JPH07508401A - 動物およびヒトにおける呼吸器合胞体ウイルス感染治療ならびに予防用新規抗体 - Google Patents

動物およびヒトにおける呼吸器合胞体ウイルス感染治療ならびに予防用新規抗体

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JPH07508401A JP5517272A JP51727293A JPH07508401A JP H07508401 A JPH07508401 A JP H07508401A JP 5517272 A JP5517272 A JP 5517272A JP 51727293 A JP51727293 A JP 51727293A JP H07508401 A JPH07508401 A JP H07508401A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３２、該蛋白を複製し発現させる能力のある調節配列の支配下で該蛋白をコード している核酸配列により形質転換された適当な細胞系を培養することおよび該細 胞系から発現される蛋白を得ることからなる請求項１記載の融合蛋白の生産方法 。
３３　融合蛋白または抗体をトランスジェニック動物において生産することから なる請求項１記載の融合蛋白あるいは請求項１７記載の改変抗体の生産方法。
明細書 動物およびヒトにおける呼吸器合胞体ウィルス感染治療ならびに予防用新規抗体 発明の分野 本発明は一般的に、モノクローナルおよび組換えヒト化抗体、ならびに特に呼吸 器合胞体ウィルス上のエピトープについての抗体の分野に関する。
発明の背景 呼吸器合胞体ウィルス（Ｒ８Ｖ）は、バラミクソビリダニ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖ ｉｒｉｄａｅ）科の肺ウィルスであり、生後１年間の小児および子ウシの重大な 低機能性呼吸系感染の主たる原因である［キムＱｉｍ）ら、アメリカン・ジャー ナル・オブ・エビデミオロノー（＾１ＩｅｒＪ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏ１．）　、９ ８　：　２１６−２２５　（１９７３）　ニスドツト（Ｓｔｏｔｔ）ら、ジャー ナル・オブ・ハイジーン（Ｊ、Ｈｙｇｅｎｅ）　、８５　：　２５７−２７０　 （１９８０）：ビー・エヌ・フィールズ（Ｂ、　Ｎ、　Ｆｉｅｌｄｓ）ら編、ウ イロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）ラベン・プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）ニ ューヨーク（１９９０）中、マツキントラシュ（ｌｉｃＩｎｔｏｓｈ）およびチ ャノック（Ｃｈａｎｏｃｋ）　］。ヒトおよびウシ・Ｒ３Ｖ株は抗原的に異なっ ているが、密接に関連していて、ヒトおよびウシ両方の２亜種が同定されている ［ラーチ（Ｌｅｒｃｈ）らジャーナル・オブ・ウイロロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ） 、６３　：８３３−８４０　（１９８９）：アンダーラン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ） ら、ジャーナル・オブ・インフエクシャス・ディシーズ（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄ ｉｓ、）　、１５１　：　６２６　６３３　（１９８５）　］。
ネズミおよびラン種におけるＲ３Ｖ治療への抗−Ｒ３Ｖ抗体の利用が示唆されて いる。しかしながら、非ネズミおよび非つシ種の治療は、外来のネズミおよびラ ン・抗体に対するこれらの種の免疫反応性により、潜在的に制限されている。
例えば、ネズミ・抗体に対するヒトの免疫反応性は、免疫グロブリンネ変部およ び可変部領域に対して見られる。
当該分野において、Ｒ３Ｖ蛋白上の防御的なエピトープおよび感染防御を行う免 疫エフェクター機構を特異的に同定し、安全かつ効果的なＲ３Ｖワクチンに利用 するためのＲ３Ｖ抗原、エピトープおよびそれに対する抗体を生産し、特徴づけ る必要性がある。
発明の概要 本発明は、種々の形態の抗−Ｒ３Ｖ抗体およびＣＤＲを含むその機能的断片を提 供する。これらの抗体および断片は、抗−ＲＳＶモノクローナル抗体（ｍＡｂ） の結合特異性および／または中和活性により特徴づけられる融合蛋白、とくに、 キメラおよびヒト化抗体の構築に役立つ。また本発明は、ヒト・免疫グロブリン の骨格および不変部に連結したウシ・抗体の可変部を含む新規ヒト化抗体を提供 する。さらにＲＳＶ治療のための治療用および医薬組成物をさらに含むこれらの 生成物の製法も開示する。
本発明の他の態様および利点を以下の詳細な説明中に記載する。
図面の簡単な説明 図１は、ｐＧＥＭ４のポリリンカー中にクローン化された、Ｃから八への置換を 有するＲ３Ｖの長い株（ＲｌＶ　Ｌｏｎｇ　５ｔｒａｉｎ）のＦ糖蛋白のｃＤＮ Ａを有するＬＦｌ／１２９８組換えプラスミドの単離を示すグラフである。該組 換えプラスミドは、選択された宿主細胞中でＦ蛋白を発現させる。
図２は、疎水的領域（１）、蛋白分解的プロセッシング部位（↓）、Ｎ−グリコ ノル化の可能性のある部位（＾）、システィン残基（・）および中和エスケープ 変異株（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｅｓｃａｐｅ　５ｕｔａｎｔｓ）にお いて変化したアミノ酸残基（−）を示すＦ糖量白１次構造のダイヤグラムである 。
図３Ａおよび３Ｂは、Ｂ４抗体の一部およびＢ１３／Ｂ１４抗体の可変部り鎮（ ＶＬ）のアミノ酸配列［配列番号＝１および２１］を比較する。Ｂ４配列は上記 Ｂ　１３／Ｂ　１４配列に報告されており、その配列間の比較を示す。配列中、 「−」は、配列間のつながりを改善するために導入された配列中のギャップを示 す。ＣＤＲを箱の中に示す。下線を付した配列は、これらの抗体の配列を増幅す るのに用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のオリゴヌクレオチドプライマーの 配列に対応する。
図４Ａおよび４Ｂは、Ｂ４抗体の一部およびＢ　１３／Ｂ　１４抗体の可変部Ｈ 鎮（ＶＨ）のアミノ酸配列し配列番号＝３および４］を、先にＢ　１３／Ｂ　１ ４配列について報告したＢ４配列と比較する。記号ｒ−Ｊ、ＣＤＲおよびＰＣＲ オリゴヌクレオチドブライマー配列は、図３Ａおよび３Ｂにおける如く定義され 、示された通りである。
図５は、非標識抗体量を増加させた場合のＲＳＶのＡ２株に対する＋ｘｓ１で標 識した１０種の抗−ウシ・ｍＡｂの競争的結合を示すバー・ダイアグラムである 。
「中和（Ｎｅｕｔ）　Ｊは、プラーク中和分析において、ｍＡｂがＲＳＶを中和 しうることを示す。「融合阻害（Ｆｒ）　Ｊは分析における多核巨細胞の融合を 阻害する抗体の能力を示す。「防御（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）　Ｊは生体内分析 において、ｍＡｂがＲＳ■感染からネズミを守ることができるかどうかを示す。
記号：試験した競争抗体の最大量における結合率が１０％以下（■）、１１ない し８０％（斜線）８０％以上（ロ）。
図６は、抗−Ｆネズミ・ｍＡｂの競争的結合を示すバー・ダイアグラムである。
「中和（Ｎｅｕｔ）　Ｊ、「融合阻害（ＦＩ）　Ｊ、「防御（Ｐｒｏｔｅｃｔｉ ｏｎ）　Ｊおよび記号は図５において定義されたものとも同じである。
図７は、ＲＳＶ　Ａ２株および抗体エスケープ（ｅｓｃａｐｅ）変異Ｒ８■への 抗−ＦｍＡｂの結合を示すバー・ダイアグラムである。。マイクロタイター・プ レートをおおうように図の最上部に示された精製ウィルスを用いたＥＬＩ　ＳＡ で、抗体を試験した。記号　Ａ２株について得られた吸着値が２０％以下（■） 、２０ないし８０％（斜線）８０％以上（ロ）。
図８は、ＲＳＶのＬ鎖および抗体エスケープ変異Ｒ３Ｖへの抗−ＦｍＡｂの結合 を示すバー・ダイアグラムである。試験した抗体を図７に示した。記号：Ｌ鎖に ついて得られた吸着値が２５％以下（空白）、２５ないし５０％（斜線）、５０ ％以上（■）。
図９は、ポリエチレンのビンに結合しているＲＳＶ　Ｆ蛋白の２６６番から２７ ３番のアミノ酸［配列番号　１９］に対応する配列中の個々のアミノ酸が、順番 に他のアミノ酸（横軸）に置換されている合成８量体ペプチドに対するｍＡｂＢ ４の結合を示す８つのバー・ダイヤグラムである。個々のバー・ダイアグラムの 下のアミノ酸配列は、どのアミノ酸が置換されたか（文字を囲む箱で示す）を示 す。ＥＬＩＳＡで抗体結合を試験し、黒い棒は、ペプチドの元々の配列について 得られた吸着値を示し、灰色の棒は置換アミノ酸を含むペプチドについて得られ たを着値を示す。
図１０は、ウシ・ｍＡｂ　Ｂ４が供与抗体［配列番号＝５］である、予想される ヒト化ＶＨ領域配列Ｂ４ＨｕＶＨである。ＣＤＲを箱で示す。フレームワーク中 、下線の残基は、残存するネズミの領域である。
図１１は、改変抗体を構築するのに使用する隣接した予想ヒト・ＶＨ領領域配列 Ｂ４ＨｕＶＫであり、その中で、Ｂ４が供与体抗体［配列番号＝６コである。
ＣＤＲを箱で示す。
図１２’Ａおよび１２Ｂは、改変抗体を構築するのに使用する隣接した予想ヒト ・ＶＨ領領域配列Ｂ１３／Ｂ１４ＨｕＶＨ［配列番号ニア］であり、その中で、 Ｂ１３／Ｂ１４が供与体抗体である。ＣＤＲを箱で示し、残存するネズミの残基 に下線を付しである。
図１３は、予想されるヒト化不変部Ｈ領域Ｂ１３／Ｂ１４ＨｕＶＫ　［配列番号 ８］を示し、その中で８１３／Ｂ　１４が供与抗体である。ＣＤＲを箱で示す。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＲＳＶ１９のＶＨ領領域関する隣接したＤＮＡ配列お よび対応するアミノ酸配列［配列番号：９および１０コを示す。ＣＤＲを箱で示 す。下線を付した配列は使用したプライマーに対応する。
図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｒ３Ｖ１９　ＶＬ領領域関する隣接したＤＮＡ配列お よび対応するアミノ酸配列［配列番号・１１および１２］を示す。ＣＤＲを箱で 示す。下線を付した配列は使用したプライマーに対応する。
図１６は、ヒト・Ｉｇ（免疫グロブリン）ＶＨ領域構造およびネズミ・Ｒ３Ｖ１ ９からのＣＤＲからなるプラスミドｐＨｕＲ８Ｖ１９ＶＨを示す。
図１７はヒト・ＩｇＶＬｇ域構造およびネズミ・Ｒ３Ｖ１９由来のＣＤＲからな るプラスミドｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫを示す。
図１８は、ネズミ・Ｒ３Ｖ１９ＶＨ［配列番号、１３］によりコードされる誘導 されたＩｇ可可変領領域アミノ酸配列を示す。
図１９は、ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ［配列番号：１４］によりコードされる誘導さ れたＩｇ可可変領領域アミノ酸配列を示す。
図２０は、ｐＨｕＲｓＶ１９ＶＨＦＮｓ　［配列番号：　１５］　１ｎ、ｋ”Ｊ ）−ドされる誘導されたＩｇ可可変領領域アミノ酸配列を示す。
図２１は、ｐＨｕＲｓＶ１９ＶＨＮＩＫ　［配列番号：１６］によりコードされ る誘導されたＩｇ可可変領領域アミノ酸配列を示す。
図２２は、ｐＨｕＲ９Ｖ１９ＶＫ　Ｃ配列番号：１７］１．：よりコードされル 誘導されたＩｇ可可変領領域アミノ酸配列を表す。
図２３は、ＨｕＶＬ構造４［配列番号２０および２１］をコードするＤＮＡおよ びアミノ酸であり、可能な切断部位を示す。下線を付した塩基は置換され、純粋 なＪ１遺伝子配列［配列番号＝２２コを提供する。
発明の詳細な説明 ■、　定義本明細書中の用語「第１の融合相手（ｆｉｒｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐ ａｒｔｎｅｒ）　Ｊは、選択された抗体、好ましくは抗−Ｒ８Ｖ抗体に対する抗 原結合特異性を有するＨ鎖可変部、Ｌ鎖可変部、ＣＤＲ，その機能的断片または そのアナログの全部あるいは一部のアミノ酸配列をコードしている核酸配列であ る。
本明細書中の用語「第２の融合相手（ｓｅｃｏｎｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐａｒｔｎ ｅｒ）　Ｊは、第１の融合相手が、構造中または所望の慣用的なリンカ−配列に より融合する蛋白あるいはペプチドをコードしている別のヌクレオチド配列であ る。かかる第２の融合相手は、例えば、適当なヒト・不変部またはフレームワー クのような、対象となる２次抗体をコードしている核酸配列を含んでいてもよい 。
「融合分子」は、第２の結合相手に作動可能に結合した第１の融合相手の生成物 である。融合相手の「作動可能な結合」は、供与体抗体からの抗−Ｒ３Ｖ配列（ 第１の融合相手）の抗原特異性のみならず、第２の融合相手の所望の性質も０珊 させる会合として定義する。例えば、アミノ酸リンカ−をコードする核酸配列を 所望により使用してもよく、あるいはフレーム中の融合を介しての第２の融合相 手への連結であってもよい。
「融合蛋白」は、融合分子の発現の結果物である。かかる融合蛋白は、例えばキ メラ抗体、ヒト化抗体あるいは本発明中で同定され、免疫グロブリンまたは非免 疫グロブリン蛋白およびそれに類する蛋白に融合されるいかなる抗体の領域であ っでもよい。
本明細書中の用語［供与体抗体（ｄｏｎｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　Ｊは、天然 の核酸配列に由来する抗体（ポリクローナル、モノクローナルあるいは組換え型 ）あるいは修飾された可変部りおよび／またはＨ鎮、そのＣＤＲあるいは第１の 融合相手に対するそれらの他の機能的断片またはアナログであり、供与体抗体の 特徴である抗原特異性または中和活性のある融合分子および結果として発現され る融合蛋白を提供する。本発明における使用に適した供与抗体の一例は、ウシ・ ｍＡｂ　Ｂ４またはＢ１３／Ｂ１４である。
本明細書中の用語「受容体抗体」は、供与体抗体とは異種の抗体（ポリクローナ ル、モノクローナルあるいは組換え型）であるが、治療されるべき患者（ヒトま たはウシ）と同種であり、第２の融合相手に対して可変部Ｈ鎖および／またはＬ 鎖フレームワークおよび／またはそのＨ鎖および／またはＬ鎖不変部領域をコー ドしている核酸配列の全部または主要部を供与する。好ましくは、ヒト・抗体を 受容体抗体とする。
ｒｃＤＲｊは、抗原またはエピトープに対する抗体の結合に関する接触残基の大 多数を提供する免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の超可変部である抗体の相補性決定 領域アミノ酸配列として定義する。本発明において対象とするＣＤＲは供与体抗 体のＨおよびＬ鎖配列由来のものであり、機能的断片および天然のＣＤＲのアナ ログを含み、断片およびアナログはまた、それらが由来する供与体抗体と同一の 抗体結合特異性および／または中和能力を共有しているかあるいは維持している 。図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂおよび１０から１３において箱で示されたＣＤＲ参 照。「抗体結合特異性または中和能力を共有していることｊによりとは、例えば 、ｍＡｂ　Ｂ１３／Ｂ１４があるレベルの抗原親和性により特徴づけられ、適当 な構造的環境中でＢ　１３／Ｂ　１４の核酸配列によりコードされたＣＤＲがよ り低い親和性を持っていても、かかる環境においてＢ　１３／Ｂ　１４のＣＤＲ はＢ１３／Ｂ１４を同じエピトープとして認識することが予想されるということ を意味する。
「機能的断片Ｊは、断片が誘導された抗体と同じ抗原結合特異性および／または 中和能力を保持している部分的なＣＤＲ配列あるいは部分的なＨ鎖またはＬ饋の 可変部配列である。
［アナログ］は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、アミノ酸の修飾または化学 的置換により修飾されたアミノ酸またはペプチド配列であり、その修飾はアミノ 酸配列に、例えば、未修飾配列の抗原特異性生物学的特性を保持させる。
「対立遺伝子的変化または修飾」は、本発明のアミノ酸をコードしている核酸配 列あるいはペプチド配列の改変である。かかる変化または改変は、遺伝暗号の縮 重によるものであってもよく、あるいは計画的に作成され所望の性質を示すもの であってもよい。これらの変化または改変は、コードされたアミノ酸配列の変化 を起こすことも起こさないこともある。
本明細書中の用語「改変抗体」は、その中で選択された受容体抗体のＬおよび／ またはＨ鎖の可変部ドメインの一部が、選択されたエピトープに対して特異性を 有する１つあるいはそれ以上の供与体ｍＡｂ由来のＣＤＲの類似部分により置換 されている融合蛋白の一形態、すなわち、合成抗体（例えばキメラまたはヒト化 抗体）である。これらの改変抗体はまた、受容体ｍＡｂのＬおよび／またはＨ鎖 可変部ドメインフレームワークをコードしている核酸配列の最小限の改変により 特徴づけられ、供与体ｍＡｂ結合特異性を保持している。これらの抗体は、免疫 グロブリン（Ｉｇ）の不変部および受容体ｍＡｂからの可変部フレームワークな らびに本明細書記載の抗−Ｒ３Ｖ供与体抗体からの１つあるいはそれ以上のＣＤ Ｒからなっていてもよい。
「キメラ抗体」は、ヒト・受容体抗体由来のＬ鎖およびＨ鎮不変部に会合した非 ヒト供与体抗体由来の天然の可変部り鎖およびＨ鎖（ＣＤＲおよび構造の両方） を含む改変抗体の一形態である。
「ヒト化抗体」は、そのＣＤＲおよび／または非ヒト・供与体免疫グロブリン、 すなわち１つあるいはそれ以上のヒト・免疫グロブリンに由来する残りの免疫グ ロブリン由来の分子の一部に由来するＬおよび／またはＨ鎖可変部ドメイン構造 の一部を有する改変抗体である。かかる抗体もまた、供与体または受容体の未修 飾し鎖あるいはキメラなＬＭに会合したヒト化Ｈ鎖、あるいはその逆（供与体ま たは受容体の未修飾Ｈ鎖あるいはキメラなＨａに会合したヒト化り鎖）により特 徴づけられる改変抗体を含む。
「エフェクター剤」は、融合蛋白および／または天然の、もしくは合成された供 与体抗体のしまたはＨ鎖あるいは供与体抗体の他の断片を、慣用的方法で会合さ せる非蛋白担体分子である。かかる非蛋白担体は、例えばポリスチレンまたは他 のプラスチ−ツク・ビーズあるいは医療分野に有用であり、ヒトおよび動物に投 与しても安全な非蛋白物質のごとき診断分野に有用な慣用的担体を包含しつる。
他のエフェクター剤は、重金属原子またはりシン（ｒｉｃｉｎ）のごとき毒物を キレートするための大赤血球を包含しうる。かがるエフェクター剤は、アミノ酸 配列由来の抗−ＲＳＶの半減期を延長するのに有用である。
１１　抗−Ｒ３Ｖ抗体 本発明の抗体、断片および融合蛋白の構築に使用するため、非ヒト種を用いて呼 吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）Ｆ蛋白またはそれに由来するペプチド・エピトー プを与える望ましい免疫グロブリンを生成させる。慣用的なハイブリドーマの手 法を用い、Ｒ３Ｖペプチドに対する非ヒト・ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細 胞系を提供する。
例えば、いくつかの中和、融合阻害的（Ｆｌ）および非常に防御的なウシおよび ネズミ・抗−Ｒ３Ｖモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を本発明により提供する。
Ｆｌ蛋白、Ｂ１３およびＢ１４ならびに本明細書中でＢ４、Ｂ７からＢＩＯと命 名した他の適当なウシ・ｍＡｂ、および本明細書中で、１６から２１と命名した 不ズミ・ｍＡｂに結合する能力のあるウシ・抗体の生成および特徴づけを、実施 例１および２１ならびに図５および６にて詳細に記載する。
生じたＢ１３およびＢ１４抗−Ｒ３Ｖ抗体を、プラーク減少中和試験にょるＲ８ ■中和能力で特徴づける。Ｂ１３およびＢ１４は両方とも融合阻害分析にて能力 が認められ、マウスにおいて防御的である。競争的な研究は、Ｆ蛋白断片および 合成ペプチドに結合する抗体エスケープ変異株の研究とともに、Ｂ１３およびＢ １４により認識されるエピトープが、ｍＡｂ　ＲＳＶ１９　（ｍＡｂ　１９また はＲ３ＭＵ１９として知られる）により認識されるエピトープと類似していても よいが、同一ではないことを示唆する。Ｆ蛋白に特異的なＧ２＋クラスの免疫グ ロブリンの４１７〜４３８番目のアミノ酸を以下の実施例１１およびＰＣＴ特許 出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１５５４号に記載する。配列決定後、Ｂ１３および Ｂ１４は実質的に同一であることがわかり、ある場合には単一の抗体としてＢ１ ３／Ｂ１４という。抗体が別々に試験される場合、ｍＡｂＢ　１３またはＢ１４ という。
発明者は、以前開示した抗−ＲＳ　ＶｍＡ　ｂであるＢ４が、ウソ・ＲＳＶによ る感染から子ウシを守るのみならず、ヒト・Ｒ８Ｖ感染からマウスを守る効果が あることを確認した。ウシ・ｍＡｂであるＢ４の能力は、気管内経路により子ウ シに投与した場合、ＲＳ　Ｖによる低度の呼吸器感染および呼吸障害の進展から 守り、つ／・ｍＡｂが子ウソの呼吸器疾病の抑制における、潜在能力のある予防 的ならびに治療的薬剤であることを示している。Ｂ４はまた、融合阻害およびウ ィルス中和分析（実施例１６および１７）においても能力がある。
これらの３種のｍＡｂ　Ｂ４、Ｂ１３およびＢ１４を、医薬上あるいは予防上の 用途のために改変できる望ましい抗体と確認した。しかしながら、本発明は、こ れらの３種のｍＡｂの利用あるいはこれらの超可変部配列の使用に限定しない。
これらのｍＡｂは本発明の生成物および方法を説明する１以下の記載のどの部分 において供与者抗体がＢ４、Ｂ１３またはＢ１４と同定されても、他のいかなる 適当な抗−Ｒ３Ｖ中和抗体および対応する抗−ＲＳＶ　ＣＤＲはそれと置換され うる。
２６６番目のアミノ酸ないし２７３番目のアミノ酸までのＲＳＶ　Ｆ蛋白エピト ープのみならず本明細書記載の対象となる他のＲ３Ｖエピトープに対して開発さ れたウソのみならず他の種の他の抗体が、マウス、子ウソおよびヒトのＲＳＶの 治療に関する本発明の構成に有用でありうることが予期される。ハイブリドーマ 生成物を含む抗体ライブラリー、あるいは以下の実施例記載のような１種または それ以上のウソ抗体あるいは本明細書記載のＲ８Ｖエピトープを用いた慣用的な 競合分析におけるすべての種の免疫グロブリン類に由来するライブラリーを検索 することにより、他の抗−Ｒ３Ｖ抗体を開発できる。中和的かつ防御的なｍＡｂ であるＢ４およびＢ１３／１４が付加的な抗体の検索に特に好ましい。
かくして、本発明はＢ４あるいはＢ１３／１４以外の、Ｆ蛋白の２６６番目ない し２７３番目のアミノ酸範囲ＩＴＮＤＱＫＫＬのＲ３Ｖペプチドまたは他の関連 したエピトープに結合する能力のある抗体を提供しつる。この抗体はｍＡｂもし くは改変抗体あるいはかかる抗体のアナログ、そのＦａｂ断片、またはそのＦ（ ａｂ’）ｚ断片であってもよい。所望のＲ３Ｖエピトープに対して生成され、慣 用的技術で調製されたかかる他のｍＡｂは、制限なくネズ・ミｍＡｂ、ヒト・ｍ Ａｂおよび結合抗体を含む。
これらの抗−ＲＳＶ抗体は、ヒトまたは他の動物のＲＳＶの治療に関する医薬お よび治療用組成物において有用であろう。
ＩＩｌ、抗体断片 上記抗−Ｒ３Ｖ抗体は、抗体のしおよびＨ鎖可変部配列およびＣＤＲペプチドを 含む所望の機能的断片の供与体として有用であろう。
本発明はまた、Ｒ８Ｖ感染および疾病に対する生体内での防御的薬剤としてＲＳ Ｖのエピトープに向けられたｍＡｂ由来のＦａｂ断片あるいはＦ（ａｂ’）ｘ断 片を包含する。Ｆａｂ断片はＨ鎮の半分および１本のＬ鎖からなり、Ｆ（ａｂ’ ）ｓ断片は、ノスルフィド結合で結合した２つのＦａｂ断片である。ｍＡｂ　Ｂ １３／１４または抗体を含む他の適当なＲＳＶは、これらの断片の原料を提供す る。
それらの原料は、例えば、適当な蛋白分解酵素であるパパインおよび／またはペ プシンによるｍＡｂの切断のような慣用的方法により得られる。
これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ断片は、ヒトおよび他の動物のＲＳＶに関 す部鎖の配列、ＣＤＲおよび他の機能的断片の供与体としても有用である。
