JPH07508165A - 乳酸ｌｄｈ遺伝子を発現する酵母菌株，及びその菌株を得るために使用可能なベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳酸ＬＤＨ遺伝子を発現する酵母菌株、及びその菌株を得るために使用可能なベ クターこの発明は、アルコール／乳酸混合発酵を発現する酵母の構築に関するも のである。

砂糖の発酵におけるこれらの両方の主なタイプが、伝統的に農業食品産業に使用 されている。すなわち、サツカロミセス属の酵母によって行われるアルコール発 酵により、エタノールと二酸化炭素か主に形成され、乳酸発酵（乳酸菌による） により、乳酸か形成される。

アルコール発酵と乳酸発酵は、ピルビン酸まではほとんど一致する代謝経路を持 っている。この段階で、この中間体は、二つの最終電子受容体システムにより異 なって処理される。アルコール発酵においては、ピルビン酸はアセトアルデヒド に脱カルボキシル化され、アセトアルデヒドはアルコール脱水素酵素によってエ タノールに還元される。乳酸発酵においては、ピルビン酸は乳酸脱水素酵素（Ｌ ＤＨ）によって直接乳酸に還元される。

農業食品に利用されている微生物は、これら２つの代謝経路の一方を持っており 、これらの２つの発酵の一方をもっばら利用している。

発明者らは、アルコール発酵と乳酸発酵の両方の発酵を行なうことができる酵母 菌株を構築することに着手し、これらの２つのタイプを仲介する結果となる発酵 を得た。

発明者らの行った構築の原理は、ＧＲＡＳ乳酸菌〔カセイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）　）の乳酸脱水素酵素遺伝子をクローニングし、カー ボンフラックスの終わりで野生型システムと競合する電子受容体系を確立するよ うに、サツカロミセス属中でこの遺伝子を発現させることからなる。

そのような構築は、従来技術においては提案されたことがなかった。その理由は 、それらを機能化する方法において、３つの主要な障害、すなわち、 一サツカロミセス属中でのバクテリア遺伝子の無又は不充分な発現。

一導入された受容体系における非競合的な機能化；−その系の機能化と、例えば 乳酸の膜輸送の問題から生しるサツカロミセス属の生存性や発酵活性との間の不 適合性。

か存在するということか一般に知られていたからである。

驚くへきことに、発明者らは、乳酸へのカーボンフラックスの大部分の転換を行 なう生育可能でかつ機能的な系を得ることに成功した。

この発明の主題は、酵母中て乳酸菌ＬＤＨをコードする遺伝子の発現を調節する 配列の制御下で、その遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む酵母菌株である。

“遺伝子の発現を調節する配列”とは、酵母中で活性を示すプロモーター及びタ ーミネータ−タイプの配列を意味するものと理解すべきである。異なる遺伝子の プロモーターやターミネータ−か、異なる組み合わせで用いられてもよい。アル コール脱水素酵素１　（ＡＤＨＩ）　、ホスホグリセラードキナーゼ（ＰＧＫ） 及びグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のそれ自 体公知のプロモーターやターミネータ−か、その例として挙げられるが、これら に限定されるものではない。

また、この発明は、前記調節配列とＬＤＨ遺伝子とを組み合わせることによって 得られる発現カセットからなる。このカセットは、プラスミドによって保存され てもよく、又は宿主酵母の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。

この発明の好ま、しい具体例によれば、前記酵母はサツカロミセス属に属する。

この発明の別の好ましい具体例によれば、発現される遺伝子は、カセイ菌（Ｌａ ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）　ＬＤＨの遺伝子である。

酵母中で発現される組込み遺伝子のために、ＧＴＧ開始コドンは、予めＡＴＧに 修飾される。

この発明は、上記で定義された発現カセットからなる発現ベクターも包含してい る。この発現ベクターは、この発明による形質転換酵母菌株を得るために用いる ことができる。

これらのベクターは、発現力セントを構成する調節要素の性質及び強度に基づい て選択される。上記のように定義されたプロモーターやターミネータ−１あるい は酵母中て遺伝子の発現を制御することかできる他のいずれかの配列を選択する ことかできる。

ベクターを選択する別の基準は、複製起点の選択によって条件付けられるベクタ ーのコピー数にある。

制限配列を備えたＬＤＨ遺伝子を酵母のゲノム内に組込むことを選択することが できる。この場合には、例えば、酵母中における複製起点を持たない組込みベク ター（Ｙ　Ｉ　ｐ）を選択することができる。また、他の技術、例えば共形質転 換を用いてこの遺伝子を組込むことも可能である。

