 本発明はさらに容易に理解されるであろう。しかし、これらの実施例は単なる例 示であり、特に明記しないかぎり、本発明の限定を意図するものでない。本明細 書にて引用しているすべての特許及び出版物は本明細書での引用によってそのす べてが包含される。

イチイ種の未成熟な種衣を夏期（最適な時期は７月）に採取し、それを家庭用の 漂白剤（１１％次亜塩素酸ナトリウム）と共に３０分間撹拌し、同時に水和剤と してＴｗｅｅｎ　２　ＯＴＭ数滴（１００ｍＬ殺菌剤当たり）を利用しつつ、種 衣を滅菌した。滅菌水て３回洗浄した後、得られた種衣から未成熟な胚を無菌的 に摘出し、それを以下のりに示す培地上に水平に置いた。培養物を２２℃、暗所 にて４週間インキュベートした。その終了時点に、培養物を元のベトリ皿上の新 たな位置に単に移動させるだけて、その外植片を新鮮な培地に移した。さらに２ 週間後（総時間＝６週）、その培養物を胚形成組織の開始に関してスコアー化し た。

胚形成組織は半透明から白色の粘液質の表現型特性を有する胚形成針葉樹組織を 示した。

最も頻繁には、胚形成は未成熱狂外植片の子葉又は胚軸にて始まった。鉗子を用 いて元の外植片から胚形成組織を切り裂くと、それは、開始について説明した同 じ条件下、同じ培地上に純粋な胚形成組織として維持させることができた。胚形 成組織は３週毎に新鮮な培地に移すことで連続して維持させた。

未成熟なタキサス・プレビフォリア種子の１つの具体的なコレクション（Ｃｏｒ ｖａｌｉｓ、　ＯＲ）について、未成熟イチイ胚からの胚形成組織の開始の頻度 を例示する（以下の第２表を参照）。まさに子葉形成の段階にある胚は、子葉段 階にまで未だ発達していない若い胚よりも高い頻度で胚形成カルスを生じさせた （！上客を参照）。培地中にカゼイン加水分解物（５０（ｂｌ／Ｌ）を含ませる と、子葉段階の胚からの開始頻度が高まるだけでなく、より若い胚からの胚形成 組織の開始も可能となった。

Ｔ　ブレヒフォリア以外の培養物からの胚形成組織の開始頻度を第３図に示す。

これには、Ｔ　バカタ（Ｔ、　ｂａｃｃａｔａ）、Ｔ　キメディア（７，Ｘ　ｌ ｌ１ｅｄｉａ）及びＴ　カスピダタ（Ｔ、　ｃｕｓｐｊｄａｔａ）が包含される 。

胚形成組織からのタキサン環含有アルカロイドの抽出及び測定文献記載の手法［ ｆｉｔｈｅｒｕｐ、　Ｋ、　Ｍら、　Ｊ、Ｌｉｑ、Ｃｈｒｏｍｏｔｇｒ、　１２ ＋２１１７−２１３２（１９８９）］の改変法［Ｍ、Ｂｏｙｄ、　Ｐｅｒｓｏｎ ａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　（１９９１年８月）コによって、胚形成組 織内のタキソールを分析した。平炉に説明すると、テン・プレオック（Ｔｅｎ　 Ｂｒｅｏｃｋ）組織ブレンダーによって胚形成イチビ組織をヘキサン中にてホモ ジナイズした。

ヘキサンを廃棄し、残りの植物組織を塩化メチレン　メタノール中１によって室 温にて一晩、抽出した。翌日、その混合物を濾過し、窒素気流下に蒸発乾固した 。得られた残留物を最少量のメタノールに溶解し、塩化メチレン・水１：１に分 配した。水相を廃棄し、有機相を蒸発乾固した。その残留物をメタノール中にと り、ＨＰＬＣ分析にかけた。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析は次の条件によって行った。　酢酸によりｐＨ４，４に調節し たメタノール　アセトニトリル：５０ｍＭ硫安の水性緩衝液からなる移動相を使 用し、イソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）な条件下に操作するフェニル結合 シリカゲルカラムを用いる。流速はｌ＋ａＬ／ｍｌであり、得られる溶出液は２ ２８ｎａｉにてモニターした。