ＩＶ　対象となるＲＳＶ　Ｆａｂ蛋白エピトープ上記ｍＡｂは、ＲＳＶの天然に おける宿主により認識されるＲＳＶの融合（Ｆ）蛋白上のある種の防御的なエピ トープを認識する。Ｆ　ｍＲＮＡの核酸配列およびＦ蛋白（融合蛋白）の予想さ れる蛋白配列［配列番号：１９コは以前、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、プロ シーディングズ・オブ・す／ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニス ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓ＾）８１　：　７６ ８３−７６８７　（１９８４）にて報告されている。本明細書中のアミノ酸の番 号づけはこの後者の文献と同じである。発明者は、Ｆ蛋白の２６６番目ないし２ ７３番目の８個のアミノ酸［配列番号＝１９１を、中和抗体の検索についての適 切な標的として、ＲＳＶの治療剤に有用な抗原として、そして特に、ＲＳＶに対 するモノクローナル抗体住産用に同定した。対象とする他のエピトープは、中和 抗体Ｂ１３およびＢ１４により認識される４２９番目のアミノ酸周辺のエピトー プを含む。
本発明の中和的かつ融合阻害的で高度に防御的なウシおよびネズミ・ｍＡｂと反 応するＦ蛋白の領域［配列番号：１９Ｅを競合的結合分析により（実施例６）マ ツピングし；抗体中和エスケープ変異株を単離し配列決定（実施例７および８） し、そしてエスケープ変異株において変化したアミノ酸を含む配列を伴うペプチ ドの合成ならびにｍＡｂを用いたこれらのペプチドの反応性評価（実施例９ない し１１）を行った。
抗体エスケープ変異株のＦ蛋白の配列分析［配列番号：１９］は、非常に防御的 なｍＡｂの結合に重要なアミノ酸残基の同定を可能にする。同様に、合成ペプチ ドへの防御的なｍＡｂの結合に関する情報は、それらが認識するエピトープの位 置決定を可能にする。
簡単に記載すると、たいていのウシ・ｍＡｂはネズミ・ｍＡｂにより認識される のと同様なエピトープを認識し、防御的な抗体部位（部位８１図８の部位ＩＩ） が、天然のＲ５Ｖ宿生であるウシおよびネズミ・ｍＡｂ両方により！Ｉ！識され る。
防御的なウシ・ｍＡｂＢ１３およびＢ１４により認識されるエピトープ（複数で もよい）ネズミ・ｍＡｂにより認識されるいかなるエピトープとも同じでないと 思われる。Ｂ１３およびＢ１４は、Ｆ蛋白の４２９番目のアミノ酸の近傍の領域 に結合する。このエピトープは同様のものであるが、ネズミ・ｍＡｂ　Ｒ８Ｖ１ ９（ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１５５４号および実施例１１）によ り認識されるＦａｂとは異なる。例えば、ｍＡｂ　Ｂ１３／Ｂ１４は配列番号・ １つのＦ蛋白の４１７番目ないし４３８番目、４１７番目ないし４３２番目およ び４２２番目ないし４３８番目のアミノ酸範囲のペプチドすべてを認識しないが 、それらはｍＡｂ　Ｒ８Ｖ１９により認識される。中和的、防御的なネズミ・ｍ Ａｂ　Ｒ３Ｖ１９および２０により認識されるＦ蛋白上の２番目の抗原部位（図 ５および６のＣ領域、図８のＩＶ領領域は、Ｆ１サブユニットのカルボキン末端 方向に位置し、上記ＰＣＴ出願明細書中に記載されている。
Ｂ４により認識されるＲＳＶのエピトープは、配列番号：１９の２５５番目ない し２７５番目のアミノ酸範囲の配列におけるＲＳＶ　Ｆペプチドにより再生産さ れる。発明者はゲイセン　ベブスカン（Ｇｅｙｓｅｎ　ｐｅｐｓｃａｎ）法を用 いて、Ｂ４がＦ蛋白の２６６ないし２７３番目のアミノ酸範囲［配列番号・１９ 〕のエピトープを認識することを確認した。このＦ蛋白の機能的断片あるいはア ナログに向け）　られた改変抗体を、同じ抗体に関して増強された結合を誘導す るように設計してもよい。このエピトープに向けられたｍＡｂは、生体内ＲＳＶ 感染がらネズミおよび／またはウシを守ることが示された。
配列中の個々のアミノ酸の置換は、Ｂ４の増強された結合が変異株のエピトープ 上で起こるという発見を可能にした。２６６．２７９および２７３番目のアミノ 酸の変化はｍＡｂ　Ｂ４の結合に影響しなかった。２６７番目のアミノ酸の変化 はｍＡｂ　Ｂ４の結合を減少させた。２６８．２６９および２７２番目のアミノ 酸の変化は全体的な結合の減少を引き起こした。２７１番目のアミノ酸の置換は 、有意な結合の増強を引き起こした（実施例１０）。
）　これらの抗体のエピトープは上記のさらなる抗−Ｒ８Ｖ抗体の検索および開 発に有用である。これらのエピトープに関する知識は、当業者に、合成ペプチド を定義し、ＲＳＶに対するワクチンに適した天然のペプチドを同定し、ヒトまた は他の動物のＲ９Ｖ感染の処置や治療的および／または予防的に有用なｍＡｂを 製造することを可能ならしめる。
ＩＶ、対象とする抗−Ｒ３Ｖ核酸配列 本明細書記載のｍＡｂ　Ｂ４およびＢ１３／１４または他の抗−ＲＳＶのネズミ およびウシの抗体、可変部ＨおよびＬＭアミノ酸配列およびＣＤＲ，第１の融合 相手の開発に有用な機能的断片およびそのアナログ、キメラなものを含む本発明 による融合分子および結果として生じる融合蛋白ならびにヒト化抗体を与える。
本発明は、供与体抗体の抗原結合特異性により特徴づけられた抗−Ｒ８Ｖ抗体由 来の天然のあるいは合成の可変部り鎖および可変部Ｈ鎖配列を提供する。例示し た対象の核酸配列は、以下の実施例記載のようにｍＡｂ　Ｂ４、Ｂ１３およびＢ １４のＨおよびＬ鎖可変部の鎖配列を含む。この可変領域配列のデータに基づき 、Ｂ１３およびＢ１４が実質的に同一と考えられる。
天然の８１３／１４の可変部り鎮を、Ｂ１３／１４ＶＬと標記した図３Ａおよび ３Ｂのアミノ酸配列Ｃ配列番号・２］により特徴づける。天然の８１３／１４の 可変部Ｈ鎖を、Ｂ１３ＶＨと標記した図４Ａおよび４Ｂに示したアミノ酸配列［ 配列番号５４コにより特徴づけた。これらのＨおよびＬ鎮を実施例１８に記載す る。
Ｂ１３／１４に関しては上記のように、Ｂ４　ＶＬおよびＶＨ鎖のアミノ酸配列 をそれぞれ図４Ａおよび４Ｂ［配列番号・４］ならびに３Ａおよび３Ｂ［配列番 号　２コに示し、推定上のＣＤＲペプチドを箱で囲んだ。Ｂ１３／１４およびＢ ４のＶＨ鎖のいずれにおいてもＣＤＲ３ペプチドは異常に長く、それぞれ２５お よび２０個のアミノ酸を有している。これとは対照的に、ヒトおよびげっ歯動物 のＣＤＲ３は２０個以下のアミノ酸を有する。
可変部Ｈおよび／またはＬ鎖、ＣＤＲまたはその機能的断片をコードする核酸配 列を未修飾型で用いるか、あるいは所望の修飾を導入するために合成する。所望 によりこれらの配列が、例えば、適当な抗体のフレームワーク領域または上で定 義した第２の融合相手をコードする適当な核酸配列のような第２の融合相手への 挿入または連結を容易ならしめるための制限部位を有していてもよい。
遺伝暗号の縮重を考慮して、ＶＨおよびＶＨ鎖のアミノ酸配列、およびＣＤＲ配 列（例えば、図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂおよび１０ないし１３）ならびに供与体 抗体の抗原特異性を共有する機能的断片およびそのアナログをコードする種々の 暗号配列を構築できる。
かくして、これらの単離または合成された核酸配列あるいはその断片が第１の融 合相手であって、有効に第２の融合相手と結合された場合に、本発明の改変抗体 を含めた融合分子および発現した融合蛋白を生産するために利用できる。これら の核酸配列は、ＣＤＲあるいは構造を領域をコードする核酸配列の中で特異的変 化を起こさせる変異原の挿入に関して、そして修飾された核酸配列の発現ベクタ ーへの導入に関して有用である。
Ｖｌ、本発明の融合分子、融合蛋白および池の蛋白融合分子は、第１の融合相手 として、抗−Ｒ５Ｖ供与体ｍＡｂ由来の核酸配列、配列が天然のあるいは合成的 なＶＨまたはＶＬをコードしている断片あるいはアナログ、その機能的断片また はアナログを含んでいてもよい。第１の融合相手が有効に第２の融合相手に連結 された場合、生じる融合分子および発現された融合蛋白は、望ましい治療的ある いは予防的性質により特徴づけられる。
発現の際、融合分子は、改変抗体、キメラ抗体、ヒト化または部分的にヒト化し た抗体である融合蛋白を生成することができる。ＲＳＶの機能的断片またはアナ ログに向けられた改変抗体を、供与対抗体と比べて増強された結合を誘導するよ うに設計してもよい。
例示した融合分子は、ｍＡｂ　Ｂ４またはＢ１３／１４の抗原特異性を有するペ プチドまたは蛋白をコードする供与体ｍＡｂからの合成ＶＨおよび／またはＶＨ 鎖の核酸配列を含んでいてもよい。さらに別の望ましい融合分子は、少なくとも １つの、そして好ましくは、ウシ・ｍＡｂ　Ｂ４またはＢ１３／１４のＶＨおよ び／またはＶＬｉＪｌのＣＤＲのすべて、あるいはその機能的断片またはアナロ グを含んでいてもよい。第１の融合相手である抗−Ｒ３Ｖ配列が融合分子中で会 合している第２の融合相手は、上で詳しく定義しである。
第２の融合相手が、抗−Ｒ３Ｖ抗原特異性を有する核酸配列に対して異型である ペプチド、蛋白またはその断片をコードしている核酸配列である場合、生じる融 合分子は、抗−Ｒ８Ｖ抗原特異性および第２の融合相手の特徴を発現しうる。
典型的な第２の融合相手の特徴は、例えば、組換え宿主からの分泌のような機能 的特徴であるか、あるいは融合相手がそれ自身治療的な蛋白である場合の治療的 特徴であるか、または第２の融合相手がそれ自身の抗原特異性を有する場合のさ らなる抗原的特徴でありうる。
例えば第２の融合相手が、何等かのイソタイプまたはクラスの免疫グロブリン構 造あるいは不変部領域（好ましくはヒト）もしくはそれと類似のものに由来する 場合、発現により生じた本発明の融合分子は改変抗体を提供する。よって、発現 の際、改変抗体を生成する融合分子は、Ｈ鎮およびＬ鎖の全長もしくはその何等 かの断片、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’：ｈ断片、Ｌ鎖またはＨ鎖２量体、あるいは ＦＶまたは単鎖抗体（ＳＣＡ）または供与体ｍＡｂと同じ特異性を有する他の分 子のごときその何等かの最小限の断片を有している完全な抗体分子をコードする 核酸配列からなっていてもよい。
一例として、発現の際、改変抗体を生産する融合分子が、第２の融合相手に作動 可能に連結した、配列番号、１９の２６６番目ないし２７３番目のアミノ酸範囲 のＦ蛋白アミノ酸配列ＩＴＮＤＱＫＫＬおよびそのアナログに向けられた抗−Ｒ ８Ｖ抗体の抗原特異性を有するアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含んで いてもよい。そのエピトープは、例えば、２６６番目のアミノ酸がアラニン、ノ ステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒス チジン、ロイン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バ リン、トリプトファンおよびチロノンで置換された場合の配列番号；５６；また は２６９番目のアミノ酸がグルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロ イノン、メチオニン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファ ンおよびチロノンで置換された場合の配列番号　５７．あるいは２７１番目のア ミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイノン、ロ イノン、メチオニン、アリギニン、セリン、メチオニン、バリン、トリプトファ ン、チロノンおよびグルタミンで置換された場合の配列番号　５８もしくは２７ ３番目のアミノ酸がアラニン、ンステイン、アスパラギン酸およびグルタミン酸 で置換された場合の配列番号・５９のごと〈実施例にて同定されたエピトープを 含む。
望ましくは、その核酸配列の原料がｍＡｂ　Ｂ４である。
発現により、改変抗体を生成する融合分子が、図４Ａおよび４Ｂの可変部Ｈ鎖配 列をコードしている核酸配列およびその機能的断片またはアナログ、図３Ａおよ び３Ｂの可変部り鎖配およびその機能的断片またはアナログ、あるいは１つまた はそれ以上の８４　ＣＤＲペプチドを含んでいてもよい。
他の典型的な融合分子が、選択された第２の融合相手に機能的に連結した抗−Ｒ ３Ｖ抗体Ｂ１３／１４の抗原特異性を有するアミノ酸配列をコードしている核酸 配列を含んでいてもよい。例えば、その核酸配列が、図４Ａおよび図４８のＶＨ 鎖断片の配列［配列番号：４］およびその機能的断片またはアナログ、図３Ａお よび３ＢのＶＨ鎖の配列［配列番号：２］およびその機能的断片またはアナログ 、あるいは１つまたはそれ以上のＢ１３／１４　ＣＤＲペプチドをコードしてい てもよい。
融合分子の究理により得られる融合蛋白が改変抗体である場合、その抗体は、少 なくとも、１つまたはそれ以上の供与体モノクローナル抗体からの可変部りおよ び／またはＨ鎖の類似部分により置換された受容体ｍＡｂのＶＨおよび／または ＶＬ断片を含む。これらの改変抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）不変部分および 、例えば、受容体抗体のような１つの原料からの可変部フレームワーク、ならび に、例えば、本明細書記載の抗−Ｒ３Ｖ抗体のような供与抗体からの１つまたは それ以上のＣＤＲからなっていてもよい。
改変抗体を、供与対抗体の特異性に影響することなく可変部ドメインのアミノ酸 の置換によりさらに修飾してもよい。Ｈ鎖およびＬ鎖アミノ酸（例えば、その２ ５％程度）を、可変部ドメインまたはＣＤＲのいずれかあるいはその両方におい て、他のアミノ酸により置換してもよいことが予想される。かかる改変抗体はま た、供与体ｍＡｂ結合特異性を保持するために、受容体ｍＡｂのＶＨおよび／ま たはＶＬドメインフレームワークを含んでいても、含んでいな（てもよい。
そのうえ、これらの改変抗体はまた、供与体抗体の抗原結合特異性を保持するた めに、核酸またはアミノ酸レベルでの、例えば、欠失、置換あるいは付加のよう な、受容対抗体ｍＡｂのＶＬおよび／またはＶＨドメインフレームワークの最小 限の改変により特徴付けられてもよい。
選択された抗−Ｒ８ＶｍＡｂ　（所望により記載のごとく修飾）のＶＨまたはＶ Ｈ鎖の一方または両方、もしくは上で同定したＨおよび／またはＬ鎖ＣＤＲアミ ノ酸およびコードしている核酸配列の１つかそれ以上を用いるように、かかる改 変抗体を設計する。もう１つの例として、受容体ｍＡｂのＶＬ領領域コードして いる核酸配列の少なくとも一部、および、例えばウシ・ｍＡｂ　Ｂ１３／１４の ような選択された抗−Ｒ３Ｖ抗体のＶＨ鎮の３つのＣＤＲあるいはその機能的断 片をコードしている核酸配列の代わりに選択された抗−ＲＳＶ抗体のＶＬ鎮領領 域３つのＣＤＲあるいはその機能的断片、もしくは、ヒト・抗体のような受容体 ｍＡｂのＶＨ領領域コードしている核酸配列の少なくとも一部の代わりにその機 能的断片をコードしている合成核酸配列を有する融合分子の発現により、改変抗 体を生成させてもよい。
改変抗体を、配列番号　１９の２６６番ないし２７３番のアミノ酸範囲のＲ８Ｖ の特異的蛋白エピトープに向けることができる。このエピトープに向けられたモ ノクローナル抗体が、マウスおよび／またはウシを生体内のＲ８Ｖ感染から保護 することが示された。
第２の融合相手としての核酸配列を供給するための適当な受容体抗体は、例えば カバト（Ｋａｂａｔ）データベース、ロス・アラモス（Ｌｏｓ＾ｌａｍｏｓ）デ ータベースおよびスイス・プロティン（Ｓｗｉｓｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）データベ ースのような慣用的なデータベースから、供与体抗体の核酸およびアミノ酸配列 に対する相同性により選択されたヒト・　（または他の動物）抗体であってもよ い。望ましくは、その供与対抗体を、Ｉ　ｇＧ、またはＩ　ｇＧ２のようなヒト ＩｇＧ亜種より選択するものとするが、例えば、＋ｇｒＶ、ｑおよびＩｇＡのよ うな他の１ｇ形態も使用できる。例えば、供与対抗体のフレームワークに対する 相同性（アミノ酸基準）により特徴づけられるヒト・抗体は、供与体ＣＤＲの挿 入に関するＨ鎖不変部領域および／またはＨ鎖可変部フレームワークを供給する のに適しているかもしれなし・。Ｌ鎖不変部または可変部フレームワークを提供 できる適当な受容体抗体を、同様の方法で選択できる。受容対抗体のＨ鎖および Ｌ鎖は同一の受容体抗体に由来する必要がないということに注！を払うべきであ る。
受容対抗体は、必ずしも所望の融合分子に対するヒト・免疫グロブリン核酸配列 ならびに結果化じる融合蛋白のみに寄与する必要はない。例えば、ヒト・免疫グ ロブリン鎖の一部をコードしているＤＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターま たはリポータ−分子のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列と融合している 融合分子を構築してもよい。
同様に、ヒト・免疫グロブリンよりむしろウソまたは他の種の免疫グロブリンを 、例えば、ウシ化あるいは他種の改変抗体を調製するのに用いてもよい。
特に望ましい融合蛋白の一例はヒト化抗体である。本明細書中、「ヒト化抗体」 は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲ領域および／またはそ のＶＬおよび／またはＶＨドメインフレームワークの他の部分をいい、分子の残 りの免疫グロブリン由来の部分はヒト・免疫グロブリンに由来する。
適切には、これらのヒト化抗体において、抗−Ｒ８Ｖ抗体のＶＨおよび／または ＶＬ領領域らの１つまたは２つあるいは、好ましくは３つのＣＤＲが、選択され たヒトの抗体のフレームワーク中に挿入され、後者（ヒト）の抗体の本来のＣＤ Ｒと置き換わるものとする。しかしながら、ウソ・供与体抗体からの未修飾し鎮 をＬ鎖として用いることにより、ヒト・Ｈ鎮においてのみ、ＣＤＲを置換するこ とが可能である。別法として、両方に用いることのできるし鎖を上述のごと（ヒ ト供与体抗体から選択してもよい。キメラなＬ鎖も使用できる。改変抗体の残り の部分は、いかなる適切な受容体ヒト・免疫グロブリンからも由来する。
本発明によるかかる改変抗体は、ウシ・抗体の１つあるいはそれ以上のＣＤＲ領 域を挿入されたヒト・ＩｇＧのフレームワークを有するヒト化抗体を含む。かか るヒト化抗体は、ヒト・抗体のＨ鎖フレームワーク中に挿入され、ウシ・Ｌ鎖ま たはつ／／ヒト・キメラＩＪＪＩと会合したウシ・ｍＡｂのＶＨＣＤＲペプチド を含んでいてもよい。かかる典型的なヒト化抗体を実施例２０に記載する。別法 として、かかる改変抗体を所望のヒト・Ｌ鎖に会合させてもよい。同様に、キメ ラな抗体が、抗−ＲＳＶ抗体、好ましくは、つ／ｍＡｂ、Ｆａｂ領域と融合した ヒト・Ｈ鎖不変部領域（好ましくは、ＩｇＧ）を含んでいてもよい。典型的なキ メラ抗体を実施例１９に記載する。
好ましくは、改変抗体が、天然の抗体およびその断片を有し、供与体抗体により 提供される抗原性に応じて、動物またはヒトにおいて望ましい条件の効果的な予 防あるいは治療に必要な性質の組み合わせを有する。従って、好ましくは、改変 されたヒト化抗体が、天然のヒト抗体またはその断片の構造を有し、効果的な治 療用途に要求される特性の組み合わせを有する。かかる「ヒト化」抗体は、ヒト のＲ５Ｖｇ染についての適当な動物モデルにおけるＲ９Ｖ感染の予防および治療 において効果的であり、多くの種類のＲ３Ｖの臨床的分離体を認識する。上に引 用した性質により、ウシ・ｍＡｂ　Ｂ４、Ｂ１３およびＢ１４をコードしている 核酸は、ヒトにおいて最小限の免疫反応を誘導可能な本発明によるヒト化抗体を 発現により生じさせる融合分子の構築のために、望ましいＲＳＶエピトープに特 異的な供与体配列（第１の融合相手）を提供する。例えば、図４Ａ、４Ｂ、３Ａ 、３Ｂおよび１０ないし１３の可変部Ｈ鎖およびＬ鎮参照。
上で定義したキメラ抗体である融合蛋白は、両方の鎖に関するヒト・　（また１ ま、所望により他の異種の動物）ＩｇＧ不変不変域領域連したフレームワークを 含めた、非ヒト供与体抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の可変部領域全体を提供することによ り、ヒト化抗体とは異なる。本発明のヒト化抗体と比較して、さらなる非ヒト配 列を保存しているキメラ抗体は、ヒトにおいていくつかの望ましい免疫反応を誘 導しうることが予想される。
好ましい改変抗体は、呼吸器合胞体ウィルス（Ｒ３Ｖ）に向けられるものであり 、好ましくはＲ３Ｖの融合蛋白に特異的なものである。特に好ましいこの種の抗 体は、それぞれ、そのＬおよびＨ鎖において、図３Ａ、３Ｂ、４Ａおよび４Ｂに 記載の８４あるいはＢ　１３／１４の可変部ドメインのアミノ酸配列の全部また は一部を有している。図１０〜１３は「ヒト化」抗体中での使用に適した予想ア ミノ酸領域を示し、上記図面の簡単な説明に記載されている。そのうえ、本発明 の改変抗体を、上述の図において同定した１つまたはそれ以上のＣＤＲペプチド により特徴づけてもよい。
一例として、改変抗体が、少なくとも受容体ｍＡｂのＶＬｕ域の一部の代わりに 図１１のＶＬ鎖領領域たはその機能的断片を、および、少なくともヒト・抗体の ような受容体抗体のＶＨ領領域一部の代わりに図１０のＶＨ鎖領領域たはその機 能的断片を含んでいてもよい。結果生じるヒト化抗体は、ｍＡｂ　Ｂ４の抗原結 合特異性により特徴づけられる。
さらに別の好ましい改変抗体が、図１３のＶＬ鎖領領域たは受容体ｍＡｂのＶＬ 領領域少なくとも一部の代わりにその機能的断片を、そして図１２Ａおよび図１ ２８のＶＨ鎮領領域たはそ受容体ｍＡｂのＶＨ領領域少なくとも一部の代わりに その機能的断片を含んでいてもよい。かくして、ｍＡｂ　Ｂ１３／１４の抗原結 合特異性により、改変抗体を特徴づける。
別法として、以下の配列： ５ＹＳＶＳ　（配列番号・３のアミノ酸３ｌ−３５）；ＤＡＳＮＧＧＩ　ＩＹＹ ＮＰＰＡＬＫＳ　（配列番号：３のアミノ酸５Ｏ−６５）Ｃ３ＶＧＤＳＧＳＹＡ ＣＴＸａａＧＸａａＲＫＧＥＹＶＤＡ　Ｃ式中、Ｘａａは何等かのアミノ酸また はアミノ酸かないことを示す］　（配列番号・３のアミノ酸１００−１２２）： ５ＧＳＳ　（ＳまたはＤ＞ＮＩＧ（ＲまたはＩ）（ＷまたはＦ）（Ｇ又はＡ）Ｖ （ＮまたはＧ）（配列番号・１のアミノ酸２２−３４）；ＹＥＳＳＲＰＳ　（配 列番号：１のアミノ酸５Ｏ−５６）；ＡＴＧＤＹＮＩＡ　（配列番号：１のアミ ノ酸８９−９６）；ＡＴＧＤＹＮＴＡＶ（、配列番号、１のアミノ酸８９−９７ ）；を含む８４　ＣＤＲペプチドまたは以下の配列ＧＮＴＫＲＰＳ　（配列番号 　２のアミノ酸５Ｏ−５６）；Ｖ　ＣＧ　Ｅ　Ｓ　Ｋ　Ｓ　Ａ　Ｔ　Ｐ　Ｖ　（ 配列番号　２のアミノ酸８９−９９）；ＤＨＮＶＧ　（配列番号・４のアミノ酸 ３ｌ−３５）　。
ＶＩＹＫＥＧＤＫＤＹＮＰＡＬＫＳ　（配列番号　４のアミノ酸５Ｏ−６５）； ＬＧＣＹＰＶＥＧＶＧＹＤＣＴＹＧＬＱＨＴＴＦＸａａＤＡ　［式中、Ｘａａは 何等かのアミノ酸を示すコ　（配列番号：４のアミノ酸９８−１２２）、を含む Ｂ　１３／１４のような可変部配列の機能的断片を、図の長い方の可変部領域配 列の代わりに用いてもよい。
かかる改変抗体は、動物およびヒトにおける呼吸器合胞体ウィルス（Ｒ３Ｖ）感 染の予防および治療に効果的でありうる。
本発明の治療的、診断的あるいは医薬的蛋白のもう１つの種類を、上に述べたエ フェクター試薬に会合した第１の融合相手によりコードされている蛋白またはペ プチドにより提供する。
かかる蛋白の一例は、非蛋白担体分子に関連した本発明の抗−Ｒ３Ｖアミノ酸配 列配提供する。もう１つの例は、リポータ−分子が結合している本発明の望まし い抗−Ｒ３Ｖ配列を含む。そのうえ、上記の融合蛋白の全体がエフェクター試薬 に会合していてもよい。
組換えＤＮＡ工学的方法を用いて、完全な抗−Ｒ３Ｖ抗体分子のＦｃ断片または ＣＨ３ドメインが酵素または毒性分子で置換された本発明蛋白を生産してもよい 。
本発明蛋白のもう１つの例は、本発明の抗−Ｒ３Ｖアミノ酸配列配含み、大赤血 球とともに、重金属原子またはリシンのような毒素をキレートし、共有結合によ りこれらを結合させる蛋白である。
一般的に、融合分子における抗−Ｒ３Ｖ抗体の核酸配列と第２の融合相手との間 の融合または連結、あるいは第１の融合相手によりコードされたペプチドとエフ ェクター試薬との会合を、適当な慣用的方法により行ってもよい。かかる慣用的 方法は、慣用的な共有結合またはイオン結合、蛋白融合、あるいは例えばカルボ ッイミド、グルタルアルデヒドおよびそれらに類する試薬のような架橋剤を包含 していてもよい。非蛋白性のエフェクター試薬の会合には、慣用的な化学的連結 試薬を用いて抗−Ｒ３Ｖアミノ酸配列配融合あるいは連結させてもよい。