Ｌ’ＤＨ遺伝子は、プラスミドによって保有されるのが好ましいか、以下のベク ターの中から選択することが可能である。

・酵母中における複製起点として内因性２μプラスミドの一部分を持つ高コピー 数の複製ベクター（ＹＥｐ）：・復製起点として染色体ＡＲＳ配列を持つ高コピ ー数の複製ベクター（ＹＲｐ）； ・複製起点として末端小粒（テロメア）配列を持つ線状の高コピー数の複製ベク ター（ＹＬｐ）； ・染色体ＡＲＳ配列及び動原体配列を持つ低コピー数の複製ベクター（ＹＣｐ） 。

また、この発明によるベクターは、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＴＲＰ　ｌ ５ＡＤＥ等の栄養要求性突然変異体（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）用のマーカー、及 び／又は抗生物質（０４１８、ハイグロマイシンＢ１クロラムフェニコール、フ レオマイシン）、殺草剤〔スルホメチュロンメチル（ｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ ｍｅｔｈｙｌ）　）　、銅等に耐性用のマーカーのような、酵母において選択可 能なマーカーを含むのが好ましい。

また、この発明によるベクターとしては、細菌の複製起点と細菌において選択可 能なマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）とを持つシャトルベクターが有利で ある。

乳酸菌のＬＤＨをコードする遺伝子を保育するこの発明によるプラスミドは、異 なる形質転換技術によって、あらゆる酵母菌株に導入することができる。

最も一般的な形質転換技術としては、プロトプラス法、細胞にリチウム塩透過性 を与える技術及びエレクトロポレーションを挙げることができる。

ＬＤＨをコードする遺伝子の発現レベルは、調節可能である。

その結果、特に酵母に導入されたＬＤＨ遺伝子のコピー数及び／又はそれに結合 した調節要素の強度を変化させることによって、エタノールと乳酸との割合を調 節することができる。

様々な程度でＬＤＨを発現するこの発明による異なる菌株の構築は、所望のエタ ノール／乳酸の割合を決定する所望の用途に応して行うことができる。

いずれの場合においても、この構築法は、以下の工程からなる：すなわち、 −ＬＤＨ遺伝子と、所望のエタノール／乳酸の割合に応じて変化しつる強度を持 つ調節要素とからなる発現カセットの構築。

＝（所望エタノール／乳酸の割合に応じて、）単−又は多コピーのいずれかての このカセットの酵母内への導入。

この発明による酵母菌株は、農業食品において多くの応用がある。アルコール発 酵か、生物学的酸性化（例えば、不十分な酸性リンゴからのりんご酒の生産、い わゆる酸性パン粉の生産、ケフィールタイプのミルク製品等）、あるいはそのエ タノール産出の低下によって達せられる限りは、酵母菌株を使用することができ る。

このことは、ぶとう酒醸造学の分野において、即ち、・特に熱帯地域における増 大する量のワインの酸度不足を補うために。

・かなり広範な脱酸性化になっても、酸性化を補うことにより、マロー乳酸発酵 （生産物の生物学的安定化）の利点からの利益を得ることが可能であるために； ・低エタノール含有量のワインや飲料を生産するために。

特に利点かある。

加えて、アルコール発酵からの過度の逸脱を考慮して、この発明によるサンカロ ミセス属の形質転換酵母により、乳酸発酵を行う細菌を置換することか可能とな るであろう。これらの酵母は、以下の利点を有するであろう。すなわち、ファー ジに対する無反応、栄養源の貧弱な培地ての生育、酸性培地での生育低温度での 生育である。それらはまた、乳酸の工業生産にも利用することか可能であろう。

この発明は、この発明による形質転換酵母菌株の構築の実施例、並びにその発酵 活性の例証に関する以下の追加記載から、さらによく理解されるであろう。

しかしながら、これらの実施は、単にこの発明の主題を例証するものとしてのみ 与えられており、この発明は、決してこれらに限定されるものではないことはい うまでもない。

実施例１−カセイ菌（Ｌ、　ｃａｓｅｉ）　Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のクローニング Ａ、−大腸菌におけるカセイ菌ＤＮＡライブラリーの構築ａ）カセイ菌ＤＮＡの 抽出 ラクトバチルス・カセイ菌株ＡＴＣＣ３９３を使用した。それをＭＲ３培地で培 養した。この培地の組成は、以下のようである。

ポリペプトンＩＯｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、肉抽出物１０ｇ／ｌ、グルコー ス２ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム５ｇ／ｌ、クエン酸 アンモニウム２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０゜２ｇ／ｌ、硫酸マンガン０．０５ ｇ／ｌ、ツイーン８０１ｍｌ／ｌ。