前胚形成塊（ｐｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｍａｓｓｅｓ）及び段階１の体細 胞胚を含有する胚形成組織では、タキソールの産生は観察されなかった。しかし 、タキソール以外のタキサン環含有アルカロイドであることを示す移動をもった 幾つかのピークが観察された。

これらの結果は、ポリクローナル抗体を基礎とする間接競合阻害酵素免疫検定（ ＣＩ　Ｅ　Ｉ　Ａ　；　Ｈａｗａｉｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｇｒｏｕ ｐ、　Ｉｎｃ、　）を用いて確認された。

第１表 ＫＮ○３１００ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０３２０ ＫＨ２ＰＯ４１７０ ＣａＣＩ　２　・２　Ｈ２Ｏ４４０ Ｈ３ＢＯ３６，２ Ｍｎ５Ｏ１・Ｈ２Ｏ１６，９ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０８，６ ＮａｚＭｏＯ４・２　Ｈ２Ｏ領２５ ＣｕＳＯ，ｊ　５Ｈ２００，Ｏ２５ ＣｏＣＩ２・６ＨｔＯＯ，０２５ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２７，８ Ｎａ２ＥＤＴＡ　３７．３ イノシトール　１００ ニコチン酸　領５ ピリドキシン　０１ チアミン・ＨＣＩ　０．　１ ／ヨ糖　２０．　０００ グルタミン　１．　４５０ アスパラギン　１００ バクト寒天　ｓ、　ｏｏ。

ｐＨ＝５．　８ ＢＬＧ２／１培地；上記の処方 ＢＬＣＧ２／１培地＝上記の処方＋５００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物第２表 タキサス・プレビフォリアにおける未成熱狂の発育段階の関数としての体細胞胚 形成の開始頻度（６週） ＢＬＣＧ２／１１−２　６　、　０ 液体培地中におけるイチイの胚形成組織培養からのタキソールの調製上記の寒天 固化ＢＬＧ−カゼイン培地に維持させたイチイ種の胚形成培養物中には、タキソ ールは検出されなかった。しかし、胚形成組織を振盪（１１０ｒｐｍ）フラスコ 内の同じ組成を有する液体培地中で増殖させた場合、そのスペント培地（ｓｐｅ ｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ）中にタキソールが検出された。寒天固化培地上で増殖させ た胚形成組織の塊を少量の液体ＢＬＧ−カゼイン維持培地中に分散させることに より、胚形成イチイ組織の液体培養物を：Ａ製した。２２℃、１１０ｒｐｍ及び ほの暗い（８０フィート−カンデル）蛍光の８時間光周期において１−２力月の 後、均一なサイズの小さな組織の塊（マス）が得られた。均一なサイズの組織塊 の培養物が得られるまで、スペント培地を廃棄して同量の新鮮な培地を加えるこ とで、その液体培地を１０−２１日毎に置き換えた。

充分に分散させた液体培地が入手されたなら、タキソールを次の操作により調製 した。培養物の既知量を新鮮な培地にピペッティングして培養物を新鮮培地に接 種し、母培養物１部に対して新鮮培養物１０部の接種密度とした。培養物を上記 の条件下に振盪しながらインキュベートし、２１日後にスペント培地を採取した 。スペ〉ト培地を減圧下に乾固するまで濃縮し、タキソールを抽出し、ＨＰＬＣ で検出した（第４図を参照）。