さらに、融合分子中で第１の融合相手および第２の融合相手との間に所望の大き さの空間を簡単に提供する慣用的な内部リンカ−配列を、分子中に構築してもよ い。かかるリンカ−の設計はよく知られている。かかる手法および生成物はよく 知られており、慣用的な化学および生化学の教科書に普通に記載されている。
Ｖｌｌ　融合蛋白および改変抗体の生成好ましくは、遺伝子工学的方法を用いた ＤＮＡ工学により、本発明の融合蛋白および改変抗体を調製する。例えば、キメ ラあるいはヒト化抗体、Ｌ鎖およびＨ鎖、ＣＤＲおよびそれらをコードしている 核酸配列の合成のような前記の本発明の他の具体例を実現するために、同様の手 法を用いてもよい。
簡単に記載すると、例えば、ウソ・ｍＡｂ　Ｂ４のごとき抗−Ｒ３Ｖ抗体を生産 するハイブリドーマを、慣用的方法でクローン化し、そのＨ鎖およびＬ鎖可変部 領域のｃＤＮＡを、例えばサムプルツク（Ｓａ国ｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー ・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｌｌａｎｕａｌ）　）第２版、コール ド・スプリング・ハーバ−・ライブラリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌｉｂｒａｒｙ）の記載のような、当業者に知られた方法で得る。ｍＡｂ Ｂ４の可変部領域を、ＰＣＲププライマーおよび例えば他の抗体との比較のため にカバト（Ｋａｂａｔ）のような既知のコンピューター・データベースを用いて 同定されたＣＤＲを用いて得る。
ヒト・抗体由来のＨ鎖可変部領域の相同的なフレームワークを、例えばカバトの ような同じデータベースを用いて同定し、抗−Ｒ３Ｖ供与体抗体に対して相同性 のあるヒト（または他の所望の動物）の抗体を受容体抗体として選択する。ヒト ・抗体フレームワーク中にＣＤＲを含む合成ＶＨ領領域配列を、制限部位に関す るフレームワークにおける所望の核酸置換を記すことで定義する。次いで、この プロットされた配列を１ｉ複遺伝子を用いて合成し、ポリメラーゼ鎮反応（ＰＣ Ｒ）により増幅し、エラーを修正する。適切なし鎖可変部フレームワークを同様 の方法で設計してもよいし、あるいは供与体または受容体抗体から選択してもよ い。上述のように、Ｌ鎖の起源は本発明を限定する要因ではない。
これらの合成ＶＬおよび／またはＶＨ鎖配列および抗−ＲＳ　ＶｍＡ　ｂのＣＤ Ｒならびにそれらがコードしている核酸配列を、以下の方法に従い、融合蛋白お よび改変抗体、好ましくは、ヒト化抗体の構築に用いる。慣用的方法により、非 ヒト・供与対抗体をコードしているＤＮＡ配列（例えばＢ４、Ｂ１３／１４）を 得る。かかる供与対抗体において、少なくともＣＤＲおよび供与体ｍＡｂ結合特 異性を保持するのに必要なそれらの受容対抗体のＬ鎖および／またはＨ鎖可変部 ドメインフレームワークの最小限の部分だけでなく、抗体鎖の免疫グロブリン由 来の部分を保持している部分をヒト・免疫グロブリンから誘導する。
宿主細胞において、複製およびその発現を制御する能力のある慣用的な調節配列 に作動可能に関連した位置にこれらの配列を置くことにより、最初の慣用的な発 現ベクターを調製する。同様に、非ヒト・免疫グロブリンから可変部ドメインの 少なくともＣＤＲが誘導される相補的抗体のＬ鎖またはＨ鎖をコードしているＤ ＮＡ配列を有する２番目の発現ベクターを調製する。好ましくはこの２番目の発 現ベクターが、コードしている配列を除いて最初の発現ベクターと同じものであ り、できるかぎりポリペプチド鎖が等しく発現されるように選択マーカーを関連 づける。別法として、本発明の単一ベクターを利用してもよく、該ベクターはＬ 鎖およびＨ鎖双方に由来するポリペプチドをコードしている配列を含む。ＬｔＪ ｌおよびＨ鎖に関してコードしている配列中のＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノム ＤＮＡ、あるいはその両方からなっていてもよい。
選択された宿主細胞を、最初および２番目のベクターを用いた慣用的な手法で同 時形質転換し、組換え型あるいは合成されたＩ、鎖およびＨ＠からなる本発明の 形質転換された宿主細胞を造成する。次いで、形質転換細胞を慣用的な手法で培 養し、本発明の改変あるいはヒト化抗体を調製する。組換えＨＩＭおよび／また はＬ鎖双方の会合を含むヒト化抗体を、ＥＬＩ　ＳＡ法のような適当な方法によ り培養物から検索する。同様の慣用的方法を用いて本発明の他の融合分子を構築 してもよい。
よって、本発明はまた、融合分子を包含し、発現に際して本発明の改変抗体を産 生ずる組換えプラスミドを包含する。かかるベクターを慣用的手法で調製し、適 当には、適切なプロモーターを作動可能に連結した改変抗体をコードしている上 記ＤＮＡ配列からなるものとする。本発明は、Ｆ蛋白の２６６−２７３のエピト ープに対して生産されたｍＡｂをコードしている配列を含む組換えプラスミドを 包含する。
該方法に用いるクローニングおよびサブクローニングならびに本発明の組成物の ｉ築に適したベクターが当業者により選択されてもよい。例えば、アマンヤム（ Ａｍｅｒｓｈａｍ）社（英国パッキンガムン＋　−（Ｂａｃｋｉｎｇｈａｍｓｈ ｉｒｅ）　）またはファルマンア（Ｐｈａｒのａｃｉａ）社（スウェーデン国つ プサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）　）のような業者から入手可能な慣用的なｐＵＣンリ ーズのクローニングベクターを用いてもよい。
そのうえ、よく複製できるベクターはいずれも制限部位およびマーカー遺伝子が 豊富で、クローニング操作に容易に利用できる。よりて、クローニングベクター の選択は本発明を限定する要因ではない。
同様に、本発明により改変抗体の発現に用いられるベクターが、当業者により、 いかなる慣用的なベクターから選択されてもよい。発現ベクターはまた、免疫グ ロブリン領域の配列をコードしており、しかも例えばＣＭＶプロモーターのごと き、選択された宿主細胞中の異種ＤＮＡ配列を複製し発現できるＤＮＡに作動可 能に関連している選択された調節配列を含んでいてもよい。別法として、操作の 簡単のために、所望の制限部位を挿入することにより修飾した選択された免疫グ ロブリン配列をベクターに組み込んでもよい。
発現ベクターを、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ ）またはネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ’）のような異種ＤＮＡ配列の発現を 増幅するのに適したマーカー遺伝子によって特徴づけてもよい。他の好ましいベ クターは、ウソ・成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロブリンプロモーター 配列（ｂｅｔａｇｌｕｐｒｏ）からのポリＡシグナル配列を含む。本発明で有用 な発現ベクターを、当業者によく知られた手法により合成してもよい。
例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロモーターおよびそれらに類 する、選択した宿主中で組換えＤＮＡを発現させるための構成要素を天然からあ るいは既知の合成法により得てもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母およびカビ の発現の分野で知られた様々なタイプのかかる他の適当な発現ベクターを本目的 のために選択してもよい。
慣用的手法により、かかるベクターを哺乳動物細胞または他の適した細胞系にト ランスフェクションさせる。本発明はまた、これらの記載された組換えプラスミ ドにより形質転換された細胞系を包含する。好ましくは、改変抗体または改変分 子を発現させるために用いる宿主細胞は真核細胞であり、最も好ましくは、ＣＨ ○細胞または骨髄幹細胞のような哺乳動物細胞である。例えば、分子をヒト型糖 鎖で修飾することができるヒト細胞を含め、他の霊長類の細胞を宿主細胞として 用いてもよい。適切な哺乳動物の宿主細胞および形質転換のための方法、培養、 増幅、検索および生成物の生産ならびに精製が当該技術分野において知られてい る。上記サムプルツクらの文献参照。
細菌細胞が、本発明の組換え型ｍＡｂの発現に適切な細胞であると証明されつる 。しかしながら、細菌細胞中で発現された蛋白が、折り畳み構造を有していなか ったりあるいは不適切な折り畳み構造を有していたりする傾向があるため、細菌 細胞中で生産されたいかなる組換え型のｍＡｂについても抗原結合能力について 検索する必要があろう。例えば、大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス、他の枯草 菌およびそれらに類する細菌を本性に用いることができる。
所望により、当業者に知られた酵母細胞株を宿主細胞として用いることができる のみならず、昆虫細胞およびウィルスの発現系を用いることもできる。ミラー（ Ｍｉｌｌｅｒ）ら、ジェネティノク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　８２７７−２９８、ブレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｒｅｓｓ）参照。引用文献をここに一体化させる。
本発明のベクターを構築する一般的方法、本発明の宿主細胞を造成するために必 要な形質転換法、およびかかる宿主細胞から本発明の融合蛋白あるいは改変抗体 を生産するのに必要な培養方法はすべて慣用的である。同様に、本発明の融合蛋 白または改変蛋白が一旦生成すれば、硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカ ラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびそれらに頌する方法を含 む当該分野の標準的方法で、細胞培養物から精製してもよい。かかる手法は当該 技術分野の範囲内であり、本発明を限定するものではない。
しかし、ヒト化抗体の他の発現方法はトランスジェニック動物中での発現を用い ることができる。例えば、本発明のヒト化抗体の発現方法は、例えば米国特許第 ４．８７３．３１６号のようにメスのトランスジェニック動物の乳における発現 によるものであってもよい。この文献をここに一体化させる。例えば、本発明の ヒト化抗体に関するＤ　Ｎ　Ａ配列を、乳−特異的蛋白プロモーターあるいは哺 乳動物組織において所望の蛋白を分泌（および必要ならば成熟）させるシグナル ベブチドをコードしているＤＮＡ配列により哺乳動物組織中で特異的に活性化さ れるいかなるプロモーター配列に対する発現系に機能的に連結させてもよい。適 当なプロモーターおよびノグナルベブチドは当業者により容易に選択されうる。
例えば受精した哺乳動物の卵の前核中へのマイクロインジェクション法のような 標準的な遺伝子導入法を用いて、発現系を宿主ゲノム中に導入する。ビー・ホー ガン（Ｂ、　Ｈｏｇａｎ）ら「マニビュレーティング・ザ・マウス・エンブリオ ；ア・ラボラトリ−争マニュアルＪ　（”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｈｅ　 Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”）　、： ’−ルド・スプリング１ハーバ−・ラボラトリ−（Ｑ）ｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８６）　：アール・エル・プリンス ター（Ｒ，Ｌ、　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ）ら、セル（Ｃｅｉｌ）　、２７　：　２２ ３−２３１　（１９９１）参照。
結果として、構築したベクターあるいは発現系の１つまたはそれ以上のコピーを トランスジェニック補乳動物のゲノムに組み込む。発現系の存在は、哺乳動物種 のメスの乳中に組換え型のヒト化抗体を生成および分泌させる。この系は、本発 明のヒト化抗体を高レベルで生産する。
この後者の発現方法は特に、つ／・ＣＤＲを含むヒト化抗体に適しており、特に ウシのみならずヒト幼児へのこの抗体の経口投与に適している。他の遺伝子導入 系も使用できる。
所望の方法で発現を行った場合、次いで、適当な分析を用いて改変抗体を生体内 活性につき試験する。ただちに、慣用的な酵素連結免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ） 法を用いて、Ｒ３Ｖエピトープに対する改変抗体の定量的および定性的結合を評 価する（実施例３参ｌｌ？り。通常の排泄系の存在にもかかわらず、体内での抗 体の維持を評価するためにされるヒトの治療実験に先立ち、他の分析の効率を証 明するために用いてもよい。
下記の実施例１１は、例えばＰＣＴ関連出願明細書（ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１５ ５４）記載のＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫおよびＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／Ｈｕ Ｒ３Ｖ１９ＶＫのごときネズミのモノクローナル抗体Ｒ３Ｖ１９由来の改変ヒト 化抗体を構築する方法を示す。ネズミ・Ｒ３Ｖ１９から調製したヒト化抗体につ いて記載した手順に従って、当業者は、本明細書記載のウシの抗体、可変部領域 配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することができる（実施例１９ および２０参ｌ１ｌｌＩ）。改変抗体の受容体により潜在的に「自己」と認識さ れる可変部傾城フレームワークとともに改変抗体が生産される。可変部領域構造 の小規模な修飾は、受容体に対するかなり増加した変異原性なしに、抗原結合を 大幅に増加させる効果を付与される。かかる改変抗体は感染を予防し根絶しつる 。本明細書記載の抗体Ｂ４、Ｂ１３およびＢ１４はががるヒト化抗体について特 に興味深い。かかる抗体は、ヒトのＲ３Ｖ感染に対してヒトを治療的あるいは予 防的に処置するのに有用である。かかる抗体は診断試薬としても有用である。
Ｖｌｌ、本発明の治療的／予防的使用 本発明は、本明細書記載の１つかそれ以上のｍＡｂまたはその断片あるいは本明 細書記載の改変抗体もしくは別の融合蛋白を含むヒトのＲ３Ｖ感染を処置するの に有効な抗体を、処置を必要とするヒトに投与することからなるヒトにおけるヒ トのＲ９Ｖ感染に対する治療的あるいは予防的処置方法に関する。本発明はまた 、本明細書記載の１つかそれ以上のｍＡｂまたはその断片あるいは本明細書記載 の改変抗体もしくは別の融合蛋白を含むウシまたは他の種のＲ３Ｖ感染を処置す るのに有効な抗体を、処置を必要とするウシまたは他の動物に投与することから なるヒトのＲ３Ｖ惑染に対する治療的あるいは予防的処置方法に関する。
本発明の融合蛋白、抗体改変抗体あるいはその断片もまた、他の抗体、特に、本 発明の改変抗体が指向する疾病に対して反応性のある他のマーカー（エピトープ ）と反応するヒトのモノクロナール抗体と併せて用いてもよい。同様に、本発明 の抗体が指向する選択された動物における疾病に対して反応性のある他のマーカ ー（エピトープ）と反応するモノクローナル抗体を獣医学上の医薬組成物に用い てもよい。
本明細書記載の融合蛋白またはその断片を、化学療法剤または免疫抑制剤と併せ て与えられる単独処方される組成物として用いてもよい。かがる組み合わせの例 である、実施例１１記載（７）ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫ あるいは同様に改変されたＢ４、Ｂ１３またはＢ１４抗体を、抗ウイルス剤リバ ビリンと併せて与え、ヒトにおけるＲ３Ｖ感染の処置を容易にしてもよい。
本発明の１つの医薬組成物は、免疫毒、すなわち２成分により特徴づけられ、生 体内または生体外において選択された細胞を殺すのに有用な分子における本発明 の抗体の使用からなる。１つの成分は、細胞に付着あるいは吸着した場合、通常 、細胞を死に至らしめる細胞毒性試薬である。２番目の成分は、「運搬担体（ｄ ｅｌｉｖｅｒｙ　ｖｅｈｉｃｌｅ）として知られ、癌腫からなるような特殊な細 胞形態に対する毒性試薬を供給する。その２成分は、通常よく知られた種々の化 学的方法のいずれかにより化学的に結合している。例えば、細胞毒性試薬が蛋白 で、２番目の成分が無処理の免疫グロブリンである場合、例えば、カルボジイミ ド、グルタルアルデヒドおよびそれらに類する試薬のような異種二官能基架橋剤 によりその連結を行う。種々の免疫毒は当該分野ではよ（知られている。
種々の細胞毒試薬が免疫毒として適しており、他の種類のもの、すなわち放射性 原子核、メトトレキサートのような化学療法剤、リボゾーム阻害蛋白（例リシン ）のような蛋白を含んでいてもよい。
免疫毒の運搬成分は、本発明の１つまたはそれ以上のヒト化免疫グロブリンある いはウシ・免疫グロブリンを含んでいてもよい。好ましくは、無処理の免疫グロ ブリンあるいはＦａｂのようなその結合断片を用いる。典型的には、免疫毒中の 抗体はヒト司ｇＭまたはＩｇＧのイソタイプとし、所望であれば他の哺乳動物の 不変部領域を用いてもよい。
本発明の治療薬の投与形態は、宿主に薬剤を運搬するいかなる適当な経路であっ てもよい。本発明の融合蛋白、抗体、改変抗体およびその断片ならびに本発明の 医薬組成物は特に非経口投与、すなわち皮下注射、筋肉注射または静脈注射に有 用である。非経口投与用の組成物は、通常本発明の改変抗体の溶液または許容さ れる担体、好ましくは水性担体に溶解したそのカクテルからなるものとする。水 性担体の種類は、水、緩衝化された水、０．４％食塩水、０．３％グリシンおよ びそれに類するものでよい。これらの溶液を滅菌し、微粒子を含まないものにす る。
これらの溶液を慣用的な、よく知られた滅菌手法で滅菌する。該組成物は、例え ばｐＨＩ節および緩衝剤その他の生理学的条件により、必要ならば医薬上許容さ れる添加物を含んでいてもよい。かかる医薬処方における本発明の抗体の濃度は 広い範囲で変化させてよく、約０５重量％未満、通常約１重量％または少なくと も１重量％ないし１５または２０重量％までであり、主に液体の体積、粘度その 他にまたは選択した特殊な投与形態に基づいて選択する。
かくして、筋肉注射用の本発明の医薬組成物を調製し、１ｍＬの滅菌水を加え、 本発明の５０ｍｇの改変抗体を加える。同様に、静脈注射用の本発明の医薬組成 物を調製し、２５０ｍＬのリンゲル液を加え、本発明の１５０ｍｇの改変抗体を 加える。非経口的に投与できる組成物の実際の調製法は、当業者によく知られて いるかまたは明らかであり、例えば、レミントンの薬品化学１５版、ベンンルバ ニア州イーストンのマソク出版社、（Ｒｅ＋ｃｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍ ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ。
１５ｔｈ　ｅｄ、　、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａ ｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）に、より詳しく記■ されている。
効果的にヒトまたは他の動物におけるＲＳＶ感染を予防するには、本発明の方法 の分子または抗体を１回の投与につき約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇとして 非経口投与、好ましくは静脈注射または筋肉注射するか、あるいはかかる抗体を １回の投与につき約２０μｇ／ｋｇとして鼻腔的投与する。Ｒ３Ｖの季節のはじ め（１０月〜１１月）からＲ３Ｖの季節の終わり（３月〜４月）まで、かかる投 与を６週間毎に繰り返す。別法として、Ｒ３Ｖの季節のはじめに、本発明の抗体 を１回につき約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇを静脈注射または筋肉注射す るか、あるいはかかる抗体を１回の投与につき約Ｑ、５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ ／ｋｇを鼻腔的投与する。必要であれば、Ｒ３Ｖ感染が消滅するまで適当間隔を おいてかかる投与を繰り返す。
効果的にヒトまたは他の動物におけるＲ３Ｖ感染を予防するには、本発明抗体の １回の用量約２ｍｇ／ｋｇないし約２０ｍｇ／ｋｇを非経口的、好ましくは、静 脈注射又は筋肉注射により投与するか、または約２００μｇ／ｋｇないし約２ｍ ｇｋｇを鼻腔的投与する。必要ならば、Ｒ３Ｖ感染が根絶されるまでかかる投与 を適当間隔をおいて繰り返す。
例えば、実施例１６において、気管を通してつ／を感染から守る場合に、必要な り４投与量は３００μｇ／ｋｇ体重であった。これは、気管を通して受動免疫さ れたコツトンラット（Ｃｏｔｔｏｎ−ｒａｔｓ）およびオウルモンキー（ｏｗｌ 　ｍｏｎｋｅｙ）におけるＲ３〜ｒ感染［ヘミングおよびプリンス（ｔｌｅｍｍ ｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒ１ｎｃｅ）、レビューズ。
オブ・インフェクシャス・ディンーズ（Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｏ ｉｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、１２・５４７０−４７５　（１９９０）コを減少 させるのに必要としたＲ３Ｖ中和抗体の高い力価を含むヒトＩｇＧ量より３００ ないし１０００倍少ない量である。
静脈注射と比較して、局所経路により投与した場合、ウィルス流出を減少させる のに要する抗体量は約１０倍少ないことが示されている［プリンス（Ｐｒｉｎｃ ｅ）およびヘミング（Ｈｅｍｍｉｎｇ）、（１９９０）］。それゆえ、ウシＲ８ Ｖの流出を有意に減少させるには３ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ　Ｂ４を静脈注射するこ とが必要であると推定される。この量はネズミをＲ５Ｖ感染から防御するのに必 要なネズミまたは「ヒト化」抗体と同程度である［テンペスト（７ｅｍｐｅｓｔ ）ら、（１９９１）］。
本発明の組成物を吸入により投与してもよい。「吸入」は鼻腔内および経口投与 を意味する。かかる投与に適した処方形態は、例えばエアロゾルまたは計量器付 き吸入器によるものであり、慣用的手法により調製できる。例えば、吸入投与用 の組成物をＴＡ製するには、１５〜２０ｍ１の容量のエアロゾルコンテナーを用 いる＋ｌＱｍＨの本発明の抗体を０２〜０．２にのポリソルベート８５またはオ レイン酸のごとき潤滑剤と石合し、プロペラミキサー中、フレオン、好ましくは １．２−ジクロロテトラフルオロエタンおよびジフルオロクロロメタンの混合物 中で中で分散させ、鼻腔内または経口投与用のエアロゾルコンテナーに充填する 。
さらなる例として、吸入投与の組成物に関しては１５〜２０ｍ１の容量のエアロ ゾルコンテナーを用いる　１０ｍｇの本発明の抗体をエタノール（６〜８ｍ１） に溶解し、０．１〜０，２％のポリソルベート８５またはオレイン酸のごとき潤 滑剤と混合し、プロペラミキサー中、フレオン、好ましくは１．２−ジクロロテ トラフルオロエタンおよびジフルオロクロロメタンの混合物中で中で分散させ、 鼻腔内または経口投与用のエアロゾルコンテナーに充填する。
本発明の抗体、改変抗体またはその断片を保存のために凍結乾燥し、使用の前に 適当な担体中に再構成できる。この手法は、免疫グロブリンに効果的であること が示されている。当該分野で知られた凍結乾燥および再構成を用いることができ る。
意図した結果に応じて、本発明の医薬組成物を、予防的および／または治療的処 置のために投与できる。治療的に適用する場合、疾病を治療するかまたは部分的 に疾病の進行を停止させ合併症をくい止めるに十分な量を、すでに疾病にかかっ ている患者に投与する。予防的に適用する場合、本発明の抗体を含む組成物また はそのカクテルを、まだ疾病段階でない患者に抵抗力を増強させるために投与す る。医薬組成物の単一または複数回投与を、治療医により選択された投与レベル および形態で行うことができる。投与毎に、本発明の医薬組成物が、患者を有効 に治療するに充分量の本発明の改変抗体を提供する。