１５ｍ１のＭＲ３培地にカセイ菌を植え付け、−晩３７°Ｃで培養する。同培地 の５００ｍ１に、前培養して得られた培養物の１５ｍ１を接種し、３．９の吸光 度（ＯＤ）　（５５０ｎｍ）になるまでゆっくり撹拌しなから３７°Ｃて培養す る。

ＤＮＡを、ＬＥＲＣＨら（Ｙｅａｓｔ、　７：　２５３−２６３．　（１９８９ ）　）に従って抽出し、臭化エチジウムの存在下で、塩化セシウム密度勾配で精 製する（ｌＪＡＮ［ＡＴ［ｓら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ａ 　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９））。

臭化エチジウムを、イソブタノール（２回）とイソアミルアルコール（２回）て 抽出する。２倍容の水で希釈した後、ＤＮＡを６倍容のエタノールで沈殿させる 。

沈殿物を、ロッドを用いて回収し、２ｍｌのＴＥ　（１０ｍＭ　トリス、ＩｍＭ 　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）に溶解する。

溶液中のＤＮＡの濃度を、２６０ｎｍで○Ｄを測定することによって決定する。

ｂ）カセイ菌ＤＮＡの消化 ６０ｕｇのカセイ菌ＤＮＡを、３７°Ｃで４０分間８単位の５ａｕ３Ａ酵素で部 分的に消化する。

混合物を、フェノール、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムで抽出し、 アルコールで沈殿させる。

遠心分離後、ＤＮＡを３００μｌのＴＥに溶解し、そのフラグメントを２５００ ０ｒｐｍで１５時間のショ糖密度勾配で分離する。

０．５ｍｌのフラクションを採取し、０．８％アガロースゲルで分析する。２〜 ４Ｋｂのフラグメントを含むフラクションを、４時間ＴＥに対して透析する。

Ｃ）ベクターｐＵＣＩ８への消化ＤＮＡの結合次いで、消化したＤＮＡを、以下 の条件下でライブラリーの生産のために脱リン酸化ベクターｐＵｃ１８ＢａｍＨ ［（アプリジーン）に結合する。

ｐＵｃ１８Ｂｄｐ　５　μｌ　（２５０ｎｇ）消化されたＤＮＡ　１０μｌ　（ １μｇ）アプリジーンＴｐリゲーション５×　ｌＯμｌアプリシーンリガーゼ　 ５μｌ 水　２０μｌ この混合物を、１４°Ｃで１８時間培養する。

ｄ）大腸菌の形質転換 次の遺伝子壓：　Ｆ−；　ｅｎｄＡｌ；　ｈｓｄＲ１７（Ｋ−、ｍＫつ；５ｕｐ Ｅ４４：　Ｔｈ１−１＋λ−：　ｒｅｃＡｌ：　ｇｙｒＡ９６：　ｒｅｌＡＩの 大腸菌株ＤＨ５（Ｚ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を使用した。

受容能力を存する細菌の作製に用いられたプロトコールと形質転換のために用い られたプロトコールは、ＨＡＮＡＨＡＮ　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、ＶＯｌ、 Ｉ　ＤＭ　Ｇｌｏｖｅｒ　（ｅｄ）　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１０９−１３５　（ １９８５））に記載されている。

結合混合物を、受容能力を有するＤＨ５α細菌を形質転換するために用いた。得 られたコロニーを、ＬＢディツシュ（バクトドリブトンＩＯｇ／ｌ、酵母抽出物 ５ｇ／ｌ、塩化ナトリウムｌＯｇ／ｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）上で 選択した。９２％のクローンが、予想されたサイズ（２−４Ｋｂ）の挿入断片を 育していた。

Ｂ、−ＰＣＲによるＬＤＨ遺伝子フラグメントの増幅ＨＥＮＳＥＬらによって発 表ＣＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３４：　５０３−５１１．　（１９８ ３）　）されたラクトバチルス・カセイのＬ−ＬＤＨのタンパク質配列に基づい て、オリゴヌクレオチドの２つの混合物を合成した。ブライ７−４１２２は、ア ミノ酸５−１０　：　Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓに由来 し、ブライ７−５０３６は、アミノ酸２６２−２６７　：　Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａ ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒに由来するものである（Ｋｉｎ　ｅｔａｌ、　１ ９９＋） ４１２２： ５゛−ＧＡ（Ｃ，Ｔ）−ＡＡ（Ｇ、　Ａ）−ＧＡ（Ｃ，Ｔ）−ＣＡ（Ｃ，Ｔ）− ＣＡ（Ｇ、　Ａ）−Ａ−（Ａ）　−３’５０３６　： ５−ＴＡ−（Ｃ，Ｔ）ＴＧ−（ＡＣＴＧ）ＣＣ−（Ｇ、　Ａ）ＴＣ−ＣＡＴ−（ Ｇ、　Ａ）ＴＡ−３’２つのプライマーを、この菌株から単離された全ＤＮＡか らのかセイ菌Ｌ−ＬＤＨ遺伝子のフラグメントを増幅するのに使用した。増幅し たフラグメントの大きさは、７８５塩基対である。