第４図のトレース１に示されるように、イチイ抽出物は、タキソール標品とほぼ 同じ位置で溶出される多くのピークを含有していた。トレース２はイチイ抽出物 及びタキソール標品の３：１混合物の分離を示すＨＰ　Ｌ　Ｃである。ちょうど ２０．００分前に溶出される肩はサイズが増大していることが理解できる。イチ イ抽出物及びタキソール標品の１：１混合物を分離する場合、この肩はさらに増 大するが、このことはタキソールの存在を確実にしている。セファロマニン（ｃ ｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅ）などの他のタキサン環含有化合物も明らかである 。

上述のように本発明を充分に説明してきたが、本発明の範囲又はその態様に影響 しない等価な実施管種及び他のパラメーターの広い範囲内で本発明が実施可能で あることは当業者であれば理解されるであろう。

ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　２Ｂ ＦＩＧ、　３ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ、　ＦＩ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ， ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．イチイ属由来の外植片から体細胞胚を含有する胚形成組織を調製する方法で あって、 イチイ外植片を培養培地中にて培養し、そして培養の際にその外植片を新鮮な培 地に継続的に移し、初期の体細胞胚を入手すること、を特徴とする方法。
2. ２．イチイ属由来の植物をクローンとして繁殖させる方法であって、イチイ外植 片を培養培地中にて培養し、培養の際にその外植片を新鮮な培地に継続的に移し 、初期胚を入手し、そして苗木形成を誘導できる培地にその初期胚を移すこと、 を特徴とする方法。
3. ３．イチイの胚形成組織培養物からタキサン環含有アルカロイド化合物を調製す る方法であって、 体細胞胚又は体細胞実生を産生する条件下に培養培地中にてイチイ属由来の外植 片を培養し、そして 得られた胚又は培地から該タキサン環含有アルカロイド化合物を単離すること、 を特徴とする方法。
4. ４．遺伝子的に改変されたイチイ属の植物を調製する方法であって、体細胞胚を 産生する条件下に培養培地中にてイチイ属由来の外植片を培養し、遺伝子的に改 変された胚を産生するためのＤＮＡを該胚に導入し、そして得られた改変胚から 植物を再生すること、を特徴とする方法。
5. ５．遺伝子的に改変されたイチイ属の植物を調製する方法であって、イチイ属か ら外植片を入手し、 得られた外植片にＤＮＡを導入し、 体細胞胚を産生する条件下に培養培地中にて該ＤＮＡを含有する該外植片を培養 し、そして 得られた体細胞胚から植物を再生すること、を特徴とする方法。
6. ６．該外植片が未成熟の種衣由来のものである、請求項１−５のいずれかに記載 の方法。
7. ７．該培養を暗所で行い、該移動をおよそ２−３週ごとに行う、請求項１−５の いずれかに記載の方法。
8. ８．該ＤＮＡをマイクロインジェクションによって該胚に導入する、請求項４又 は５に記載の方法。
9. ９．該ＤＮＡをＴｉプラスミド又はその改変法によって該胚に導入する、請求項 ４又は５に記載の方法。
10. １０．該ＤＮＡをエレクトロポレーションによって該胚に導入する、請求項４又 は５に記載の方法。
11. １１．該ＤＮＡを粒子促進によって該胚に導入する、請求項４又は５に記載の方 法。
12. １２．培養されたイチイ胚形成組織。
13. １３．Ｔ．ブレビフォリア、Ｔ．バカタ、Ｔ．キメディア及びＴ．カスピダタか らなる群の中から選択される植物由来である、請求項１２に記載の培養されたイ チイ胚形成組織。
14. １４．タキサン環含有アルカロイドを高いレベルで産生するイチイ属由来の植物 の変種を調製する方法であって、 体細胞胚を産生する条件下に培養培地にてイチイ属由来の外植片を培養し、突然 変異誘発の能力を有する因子によって該外植片に突然変異を誘発させ、タキサン 環含有アルカロイドを高いレベルで産生する胚を選択し、そして選択した胚から 植物を再生すること、を特徴とする方法。