本発明の融合蛋白、抗体、可変部間列ＣＤＲペプチドおよびエピトープを、抗体 と同じ治療に有用であろうところのペプチドあるいは非ペプチド化合物（模倣物 ）のいずれかの設計および合成に用いることができることにも注意を払うべきで ある。例えばサラゴビ（Ｓａｒａｇｏｖｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 　、２５３　：　７９２−７９５　（１，９９１）参照。
天然のＲ３Ｖ感染もウシ、ヤギ、ヒツジおよびチンパンジーにおいて報告されて いる。したがって、例えば、上記の方法論を用いて、適当なネズミ抗体を「つ／ 化」でき、必要ならば適当なフレームワーク残基を改変し、特異的結合親和性を 回復させることができる。一旦適当なマウスの抗体が造成されれは、当業者は、 慣用的な処方計量法を用いて、選択した動物のＲ３Ｖ感染を効果的に治療し、予 防的あるいは治療的に処置するのに必要な処方レベルおよび処方せんを、容易に 決定できる。
以下の実施例は本発明の種々の態様を説明するもので、本発明の範囲を限定する ように構成されたものではない。特に断らない限り、すべてのアミノ酸は慣用的 な３文字法、１文字法またはフル・ネームで示される。特に断らない限り、全て の必要な制限酵素、プラスミド、および他の試薬ならびに材料は商業的に入手し た。すべての一般的なりローニング連結および他の組換えＤＮＡ手法は「モレキ ュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ。
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”）　（１９８２）　エム・マニアテ ィス（Ｍ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｒａｔｏｒｙ）出版、 コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨークまたはその第２版（１９８９Ｌ サムプルツク編（同一人らによる出版）参照。
以下の実施例は、適当なベクターおよび宿主細胞中での典型的な改変抗体および その発現を示す。
実施例１−モノクローナル抗体の調製 １から１４までのネズミ・モノクローナル抗体は、上で引用したティラー（Ｔａ ｙｌｏｒ）ら（１９８４）により記載されており、ここに一体化させる。これら の抗体のい（っかは、ＢＡＬＢ／ｃマウスをウシ・Ｒ３Ｖ１２７株で免疫化して 調製された。ウシーＲ３Ｖ１２７株は、コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）にて１９ ７３年に呼吸疾病のウシから単離された。これらの抗体の他のものは、ヒト・Ｒ ＳＶのロング（Ｌｏｎｇ）株で継続的に感染させた細胞で生産させたものである ［フェルニー（Ｆｅｒｎｉｅ）らブロシーデインダス・オブ・ソサイエティー・ フォー・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディシン（Ｐｒｏｃ、 　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄｉａ、　）１６７　：　８３−８６ 　（１９８１）］。１６から２１までのネズミ・モノクローナル抗体は、２度鼻 腔内注入されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスがら調製された。鼻腔的注入は、 Ｈｅｐ−２細胞中で増殖したｌＸ１０’ｐｆｕのヒト−Ｒ８Ｖ　Ａ２株を３週間 の間隔で行った。ヒト・ＲＳＶ　Ａ２株の亜種Ａはオーストラリアの小児から分 離された［ルイス（Ｌｅｖｉｓ）らメディ・ジャーナル・オーストラリア（Ｍｅ ｄ。
Ｊ、Ａｕ５ｔｒ、）　。４８　：　９３２−９３３　（１９６１）コ。４力月の 間隔の後、２×１０’ｐ　ｆ　ｕのウシ・１２７株をマウスに腹腔内注射した。
３日後に追加接種し、牌臓細胞をＮ５−１骨髄腫細胞［アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクシジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ）　Ｔ　Ｉ　Ｂ１８株コと融合させた。生じたハイブリドーマ を、放射線免疫検定法および免疫蛍光法によりＲＳＶに対する抗体について検索 し、軟寒天上で２回クローン化し、クローン化細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに接種 し、上で引用したティラーらの記載に従い腹水を生じさせた。
Ｂ１からＢ６のウシ・モノクローナル抗体を、ケネディ−（Ｉｅｎｎｅｄｙ）ら 、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウィロロジ−（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、） ６９：３０２３　３０３２　（１９８８）の記載に従い調製した。この文献をこ こに一体化させる。同時にＢ７ないしＢＩＯ１Ｂ１３およびＢ１４のウシ・ｍＡ ｂを、同じウシから得たリンパ球から調製したが、リンパ球を液体窒素中に保存 し、後日ＮＳＩ細胞と融合させた。生じたヘテロハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ 法でＲＳＶにつ／抗体について検索し、同時にまた融合阻害分析を行った［基本 的には上で引用のケネディーら（１９８８）の記載による）が、マイクロタイタ ー・プレートは用いなかった。ＲＳＶに対するウシ・ｍＡｂを分泌するクローン 化したヘテロハイブリドーマ細胞を、プリスタンープライムド（Ｐｒｊｓｔａｎ −Ｐｒｉｃｅｄ）ヌードＢＡＬＢ／Ｃ７ウスに接種し、腹水を生じさせるか、あ るいは無血清ＤＣＣＭ−１培地［英国グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）のバイオロ ジカル・インダストリーズ・リミテッド（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔ ｒｉｅｓ　Ｌｔｄ）社製］で増殖させた。プロティンＧ　セファ０−ス４　ファ ストフロー〔ファルマノア　エル・ケー・ビー（ＰａｈｒＩＩａｃｉａ　ＬＫＢ ）社製］を用いて、細胞培養上清から抗体を精製した。結合した抗体を０．ＩＭ グリ／ン、ｐＨ７，２−’ｔ’溶出し、ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，０ ）で中和し、りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。
ロンク下蛋白に対して生成した抗体ＡＫ１３Ａ２はベルギー国マルロイエ（Ｍａ ｒｌｏｉｅ）のセントル・ド・エコノミー・ルラレ（Ｃｅｎｔｒｅ　ｄ’Ｅｃｏ ｎｏｍｉｅ　Ｒｕｒａｌｅ）のピー・コッペ（Ｐ、　Ｃｏｐｐｅ）博士から譲渡 された。ｍＡｂ　ＩＢＣＩＩ（ネガティブ対照抗体）、４７Ｆおよび４９Ｆはガ ルノアーバレノ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ）ら、ジャーナル・ライｏｏ／ −（Ｊ、１ｌｉｒｏ１．）　、６３　：　９２５　９３２　（１９８９）に記載 されている。ｍＡｂ　７Ｃ２は、上で引用のトウルーデル（Ｔｒｕｄｅｌ）ら、 （１９８７）の文献に記載されている。抗体４７Ｆ、ＡＫ１３Ａ２および４９Ｆ は、プロティン、ヘーセファロース　りロマトグラフイーを用いて腹水から精製 し、ペルオキシダーゼで標識した［上で引用のガルンアーバレノ（１９８９）］ 。
ｍＡｂ　ＩＢＣｌｌ、４７Ｆ、４９ＦＳＡＫ１３Ａ２および７Ｃ２を除イテ、本 明細書記載のすべてのネズミおよびウシ・ｍＡｂｔらびそれらを生成するハイブ リドーマ細胞系は、英国バークツヤ−州ニア−・ニューベリーのコンプトンＲＧ １６ＯＮＮ番地のゲラルデイシ・ティラー（Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ　Ｔａｙｌｏｒ ）博士の研究室、イノステイチュート・フォー・アニマルヘルス、コツプトン・ ラボラド１ノー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　：＾ｎｉｍａｌ　ｌ１ｅａｌ　 ｔｈ、　ＣｏｏＩｐｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏｍｐｔｏｎ、　mｅ ａｒ　Ｎｅｗｂｕｒｙ。
Ｂｅｒｋｓ、　ＲＧ１６ＯＮＮ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手できる。
実施例２−モノクロナール抗体の特徴づけケ不ディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、ジ ャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロノー、６９　：　３０２３−３０３２　 （１９８８）　記載ノ方法ｔ：より！Ｈした（”５）−１チオニンまたは（３Ｈ ）−グルコサミンで標識したＲＳＶ感染細胞溶解物の放射免疫沈降により、Ｆ蛋 白ウイルスピボリベブチドに対するｍＡｂの特異性を決定した。タケタ（Ｔａｋ ｅｔａ）ら、エレクトロフォレンス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　、６ 　：４９２−４９７　（１９８５）記載の方法により、還元または非還元の標識 されたＲＳＶ感染細胞溶解物のウェスタン・プロット（免疫プロット）により特 異性を決定した。免疫沈降で使用した抗原は、ヒト・ＲＳＶ　Ａ２株に感染した Ｈｅｐ−２細胞またはウシ・Ｒ５Ｖ１２７株に感染したウシ腎臓（ＣＫ）細胞の いずれかである。感染していないＨｅｐ−２またはＣＫ細胞を対照抗原として用 いた。
ｍＡｂ　Ｂｌ、Ｂ４、Ｂ５［上で引用のケネディーらの文献参照］およびｍＡｂ 　Ｒ３Ｖ１９、Ｂ１３ならびにＢ１４が、フチオスレイトール中で薫沸変性させ たＦ蛋白と反応した。ｍＡｂ　Ｂｌ、Ｂ４およびＢ５は、ウェスタン・プロット においおて変性Ｆ蛋白の４６におよび２２に断片を認識し、ｍＡｂ　ＲＳＶＩ９ 、Ｂ１３およびＢ１４のみが４６に断片を認識した。ｍＡｂ　１６ないし１８． ２０および２１、Ｒ３Ｖ１９、Ｂ７ないしＢＩＯ，Ｂ１３およびＢ１４の性質は 以前記載がなく、以下の記載の分析について下表１に示す。これらの分析におけ る他のすべてのｍＡｂの性質を図５および図６にまとめる。
ｍＡｂの多核巨細泡生成阻害能をＲＳＶ　Ａ２株［上で引用のケネディーらの文 献参照、この文献をここに一体化させる］感染２４時間後のＭＡ１０４細胞［ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、メリーランド州ロックビルコにおいて 測定した。本分析結果を表１の「融合阻害」欄および図５ならびに図６中ｒＦＩ ｊとして示す。「＋」はｍ、八すが多核用細胞生成を阻害したことを示す。
４種のイ、ズミ−ｍＡｂ（１１，１３、Ｒ３Ｖ１９および２０）および４種のウ シ・ｍＡｂ　（Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３およびＢ１４）は多核用細胞生成を阻害した 。
ｍＡｂのＲ３Ｖ中和能を、上記ケネディーらの記載に従いプラーク減少中和試験 にて測定した。この分析結果を表１の「中和力価」の欄および図５および図６中 「中和」として示す。図中「−」は中和が起こらなかったことを；「十」は抗体 の中和が起こったことを示す。７種のネズミ・ｍＡｂおよび１２種のウシ・ｍＡ ｂ（１’）うちの４種（すなわちＢ４、Ｂ５、Ｂ１３およびＢ１４）がＲＳＶを 中和した。
ｍＡｂ（７）Ｒ３Ｖ感染に対する防御能を、以下のようにＢＡＬＢ／ｃマウスに おいおて試験した。ｍＡｂを含む１００μｌの腹水を５匹のマウスに腹腔内注射 した。１日後、マウスに１０’ｐｆｕのＡ２　ＲＳＶ株を鼻腔内投与した。感染 ５日月、マウスをと殺し、ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、インフェクンヨン・ア ンド・イムニティ−（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）　４３　：　６４９−６５ ５　（１９８４）記載の方法に従い、肺を２代目のＣＫ単層上でＲＳＶについて 分析した。
この分析結果も表１の「マウスの保護」欄および図５および図６の「防御」欄に 示す。図中「−」はｍＡｂが免疫されたマウスをＲＳＶがら守らながったことを 示す。「＋」またはｒ＋十＋」はそれぞれｍＡｂが動物をＲＳＶがら守った種度 が小さいまたは大きいことをしめす。融合阻害分析において有効であった８種の ｍＡｂ（すなわちネズミ・ｍＡｂｌｌ、１３、Ｒ２Ｍ１７および２０、ならびに つ／・ｍＡｂＢ４、Ｂ５、Ｂ１３およびＢ１４）は、腹腔内注射の後２４時間後 鼻腔投与した場合、内ＢＡＬＢ／ｃマウスのＲ３Ｖ感染予防において非常に効果 的であった。
ネズミ・ｍＡｂ　９および１０［ティラーら（１９８４））およびウシ・ｍＡｂ 　Ｂ１３を除くウシ・ＲＳＶに特異的なすべての抗体は、ヒト・ＲＳＶ　Ａ２お よＵヒトＢ亜ｉ　（８／６０）株［英国サリスベリーのコモン・コールド・ユニ ット社製（Ｃｏａ＋ｍｏｎ　Ｃｏ１ｄ　Ｕｎｉｔ、５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　Ｅｎ ｇｌａｎｄ）］　（両方ともＨｅｐ−２細胞中で増殖）ならびにつ／Ｒ８ｖ株［ 上記ティラーら（１９８４）；ケネディーら］と反応した。これらの結果は、非 常に防御的かつ融合阻害性のｍＡｂにより認識されるエピトープはＲ５Ｎｒ株間 において非常に保存的であることを示す。
表１ ＲＳＶのＦ蛋白に対するｍＡｂの性質 ■＾ｂｒｇクラスＥＬＩＳＡ力価（１０ｇ＋ｏ）中和力価１融合阻害釦溶解２マ ウスの保護３＾２　８／６０　ＢＲ５Ｖ １６　Ｇｌ　６．８　６．６　６．８　２．０　−　０　０．６１７　Ｇ２ｂ　 ６．１　６．３　６．１　＜１．０　−　５９　１）、６１８　Ｇ２ａ　７．０ 　６．８　６．２　３．４　−　４３　１．６Ｒ５Ｖ１９Ｇ２ａ　６．４　６． ７　６．７　３．４　＋　’２　＞３．８２０　Ｇ２ａ＞６．０　８．６　７． ５　４．３　＋　７６　＞３．８２１　Ｇ２ａ　８．９　７．４　６．８　＜１ ．０　−　６８　１．０８７　Ｇｌ　３．０　４．９　４．９　＜１．０　−　 ６　０Ｂ８　ｃｌ　＜２．０　＜２．０　４、Ｏ＜１．０　−　８　０．２８９ 　Ｇｔ　５．１　５．４　４．９　＜１．０　−　２　０．４ＢＩＯＧｌ　５． １　５．４　６．０　＜１．０　−　９　０．５８１３Ｇ１　６．０５．１５． ４　５．８　＋　０　２．２Ｂ１４　Ｇｌ　５．６　５．２　５．６　５．４　 ＋　Ｏ＞２．２’　ｌｏｇｔｏで表した５０％プラーク減少力価２　ｍＡｂおよ びウサギ補体を１００倍希釈したことによる特異的流出パーセント値 ３　対照動物と比較した受動免疫されたマウスの肺におけるＲ３Ｖ力価の減少の ’Ｏｇｒｏ値 実施例３−酵素連結免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡにて試験すべきＲ３ Ｖ抗体を別個にＨｅｐ−２細胞から、感染３〜４日後に調製した。細胞を培地か ら掻き取り、５００ｇで５分間遠心分離し、蒸留水に再懸濁し、０．５％（ｗ／ ｖ）　Ｎ　Ｐ　４０界面活性剤で処理し、細胞溶解物を得た。同様に、感染して いないＨｅｐ−２細胞を用いて対照抗原を調製した。
ＥＬＩＳＡを以下のようにして行った：マイクロタイター・プレートをＲＳＶま たは対照抗原で覆い、蒸留水で希釈し、３７℃で一晩インキユベートし、ＰＢＳ および０５０５％ツイン２０中５％の通常ブタ血清からなる阻止緩衝液とともに １時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ／ツインで５回洗浄した。連続的にｍＡ ｂの３倍希釈液をウェルに加え、室温で１１時間インキュベートした。ｐｂｓ／ ツインで５回洗浄した後、１：４０００に希釈したＨＲＰ結合ウサギ・抗−ウ／ ｒｇＧ（ジグ７　（Ｓｉｇｍａ）社製）または１　：　２０００に希釈したＨＲ Ｐ結合ヤギ・抗−マウスｒｇＧ（米国メリーランド州のＫｐ１社製）を各ウェル に加えた。
最後の洗浄の後、基［３，３’、　５．５“−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ 、イリノイ州のアイ・ノー・エヌ・イムノバイオロジカルズ（ＩＣＮ、　Ｉｍｍ ｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）社製）にて結合複合体を検出した。
実施例４−Ｆ糖蛋白の精製およトリプノン処理Ｆ蛋白をロング株［ウォルノユ（ ｆａｌｓｈ）ら、シャーンナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジ−（Ｊ、Ｇｅｎ 、Ｖｉｒｏｌ、）　６６　：　４０９４１５　（１９８５）　；および上で引用 したガル／アームレノら（１９８９）の文献参照］に感染したＨｅｐ−２細胞か ら免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製蛋白の数個の部 分種本（各１５μｍ）を２μｇ、４μｇ、８μｇまたは１６μｇのトリブ／ンと ともに４時間３７℃でインキュベートし、消化させた。電気泳動標本緩衝液［ス トラブイア−（Ｓｔｕｄｉｅｒ）　、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ ミノ−（Ｊ、１１ｏ１．Ｂｉｏｌ、）　、７９　：　２３７−２４８　（１９７ ２）　］を加えることにより消化反応を停止し、３分間試料を煮沸した。５ＤＳ −ＰＡＧＥで試料を分離した。試料を電気泳動的にインモビロン（Ｉｍｗｏｂｉ ｌｏｎ）膜に移した。
実施例５−Ｆ蛋白上のエピトープ 下記実施例７において変異ウィルスの選択に用いる抗体ＡＫ１３Ａ２．４７Ｆ１ ７Ｃ２、Ｒ２Ｍ１７．２０およびＢ４により認識されるエピトープの位置を決定 する最初のＰｊ階として、精ＩＦ蛋白のトリプノン断片へのｍＡｂの結合をウェ スタン・プロット「トウビン（丁０冒ｂｉｎ）　呟プロノーディンゲス・オブ・ す／ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ’　１＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾）７６　：　４３５０−４３５４　（ １９７６）］により試験した。蛋白断片をクマン・ブルー染色するかまたは抗体 ＡＫ１３Ａ２または１９とともに現像した。
トリブ／ン量を増加させていくと、クマン・ブルーで染色されるＦ１サブユニッ トの小さい方の断片が生じた。３０．２０．５．１９および１５にの４ちにＦ１ 断片はＡＫ１３Ａ２によりｔＫｍされた。２０５および１９に断片は、Ｆ１サブ ユニットのＮＨ，末端において以前マツピングされている［ロベス（Ｌｏｐｅｚ ）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイｏｏジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ ｏＬ、　）　６４　：　９２７−９３０　（１９９０）］。抗体Ｂ４．４７Ｆお よび７Ｃ２はＡＫＩ３Ａ２と同じように、同一の断片のセントを認識した。か（ して、これらのｍＡｂにより認識されるエピトープは、Ｆ１サブユニットのＮＨ ，末端の１／３中に含まれるアミノ酸配列による可能性がある。
対照的に尺５Ｖ１９はＦ１断片の異なるセットと反応した。少量のトリプシンに より生じた大きなサイズの断片（２６および２２Ｋ）はＲ２Ｍ１７と反応した（ ｍＡｂ　２０は断片の同じセットとあまり効率良く反応しなかった）。したがっ て、エピトープ１９および２０は、抗体Ｂ４により認識される断片に覆われた領 域の外側のＦｌサブユニット（図２）のＮＨ２末端２／３中に存在することが実 験的に分かっているトリプ／ン感受性のアミノ酸配列を有している。トリブノン 処理後の収率が低いため、２６および２２に断片のＮＨ２末端の終端を直接蛋白 配列決定によっては決定できなかった。
図２のダイヤグラムは疎水領域を示しているＦ糖蛋白１次構造、蛋白切断部位、 可能性のあるＮ−グリコル−ノヨン部位、ノステイン残基および中和エスケープ 変異株中置換されたアミノ酸残基（下表３Ａ−３Ｃ参照）を示す。異なるｍＡｂ により認識されるトリプノン断片の位置を下表２に示す。
ｍＡｂ　Ｂ１３およびＢ１４により認識されるＦ蛋白上の領域を大＋１１１菌中 で発現したＦ蛋白断片への結合を調べることにより同定した。配列番号・１９の 組換えＣ蛋白（ｒ　Ｃ，Ｆ３７７−５２．）および配列番号　１９の組換えＤ蛋 白（ｒＤ、Ｆ３Ｈ−ｓｓｏ）を実施例３に示すようにＥＬＩＳＡにおける抗原と して用いた。Ｆ蛋白のこれらのペプチド配列をインフルエンザの非構造的蛋白１ 　（ＮＳ−１）のアミノ末端のアミノ酸１−８１を含むインフルエンザの非構造 的蛋白断片と融合させ、は発現用プラスミド中に挿入し、大腸菌で発現させた。
これらの融合蛋白の生産は慣用的な方法を含む。Ｂ４ではなく、ｍＡｂ　Ｂ１３ 、Ｂ１４およびＲ８ＶＩ９がこれらの蛋白断片と結合した。下表２はＥＬＩＳＡ における組換えＦ蛋白への抗−Ｆ　ｍＡｂの結合を示す。これらの知見はＢ１３ およびＢ１４により認識されたＦ蛋白の領域がＲ３Ｖ１９により認識された領域 と類似であり、その領域はＦ１サブユニットのカルボキン末端の１／３中にある ことを示唆する。
表２ ｍＡｂ　ｒＣｒＤ　ＲＳＶ Ｂ１３　５．７＊　＞３．０　５．６ ８１４　６．２　＞３．０　５．６ Ｒ５Ｖ１９　５．３　＞３．０　７．４Ｂ４　＜１．５　＜１．５　５．９ ＊抗原としてｒＣを２μｇ／ウェルおよびｒＤを１Ｍｇ／ウェルとした場合のＥ ＬＩＳＡによる力価のＩＯｇｔｏ値 実施例６−Ｆ蛋白における抗原領域の同定１６種のネズミおよび１２種のつ／・ ｍＡｂのエピトープ特異性を、精製し標識したｍＡｂを用いて競合結合分析した 。要約すれば、これらの競合結合分析はＦ　蛋白上の１２個の抗原部位を同定し 、それらは広範囲にわたって重複していた。３つのエピトープ部位が中和ｍＡｂ および例えばＢ４、Ｂ５、Ｂ１３およびＢ１４のような非常に防御的なＦＩｍＡ ｂにより認識された。これらの知見は、ネズミ・ｍＡｂを用いた中和に含まれる Ｆ蛋白上の３つの抗原部位を同定した他のｍＡｂと同様であり、それらのうち２ つはＦｌ活性を有していた［ウオルンユ（Ｗａｌｓｈ）ら、ジャーナル・オブ・ ンエネラル・ウイロロノー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　）６８　：　５０ ５−５１３　（１９８６）およびピーラ−（Ｂｅｅｌｅｒ）ら、ジャーナル・オ ブ・／エネラル・ウイロｏジー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）　６３　：　２９ ４１−２９５０　（１９８９）］。これらの知見は、例えばウィルス吸着に対す る立体障害のごとく、細胞壁によるウィルス融合の阻害とは別の機構により、ウ ィルスの中和が起こり得ることを示唆する。
Ａ、ｍＡｂの精製および標識 ネズミまたはランのいずれかのｍＡｂを含む腹水からのＩｇＧを、プロティンＡ −セファ０−ス（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−３ｅｏｈａｒｏｓｅ）またはプロティン Ｇ−セファロース・ファスト・フｏ−（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ−Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ ｗ）　［ファルマンアＬＫＢ社］により精製した。腹水を同体積の０．１Ｍりん 酸緩衝ｌｅ！、（＋）Ｈ８）と混合し、同緩衝液とともに蛋白Ａ−セファロース カラムに通した。結合した抗体をＯ，１Ｍクエン酸緩衝１１ｔ（ｐＨ６，０から ３．５）で溶出した。低いｐＨの緩衝液で溶出したフラクシヨンをＬＭ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，０）中に集めた。組織培養上清からのＩｇＧを蛋白Ｇ− セファロース・ファスト・フローにより精製し、０．１Ｍグリシンで上記のごと く溶出した。精製したＩｇＧをＰＢＳに対して透析し、クロラミンＴを用いて＋ ０１にて標識するかまたはビオチンに結合させた。
Ｂ　競合結合分析 放射免疫分析におけるＲ５Ｖ抗原に結合する最大量の９０％において約１０゜０ ００ｃｐｍを与えるように決定された１２８１−標識またはビオチン化したｍＡ ｂの希釈物を、Ｆ蛋白に対する種々の非標識ｍＡｂ量を増加させなからＲ９Ｖ抗 原と反応させた。ｍＡｂ　Ｂ１３およびＢ１４に関しては、Ｒ３Ｖ感染細胞溶解 物はの最大結合量の９０％を与えるように決定したビオチン化ｍＡｂの希釈物に 対し、非標識抗体量を増加させなからＲＳＶ抗原と結合させた。核蛋白に対する 非標識ｍＡｂを対照として用いた。