増幅は、以下のように行った。

ブライ７−４１２２　５　ｕＩ　（１００ｐｍｏｌ）プライマー５０３６　７． ２μｌ　（１００ｐｍｏＬ）Ｔａｑ緩衝液　１０Ｘ　１０μＩ Ｔａｑ　（ＢＥＣＫＭＡＮ）　０　、５　ｕ　１５ｕ／μ１ ｄＮＴＰ　（２ｍＭ）　Ｉ　Ｏμｍ カセイ菌ＤＮＡ　Ｉ　Ｏμ１ （１０ｎｇ／μｌ） 水　５７μ１ Ｔａｑ緩衝液１ｘ：１００ｍＭｈリス塩酸塩、　ｐＨ８，３，５００ｍＭ塩化カ リウム、　１５ｍＭ　塩化マグネシウム増幅状懸　ＴＥＣＨＮＥ　ＰＨＣ２増幅 器で、３０サイクル、９４°Ｃて１分間、５５°Ｃて１分間、７２°Ｃで２分間 増幅産物を、１．５％アガロースゲルで分析し、対応するパン）：’　（７８５ ｂｐ）を除去する。ＤＮＡを、ミリポアウルトラフリーカラムを用いて溶出し、 フェノールを用いて通常の抽出法によって精製し、アルコールを用いて沈殿させ 、次いで遠心分離し、ＴＥ緩衝液に溶解する。

Ｃ１−ライブラリーのスクリーニング ａ）　７８５−ｂｐフラグメントのラベル化増幅したフラグメントを、“高速ハ イブリッド形成システム−マルチプライム“キット（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）を用い てマルチプライム技術により、ｓｔｐでラベル化する。ＤＮＡを、３分間１００ °Ｃて変性させ、次いて水中で急速に冷却する。ラベル化は、以下の条件下で行 った。

７８５塩基ＤＮＡ　１２　μｌ　（１００ｎｇ）ラベル化緩衝液　１０μＬ ヘキサヌクレオチド　５μｌ ［３２Ｐコ　ｄＣＴＰ　４μ１ （３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ） フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）　２　μｍ 水　１７μ１ ３７°Ｃで２時間 ラベル化されたプローブを、ネンソルブ（ＮＥＮＳＯＲＢ）カラム（Ｎ　Ｅ　Ｎ ）を通して濾過することによってヌクレオチドから分離する。溶出されたフラク ションの放射活性を、シンチレーションカウンターで計数することによって測定 する。

ｂ）フィルターの準備 ライブラリーを構成する結合混合物のアリコートを用いてＤＨ５α細菌を形質転 換した後、４０００　Ａｍｐ’クローンが、ＬＢ＋アンピンリンディツシュ上で 得られた。それは、ゲノムのおよそ３倍の大きさである。

ｍ菌：ｔ　ロー１−−４ｔイａ　ンＨ（ＨＹＢＯＮＤ　Ｎ、　ＡＭＥＲＳＨＡＭ ）　上１：移し、ＤＮＡを、ＧＲＵＮＳＴＥＩＮ及びＨＯＧＮＥＳＳの技術（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２：　３９６１−３９６５　（１９７５））に従って変性 させる。次いで、その膜を、８０°Ｃで２時間培養する。

Ｃ）ハイブリッド形成 供給業者（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）によって記載されたプロトコールに従って、“高 速ハイブリッド形成システム−マルチプライム”キットを用いてハイブリッド化 を行う。膜を、６５°Ｃで１５分間ハイブリッド形成緩衝液中で、前ハイブリッ ド化する。変性したプローブを、ＩＯ”ｃｐｍ／ｍｌを基礎として緩衝液に加え る。

６５°Ｃで一晩、ハイブリッド化を行う。

ハイブリッド化後、膜を洗浄するニ ー２ＸＳＳＰＥ、Ｏ，１％　ＳＤＳを用いて６５°Ｃで１０分間２回−ＩＸｓｓ ＰＥ、０．１％　ＳＤＳを用いて６５°Ｃで１５分間１回−０，７ＸＳＳＰＥ、 ０．１％　ＳＤＳを用いて６５°Ｃて１５分間２回 （２０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　：　３．６Ｍ　ＮａＣ１；　０．２Ｍ　ＮａＨｚＰ Ｏ，：　０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ）膜を、Ｘ線７　イルＬ　（ＦＵＪ［）を用いて 、−８０”Ｃｔ’１２時間オートラジオグラフィーに付す。