この分析結果を図５および図６に示す。い（つかのｍＡｂは用量に伴って結合を 阻害した。しかしながら他のｍＡｂは、試験抗体の結合を阻害しなかった。Ｒ８ ＶのＮ蛋白に対する標識していないｍＡｂはＦ蛋白へのいかなるｍＡｂの結合も 阻害しなかった。これらの実験は、抗原への自発的結合に競合するｍＡｂの群を 同定した。競合するｍＡｂにより認識されるエピトープは、Ｆ蛋白の同じ抗原的 領域中に機能的に存在すると考えられる。ｍＡｂ競合特性は広範囲にわたって重 複していた（図５および図６）。
それゆえ、エピトープのクラスター化を部分的類似に基づいて行い、ロイコサイ ト・タイピング・データベースＩＶ　（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　ｔｙｐｉｎｇ　ｄ ａｔａｂａｓｅ　ＩＶ）　［ギルクス（Ｇｉｌｋｓ）、ｒロイコサイト・タイピ ング・データベースＩＶＪ　（”　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｔｙｐｉｎｇ　ｄａｔａ ｂａｓｅ　ＩＶ”）オソクフォード大学出版（１９９０）コを用いて分析した。
これらの研究は、１６種のネズミ・ｍＡｂがＦ蛋白上の７個の抗原部位［配列番 号・１９コ　（図６）を認識することを示した。ｍＡｂ　２および５は、はとん どすべての他のネズミ・ｍＡｂと競合した。２種の非常に防御的なｍＡｂ　１１ および１３は同一のエピトープ（部位Ｂ）を認識するように思われたが、一方、 非常に防御的な２種の他のｍＡｂ　Ｒ３Ｖ１９および２０は互いに類似であるが ｍＡｂ　１１および１３とは異なっており、部位Ｃにマツピングされた。
１２種のｍＡｂの大部分がネズミ・ｍＡｂと同じ部位にマツピングされた（図５ および６）。ネズミ−ｍＡｂ　２および５は４種のラン−ｍＡｂ（Ｂ２、Ｂ３、 Ｂ４およびＢ６）とのみ競合した。ネズミ・ｍＡｂとの競合実験で部位Ｇにマツ ピングされた中和的なネズミ・ｍＡｂ　１４は、ウソ・ｍＡｂ　Ｂ２、Ｂ３およ び白６と同様の競合特性を示し、それゆえ、グループＨ（図５）に位置した。ウ ソ・ｍＡｂ　ＢｌおよびＢ７の結合は、いかなるネズミ・ｍＡｂによっても阻害 されず、実際、Ｂ７は異なったエピトープを認識するように思われた。２種の非 常に防御的なウソ・ｍＡｂ　Ｂ＝４およびＢ５により認識されるエピトープは互 いに類似であり、２種の非常に防御的なネズミ・ｍＡｂ　１１および１３に類似 していた。マウスにおいて部分的に防御的なｍＡｂ　１８、および防御的でない Ｂ〕Ｏもこの領域（部位Ｂ）にマツピングされた。
防御的なｍＡｂＢ　１３およびＢ１４の結合は、防御的なネズミ・ｍＡｂ　Ｒ３ Ｖ１９および２０ならびに防御的なｍＡｂ　Ｂ４およびＢ５により種々の程度に まで阻害された。しかしながら、ｍＡｂ　Ｂ１３およびＢ１４の競合特性は部位 ＢおよびＣにマノピッグされる抗体とは異なっており、それらはＦ蛋白の異なっ た部位を認識していることを示唆した。
ネズミ・ｍＡｂおよびウソ・ｍＡｂは合わせて１２個の抗原領域を認激し、それ らの大部分が広範囲にわたって重複していた。非常に防御的であり、融合阻害的 （Ｆｌ）であり、中和的なｍＡｂは、２個またはおそらく３個の部位（図５中領 域ＢＳＣおよびＬ）にマツピングされた。ウィルスを中和するがＦｌ活性を持た ないｍＡｂは３つの部位（領域ＢＳＤおよびＨ）にマツピングされただ。しかし ながら、中和的でもなくＦｌ活性も持たないｍＡｂもこれらの部位にマツピング されただ。
実施例７−抗体エスケープ変異株 抗体エスケープ変異株の反応性のパターンは、競合結合分析から推定される防御 的エピトープのマツピングを確実にした。要約すると、Ｆ　１次構造の２つの領 域は、中和的なｍＡｂにより認識されるエピトープが位置している場所を同定し た。最初の領域はトリプシン耐性のＦ１サブユニットのアミノ末端側１／３中に ７＝、ピングされた。この領域は、ｍＡｂ　４７Ｆ、４９Ｆ１７Ｃ２、ＡＫ１３ Ａ２．１１およびＢ４により認識される重複したエピトープを含み、抗原領域エ エ（図８）および領域Ｂ（図５および７）を含んでいた。抗原領域エエおびＢは 同一である。これらの抗体で選択された変異株中に見い出された大部分のアミノ 酸の変化は配列番号、１９のアミノｌ！ｌ！２６２−２７２の周囲に集約されて いた。これらの抗体はウェスタン・プロットにおいてＦ１サブユニットの蛋白分 解断片と反応するため、それらが連続したアミノ酸配列により決定される「直線 的」エピトープを認識すると本来的に考えられた。
しかしながら、ある種のエピトープの構成にはある種のコンフォーメーノヨンが 必要であると考えられる。なぜならば、それらのうちのいくつがだけが、合成ペ プチド、およびある種の抗体の結合に影響される離れた部位にあるアミノ酸置換 により再生産されるからである。例えば、ｍＡｂ　ＡＫ１３Ａ２に対する抵抗性 を与える変異株４／４におけるアミノ酸２１６における置換（アスパラギン酸か らアスパラギン）もまた抗体７Ｃ２およびＢ４との反応性を除去する（２７２番 目の選択されたアミノ酸の変化によっても抵抗性が与えられる）。２１６番目の 変化は２５５−２７５番目のペプチドから離れており、エピトープＢ４を忠実に 再生産する。結果的に、Ｆ１サブユニットにエピトープＢ４により付加されるｖ Ｒａ中の２１６番目のアミノ酸の幾分長い範囲の効果が生じると推定される。
図５および６のｍＡｂの競合特性が広範囲にわたり重なり合うが、防御的なｍＡ ｂｌｌ、１３、Ｂ４およびＢ５は同じ領域（図５および７の部位Ｂ５図８の部位 ＴＩ）にマツピングされ、これらの抗体に抵抗性のある変異株は、部位Ｂを認識 するそれらの抗体とのみ結合しなかった。ｍＡｂ　７Ｃ２および４７Ｆもこの部 位にマンピングされた。部位Ｂ（部位ＩＩ）にマンピングされる抗体によりＲ３ Ｖ抗原へのｍＡｂ　Ｒ３Ｍ１９および２０の結合が阻害されているが、逆に、ク ラスター分析は、それらが異なる部位（部位Ｃ）を認識することを示唆した。こ のことは、ｍＡｂ　ＲＳＶ１９および２０に対する抵抗性により選択された変異 株が、なおｍＡｂ認識部位Ｂと反応するという知見により示された。同様に、Ｒ ３ＶへのｍＡｂ　Ｂ１３および１４の結合が部位Ｂ　（ＩＩ）および部位Ｃにマ ツピングされるｍＡｂにより阻害された。しかしながら、Ｂ１３およびＢ１４は 異なる部位（部位Ｌ）にマツピングされると、巴われ、このことは、Ｂ１３およ びＢ１４が、部位Ｂ　（ＩＩ）およびＣにマツピングされているｍＡｂにより選 択されたすべての変異株に結合するという知見により確認された。
エスケープ変異株を選択するために用いたｍＡｂによるＲ８Ｖの中和が理論化さ れ、Ｆ糖蛋白の膜融合を阻害するそれらの能力と関係づけられている［上で引用 のガルノアーバレノ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ）ら（１９８９）の文献、 上で引用したティラーら（１９８４）の文献参１１５１゜他のバラミクソウィル ス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕＳ）との類似性［例えばモリラン（Ｍｏｒｒｉｓ ｏｎ）　、ウィルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５）、１０　：１１３−１３ ６　（１９８８）］をもとに、ＲＳＶの融合活性はＦ蛋白前駆体のプロセノノン グに依存すると仮定される。この修飾はＦ１サブユニットの新しいＮ　Ｈ２末端 終点を生じ、短い疎水的ペプチドを通して脂質膜と相互作用すると考えられる。
ここで同定されたＦ糖蛋白の抗原領域は、直線的なマツプにおいて融合ペプチド から離れて位置していた：しかしながら、Ｆ蛋白の他の領域が融合ペプチドの活 性に影響してζする可能性がある。この点で、インフルエンザ・ウィルスの赤血 球ａ集素の融合の原因となる活性が変化した変異株［ダニエルス（Ｄａｎｉｅｌ ｓ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　、４０　：　４３１−４３９　（１９８５）］はＨ Ａ２サブユニットの融合ペプチドの外側にンマッピングされた。
エスケープ変異株を以下のように開発し、評価した。野生型および中和エスケー プ変異株ウィルスをＨｅｐ−２細胞中で増殖させ、前記のごとく培養上清から精 製した［ガル／アーバレノ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ）ら、ウィルス・リ サーチ（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、）　、９　：　３０７　３２２　（１９８８）コ 。ヒトＲ５ＶのロングおよびＡ２株を使用前にプラーク精製し、ｍＡｂ　４７Ｆ １ＡＫ１３Ａ２．７Ｃ２，１１、Ｂ４、Ｂ５．１９または２０および本明細書記 載のＦ［蛋白に対する他のｍＡｂにより中和耐性となったウィルスを選択した。
これらを異なる２つの方法で選択した 、へ　Ａ２株エスケープ変異株 非常に防御的なｍＡｂ　１１．Ｂ４、Ｂ５、ＲＳＶ１９および２０のうちの１株 により中和耐性となっているＲ５Ｖ　Ａ２株の抗体エスケープ変異株をプラーク 減少法を用いて作成した。Ｒ３Ｖ２Ｏ、Ｂ４およびＢ５については初代ＣＫ細胞 の集密的細胞単層を、感染多重度０２においてＡ２株で感染させた。感染を始め て２４時間後および、さらに３ないし５日間続けて培養物を毎日１０％ｍＡｂを 含む新鮮培地と交換した。細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）が明らかとなった時点でウ ィルスを収穫した。
このようにして調製されたウィルスを同体積の試験下のｍＡｂと室温で１時間混 合し、ついで、３５ｍｍ径マルチーウェル・プレート［ヌンク（Ｎｕｎｃ）社］ 中のＣＫ単層上に接種した。３７℃で１時間インキユベー７ヨンした後、同じｍ Ａｂを１ないし１０倍希釈となるように含む０．２５％アガロース含有培地をプ レートに重層した。プレートを５％ＣＯ２含有空気中、３７℃で７日間インキュ ベーションした後、０．１５Ｍ　ＮａＣ１中０．３％　３−　（４，５−ツメチ ルチアジンル−２）−２，５−ンフェニルテトラゾリウムブロミドを含む生体染 色液を重層し、ウィルスのプラークを可視化した。
単一プラークを含むと推定される寒天プレートから推定されるプラークを取り、 培地で希釈し、同体積のｍＡｂと混合し、ついで上記のごと＜ＣＫ培地上に接種 した。変異ウィルスはプラークを生じ、再びそれを拾い上げ、ウソ・精巣細胞ま たはＨｅ　ｐ〜２細胞の短冊培養物の入った試験管中に接種する。４ないし６日 インキュベー７ヨンした後、カバーグラスを取り出し、試験下のｍＡｂとともに 染色し、次いで、ＦＩＴＣ−標識ウサギ・抗−１マウスＩｇＧｒシグマ（Ｓｉｇ ｍａ）社コまたはＦＩＴＣ−標識ウサギ・抗−ウ／ＩｇＧ［シグマ社」と結合さ せた。ＦＩＴＣ−標識ウサギ・抗−ウソＩｇＧに続く試験の前に、Ｒ３Ｖに対す るポリクローナルなウソ抗体を陽性の対象として用いた。試験においてｍＡｂに 対する免疫蛍光法にて反応しないＲ３Ｖを、変異株と分類し、上記実施例３記載 のＥＬＩＳＡ用の抗原を生成するために用いた。
ｍＡｂ　１１に耐性のある変異ウィルスを、基本的には上記のごとく選択したが 、１０％ｍＡｂを上清中に含む細胞中のウィルスの先行培養を行わなかった。
ｍＡｂ　１１の存在下、プラーク形成ｉ＆ＲｓＶ　Ａ２株から５種の変異ウィル スを個々に単離した。Ｒ２Ｍ１７の存在下での培養後８種の変異株を個々に単離 し、ｍＡｂ　２０の存在下での培ｌｌ後３種の変異株を、Ｂ５の存在下での培養 後６種の変異株を、Ｂ４の存在下での培養後１０種の変異株を単離した。
クローニング後、個々のエスケープ変異株を実施例３記載のＥＬ［ＳＡにおける 抗原として用い、一連の抗−ＦｍＡｂとの反応性につき試験した（図７および８ ）。
ｍＡｂ　１１に対する抵抗性について選択した変異ウィルスはｍＡｂ　１１のみ ならずｍ、Ａｂ　１３、Ｂ４およびＢ５に結合する能力を失っており、親株Ｒ３ 〜′の４へ２株と比較した場合、ｍＡｂ　７Ｃ２への結合も弱かった（図７）。
Ｂ４またはＢ５に対する結合能について選択したすべての変異ウィルスは、Ｂ４ またはＢ５いずれかのみならず１１および１３への結合能を失っていた。しかし ながら、Ｂ４に関して選択したいくつかの変異株（例えばＣ４９４７１５）は、 なおり５と結合したが、４へ２株と比較すると結合レベルが大幅に減少していた 。
ｍＡｂ　１１に対する抵抗性について選択した変異株に見られるように、い（つ かのＢ４およびＢ５変異株は７Ｃ２への結合を減じていることを示したが、一方 では、池の変異株（例えはＣ４９４７１５）は７Ｃ２と反応しなかった。ｍＡｂ 　１１に関して選択した変異株とは対照的に、Ｂ４またはＢ５に関して選択した い（つかの変異株（例えばＣ４９４７１５，６１１９，６１１６，６３２７およ びＣ５０１４／７）はなおｍＡｂ　１８と反応した。Ｂ４およびＢ５変異株は、 親のＡ２株と比較した場合、ｍＡｂ、ＢＩＯに対する結合は、同じかまたは弱い あるいは無いかのいずれかであった。
ｍＡｂ　Ｒ３Ｍ１９または２０に関して選択したすべての変異ウィルスはｍＡｂ 　Ｒ３Ｍ１９および２０のみと反応しなかった（図７）。図５に示したｍＡｂＢ １３および１４（図７）ならびに図５で示したすべての他のｍＡｂのすべての変 異株に対する結合は親のＲ３Ｖ　Ａ２株と同じであり、すなわち変異ウィルスが 、他の変異原領域に由来するｍＡｂの結合性を保持していたことになる。
Ｂ　ロング株エスケープ変異株 ロング株エスケープ変異株を前記［ガルノアーバレノら（１９８９）］のごとく 単離した。簡単に説明すると、選択抗体４７Ｆ、７Ｃ２またはＡＫ１３Ａ２の存 在下、４ないし５回連続的に継代することにより、ウィルスのストックを変異ウ ィルス中で富栄養化させた。
ついで、寒天平板を含む抗体中でウィルスをプラーク精製した。数個のウィルス プラークを単離し、それらの抗体中和に対する抵抗性を確認した。ウィルスのス トックの各邪分榎本から生じた単一のプラークをさらなる分析用に選択した。
ｍＡｂ　Ｂ４．７Ｃ２およびＡＫ１３Ａ２により認識されるエピトープは、抗体 ニスケープ変異株に対するそれらの反応性のみを基準とすると、上で引用のがル ンアーバレノら（１９８９）の文献記載の抗原領域ＩＩに含まれていた。同様に 、ｍＡｂ　Ｒ３Ｍ１９および２０により認識されるエピトープは、同じ判断基準 によると、抗原領域ＩＶに含まれていた（図８）。
耐性ウィルス中で選択された変異は、選択抗体を含む抗原領域に由来するエピト ープのみに影響した。例えば、変異株４／４は領域ＩＩにグループ分けされる抗 体のいずれとも反応しなかったが、一方では、同じ抗体（１１／３．４．５およ び７）に関して選択した池の変異株は、ｍＡｂ　７Ｃ２およびＢ４とは反応した が、・４７Ｆ、４９Ｆまたは、八Ｋ　１３　Ａ　２とは反応しなかった。同様に 、ｍＡｂ１９または２０に関して選択した変異株は、ｍＡｂ　５２Ｆを除いては 抗原領域Ｉ）にグループ分けされる抗体に結合しなかった。しかしながら、すべ ての場合において、変異ウィルスは、他の抗原領域に由来するｍＡｂとの結合を 保持していた。
抗原領域ＩＩ由来の抗体のエスケープ変異株に対する異なる反応性は、それらの エピトープがＦ分子上で重複しているかもしれないが、同一ではないことを示し た。これらのエピトープをさらに区別するために、対応するｍＡｂが実施例３に おいて、前もってロング株に対して力価決定しておいた個々の非標識抗体の飽和 しない量を増加させながら混合されたベルオキシダーゼ標識抗体を用いたウィル スに対する自発的結合に関して競合するか否かを決定した。
ｍＡｂ　４７Ｆに対して生成した抗−イディオタイプのウサギ・抗血清がＲ３Ｖ へのｍＡｂの結合を阻害する能力もまたＥｌ、ＩＳＡ［バロモ（Ｐａｌｏｍｏ） ら、ンヤーナル・オブ・ウィロロノー（ＪＪｉｒｏｌ、、）６４　：４１９９　 ４２０６　（１９９０）］で試験した。
得られた結果は、ウィルス結合に対するこれらの抗体間の広範囲の競合を示した 。しかしながら、抗体ＡＫ１３Ａ２は、非逆数的にｍＡｂ　４７Ｆおよび４９Ｆ のウィルス結合を阻害した。そのうえ、抗−イディオタイプ血清は、ｍＡｂ４７ Ｆおよび４９Ｆのウィルス結合のみを阻害したが、ＡＫ１３Ａ２．７Ｃ２および Ｂ４の結合は阻害しなかった。
かくして、抗原領域０に含まれるエピトープを、以下の判断基準の少なくとも１ つにより区別できる　ｉ）ｍＡｂのエスケープ変異株との反応性、１１）ウィル ス結合についてのｍＡｂの競合、および１１１）抗−イディオタイプ血清による ウィルス結合の阻害。エピトープ４７Ｆおよび４９Ｆのみを上の判断基準により 区別できなかったが、それらは変性剤に対する中和能力および感受性の両方にお いて異なっていた。
実施例８−中和エスケープ変異株における選択したアミノ酸の変化の位置エスケ ープ変異株において選択したアミノ酸の変化を同定するために、異なるウィルス に感染した細胞由来のＦ蛋白のｍＲＮＡの配列決定を以下のようにして行った。
Ｈｅｐ−２細胞を異なったウィルスに感染させ、細胞変性効果が融合細胞の生成 により明らかとなった時点で、感染後３０ないし４０時間で集めた。イソチオ／ アネート−ＣｓＣ１法にて全ＲＮＡを単離し［チャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉ 口）ら、バイオケミストリー（ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ）　、１８　：　５ ２９４−５２９９　（１９７９）］　）　、ついで］ポリーＡ″ＲＮをオリゴｄ Ｔ−セルロースクロマトグラフィーにより選択した。これらのｍＲＮＡ標品を、 逆転写酵素および５’　５ｚｐ−標識オリゴヌクレオチド、ついでターミナル・ デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ［デ・ボルダ（１）ｅ　Ｂｏｒｄ ｅ）ら、アナリティヵル・バイオケミストリー（＾ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、） 　、１５７　：　２７５−２８２　（１９８６）コを用いるジデオキ７法〔サン が−（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロノーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイｘ’）ス−ｘ−ニスニー　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　、　ＬＩＳＡ　７４　：　５４６３−５４６７　（１９７７）］に よる配列決定に用いた。配列決定に用いたプライマーを、報告されたロングＦ蛋 白遺伝子の配列［ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら、ウィルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ　 Ｒｅｓ、）　、１０　：　２４９　２６２　（１９８８）　］に従い合成した。
ｍＡｂ　Ｒ３Ｖ１９および２０について選択した変異株の配列決定に用いたオリ ゴヌクレオチドプライマーは、アンチ−ＲＮＡセンスにおける。
配列番号　２３　Ｆ１２１６＋　５°　−ＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡ Ｔ配列番号：２４　Ｆ１３００・　５’　−ＡＣＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＧＡＴＧ Ｃ配列番号　２５　Ｆ１３３９：　５°　−ＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＣＡＣＣＣＧ Ｔ配列番号　２６　Ｆ１４７８：　５’　−ＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＧ 配列番号　２７　Ｆ１４５８・　５°　−ＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＡＴＴＴＡＣＧ Ａ配列番号　２８　Ｆ１７０７　５’−ＣＴＣＡＧＴＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴ ＡＧである。
ｍＡｂ　ＡＫ１３Ａ２．７Ｃ２およびＢ４について選択したウィルスのＦｍＲＮ Ａを、それらの抗体によりｆＸ！されるトリプノン抵抗性の断片をコードしてい るヌクレオチド４２０ないし９２０番の間で配列決定した（図２）。ｍＡｂｌｌ について選択したウィルスのＦ　ｍＲＮＡを８９３ないし９０６番の間のみて配 列決定した。同様に、ｍＡｂ　１９および２０について選択したウィルスのＦ　 ｍＲＮＡを、それらの抗体により認識される、存在が予想される２６ｋＤａのト リプシン抵抗性断片の領域をコードしている１１００ないし１６８０番の間で配 列決定した。
表３は異なる中和エスケープ変異株において選択される配列の変化を示し、２種 の以前報告されたｍＡｂ　４７Ｆについての変異株ｃ上で引用のロベスら（１９ ９０）の文献参照］も記載する。示された位置でのヌクレオチド（ｍＲＮＡ暗号 ）およびアミノ酸の変化のみを、ロングおよびＡ２株と比較して示す。ＮＤは試 験しなかったことを示す。
表３Ａ、３Ｂ、３Ｃの一部を、個々の抗体について、互いに見比べる必要がある 。例えば、抗体４７Ｆについては、ウィルス４は、７９７番目におけるＡからＵ のヌクレオチドの変化（表３Ａ）は、２６２番目におけるＡｓｎからＴｙｒへの アミノ酸の変化を引き起こしく表３Ｂ）、その結果４７Ｆ、４９ＦおよびＡＫ１ ３Ａ２における抗体結合能を失っている（表３Ｃ）。
表３Ａ ヌクレオチド位置 選択に用いた抗体　ウィルス　５８３６５９７８６７９７８１６８２７８２８１ ２９８−ロングおよびＡ２　ＣＡ　Ｕ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｃ１１Ｕ ＡＫ１３Ａ２　４／４　Ｇ　Ｕ １２　Ｃ ６１：１６／８　Ｃ １９Ｃ４８４ｆ　Ａ Ｃ４９０９１５Ａ Ｃ４９０９／６　Ａ 表３Ａ（続き） ヌクレオチド位置 Ｃ４９０２Ｗｃ　Ａ 表３Ｂ アミノ酸位置 選択に用いた抗体　ウィルス　１９０２１６２５８２６２２６８２７２４２９０ ングおよびＡ　２　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ ｌ　１　１１ｅ ＡＫ１３Ａ２　４／４　＾ｓｐ　Ｔｙｒ４゜ Ｂ４　６１：１６／７　Ｔｈｒ ６１：１６／８　Ｔｈｒ １９　Ｃ４８４ｆ　５ｅｒ Ｃ４９０９／　５　５ｅｒ Ｃ４９０９／６　Ｓｅｒ 表３Ｃ（続き） 選択に用いた抗体　ウィルス　抗体に関する結合損失２０　Ｃ４９０２Ｗａ　５ ６Ｆ、５７Ｆ、１９．２０Ｃ４９０２Ｗｂ　５６Ｆ、５７Ｆ、１９．２０Ｃ４９ ０２Ｗｃ　５６Ｆ、５７Ｆ、１９．２０ｍＡｂ　１１は、８１６番目のヌクレオ チドにおいて単一の置換（八からＵ）を有する変異株を選択した。また、この置 換は、Ａｓｎ−２６２をｌｉｅに変化サセタ。−１，ノｆ化モまた、ｍＡｂ　１ ３、Ｂ４およびＢ５により認識されるエピトープの損失を誘導した。エピトープ は図５の抗原領域Ｂに含まれ、この変化は、図８の抗原領域ＩＩに含まれるすべ てのエピトープの損失を誘導するｍＡｂ　４７Ｆについて選択した変異株７にお いて見られる変化と同じである。
ｍＡｂ　ＡＫ１３Ａ２について選択した４種のウィルスは、７９７番目のヌクレ オチドにおける単一の置換（八がらＵ）を有しており、Ａｓｎ−２６２がＴｙｒ に変化した。この変化は、抗体４７Ｆ、４９ＦおよびＡＫ１３Ａ２についての結 合部位を除去しく図８）　、ｍＡｂ　４７Ｆについて選択した変異株４において 観察された変化と同じである。そのうえ、ｍＡｂ　ＡＫ１３Ａ２について選択し た５番目のウィルス（４／４）は、Ａｓｎ−２１６をＡｓｐに変化させる６５９ 番目のヌクレオチドにおける置換（ＡがらＧ）を有していた。この２番目のアミ ノ酸変化は抗原領域ＩＩ由来のすべてのエピトープの損失を誘導した（図８）。
ｍＡｂ　ＡＫ１３Ａ２について選択した最後の変異株（４°）は単一の八がらＧ への置換を８２７１目のヌクレオチドにおいて有しており、ＧｌｕにょるＬｙｓ −２７２の１換および領域ＩＩ由来のすべてのエピトープの損失を誘導した。
変異株４を除いて、ｍＡｂ　７Ｃ２に関して選択したすべての変異株は、８２７ または８２８＃目のヌクレオチドにおいて単一のｒＩｌ換（八からＧまたは八が らＣ）を有しており、Ｌｙｓ−２７２がＧｌｕまたはＴｈｒにそれぞれ変化して いる。これらの変化は、抗原領域ＩＩ由来のすべてのｍＡｂについての反応性を 除去した。変異株４は２つのヌクレオチド置換を５８３番目（ＣがらＡ）および ７８６番目（ＵからＣ）に有しており、１９０番目のアミノ酸（ＳｅｒからＡｒ ｇ）および２５８番目のアミノ酸（Ｌｅｕがら５ｅｒ）が変化している。最後の 変異株はｍＡｂ　７Ｃ２についての結合部位のみを失っているが、すべての他の 抗−Ｆ抗体との反応性を保持していた（図８）。
ｍＡｂ　Ｂ４について選択した２種の変異株は、８２８番目に単一のヌクレオチ ド置換（ＡからＣ）を有しており、Ｌｙｓ−２７２がＴｈｒに変化していた。
かくして、抗原領域ＩＩ由来のｍＡｂについて選択されたすべてのアミノ酸変化 が、２つのアミノ酸置換をともなったウィルス中でのみで検出される２５８．２ １６および１９０番目のアミノ酸の変化を除くＦ蛋白の２６２番目ないし２７２ 番目の小さなセグメント中に集合化されていた。
抗体Ｒ３Ｖ１９または２０に関して選択したすべての変異株は１２９８２９８番 目レオチドにおいてＣからＡの単一の置換を有しており、Ａｒｇ−４２９がＳｅ ｔに変化していた。Ｆ１サブユニットのノステインの多い領域のカルボキン末端 終結部（図２）に向かって位置するこのアミノ酸の変化は、抗体５２Ｆを除いて 、抗原領域ＴＶにグループ分けされるすべてのｍＡｂの反応性を除去した。４２ ９番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）は、それゆえ、Ｆ蛋白へのｍＡｂ　Ｒ３Ｖ１９およ び２０の結合にとり重要である。Ｆ蛋白［配列番号、１９］の合成ペプチド４１ ７−４３２および４２２−４３８は、ｍＡ、ｂ　Ｒ５〜’１９により認識される エピトープの少なくとも一部を再生産する。配列決定結果は、図７および８に示 した抗原領域ＨおよびＴＶは重複していないという知見を確認する。
実施例９−合成ペプチドとの抗体の反応性エスケープ変異株を選択するために用 いた抗体が、ウェスタン・プロットにおいてＦ１サブユニットのトリプシン断片 と反応したので、合成ペプチドがこれらの抗体により認識されるエピトープを再 生産できるかどうかを調べた。
要約すると、合成ペプチドにより得られた結果もまた、抗原領域ＩＩのエピトー プにおけるコンフォーメー／ヨン上の制約を示唆した。エピトープＢ４は配列番 号　５５のペプチド２５５−２７５により再生産された：しかしながら、他の密 接に関連したペプチドはその抗体と反応しなかった。そのうえ、試験したペプチ ドのうち、他の抗原領域ＴＩ　（Ｂ）のエピトープを再生産するものはなかった 。これらのエピトープを含むＦ１サブユニットの領域は多量のトリプシンに抵抗 性があり、ウェスタン・プロットにおいては保存される可能性があるが、合成ペ プチド中では保存されない特殊な３次元構造を示唆した。
表４に示したペプチドを、固相法およびｔ−Ｂａｃの化学「メリフィールド（Ｍ ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２３２　：　３４ １　３４７　（１９８６）］を用いたアプライド・バイオシステム（＾ｐｐｌｉ ｃｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）　４３０装置により合成した。ペプチドをトリフル オロメチルスルホン酸により開裂させ、保護基および反応停止剤からセファデッ クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５クロマトグラフイーにより精製した。個 々のペプチドのアミノ酸配列を、アプライド・バイオフステム４フフ蛋白配列決 定装置における自動エドマン分解により確認した。
抗原領域ＩＩ由来のｍＡｂに関して選択した変異株において変化した位置をとり 囲むＦ１サブユニット［配列番号・５５コのアミノ酸２５０−２７３．２５５− ２７５または２５８−２７１に対応した配列とともに３つのペプチドを合成した 。
合成ペプチドに対するｍＡｂの結合を、実施例３のＥＬＩ　ＳＡにより、１ない し２μｇのペプチドで覆ったポリ塩化ビニルのマイクロタイター・プレート中で 一晩試験した。５％ブタ・血清を含むＰＢＳをブロッキング試薬として用い、見 掛けの交差反応を除去した。結果を下表４に示した。
抗体Ｂ４および別のウソ抗体Ｂ５のみが配列番号：５５のペプチド２５５−２７ ５と反応した。このペプチドに関するＢ４の力価は精製ウィルスに対して得られ た力価と同様であった。し力先ながら、この抗体は、配列番号：５５のペプチド ２５５−２７５中に含まれるアミノ酸配列のほとんど全体を含む配列番号・５５ のペプチド２５０−２７３および２５８−２７１の双方とは反応しなかった。
領域ＩＩ由来のすべての池の抗体はいずれの抗体とも反応しながった。
ｍＡｂ　ＲＳＶ１９および２０について選択したエスケープ変異株において変化 した４２９番目の位置をとり囲むＦ１サブユニットの配列［配列番号　５５〕４ １７−４３２．４２２−４３８および４３５−４５０に対応する３つの他のペプ チドもＥＬ’ＩＳＡにて試験した（表４）。抗体Ｒ３Ｖ１９、Ｂ１３およびＢ１ ４のみが最初の２つのペプチド（配列番号　５５の４１７−４３２および４２２ −４３８）と反応した。
かくして、Ｆ蛋白に向（ブられた中和的で防御的なｍＡｂによ／）認識される２ つの抗原部位を同定した。最初の部位は、Ｆ１サブユニットのトリブ／ン抵抗性 のアミノ末端側１／３中にｔｉａし、配列番号　５５のアミノ酸２６２−２７２ 近辺に集合化した、数個の重複したエピトープを含んでいる。これらのエピトー プのうち１つのみが、Ｂ４により認識され、Ｆｌ白のアミノ酸２５５−２７５　 ［配列番号　１９］に対応する短鎖合成ペプチドにより忠実に再生産された。２ 番目の抗原部位は、Ｆ１サブユニットのカルボキン末端側１／３中に位置し、ｍ ＡｂＲ３Ｖ１９により認識されるエピトープおよびＢ１３およびＢ１４により認 識されるエピトープが配列番号・５５の４１７−４３２および４２２−４３８番 目のアミノ酸に対応する合成ペプチドにより再生産された。しかしながら、ｍＡ ｂＢ１３およびＢ１４が、４２９番目のアミノ酸Ａｒｇ　（図７）における置換 を有するｍＡｂ　ＲＳＶ１９に関して選択された抗体エスケープ変異株と反応す るため、ｍＡｂ　ＲＳＶ１９、Ｂ１３およびＢ１４により認識されるエピトープ は同一ではないと考えられる。そのことは、４２９番目のアミノ酸ＡｒｇはＦｌ 白へのｍＡｂ　Ｂ１３およびＢ１４の結合に必須でないことを示す。下表４のペ プチド断片は配列番号　５５のＦ１サブユニットから引用されている。
表４ 合成ペプチドとのモノクローナル抗体の反応性モノクローナル抗体 ヘフ＋）’　７Ｃ２４７Ｆ　ＡＫＩ３Ａ２　ＩＩ　Ｂ４　Ｒ５Ｍ１９　２０　Ｂ Ｉ３　Ｂ１４２５０−２７３　＜２．Ｑ本　＜２．０　＜２．０　＜２．０　＜ ２．０　＜２．ＯＮＤ　ＮＤ２５５−２７５　＜２．０　＜２．０　＜２．０　 ＜２．（ｌ　δ　７　＜２．０　＜２．０　＜２．０　＜２．０２５ｇ−２７１ ＜２．０　＜２．０　＜２．０　＜２．（ｌ　＜２．０　＜２．ｆ）　＜２．０ 　ＮＤ　Ｎ０４１７ｍ４３２　＜２．０　＜２．０　ぐ２．０　＜２．０　＜２ ．０　２．１１１　ぐ２．０　４．５　３．２４２２−４３８　＜２．０　＜２ ．０　（２，０＜２．０　＜２．０　６．０　＜２．０　５．０　４．３４３５ −４５０　＜２．０　＜２．０　＜２．０　＜２．０　＜２．０　２゜３　＜２ ．ＯＮＤ　ＩｆＤＲＳＶ　５ｔｒａｉｎ＾２ｇ、４　６．１　４．９　６．４　 ５．３　６．４　６．３　５．６　５．６木ウェル上て吐煙させた合成ペプチド あるいはＥＬＩＳＡで試験したＲ８Ｖ抗原に対する抗体結合力価のＩＯｇ＋ｏ値 避訪上叶二五り且旦ダ男止賢焦ヒ旦辷ゴ二！ス赴シ（ｐｅｐｓｃａ回上！ Ｆ蛋白［配列番号　１９］の２５５−２７５番目のアミノ酸に対応するｉｉ復し たペプチドを、７個のアミノ酸が重複しており余分に１個のアミノ酸のついた一 連の８量体を２個ずつ合成し、ゲイラン（Ｇｅｙｓｏｎ）ら、ジャーナル・オブ ・イムノツノカル・メリンス（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈ、）　、１０２　：　 ２５９−２７４　（１９８７）の方法に従いＦ−Ｍｏｃの化学（Ｆ−Ｍｏｃ　ｃ ｈｅＩＩｉｓｔｒｙ）を用いてペプチドをポリエチレン製ビンに結合させた。ペ プチド生成に用いたソフトウェア・パッケージ、ポリエチレン製ピンおよびアミ ノ酸は、英国チェ／サイア（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）のケンブリツノ・リサーチ・バ イオケミカルズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ）社から１↓」ｔこ。
ペプチドを結合させるビンを、９６ウエルのマイクロタイタープレート中の阻止 緩衝Ｍ（０，０５％ツイン２ｏおよび２％マーベルを含むＰＢＳ）とともに、ロ ータリーンニーカー上でインキュベートした。１時間室温でインキュベートした 後、ビンをｍＡｂ　Ｂ４とともにインキュベートし、４℃で振とうしながら阻止 緩衝液で１１６００に希釈した。０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳ　（ＰＢＳ ／Ｔｗ）にて５分間１０回洗浄した後、ピンを西洋ワサビ・ベルオキ／ダーゼ（ ＨＲＰ）−ウサギ抗−ウ／ＩｇＧ［／グマ社］とともにインキュベートシ、阻止 緩衝液で１：４０００に希釈した。１時間４５分後、ビンを５分間１０回洗浄し 、次いで、０．３μＩ／ｍｌの１２０倍体積の過酸化水素水を含む１００ｍ１の 基質緩衝液（０１Ｍオルトりん酸水素二ナトリウム：　０．０８Ｍクエン酸）中 に溶解した１５０μｍ／ウェルの５’Ｏｎ　ｇのアノノージー３−エチル−ベン ズチアジノスルホ不−トＥ／グマクを入れたマイクロタイタープレート中、暗所 で撹拌しながらインキュベートした。じゅうぶん着色したら、タイターチック・ マルチスキ＋　ン（Ｔｉｔｅｒｔｅｃｈ　１ｌｕｌｔｉｓｃａｎ）　ＭＣＣ３４ ０プレートリーダーにて４０５ｎｍでＯＤを測定した。ｍＡｂ　Ｂ４は配列＃号 、１９の２６６−２７３番目のアミノ酸の範囲の単一ペプチドを認識し、それは ピンに結合した配列ＩＴＮＤＱＫＫＬを有するペプチドであった。
ピンに結合しており、上の配列で表されるが、個々のアミノ酸が２０種の天然に 存在するアミノ酸に１換されているペプチドを用いて、この８量体への８４の結 合をさらに研究した。２個ずつのペプチドを上記のごとく合成し、ペプチドへの ｍＡｂ　Ｂ４の結合を図９に示すようにＥＬＩ　ＳＡにより検出した。２６６番 目のアミノ酸１１ｅがすべての他のアミノ酸で順番に置換されたすべてのペプチ ドに８４は結合し、配列番号　１つの２６６−２７３のペプチドへのＢ４の結合 には２６６−１１ｅは必須でないことが示された。同様に、２７０−Ｇｌｕおよ び２７３−Ｌｙｓの置換もＢ４の結合に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に 、２６８−、＝λｓｎ、２６９−Ａｓｐおよび２７２−Ｌｙｓの置換は、Ｂ４の 結合を総体的に失わせ、これらのアミノ酸は配列番号　１９のペプチド２６６− ２７３への８４の結合に・ｙ須であることが示された。これらの研究は、抗体エ スケープ変異株の配フリ分析（実施例８）から得られた知見を確実なものにし、 またその両県は、２６８−Ａｓｎおよび２７２−ＬｙｓがＦ蛋白へのＢ４の結合 に重要であることを示した。２６７−Ｔｈｒの置換は、Ｂ４の結合を弱め、２７ １−Ｌｙｓの置換はペプチドへの結合を有意に強めた。２７１−Ｌｙｓが１ｌｅ ｌ：ｆｆｉ換された場合に、配列番号、１９のペプチド２６６−２７３への最強 の結合が認められた。
実施例１１−ヒト化抗−Ｒ５Ｖ抗体 以下の実施例は、同時出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１５５４号記載 の、Ｒ２Ｍ１７またはＲ５ＭＵ１９と呼ばれるネズミｉｇ（ｇ、ｍＡｂを供与体 可変部鎖配列およびＣＤＲとして用いた、代表的な改変抗体の調製を記載する。
改変抗体の開発のために、本明細書記載の他の抗−Ｒ’ＳＶ抗体を用いた同様の 方法に従ってもよい。
Ｒ２Ｍ１７はＲ５Ｖの融合（Ｆ）蛋白に特異的である。Ｒ３Ｖ１９ハイブリドー マｍ胞系はノエラルディン・ティラー（Ｇｅｒａｉｄｉｎｅ　Ｔａｙｌｏｒ）博 士から得た。Ｒ３Ｖに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細 胞系の単離の方法論は、ティラーら、イムノｏノー　（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） 　、　５２　：１３７−１４２　（１９８４）に記載されている。
先の実施例記載のごとく、細胞質ＲＮＡを、上で引用のファバロロ（Ｆａｖａｌ ｏｒｏ）ら（１９８０）の方法によりＲ５ＶＩ９ハイブリドーマｍ胞系から調製 し、Ｉｇ可可変領領域プライマーを用いて、以下のようＪ二してｃＤＮＡを合成 した。ＩｇＨＨ１ｇ変部領域ｔ：ツイテハ、Ｒ５Ｖ１９ＶＨ（図１５Ａ、１５Ｂ および１９参照）およびプライマー［配列番号・３３コＶＨＩＦＯＲ５°　ＴＧ ＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣΔＧ３’　を 用い、ＩｇＬ鎖可変部領域については、Ｒ３Ｖ１９ＶＫ　（図１６Ａおよび１６ Ｂ＃照〕およびプライマー［配列番号　３４］　ＶＫＩＦＯＲ５’　ＧＴＴＡＧ ＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ３を用いた。
ｃ　Ｄ　ＮＡ合成反応系は総体積５０μｊ中、２０ｕｇのＲＮＡ、０．４μＭの ＶＨＩＦＯＲまたは〜’ＫＩＦＯＲ１２５０μＮ１の各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣＩ　ｐＨ７５，７５ｍＭ 　ＫＣＩ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、３ｍＭ　Ｎｊｇｃ１２および２７ユニットのＲＮ ａｓｅ阻害剤からなる。試料を７０℃で１０分間加熱し、４２℃までゆっくりと ３０分以上かけて冷却した。次いで、１００μＭのＭＬＶ逆転写酵素を添加し、 ４２℃で１時間インキュベーノジンを続けた。
次いで、ＶＨおよびＶＫ　ｃＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲ用に用イ タブライ７−ｉ；！：　ＶＨＩＦＯＲ：　ＶＫＩＦＯＲ：　ＶＨＩＢＡＣＫ　（ 実施例１８記載）および［配列番号　３５］　ＶＫＩＢＡＣＫ　５’　ＧＡＣＡ ＴＴＣＡＣ；ＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ３°である。
プライマーＶＨＩＦＯＲＳＶＫＩＦＯＲ，ＶＨＩＢＡＣＫおよびＶＫＩＢＡＣＫ ならびにマウス・Ｉｇ　ＤＮＡのＰＣＲ増幅へのそれらの利用は、上で引用した オルランディ（○ｒｌａｎｄｉ）ら（１９８９）の文献により記載されている。
ＶＨのＰＣＲ増幅用に、ＤＮＡ／プライマー混合物は５μｌ　ＲＮＡ／ｃＤＮＡ ハイブリッドおよび０５μＭ　ＶＨＩＦＯＲおよびＶＨＩＢＡＣＫプライマーか らなる。
ＶＫのＰＣＲ増幅用に、ＤＮＡ／プライマー混合物は５μｌ　ＲＮＡ／ｃＤＮＡ ハイブリッドおよび０５μＭ　ＶＫＩＦＯＲおよびＶＫＩＢＡＣＫプライマーか らなる。これらの混合物に２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび ｄＴＴＰ、１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、 １゜５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．０１％（ｗ／ｖ）ツイン２０．０５０１％（ｖ／ ｖ）ノニデソトＰ４０および２ユニ、トのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ［米国オハ イオ州のユナイティッド・ステーソ・バイオケミカルズクリーブランド（Ｕｎｉ ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｄｌｅｖｅｌａｎｄ）社］ を添加した。９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃２分間の加熱サイクルを２５ 回、最後に７２℃で５分間処理するＰＣＨに試料を供した。クローニングおよび 配列決定には、増幅したＶＨＤＮＡを低融点アガロースケルおよびエリューチノ ブ（Ｅｌｕｔｉｐ）　−Ｄカラムクロマトグラフィーにて精製し、ファージＭ１ ３中にクローン化した。一般的なりローニップおよび連結の方法は、上で引用し たマニアティスらの文献に記載されている。
ＶＨＤＮＡを直接Ｍ１３ｍｐ１８／１．９のＳｍａ　１部位中にに連結するか、 またはＰｓｔｌによる消化を行ってからＭ１３ｔｇ１３１［英国アマノヤム・イ ノターナノＢナルーリトル Ｃｈａｌｆｏｎｔ）社］のＰｓｔ１部位中に連結する牟のいずれかを行った。増 幅したＶＫを同様にゲルで精製し、次の点を変更してクローニングした　（１） ＰｖｕＩＩ消化断片をＭ１３ｍｐ１９中に連結（Ｓｍａ　１部位）；　（２）Ｐ ｖｕＩＩおよびＢｇＩ１１消化断片をＭ１３ｍｐ１８／１９中に連結（Ｓｍａ　 Ｉ−ＢａｍＨ１部位）＋　（３）ＰｖｕＩＩおよびＢ　ｇ　Ｉ　ＩＩＭ化断片を Ｍ１３ｔｇ１３１中に連結（ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ部位）＋　（４）ＢｇｌＩ Ｉ消化断片をＭ１３ｔｇ１３１中に連結（Ｓｍａ　ｒ−Ｂｇ　Ｉ１１部位）。結 果生じた重複したクローンのコレク／Ｂンを、セクエナーゼ［米国オノゾオ州の ユナイティソド・ステーブ・バイオケミカルズークリーブランド（Ｕｎｉｔｅｄ 　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌｓ−Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）社］を用い たノデオキシ法口上で引用のサンガーらコにて配列決定した。
図１４Ａおよび１４Ｂおよび１５Ａならびに１５Ｂにそれぞれ示したように、Ｒ Ｓ〜１９ＶＨおよびＶＫドメインの配列決定がら、カバト（Ｋａｂａｔ）ら、「 ノークエンノズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト」 　ＣＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ−）　、ニーニス・デパートメント・オブ・ヘルス ・アンド・ヒユーマン・サービ／ズ（ＵＳ　Ｄｅｐｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈａｎ ｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）　、ニーニス・ガバンメント・プリンティ ングψオフェイス（ＬＩＳ　ＧｏｖｅｒｎｌＩｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｏｆ ｆｉｃｅ）　（　１　９　８　７　）の方法に従い、他のＶＨおよ部位特異的変 異法によりネズミ・ＲＳＶ１９　ＣＤＲをヒト・フレームワーク中に移した。用 いたプライマーは ［配列番号　３６］　ＶＨＣＤＲＩ　５’　ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣ ＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＴ３ ’［配列番号　３７］　ＶＨＣＤＲ２　５’　ＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＣＣ ＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣ ＡＧＧＡＴＣＡＡＴＣＣＡ３’ ［配列番号　３８］　ＶＨＣＤＲ３　５’ＣＣＣＴＴＧにＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴ ＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡ３’［配列番号　 ３９コ　ＶＫＣＤＲＩ　５°　ＣＴＧＣ丁ＧＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧ ＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＣＴＡＧＡＴ ＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡ３。
Ｅ配列番号　４０］　ＶＫＣＤＲ２　５’ＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡ ＡＴＣＧＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧ３’〔配列番号　 ４１コ　ＶＫＣＤＲ３　５“　ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＡ ＡＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴ３。
である。
変異用のＤＮＡ鋳型は、それぞれ、結晶学的に溶解した蛋白、アミノ酸２７をセ リンからフェニルアラニンに置換［上で引用のりーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ）の文献コしたＮＥＷ［サウル（Ｓａｕｌ）ら、ツヤ−ナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｌｌ．）　４５　：　５１３−５２ ４　（１９７４）コおよびＶＨおよび＼゛にドメインについてはＲＥＩ［ニップ （Ｅｐｐ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・才ブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）　、４５　：　５１３　５２４　（１９７４）］に由来 するヒトフレームワークからなる。ＣＤＨに無関係なヒト構造からなるＮ１１３ を基礎とした鋳型を、リーチマンら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３３２　 （１９８８）の記載のようにして調製した。
ヒト・Ｘ′ＨおよびＶＫ遺伝子のオリゴヌクレオチド部位特異的変異をナカマイ エ（＼ａｋａｍａｙｅ）ら、ヌクレイツク・アノンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａ ｃｉｄ　Ｒｅｓ．　）　、１　４９６７９　９６９８　（１９８６）の方法に基 づいて行った。５μｇのＭ１３中の＼′Ｈまたｊマ＼’Ｋｌｉｉ鎖ＤＮ．へに、 ３種のネズミ・ＣＤＲ　（、相補的に決定される領域）配列をコードしている２ 倍のモル数の過剰の３種のＶＨまたはＶＫのりん酸化されたオリゴヌクレオチド のそれぞれを添加した。７０℃に加熱することにより、プライマーを鋳型に対し てアニーリングし、徐々に３７℃まで冷却した。
アニーリングしたＤＮＡに、６ユニットの７４ＤＮＡリガーゼ［英国ペスリー（ Ｐａｉｓｌｅｙ）のライフ・ソクノｏ　／−　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）社製〕　、各Ｑ．５ｍＭの以下のヌクレオ、ト３りん酸（ｄＡＴＰ．ｄＧＴ Ｐ．ｄＴＴＰおよび２゛　−デオキシノチノン５’−〇−）１−チオトリホスフ ェート（チオｄＣＴＰ）　）；　６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）； ６ｍＭ　ＭｇＣＬ＋５ｍＭ　ＤＴＴ［英国プール（Ｐｏｏｌｅ）のノグマ社製コ および１０ｍＭ　ＡＴＰを添加し、反応物の体積を５０μ［とした。この混合物 を１６℃で１５時間インキュベートした。
次いで、ＤＮＡをエタノール沈澱し、５ユニツトのＮｃｉｌ［英国ペスリーのラ イフ・チクノロノー社］で消化した。ＮｊＣ＋は、親のＤＮＡ鎮を切断するが、 楢ｔ；われていないチオｄＣＴＰを有する新しく合成されたＤＮＡＩＩＩを切断 せずに残す制限酵素である。次いで、５０μｌの６０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＨＣ Ｉ　（ｐＨ８。