ハイブリッド化の終わりに、ｐＧ４と称す陽性クローンが得られた。このプラス ミドを、ミニプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）　（ＭＡＮＩＡＴ［Ｓ。

＋９８９．上記参照）によってこのクローンから抽出し、制限酵素で消化するこ とによって分析した。プラスミドｐＧ４は、カセイ菌ＤＮＡの３．５−Ｋｂの挿 入断片を含有する。

大腸菌中での乳酸の産生を、クローンｌｌＧ４に関して測定した。

３７°Ｃで１％のグルコースとアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含む１０ｍ１ のＬＢ中でｐＧ４を増殖させた後、乳酸の産生を、Ｌ−ラクテートキット（ＢＯ ＥＨＲ［ＮＧＥＲ）を用いて酵素アッセイによって例証した。

これによって、カセイ菌Ｌ−ＬＤＨ遺伝子の全てが、単離された３、　５−Ｋｂ のフラグメント上に存在することが、確認される。

実施例２−突然変異誘発による遺伝子の修飾カセイ菌ＬＤＨ遺伝子の配列は、近 年発表されている（ＫＩＭｅｔ　ａｌ、、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５６：　２４１３−２４１７　（１９９１））。

発表された配列から推定された制限地図が、プラスミドｐＧ４の３．５−Ｋｂｔ １人断片人中片フラグメントの配列と一致することが、証明された。

カセイ菌ＬＤＨ遺伝子の翻訳開始コドンは、ＧＴＧであり、これは、開始コドン としてサツカロミセス・セレビシェに用いられないコドンであるので、ＧＴＧを 、突然変異誘発によって、ＡＴＧに置換した。

詳細な突然変異誘発法は、図１に要約されている。

１、突然変異を誘発させたフラグメントの獲得プラスミドｐＧ４に含まれる３、 　５−Ｋｂ挿入断片は、ＬＤＨ遺伝子のコーディング領域とともに、図１に示さ れている（ＧＴＧ開始コドン、ＴＡＡ停止コドン）。

ＧＴＧのＡＴＧでの置換を、プラスミドｐＧ４からの遺伝子の５“　フラグメン トのＰＣＲ増幅により、二つのプライマーを用いて行った。二つのプライマーの 位置と配列は、図Ｉに示されている　すなわち、 一プライマー１は、５°末端でのコーディング領域に相補的な１３の塩基と９つ の異なる塩基からなる。その１つは、ＧＴＧをＡＴＧで置換するためにＡであり 、他の８つは、開始コドンの５′側にＸｈｏ［部位を作ることを可能にする；− ブライマ−２は、その遺伝子に存在するＢｇｌ［１部位からなるコーディング領 域の内部の領域に相補的な２２の塩基からなる。

これらの２つのプライマーは、３３５−塩基フラグメントの増幅を可能にする。

増幅は、以下の手法によって行われた。

手法 ブライｖ　−１４μｌ　（２０ｐｍｏｌ）ブライ７−２　４　μｍ　（２０ｐｍ ｏｌ）Ｔａｑ緩衝液　１０ｘ　１０μＩ Ｔａｑ　５ｕ／μｌ　Ｏ，５μｍ ｄＮＴＰ　（２ｍＭ　）　Ｉ　Ｏμ１ ｐＧ４ａ　１　０　ｕ　ｌ　１１００ｎ水　７０．５μｍ 増幅条件　３０サイクル、９４°Ｃで３０秒、５５°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１ 分 増幅フラグメントの大きさを、１．５％アガロースゲル上でアリコートを分析す ることによって、証明した（３３５塩基）。

増幅産物の１，５μｍを、Ｘｈｏｌ／Ｂｇｌｌ［で消化し、消化したフラグメン トを、下記のようにしてプラスミドｐＢｓＬＤＨｓにサブクローン化した（２． ｂ）。

２、遺伝子の再構築 この構築における異なる工程を、図２に図式で示す。

ａ）プラスミドｐＢｓＬＤｔ（ｓの構築ＴＡＡ停止コドンの下流部位及びプラス ミドｐＧ４のポリリンカーにおける部位によって結合されたＸｂａ　［フラグメ ント（２，２Ｋｂ）を、ｐＧ４のＸｂａｌ消化、ＮＩＵＳ［ＥＶＥ低融解温度ア ガロースゲル（ＦＭＣ）上でのフラグメントの分離、及び２．２Ｋｂのバンドの 切り離しによって単離した。