０）　、０．６６ｍＭ　ＭｇＣｌ４および１ｍＭ　ＤＴＴの溶液中の１００ユニ ツトのエキソヌクレアーゼＩＩＩ　［英国ミルトン・ケインズ（Ｍｉｌｔｏｎ　 Ｋｅｙｎｅｓ）のファルマ／ア（ＰｈａｒＩＩａｃｉａ）社製コにて親のＤＮＡ 鎖をｉｔｉ？’ヒし、これを除去した。次いで、５０ａ　Ｉの６０ｍＭ　Ｔｒ　 ｉ　ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８．０）　、６ｍＭ　ＭｇＣｌｘ、５ｍＭ　ＤＴＴ，１ ０ｍＭ　ＡＴＰおよびそれぞれＱ．５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰＳｄＧＴＰおよ びｄＴＴＰの溶液中の３ユニツトのＤＮＡポリメラーゼ■　［英国ベスリー（Ｐ ａｉｓｌｅｙ）のライフ・チクノロノー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社 製］および２ユニ、トのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加することにより、ＤＮＡを修 復した。
上で引用のマニアティスらの方法により、ＤＮＡをコンピテントな大ＭｆｌＴＧ 　１細胞［英国ノヤルフォントのアマーンヤム・イノターナショナル社製］中に 形質転換した。
１重鎮ＤＮＡを個々のプラークから調製し、メノンング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、 メソソズ・イン・エンザイモロノー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙＩＩｏｌ ｏｇｙ）　、１０１　：　２０　７　８（１９８３）の方法により配列決定した 。単一または二重変異株のみが得られた場合には、ＣＤＲの三重変異株が得られ るまで、さらに変異操作を繰り返した（上の方法を用いた）。
ＣＤＲ１ｔ換されたＶＨおよびＶＫ遺伝子を発現ベクター中でクローン化しくマ ニアティスらの方法による）、それぞれプラスミドｐＨｕＲｓＶ１９ＶＨおよび ｐＨｕＲＳＶ１９ＶＫを得た。ｐＨｕＲｓＶ１９ＶＨについては、ＩｇＨ鎖プロ モーター、適当な切断部位および／グナルベブチド配列といっしょになったＣＤ Ｒ置換されたＶＨ遺伝子を、Ｈｉ　ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによる消化によっ てＭ２Ｓから切り出し、ネズミ・Ｈ鎖のエンハンサ−１ＳＶ４０プロモーター、 ヒト・細胞における選択のためのｇｐｔ遺伝子および大１ｌＩＪ菌中での複製お よび選択のための遺伝子を含む発現ベクター中にクローン化した。その可変部類 域アミノ酸配列を図１９に示す。次いで、ヒト・ＩｇＧ１不変部領域をＢａｍＨ Ｉ断片として加えた。
ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫプラスミドの構築は、ｇｐｔ遺伝子がヒグロマインン耐性 遺伝子に置き換えられていること、およびヒトのカッパー鎖不変部領域が加えら れていることを除いて、基本的に同じである（図１７および２２参照）。
１０μｇ（７）ｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨおよび２０μｇのｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＫを 、慣用的手法を用いてＰｖｕ　Ｉにて消化した。ＤＮＡを混合し、エタノール沈 澱し、２５μｍの水に溶解した。約１０’個のＹＢ２１０細胞［米国メリーラン ド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾ｍｅｒｉ ｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　］を半集密的にな るまで増殖させ、遠心分離により集め、０５ｍｌのＤＭＥＭ　［英国ベスリーの ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製］中に消化したＤＮＡとともに、キュベツト中で再瞥 濁した。５分間水冷後、９６０μＦで１７０Ｖの単一パルス（ノーン−パルサー （Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ）米国カリフォルニア化のバイオーラノドーリソチモ ンド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）社製）を細胞に与え、水中にさらに ２０分間放置した。次いで、細胞を２０ｍ１の１０％ウソ・胎児血清含有ＤＭＥ Ｍ中にに加え、４８時間回復させた。この後、細胞を２４−ウェルのプレートに 分配し、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％つ７胎児血清、０８μｇ／ｍｌのミコフェ ノール酸および２５０μｇ／ｍｌのキサンチン）を添加した。３〜４日後、培地 および死細胞を除去し、新鮮な選択培地と交換した。移されたクローンは１０〜 １２日たつと肉眼で見ることができた。
形質転換されたクローンを含むウェルの培地中のヒト抗体の存在を慣用的なＥＬ ＩＳＡ法により確認しメ：。４℃で一晩、１μｇ／ウェルのヤギ抗−ヒト■ｇＧ （カンマ鎖特異的）抗体［英国フローリー・ダウン（Ｃｒａｗｌｅｙ　Ｄｏｗｎ ）のセージ・ラブ・リミテッド（Ｓｅｒａ−Ｌａｂ−Ｌｔｄ）社製コでマイクロ タイタープレートを覆った。
ＰＢＳＴ　（０，０２％ツイン２０ｘを含むりん酸緩衝化生理食塩水）で洗浄後 、１００μｍの形質転換細胞を含むウェルからの培地を個々のウェルに添加し、 ３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄 し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ・抗−ヒトＩｇＧあるいはベルオキシダーゼ結合 ヤギ・抗−ヒト・カフパー不変部領域抗体のいずれかを、ウェル当たり１１００ ｎ添加した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、 ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄した。３４０μｇ／ｍｌの５０ｍＭクエン酸ナ トリウム中のｐ−フェニレンジアミンおよび５０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ５ ，０）および０．００３％（ｖ／ｖ）Ｈ，０２を添加し、ウェル当たり２００μ ｍとした。
１〜５分後、１２．５％硫酸をウェル当たり５０μｌ添加することにより反応を 停止し、次いで４９２％ｍの吸光度を分光光度計で測定した。
ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨおよびｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫで同時形質転換された細胞系 から分泌されて生じたヒト化抗体ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ＶＫ　（Ｒ３Ｈ２００と も称す）を蛋白−Ａアガクースカラム［英国リューズ（Ｌｅｖｅｓ）のベーリン ガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製］で精製し 、ＥＬＩＳＡ分析においてＲ３Ｖウィルスへの結合に関して試験した。Ｒ３Ｖ　 Ａ２株に感染［ルイス（Ｌｅｖｉｓ）　ラ、メディ’ジャーナル・オーストラリ ア（Ｍｅｄ、　Ｊ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）　、４８　：　９３２−９３３　（ １９６１）コし、０５％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０界面活性剤で処理して細胞溶解物 を生じたウソ・腎臓（ＣＫ）細胞中に抗原が存在した。感染していないＣＫ細胞 を用いて、対照の細胞溶解物を同様にして調製した。マイクロタイタープレート のウェルを感染または対照細胞の溶解物で覆った。抗原で覆われたプレートを、 ３７℃で１時間ＰＢＳＴでブロックし、ＰＢＳＴで洗浄し、その後ヒト化抗体を 適用した（すなわちＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ＶＫ）。３７℃で１時間インキュベー トした後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ・抗−ヒト・ＩｇＧ抗体［ 英国クロー９−・ダウン（Ｃｒａｗｌｅｙ　Ｄｏｗｎ）のセージ・ラブ・リミテ ッド（Ｓｅｒａ−Ｌａｂ−Ｌｔｄ）社製］をウェル当たり２００％ｇ添加した。
３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、２ ００μｌのＨＲＰ−結合ウサギ・抗−ヤギ・ＩｇＧ抗体［英国ノブマーブール社 製］の１．１０ＯＯ希釈物を添加した。
３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄した。
各ウェルに２００μｌの基質緩衝液（５０ｍＭクエン酸ナトリウム中の３４０μ ｇ／ｍｌのｐ−フェニレンジアミン、５０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ５，０） および０．００３％（ｖ／ｖ）Ｈ２０ｚ）を添加した。１２５冗硫酸をウェル当 たり５０μｍ添加することにより反応を停止した。次いで、４９２％ｍにおける 吸光度を測定した。
ヒト・Ｈ鎮フレームワーク（ＲＥＩおよびカッパーのそれぞれ可変部および不変 部領域）中のＲ５Ｖ１９Ｈ鎖およびＬ鎮のＣＤＲの直線的な置換により生じた、 このヒト化抗体ＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫ　（Ｒ３Ｈ２００）は全ＲＳＶ調製物 と結合したが、一方では供与体であるネズミのＲ３Ｖ１９抗体よりも弱い親和性 を最小の可変部類域ＩＩＩ造の修飾を行い、高親和性結合を生じさせるようｌ二 計画された方法により、Ｒ５Ｖに特異的な高親和性抗体を開発した。該方法は、 以下の改変およびｔＸ験の手順からなる １、　ＣＤＲとの相互作用に重要であることが知られている個々のフレームワー クのアミノ酸残基を１次抗体および改変ＣＤＲ−置換抗体中で比較する。例えば 、１４鎖の９４番目のアミノ酸（カバトの番号−上で引用のカバトらの文献参照 ）を１次（供与体）および改変抗体中で比較する。この位置のＡｒｇ残基が不変 部Ｈ鎖のＣＤＲの１０１番目のＡｓｐ残基と相互作用すると考えられる。
９４番目のアミノ酸が、１次抗体のフレームワーク中に存するが改変抗体中に存 しないＡｒｇからなる場合には、改変抗体においてＡｒｇ９４を含む別のＨ鎖遺 伝子が生産される。それとは逆の状況において、改変抗体のフレームワークが、 ９４番目の、へｒｇ残基を含むが、１次抗体のフレームワークが９４番目のＡｒ ｇ残基を含まない場合には、９４番目に本来のアミノ酸を有する別のＨ鎖遺伝子 を生じる。いかなる分析にも先立ち、この理論に基づいて調製された別のプラス ミドを、高親和性改変抗体の生産に関して試験する。
２　カバト（上で引用のカバトらの文献参照）により定義されたＣＤＲの４つの 残基中のフレームワークのアミノ酸を１次抗体および改変ＣＤＲ−置換抗体中で 比較する。相違がある箇所において、それぞれの領域（例えばＶＨＣＤＲＩの上 流）に関して、その領域の特異的アミノ酸を改変抗体の対応する領域のアミノ酸 と置換し、少数の改変遺伝子を得る。次いで、この理論にもとづいて調製された 別のプラスミドを高親和性抗体の生産に関して試験する。
３　１次抗体および改変抗体中のフレームワークを比較し、サイズあるいは疎水 性に大きな変化のある残基に注目する。この理論に基づいて、１次抗体の対応す るアミノ酸により示された個々の注目されたアミノ酸に関して別のプラスミドを 調製し、かかる別のプラスミドを高親和性抗体の生産に関して試験する。
該方法は、Ｒ３Ｖに特異的なＨｕＲ９Ｖ１９ＶＨ／ＶＫの高親和性改変抗体の銹 導体の生産により例示される。Ｒ８Ｖ１９ＶＨおよびｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨの間 の〜′Ｈ遺伝子配列の比較は、配列番号　１９のＦ蛋白の９１−９４番目の開の アミノ酸において４つのうち３つが異なっており、そのことがＣＤＲ３に近接し たフレームワーク配列を定義するということを示している。
よって、Ｒ３Ｖ１９ＨＩＪＩＣＤＲおよび９１−９４番目の４つのアミノ酸のフ レームワーク配列を先の実施例記載のヒト・フレームワーク中に挿入することに より、プラスミドｐＨｕＲ３〜’１９ＶＨＦＮＳ　（図２０）を調製する。変異 用オリゴヌクレオチド部位を用いて、次のオリゴヌクレオチドを、Ｍ１３中のＨ ｕＲ３Ｖ１９ＶＨ遺伝子の変異に用いる。
［配列番号　４２コ　ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ−５’ＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＡ 、へＴＴＡＣ，ＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＣＧ３’ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳおよび ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫ　（図２２）により同時形質転換された細胞系は２次ヒト 化抗体、ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＫ（以後Ｒ５Ｈｚ１９ と称す）を生じる。界面活性剤により抽出され、ウィルス感染した細胞から：Ｊ ！Ｊ製した尺ＳＶ抗体への結合について、この抗体を試験シタ。マ’ｙス−Ｒ５ Ｖ１９ＶＨに関するＨｖＲ８Ｖ１９ＶＨ／ＶＫＩ：おける９１−９４番目のｖ１ ４の残基の置換は抗原結合レベルを部分的に回復させた。ＨｕＦＮＳ結合特性に ついての付加的な分析を、変化していないＡ型Ｒ３Ｖ　（ロング株）を抗原とし て用いるＥＬＩＳＡを用いて行った。かかる付加的分析からのデータは、変化を 受けておらず、かつ変性していないＲＳＶへの結合能力において、ｍＡｂ　Ｒ３ Ｖ１９およびヒト化Ｒ３Ｈ２１９抗体の間に何等かの相違があったとしても、ご く僅かであることを示す。この付加的分析はまた、変化していないウィルスへの ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ＶＫの検知しうる結合を示したが、一方では、Ｒ３Ｖ１９ またはＲ８）（Ｚ１９のいずれかについては、格段に弱い結合を示しニ。
よって、このさらなる分析のデータ（ツ、変化していない抗原に対する親和性が Ｒ３Ｈｚ１９　ｍＡｂにおいて回復されることを示唆する。ＲＳＶ　Ｆ蛋白に対 するＲ　Ｓ　ＨＺ　］、　９の特異性は、ＣＨＯ細胞中で弁用された不完全な可 溶性Ｆ蛋白構造を用いた慣用的なウェスタン・プロット分析により示された。
実施例１３−１上」几Ｍ望の一象疫蚤光分析Ｒ３Ｖに特異的なヒト化抗体の潜在 的な治療上の有用性を確認するために、臨床的に単離された２４種のＲＳＶに対 する結合について免疫蛍光分析を行った。
ブリスｌ−ル・パブリック・ヘルス・ラボラトリ−（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｐｕｂｌ ｉｃ　）ｌｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（英国グラストル）により１９ ８３−１９８４年の冬期に子供から分離されたＲ　Ｓ　Ｖを得、王な亜種に分類 した。】３の分離体を亜種への血清型に分類し、１１の分離体を亜種に分類した 。ＲＳ　Ｖ分離体に感染した＋４　ｅ　Ｉ　ａまたはＭＡｌｏ、！ｌ細胞を組織 培養にて増殖させた。細胞が細胞変性効果を示した時点て、２０ｍ１のＰＢＳ中 ０．０２％（ｗ／ｖ）エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）［英国 プールのビー・ディー・エイチ・ケミカルズ・リミテッド（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃ ａｌｓ　Ｌｔｄ、　、　Ｐｏｏｌｃ、　ＵＫ）社製］および３ｍｌのＰＢＳ中０ ．２５％（Ｗ／ｖ）トリブンノを添加し、細ｈａｔ濁液をＰＦＴＥで覆ったスラ イドグラス（ポリテトラフルオロエチ１）／で覆ったスライドグラス）［英国エ セソクスのヘンドリー（Ｉｌｃｎｄｌｅｙ、　Ｅｓ５ｅλ、ＵＫ）社製］のウェ ル中に滴下した。３７℃で３時間イノギュベートした後、スライドグラスを乾燥 させ、８０％アセトン中で固定した。細胞にモノクロナール抗体（すなわち、ヒ ト化抗体ＲＳ　ＨＺ　１９またはネズミ・抗体Ｒ５Ｖ１９のいずれか）を重層し 、１時間室温放置した。じゅうぶん洗浄した後、フルオレセイン結合ウサギ・抗 −マウス・ＩｇＧ［オランダ国ティルブルグ（Ｔｉｌｂｕｒｇ）のノルディック ・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｄｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製コまたはフ ルオレセイン結合ヤギ・抗−ヒト・ＩｇＧ１［米国アラバマ（＾ｌａｂａｍａ） 州プリンガム（Ｂｒｉｎｇｈａｃ）のサザン・バイオチクノロノー（Ｓｏｕｔｈ ｅｒ口Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製コのいずれかを添加し、インキュベー トを繰り返した。さらに洗浄した後、細胞をグリセロール中に！き、紫外線下で 試験した。
ヒト化抗体Ｒ５Ｈ２１９およびネズミ・抗体Ｒ５Ｖ１９についての比較上の免疫 蛍光の結果は、臨床分離体の１００％がヒト化およびネズミ・抗体の両方に認識 されたことを示したつかかるデータは、ヒト化抗体が、主にＲ３Ｖ亜種からなる 大部分の臨床分離体を認識する能力を有することを示した。
次いで、ヒト化抗体Ｒ５Ｈ２］、９を、融合阻害分析にて生体内における生物学 的活性について試験した。ＭＡ１０４細胞のり濁液を、細胞当たりｇ染の多重度 （ｍ、ｏ、　ｉ、）　０．０１ＰＦＵ　（プラーク形成単位）にて感染させた。
３７℃で】時間インキュベートシフた後、１０’／ｍｌの細胞懸濁液２ｍｌを試 験管中のカバーグラスに分配した。３７℃で２４時間インキュベートした後、培 養物をヒト化抗体Ｒ３Ｈ２１９の希釈物を含む培地に移した。２４時間後、カバ ーグラス培養物をヌクノール中で１０分間固定し、メイ・グルンワルド（ｉｌａ ｙ　Ｇｒｕｎｗａｌｄ）染色１ｆｆｌ［英国プールのＢＤＨケミカルズ社製コで 染色した。巨細胞の融合頻度を阻害憚ることにおいてＲＳＨ２１９の６Ｉｆを増 加させる効果は、Ａ型Ｒ３〜ｒにより誘導される細胞融合の阻害におけるヒ１− 化抗体ＲＳ　ＨＺ　１９に見られる生物学的活性を示した。さらなる研究は、Ｒ ３Ｖ１９対Ｒ３Ｈ２１９の融合阻害力価が同等であることを示し、天然のウィル ス抗原に対する親和性がヒト化Ｒ３Ｈ２１９においてじゅうぶんに回復している というさらなる証拠を提供した。Ａ型Ｒ３Ｖにより誘導される細胞融合を阻害す ることを示すために上で用いた方法と類似の方法を用いて、ヒト化抗体ＲＳ　Ｉ −（Ｚ　ｌ　９はまたＢ型Ｒ８Ｖ　（８／６０株）により誘導される巨細胞の融 合阻害が投与量依存的であることを示した。
次いて、ヒト化抗体Ｒ３Ｉ（２１９を、ＲＳＶ−マウス感染モデルにおける生体 内での生物学的活性について試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス［チャールズ・リバ ーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉνｅｒｓ）社　特異的な病原体が存在しないカテゴ リー４の榎準のマウスコを、１０″ＰＦＩＪのヒトＲ３Ｖ　、へ２株に鼻腔内よ り感染させた［ティラー（Ｔａｙｌ、ｏｒ）ら、インフエク／ヨン・アンド・イ ムニテイ−（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ１吐ｕｎｉｔｙ）　、４３・６４９− ６５５　（１９８４）　］。群に分けたマウスにウィルス感染１日前または感染 ４日（麦のいずれかにおいて２５μｇのヒト化抗体を投与した。
抗体の投与は鼻腔内または腹腔内投与のいずれかによ、った。Ｒ３Ｖ感染５日後 、マウスをと殺し、ＲＳＶ　ＰＦＵに関して肺を分析した［上で引用のティラー の文献参昭コ。データは、マウス当たり２５μｇの１回の投与で、Ｒ３Ｉ−ＩＺ １９はＲｓｖ＝染の予防および治療に極めて効果的であることを示した。
上記方法と同様の方法でＢ型Ｒ３Ｖ　（８／６０株）に感染させられたマウスに 予防的に投与した場合にも、ＲＳ　ＨＺ　］、　９は生体内において活性を示し た。そのうえ、上記方法と同様の方法てＢ型Ｒ３Ｖ（８／６０株）に感染させら れたマウスに予防的に投した場合、ヒト化抗体ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ＶＫも生体 内において活性を示した。
実施例１４−静脈注射または朦腔内注射した後のＲ３Ｈ２１９血中レベルの比較 ５匹のメスのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃマウス（体重的２０ｇ）に腹腔内生射によ り５０μｇのＲ５１（ｚｘ９（ＣＨＯ）を接種し、別の５匹に静１１１ｉｉ注財 により５０μｇのＲ８Ｈ２１９（ＣＨＯ）を接種した。２時間、１．４．７．１ ４．２１および４６日後、マウスの尾から採血し、血清中のＲ３Ｈ２１９のレベ ルを以下の２種の異なるＥＬＩＳＡにより測定した。
（ｉ）　ＲＳＶ　Ａ２株に感染した、または感染していなし用ｅｐ−２細胞の溶 解物でプレートを１い、次いてマウス・血清およびＨＲＰ−抗一ヒト・ＩｇＧて 希釈した。
（ｉｉ）　２００　ｎ　ｇの抗−イディｆタイプｍＡｂ　Ｂ１２でプレートを覆 い、次いてマウス血清およびＨＲＰ−抗一ヒト・ＩｇＧて希釈した。
両方の分析は基本的に同一の結果を示したが、一方ては、Ｂ１２　ＥＬＩＳＡは 、より感受性が高かった。接種２時間後、Ｒ３Ｈｚ１９のマウス血清レベルは、 腹腔内注射したものに比べ、静脈注射によるものは５倍高かった。しかしながら 、Ｒ３Ｈ２１９の力価は、接種２４時間後、どちらの群のマウスにおいても等し かった。Ｒ５Ｈ２１９のレベルは少なくとも接種ｉ＆４日間は維持され、７日目 で減少し始めた。これ以後、静脈注射で接種されたマウス・Ｒ３Ｈ２１９血清レ ベルはｐ、ｍｔ＝減少したが、腹腔内注射されたマウス・Ｒ３Ｈ２１９レベルは よりゆっくりと減少した。これらの結果を表５に示す。
静脈注射または腹腔的注射した後のＲＳ　Ｔ−Ｉ　Ｚ　１９のマウス・血清レベ ルの比較接種されたマウスにおけるＥＬＩＳＡ力価の１０ＪＬＬ。
Ｏ，１３，５土０２　４６±０．２　３．２±０．１　４．２±０．１１３．１ ±０２４２土０．０４　３．３±０．０４　４．３±０．１４３．２±０１４２ ±０．１　３．３±０２４２±００４７３．１±０．２　３．７±０．３　３． ６±０．２　３．９±０．１Ｍ　＜１．５　＜１．５　３．１±０．２　３．８ ｔ０．１２］　＜１．５　＜１．５　２．３±１．３　３．５±０．２４６　Ｎ Ｄ　＜１．５　ＮＤ　３．３±０．１静脈注射したマウスにおイする、マないし １４日の開のＲ３Ｈｚユ９の急激な減少が免疫応答によるものかどうかを調べる ために、ＥＬＩＳＡにて、Ｒ３Ｈｚ１９に対する抗体に関して血清を試験した。
５０量ｇのＲ５Ｈ２１９でプレートを覆い、次いでＤ２１マウス・血清およびＨ ＲＰ−抗マウス・ＩｇＧで処理した。
表ｂ（二丁しγ二よつ（ユ、静廓匝射（Ｉ金種されｌ−イ・ンスは２１己邑を二 ＲＳ）ｆＺ２９に対する抗体を発生させたが、腹腔的注射されたマウスはＲ５Ｈ ２１９に対して何等検出可能な抗体を有していなかった。これらの結果は、マウ スにおいて腹腔的注射に続いてＲ３Ｈ２１９ｉ！ｉｌ性が生じたが、静脈注射で はこの抗体についての耐性を生じなっかったことを示唆する。Ｃ）（○細胞また は骨髄幹細胞から調製されたＲ８Ｈ２１９を腹腔的注射または静脈注射でマウス に接種し、これらの結果をさらに確認した。