このフラグメントを、２００　ｎｇのＸｂａ　［フラグメント（６５℃に加熱さ れたＮＩＵＳＩＥＶＥにおける）をｓｏｎｇのＸｂａ　Ｉで消化しかつ脱リン酸 化したプラスミドｐＢＳに結合することによって、プラスミドｐＢＳ　（ｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉｔ　ＳＫ＋、　５ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）にサブクローン化 した。得られた組換えプラスミドを、ｐＢＳＬＤＨ，と命名する。

ｂ）修飾フラグメントの導入 プラスミドｐＢｓＬＤＨ，を、Ｂａ１ｌ［（コーディング領域において）及びＸ ｈｏｌ　（ポリリンカ一部位）で消化し、次いで脱リン酸化した。

ＰＣＲによって増幅され、かつＢａ１ｌ［／Ｘｈｏ［で消化された（上記ｌで記 載のように）フラグメントの１００　ｎｇを、処理したｐＢｓＬＤＨｚの５０ｎ ｇに結合した。

得られたプラスミドｐＢＳＬＤＨ″ｌは、ＡＴＧの隣接した上流のＸｈｏ１部位 及びＴＡＡ停止コドンの隣接した下流のＸｂａ　１部位によって結合された、開 始コドンとしてのＡＴＧコドンを有する再構築されたＬＤＨ遺伝子のコーディン グ領域を持っている。

このプラスミドのＸｈｏｌ−Ｂａｌ［Ｉフラグメントを、一方ではＧＴＧのＡＴ Ｇでの置換を、他方では増幅間でのＴａｑポリメラーゼによるミスが全くなかっ たことを証明するために、配列した。

実施例３−修飾された遺伝子の発現ベクターへの導入突然変異を誘発されたカセ イ菌遺伝子の酵母中での発現を得るために、つくられたＡＴＧコドンを含むコー ディング領域を酵母／大腸菌シャトルベクター中に酵母調節要素の制御下で配使 用された発現プラスミドは、２μ起点、ＵＲＡ３マーカー、及び強ＡＤＨ調節要 素（プロモーター及びターミネータ−）、ならびに細菌要素（起点及びアンピシ リン耐性遺伝子）を含むプラスミドρＶＴ１００−Ｕである。

このプラスミドは、ＶＥＲＮＥＴらによって報告されている（Ｇｅｎｅ５２：　 ２２５−２３３．　（１９８７））。

プラスミド　ｐＢｓＬＤＨ’ｌのＸｈｏ［−Ｘｂａｉフラグメントを、Ｘｈｏ　 １−Ｘｂａ　［消化及びＮ［ＵＳ［ＥＶＥ低融低融解温度ロガローズゲル上フラ グメントの分離によって、単離した。その遺伝子に対応するｘｈｏｆ−Ｘｂａｌ 　フラグメント（Ｉ　Ｋｂ）を、切断した。

このフラグメントの１００　ｎｇを、ベクターｐＶＴ−１００−Ｕの５０ｎｇに 結合した。ベクターｐＶＴ−１００−Ｕは、Ｘｂａ［及びＸｈｏｌ　（ポリリン カーに存在する部位）で消化され、脱リン酸化されている。

組換えベクターｐＶＴ−１００−ＵＬＤＨ”が得られた。

単一コピー動原体プラスミドＹＣｐ５０は、ＲＯ５Ｅによって記載されている（ Ｓ、　Ｌ、　ＢＥＲＧＥＲａｎｄ　Ａ、　Ｒ，ＫＩＭＭＥＬ　（Ｅｄ）、＾ｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　４８１−５０４　（１９８７））。

このベクターは、ＡＲ３配列と動原体配列とＵＲＡ３マーカー、並びに細菌要素 （複製起点及びアンピシリン耐性）を有する。

ｐＡＤＨ−ＬＤＨ”−ｔＡＤＨ発現カセットを含むｐｖＴ１００〜Ｕ−ＬＤＨ” のＳｐ旧フラグメントを、Ｓｐ旧消化及びＮＩＵＳ［ＥＶＥ低融解温度アガロー スゲル上でのフラグメントの分離によって、単離した。発現カセットを含むＳｐ 旧フラグメント（１，７Ｋｂ）を、切断した。

このフラグメントの１００　ｎｇを、ベクターＹＣｐ５０の５０ｎｇに結合した 。ベクターＹＣｐ５０は、Ｓｐｈ＋で消化され、脱リン酸化されている。組換え ベクターＹＣｐ５０−ＬＤＨ”か得られた。

実施例４−酵母の形質転換 サツカロミセス・セレビンエ酵母菌株５ＣＶ５１Ｊを、一方ではプラスミドｐＶ Ｔｌｏｏ−Ｕ−ＬＤＨ”を用いて、他方ではプラスミドｙｃｐ５０−ＬＤＨ’を 用いて形質転換した。

菌株ＳＣＶ５Ｍは、番号１−１２２２として、パスツール研究所によるＣｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒ ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ＣｕＨｕｒｅｓ　）に、１９９２年６月１８日に 寄託された。この生物は、ぶとう酒醸造常用の菌株に由来する半数体実験株で、 ウラシル（ｕ　ｒ　ａ　３）に対する栄養要求性突然変異体である、ＭＡＴ　ａ である。この菌株は、工業用菌株に匹敵するぶとう酒醸造条件下で発酵を行うこ とかできる。

使用した形質転換法は、ＧＩＥＴＺ及びＳＣＨ［ＥＳＴＬによって記載されたリ チウムアセテート法であるＣＹｅａｓｔ、　７：　２５３−２６３、（１９９１ ）〕。

使用した選択培地は、ＹＮＢである（酵母窒素塩基７ｇ／ｌ　ＤＩＦＣＯ，グル コース２０ｇ／Ｉ）。ウラシルの欠如により、プラスミドの保存を可能にする選 択圧となる。

実施例５−発酵テスト １）多：＋ピープラスミドｐＶＴｌｏＯ−Ｕ−ＬＤＨ＠発酵テストを以下の菌株 を用いて行った。

−Ｖ５／ｐＶＴＩｏｏ−Ｕ　：対照として、挿入断片なしにプラスミドｐＶＴ１ ００−Ｕを用いて形質転換された菌株ＳＣＶ５Ｍ−Ｖ５／ｐＶＴ１００−Ｕ−Ｌ ＤＨ”　：修飾されたＬＤＨ遺伝子を含む多コピープラスミドｐＶＴ１００−Ｕ を用いて形質転換された菌株ＳＣＶ５Ｍ。

いくつかの形質転換細胞を別々にテストした。

発酵を、ＹＮＢ　（酵母窒素塩基７　ｇ／ｌ　ＤＩＦＣＯ）最小合成培地（５０ ｇ／ｌのグルコースを含存し、６．３ｇ／ｌのクエン酸と水酸化ナトリウムてｐ Ｈ５，１に緩衝化されている）上で行った。

菌株Ｖ５／ｐＶＴＩｏＯ−Ｕ及びＶ５／ｐＶＴ１００−Ｕ−ＬＤＨ”　（７）前 項ｔを、２８℃で１０ｍ１の培地中で２０時間行った。

培養は、前培養物からの７ＸＩＯ’細胞／ｍ細胞液種することによって、５０ｍ １中で行った。細胞の数を、コールタ−カウンターモデルＺＢ［型装置で測定し た。

培養物を、時々棒磁石で撹拌しながら、２８°Ｃでインキュベートした。

初期ｐＨを測定した。Ｖ５／ｐＶＴｌｏｏ刊では５、Ｖ５／ｐＶＴ１００−Ｕ− ＬＤＨｌては４．９であった。

サンプル１ｍｌを、次の測定を行うために、定間隔で採取した。

−細胞測定器（コールタ−カウンター）による細胞の数。

−培地のｐＨ２ 一酵素アノセイによる、培地のグルコース、エタノール、乳酸の濃度（ＢＯＥＨ Ｒ［ＮＧＥＲａＳＳａｙ　ｋｉｔｓ）　；乳酸脱水素酵素の比活性、この活性は 、以下のようにして得られた粗細胞抽出物で測定された。：　ｔｏ”細胞を採取 し、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍｌの８０ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５ ，５（０，２Ｍ酢酸塩緩衝液・酢酸ナトリウム２．７３　ｇ　／水１００ｍ１、 酢酸でｐＨ５，５に調製）で洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝液０．５ｍｌに 溶解する。細胞を、低温状態で、１分間に４回、ガラスピーズを用いてヴオルテ ックスミキサーで粉砕する。粉砕品を、１５０００ｒｐｍて５分間遠心分離し、 得られた上清を粗抽出物として用いる。ＬＤＨアッセイを、ＨＥＮＳＥＬらの記 載に従って行う（Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１１２．８１−９３　（ １９７７））　。ＬＤＨ活性は、抽出物におけるタンパクのＵ／ｍｇで示される 。

行われたアッセイの結果は、以下の通りである。

−エタノール及び乳酸の産生： Ｖ５／ｐＶＴｌｏｏ−Ｕ−ＬＤＨ”の乳酸産生は、処理した形質転換細胞によっ て６〜２５　ｇ／ｌ乳酸の間で変動し、はとんどの場合１０ｇ／ｌのオーダーの 産生量である。以下で詳細にされ、かつ図５に示されている実験結果は、約１０ ｇ／ｌの乳酸を産生ずる形質転換細胞Ｖ５／ｐＶＴ１００−Ｕ−ＬＤＨ’で得ら れたものである。対照菌株は、エタノールを産生し、検出可能な乳酸産生を示さ ないのに対しく図５Ｄ）、形質転換細胞は、同時に乳酸とエタノールを産生じ（ 図５０）、これは、培地に存在するグルコースの２５〜３０％の乳酸への分解に 相当する。

さらに、乳酸とエタノールの同時産生は、指数的成長相の間及び定常期の初期に みられる。定常期の間は、乳酸産出は停止する。

一細胞増殖・ 形質転換細胞Ｖ５／ｐＶＴ１００−Ｕ−ＬＤＨ”の増殖（図５Ａ）は、対照菌株 （図５Ｂ）の増殖に匹敵する。しかしながら、増殖の停止（定常期の開始）は、 対照より形質転換された菌株の方が早く、最終の細胞数は、対照菌株で観察され るものより約２０％低い。

一培地のｐＨ測定 増殖の停止は、培地の実質的な酸性化によって説明することかできる。ｐＨのよ り大幅な低下が、対照菌株の場合（図５Ｂ）より形質転換された菌株の場合（［ Ｎ５Ａ）において、効果的に観察される。この実質的な酸性化は、観察された乳 酸産生と密接に相関している。

−ＬＤＨ活性のアッセイ。

形質転換された菌株の粗抽出物で得られた結果（図５Ｅ）は、ＬＤＨ比活性が、 細胞が定常期に入るとき最大になり、次いで定常期の間に減少することを示して いる。

−他の培地： さらに、ＹＮＢ培地で得られた結果は、グレープジュース（１８５ｇ／ｌ　グル コース）とアップルジュース（９３ｇ／ｌグルコース）に関して確認された。

従って、乳酸／エタノール混合産生の獲得は、種々のグルコース濃度を含む異な る培地（合成、最小又は完全、天然）で、かつ開始ｐＨに関係なく達せられつる 。使用できる温度範囲は、酵母の成育を許容しつる温度（約１４〜３５°Ｃ）で ある。

２）単一コピープラスミドＹＣｐ５０−ＬＤＨ”発酵テストを、ｐＨ５，１に緩 衝化された５０ｇ／Ｉのグルコースを含むＹＮＢ培地上で、菌株Ｖ５／ＹＣｐ５ ０−ＬＤＨ”を用いて行った。

Ｉｇ／１オーダーの乳酸産生が、この菌株に関して得られた。

上記のようにして測定されたＬＤＨ比活性は、多コピー形質転換細胞で観察され たものに類似する変化を示す。これに対して、指数的成長相の末期／定常期の初 期に観察された最大活性は、１．５０／ｍｇタンパクのオーダーであり、これは 、多コピー形質転換細胞で得られた最大活性（１０Ｕ／ｍｇタンパク）の７分の １に等しい。

従って、単一コピー形質転換細胞による乳酸産生は、ＬＤＨ比活性のレベルと相 関する。

このことは、乳酸産生が、特に酵母に導入されるＬＤＨ遺伝子の数に応じて調節 されることを示している。

上記から明らかなように、この発明は、さらに明白に記載された実施と応用に関 する実施例及び方法になんら制限されず、逆に、当該分野において、専門家に生 じつるあらゆる変形を、この発明の範囲を逸脱することなく、包含するものであ る。

Ｘｈｏｌ　Ｂｇｌｌｌ 加１ 図１ 結合 結合 ｘｂａ１ｗＨ″　Ｘｈａｌ 図４ ＶＳ／ｐＶＴ１００−Ｕ−ＬＤＨ− 国際調査報告 ＦＲ９３００６ｉ８ 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：２４５） （Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） Ｉ Ｃ１２Ｒ１：２４５）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母中で乳酸菌ＬＤＨをコードする遺伝子の発現を調節する配列の制御下で 、乳酸菌ＬＤＨをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む酵母菌株。
2. ２．酵母がサッカロミセス属に属する請求項１に記載の菌株。
3. ３．発現される遺伝子がカゼイ菌ＬＤＨのものである請求項１又は２に記載の菌 株。
4. ４．酵母中で活性を示す調節配列と組み合わされた乳酸菌ＬＤＨの遺伝子からな る発現カセット。
5. ５．請求項４に記載の発現カセットからなり、かつ請求項１に記載の形質転換酵 母を得るのに使用可能な発現ベクター。
6. ６．さらに、細菌の複製起点と細菌中で選択可能なマーカーを有するシャトルベ クターである請求項５に記載のベクター。