表６ ５０　ｕ　ｇのＲ３Ｈ２１９（ＣＨＯ）を静脈注射または腹腔的注射で接種され たマウス・血清中のＲ３Ｈｚ１９に対する抗体応答接種されたマウス　旦↓−Ｉ ＳＡカ（ｉ［１ｉ（７）　Ｉ　Ｏｇ　＋ｏ＊静脈注射　２．５±０２ 腹腔内注射　＜１．５ ＊５０量ｇのＲ３Ｈ２１９（ＣＨＯ）でプレートを覆った実施例１５−臨床分離 物の認識 ビオチン標識したＲＳＨ２１９（ＢＯｌ、２．５Ｍｇ／ｍｌ　；　１９９２年９ 月２９日スミスクライン・ビーチャムから得た）およびＦＩＴＣ−ストレプトア ビノン（ノグマ）を用いた、Ｒ３Ｖ−感染および見未感染ウシ・精巣細胞につい ての予備実験は、１／４０１にのビニｔｆンーＲ３Ｈ２１９はｌ／８０量のＦＩ ＴＣ−ストレプトアビノンとともに、Ｒ３Ｖ−感染細胞に特異的な蛍光を与えた 。
ＲＳ　Ｖ感染で入院している子供からの上咽頭吸引物の９枚のスライドグラス標 本を、英国ニューカッスル−アブオン−タインの王立ビクトリア診療所のダブリ ュー・丁イチ・ナー・１ラボレーテイ′／グ・七゛ツタ−・フォー・１１フ７１ ノ゛ノス・アンド・リサーチ・オン・ラピッド・ラボラトリ−・バイタル・ダイ アグノノス（ＷＨＯＣＣｏ１１ａｂｏｔａｔｊｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｒｅ ｆｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ５ａｅｒｃｈ　ｏｎ　Ｒａｐｉｄ　Ｌａｂ盾窒≠ 狽盾窒■ Ｖｉｒａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、　ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ　 Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ、　Ｎｙｅｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔ凾獅■A　Ｅｎｇｌ ａｎｄ） から得た。各スライドグラスの３つの部分に同じ試料を入れである。１つ目の部 分の試料は、その技術データの指示どおりにイマゲン”　（Ｉｍａｇｅｎ”）　 Ｒ３Ｖ　（ノボ・ノルディスク・ダイアグノスチクス・リミテッド（Ｎｏｖａ　 ＮｏｒｄｉｓｋＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ）　、ケンブリツノ（Ｃａｍｂ ｒｉｄｇｅ）　Ｃ８４４ＷＳ、英国（υＫ））で染色した。２番目の部分の試料 は、ビオチン化Ｒ５Ｈ２１９の１・４０の希釈物で】時間室温で染色し、ＰＢＳ て３回洗浄し、ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンとともに１時間室温でインキュベ ートした。３番目の部分の試料は、ＦＩＴＣ−ストシブ）・アビジンのみで染色 した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンで染色した試料 を、０．０１％エバンズ・ブルー（Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅ）で５分間対比染色し 、洗浄し、８０％グリセロール中に置いた。イマゲン７′（ＩＭＡＧＥＮＴ″′ ）　ＲＳ　Ｖを用いて染色した上咽頭吸引物中のＲ８Ｖ感染細胞の試料は、Ｒ３ ＶのＮ蛋白に対するｍＡｂで染色された感染細胞に典型的な、分離した蛍光を発 する細胞質内封入物を示した。対照的に、ビオチン化Ｒ５Ｈ２１９およびＦＩＴ Ｃ−ストレプトアビジンで染色された上咽頭吸引物中のｌｌｌ１胞は、Ｆ蛋白に 典型的な顆ｆｉ状の細胞内染色物を示した。ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンのみ で染色した試料は蛍光を示さなかった。
結果を表７に示す。ビオチン化Ｒ５Ｈｚ１９は試験したすべての上咽頭吸引物中 のＲ５Ｖを認識した。ビオチン化Ｒ５Ｈ２１９で染色された試料の蛍光の強度は イマゲンＴＩ′Ｒ３Ｖで染色されたものより小さがった。しかしながら、染色さ れた細胞の数は両方の試料中て同程度と思われた。
表７ 上咽頭吸引物中のＲ５ＶへのＲＳＨ２１９の結合６５１３０２１０２／８８　＾ 　＋＋＋＋　＋＋＋７４３０１５１０３／８８　＾　＋＋＋＋＋９９９７　１６ １０７／８５　Ｂ　＋＋＋＋　’　−＋＋７９２０　２２１０３／８５　Ｂ　＋ ＋　＋８１９５２０／１１／９１　Ｎｌ）　＋＋＋＋　＋＋＋８８１８　１３／ １２／９１　ＮＤ　＋＋＋＋　＋＋＋８８４５１４／１２／９１　ＮＤ　＋＋　 ＋９４９５　１６１０１／９２　ｔすＤ　＋＋＋　＋＋９７９５　０ｇ１０１／ ９２　ＮＤ　＋＋＋　十十÷これらの研究は、ＲＳＨ２１９が、試験した範囲で は上咽頭吸引物のすべてのＲ３Ｖをａ＝ｉすることを示す。
３匹の１ないし２週齢の体重４３ないし５５ｋｇの無菌の子ウシに１５ｍｇのＩ Ｗ製つ＞−ｍＡｂ　Ｂ４を気管内接種し、もう３匹にはＰＢＳを気管内投与した 。
２４時間１麦、すべての子ウシを約１０’ｐ　ｆ　ｕのウシ−Ｒ５Ｖのスヌーク （Ｓｎｏｏｋ）株で鼻腔内および気管内感染させた。肺炎で死んだ子ウシの肺が らつ戸Ｒ５Ｖのスヌーク株を単離し「トーマス（丁ｔ＋ｏｍａｓ）ら、プリティ ノノユ・ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・バ□ｙｏ／−（Ｂｒｉｔ、Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｐａｔｎｏｌ、）　、６５　：　１９−２８　（１９８４）１．２次 ＣＫ細胞を増殖させた。感染後、上咽頭から綿棒でかき取った試料を毎日得て、 感染７日目に子つ７をと殺した。８００ｍ１のＰＢＳで肺を満たすことにより肺 洗浄液を得た。肺洗浄液を１３００ｇで遠心分離し、細胞ペレットを５ｍｌの培 地に再懸濁した。すべての試料を２次ＣＫ単層上のＲＳＶについて分析した。
ＲＳＶのウシ株で感染させる前に、ｍＡｂ　Ｂ４で２４時間子子ウシ処理するこ とは、７日間の感染にわたって上咽頭からのウィルス流出に対して何の効果もな かった。しかしながら、下表８に示したように、Ｒ３Ｖ３Ｖ感染後にＢ４で処理 された子ウシの肺からごく僅かのウィルスしか回収されなかったか、あるいは全 く回収されなかった。ｍＡｂ　Ｂ４を与えた子ウシは肝障害を起こさなかったが 、対照動物は肝障害を起こした。
表８ 子つ／におけるＲ３Ｖ感染に対するウシ・ｍＡｂ　Ｂ４の予防的効果Ｂ４　ｄ− １＊　１０９７　２．４　＜０．７　＜１１２３０　３．５　０．７　０ １２４２　３．６　＜０．７　＜１ なし　１０９８　２．２　３．２　９ １２３１　＜０．７　３．２　６ ウノＲ３Ｖ　（ＢＲ３Ｖ）で感染させる２４時間前に、１５ｍｇの８１３または １５ｍｇのＢ１で、子ウシを気管内から処理した。ｍＡｂ　Ｂｌはマウス中では 非中和的かつ非防御的であるが、補体を固定する抗−Ｆ抗体である（ケネディー ら（１９８８））。Ｂ１３を与えた子ウシの肺においてウィルス力価の減少があ るが、ＰＢＳを与えた対照の子ウシと比較するとウィルス力価の相違は統計学的 に有！ではなかった（ｐ＝０．０７）（図８）。しかしながら、対照と比較した 場合、Ｂ１３を与えた子ウシの肝障害の重篤性においては統計学的に有意な減少 があった。対照と比較すると、Ｂ１を与えた子ウシの肺中のウィルスのレベルま たは肝障害の重篤性のいずれにおいても有意な相違はなかった（表９）。
これらの研究は、子つ／においてはＢ４はＢ１３よりもＲ３Ｖ感染に対して防御 的であることを示す。さらに、子ウシにおいては防御的でないが、非防御的であ り補体を固定するｍＡｂは肝障害を悪化させることはない。
表９ 子ウシにおけるＲ３Ｖ感染に対するウシ・ｍＡｂの予防的効果Ｂ４ｄ−１３５， ０±０　３９±０．７　１　＜ｏ、７”　＜１″′Ｂ１３　ｄ−１４４，５±０ ．６　２．９”０．２　２　１．３”１．５’２±２．６ｅＢｉｄ−１４４，８ ±０５　３２±０．７　４　２．６±１．８’　５．５±２．４１ＰＢＳ　ｄ− １９４，４±１．２　３叶０．５　９　３．１±１．５　１０．５±７０’ＰＦ Ｕ／ｍｌのｌｏｇ＋ｏ値 ５受動免疫された動物が有意に対照と異なる確率。ｐ＜Ｑ、１’ｐ＝０．０７； 　’ＮＳ：　’ｐ＜０．０５実施例１８−Ｂ４、Ｂ１３およびＢ１４のクローニ ングおよび配列決定細胞ｆｆｆＲＮＡをファバロロ（Ｆａｖａｌｏｒｏ）ら、メ リンス・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ）　、６５°７１ ８−７４９　（１９８０）の方法によりＢ４、Ｂ１３およびＢ１４ハイブリドー マ細胞系から調製した。ウシ・γ−１およびγ−２不変部領域遺伝子の５“末端 に相補的なプライマー、ＢＣＧＩＦＯＲ・　５゜ＴＴＧΔＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴ ＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧ３’　［配列番号　２９］およびウシ・ 不変部領域遺伝子の５°末端に相補的なプライマー、ＢＣＬＩＦＯＲ：　５’　 ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧ３’　［ 配列番号　３０］を、それぞれ［ｇＨ鎮（ＶＨ）およびＬ鎖（Ｖ　Ｌ）可変部領 域ｃＤＮＡの合成に用いた。
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成反応系は、全体積５０μｍ中、２０μｇのＲＮＡ、０．４μ ＭのＢＣＧＩＦＯＲまたはＢＣＬＩＦＯＲ，各２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ ＳｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−トＩＣＩ　ｐＨ７，５，１０ ｍＭＤＴＴ、３ｍＭ　ＭｇＣｈおよび２７ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤［英国ミ ルトノ・ケインズ（ｌｌｉ　１　ｔｏｎ−Ｋｅｙｎｅｓ）のファルマノア社製］ からなる。試料を７００Ｃで１０分間加熱し、次いでゆっくりと３０分以上かけ て４２°Ｃに冷却しｔこ。次しλて、１００μＮ１のＭＬＶ逆転写酵素［英国ペ スリーのライフ・テクノロジー社製］を添加し、１時間インキュベートを続けた 。
次いで、＼゛ＨおよびＶＨＣＤＮＡを、サカイ（Ｓａｋａｉ）ら、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２３９　：　４８７−４９１　（１９８８）記載の方法に よりポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。ＰＣＲ用に用０たプライ マー（′！、ＢＣＧＩＦＯＲＳＢＣＬＩＦＯＲ。
１配列番号　３１］■ト１１８ＡｃＫ・５°　、ＡＧＧＴ　（Ｓ）（Ｎ・１）（ Ｒ）ＣＴＧＣＡＧ　（Ｓ）ＡＧＴＣ（Ｗ）ＧＧ３’［配列番号　３２：〜’Ｌ２ ＢＡＣＫ ５゛　ＴＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣ（Ｋ）　ＣＡＧ　（Ｓ） 　（Ｍ）ＧＣＣＣＴＣ３°である。
ＶＨＩＢＡＣＫはオルランディ　（Ｏｒｌａｎｄｉ）　、ら、プロノーディンゲ ス・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ’　１＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　。
しＳへ）８６　：　３８３３−３９３７　（１９８９）により記載されてＬする 。ＶＬ２Ｂ、八ＣＫの配列は、ヒト・ラムダ可変部領域［上で引用のカッくトら （１９８７）の文献］の５゛末端に関して挙げられた核酸配列を基礎としてＬ） る。
ＶＨ，ＤＮＡ／ブーｙイマ−ｉｊ！ａ物は、５　μＩ　のＲＮＡ／ｃＤＮ、Ａノ ＼イ”：ｆ’）　ノＦおよび０５μ〜１０ＢＣＬＩＦＯＲおよび〜’Ｈ２ＢＡＣ Ｋプライマーカ１らなる。これらの混合物に各２５０μＮ１のｄＡＴＰＳｄＣＴ Ｐ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，５０ ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭＭｇＣ１２，０，０１％（ｗ／　ｖ　）ゼラチン、０ ，０１％（ｖ／ｖ）ツイン２０．００１％（Ｖ　／　Ｖ　）ノニデノトＰ４０お よび５ユニツトのアンブリタック（＾ｍｐｌｉＴａｑ）「セトス（Ｃｅｔｕｓ） 社製コを添加した。試料を９４℃３０秒；５５℃３０秒。
７２℃４５秒の加熱サイクルに供し、７２℃５分間の処理にて終了した。クロー ニングおよび配列決定用に、増幅したＶＨＤＮＡを低融点アガロースゲルおよび エリューチソプ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄカラムクロマトグラフィー［ドイツ国ジュ ッセルドルフの７ユライヒヤー・アンド・ツユエル社製］にて精製し、ファージ Ｍ１３　［英国ミルトン・ケインズのフフルマンア社製］中にクローン化した。
〜’ＨＤＮＡをＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ１断片として同様に消化したＭ１３ｍｐ１８ ／１９［英国ミルトン・ケインズのファルマンア社製］中にクローン化した。
〜’Ｌ　ＤＮＡをＳｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片として同じ酵素で消化したＭ１ ３ｍｐ１８／１９中にクローン化した。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ［ファルマンア 社製］を用い、ノデオキシ法Ｕサンが−（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロン−ディンゲ ス・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ”１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＩＩＳ＾）７４　：５４６３−５４ ６７　（１９７７）］により、代表的なりローンの配列決定を行った。
可変部領域遺伝子の翻訳により得られたアミノ酸配列を既知のＶＨおよびＶＬ配 列と昭合し、ＣＤＲの同定を可能にした。
Ｂ４および見掛は上実質的に同一のＢ１３およびＢ１４抗体のＶＨおよびＶＬの アミノ酸配列を図３Ａおよび図３８　（ＶＬ）ならびに４Ａおよび４Ｂ（ＶＨ） に示す。Ｂ４配列を、それらの間の相同性を示すために８１３／Ｂ　１４配列の 上Ｂ４のキメラなＨ鎖を発現するベクターを構築するために、Ｂ４ＶＨ遺伝子を 〜・１１３クローン（実施例１８）から、オリゴヌクレオチドＶＨＩＢＡＣＫ　 （実施例］８記載〕および〜’ＨＩＦＯＲ（５’　ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧ ＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＡＧ３’　［配列番号　４３］を用い て、オルランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）ら、プロン−ディンゲス・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１＾ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ）８６　：　３８３３−３９３７　（１９８９）に より記載）の記載のようにしてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、５ ０μｍの体積中、０５μｍのＭ１３ファージ上清、０．５μＭの各ｄＡＴＰＳｄ ＣＴＰＳｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｍＭ　ＫＣＩ、２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５ −ＨＣＩ　ｐＨ８，８，１０ｍＭ　（ＮＨ４）２Ｓ○４．２ｍＭＭｇ５０４．０ ．１％トリトンＸ−’１００および１ユニツトのベント（Ｖｅｎｔ）　ＤＮＡポ リメラーゼ（：、−−イングランド・バイオロジー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）からなる。試料を９４°Ｃ３０秒、５０６Ｃ３０秒、７ ５℃１分の加熱サイクルに】５回供し、！＆後に７５°Ｃ５分間加熱して終了し た。増幅したＤＮＡを低融点アガロースゲルおよびエリューチノプ（Ｅｌｕｔｉ ｐ）　−ｄカラムクロマトグラフィー［ドイツ国ジュッセルドルフのンユライヒ ャー・アンド・ツユニル社製コにて精製した。ＤＮＡをＰｓ　ｔ　ｌ−Ｂｓ　ｔ ＩＩ断片として同様に消化したＭ１３ＶＨＰＣＲＩ　（上で引用のオルランディ らの文献）中にクローン化した。選択クローンの完全性をヌクレオチド配列によ り確認した。
ヒト・ＩｇＧ１不変部領域がすでにベクター中に存在することを除いて、Ｂ４Ｖ Ｈを実施例１１記載のごとく発現ベクター中にクローン化した。そのプラスミド をｐｓＶｇｐｔＢ４ＢｏＶＨＨｕ１ｇＧ１と命名した。
Ｂ４のキメラなＬ鎖を発現するベクターを構築するために、ベクターＭｌ　３Ｖ ＫＰＣＲＩ　（上で引用のオルランディらの文献）をまず修飾し、カッパーより もむしろラムダ鎖可変部領域を導入させた。このことは、オリゴヌクレオチド、 ５’　ＴＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣ ＡＣＣ３°　［配列番号　４４］を用いて、存在するＶＫ遺伝子の５゛末端をＫ Ｒさせること、およびオリゴヌクレオチド５°　ＡＴＴＣＴＡＣＴＣＡＣＧＡＣ ＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴ３°　［配列番号　４５コを用いてそ の３゛末端を変異させることにより達成され１、ＨｐａｌおよびＮｃｏｌ制限部 位がそれぞれ導入された。該ベクター中のＮｃｏ１部位存在を、オリゴヌクレオ チドの５゛ＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧ３’　［配列 番号　４６］を用いて除去した。
Ｍ１３ＶＫＰＣＲ１を大腸菌ＲＺ１０３２　、（ｄｕ　ｔ−ｕｎｇ−）中で増殖 させ、チミンのかわりにウラシルを有する１重鎮鋳型ＤＮＡを生じさせた。０． ５μｇのＤＮＡを、ｌｐｍｏｌの上記オリゴヌクレオチド３りん酸のそれぞれ、 および挿入ＤＮＡの下流のＭ１３鋳型にアニーリングするｌｐｍｏ　Ｉのオリゴ ヌクレオチドＶＫＰＣＲＦＯＲ（５°　ＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴ ＡＣＧＣ３゛）［配列番号、４７コと混合した。２０μｍの５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ 　５−ＨＣＩｐＨ７，５中、２５ｍＭ　ＭｇＣｈ、６３ｍＭ　ＮａＣ］とともに ８０℃で５分間加軌することにより、オリゴヌクレオチドを鋳型にアニーリング させた。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを最終濃度２５０μＭと なるように添加し、０．５ユニツトのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ社）およ び０．５ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ社）とともに同じ緩衝液中に、 ＤＴＴを７ｍＭ。
Ａ　Ｔ　Ｐを１ｍとなるように添加した。３０μｍの反応液を１時間室温でイン キュベートし、ＤＮＡをエタノール沈澱した。
親のＤＮＡＨに切れ目（ｎｉｃｋ）を入れるために、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．ｍ ＭＤＴＴ、および１ユニツトのウラノルＤＮＡグリコシラーゼを含む１１ｍｇ／ ｍ１ＢｓＡを含有する５０μｍの６０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０にＤ ＮＡを溶解し、３７℃で１時間インキュベートし、次いでＮａＯＨを０．２Ｍ１ ｍなるよう添加して５分間室温でインキュベートした。ＤＮＡをエタノール沈澱 し、２０μｍのＴＥに溶解し、挿入断片をＰＣＲで増幅した。反応混合物は、２ μｍの変異ＤＮＡ、各０５μＭのＶＫＰＣＲＦＯＲおよびＶＫＰＣＲＢＡＣＫ（ ５’　ＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡ３’　）［配列番号　４ ８］、各２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ 、００１％ツイン２０．０．０１％ゼラチン、領０１％ＮＰ４０および２ユニツ トのサーマラーゼ（ＩＢＩ社製）を５０μｌ中に含有していた。増幅は、９４℃ ３０秒、５００Ｃ３０秒ニア２℃１分で１５サイクル行い、７２６Ｃ５分で終了 した。
生成したＤＮＡをＨｉｎｄｌｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＭ１３ｍｐ１９中にク ローン化した。代表的なりローンを配列決定し、３つの部分におけるクローン変 異株を選択し、Ｍ１３ＶＬＰＣＲ１と命名した。
オリゴヌクレオチドＶＬ３ＢＡＣＫ　（５°　ＴＣＴＧＴＧＴＴＡＡＣＧＣＡＧ ＧＣＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧ３°）［配列番号　４９コおよびＶＬＩＦＯＲ（ＧＧ ＣＴＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣ３’　）［配列番号　５ ０］ならびにＢ４ＶＨに関して上で記載したベントＤＮＡポリメラーゼを用いて 、Ｍ１３クローン（実施例］８）からＤＮＡを増幅することにより、Ｂ４ＶＬの 末端にＨｐａｌおよびＮｃｏｌ制限部位を導入した。生成したＤＮＡを精製し、 ＨｐａｌおよびＮｃｏ＋で消化し、同様にして消化されたＭ１３ＶＬＰＣＲＩ　 ＲＦＤＮＡ中にクローン化した。Ｂ４ＶＬを有するクローンを配列決定により同 定し、かかるクローンのＨｉ　ｎｄｌＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入断片を、実施例１１ 記載のごと＜Ｒ現ベク９−ｐｓＶｈｙｇＢ４ＢｏＶＬＨｕＶＫの構築に用いた。
発現ベクターを’ｌ’Ｂ２１０骨髄幹細胞中に同時形質転換し、形質転換体の分 泌する抗体を同定し、キメラ抗体Ｂ４ＢｏＶＨ／ＢｏＶＬを実施例１１記載のご とく精製した。キメラ抗体を、ＥＬＩＳＡにおいてＲＳ　Ｖ感染細胞溶解物への 結合についてＢ４と比較した。その方法は、ＲＳ　Ｖ感染および非感染Ｈｅｐ２ 細胞溶解物を用いた以外は、基本的には実施例１１と同様である。リポータ−抗 体は、ＨＲＰＯ−結合型ヤキ・抗−ヒト・ＩｇＧ抗体（英国フローリーダウン（ Ｃｒａｗｌｅｙ−Ｄｏｗｎ、Ｕ）：）のセータ・ラボ・リミテッド（Ｓｅｒａ− Ｌａｂ　Ｌｔｄ、　）社製）およびＨＲＰＯ−結合型ウサギ・抗−ウラ・ＩｇＧ 抗体（英国プールの／グツ社製）を１　：　１０００の割合で希釈したものを用 いた。
ウラおよびキメラ（ＢｏＶＨ／Ｂｏ〜ｒＬ）なり４抗体は感染した細胞溶解物に 結合したが、無関係なヒト化抗体は結合しなかった。対照の溶解物と反応する抗 体はなかった。異なったリポータ−抗体を用いたために、この実験からはつ／お よびキメラ抗体の開の比較を行うことができない。
？！会合体比較する別々の実験において、同じＯＤの読みを得るにはヒト・抗体 の約２５倍のウラ・抗体を要した。よって、ウラおよびキメラ抗体は結合におい てほぼ′同等である。
実施例２０−ヒト・Ｂ４ Ａ、Ｂ４ヒト化Ｈ鎮 部位特異的変異法を用いてつ７・ＣＤＲをヒトＮＥＷＭ　ＶＨフレームワーク上 に移すことによりＢ４ＶＨをヒト化した（上て引用したサウルら、１９８７年の 文献）ｅ以下のウラ・ソレームヮーク残基（上で引用のカバトら（１９８７）に よる番号づけ）を、そのＣＤＲの横のヒト化ＶＨ中に組み込んだ（図１０参照） 。
Ｐｈｅ２７．５ｅｒ２８、Ｌｅｕ２９は超可変部領域には存在しないのであるが 、これらの残基はＣＤＲＩの構造的環状部分の一部である（コチ力およびレスク （Ｃｈｏｔｉｋａ　ａｎｄ　Ｌｅｓｋ）　、ツヤ−ナル・オブ・モレキュラー・ バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　、１９６　：　９０１　９１７　（ １９８７）　）。
Ｌｅｕ４８はＣＤＲ２に隣接しており、この残基は、他の新しく構築した抗体の 結合に影響した。
Ａｒｇ７１は他の新しく構築した例にいおて重要であることが示され、ＣＤＲ１ および２のバッキングに含まれる（テラモト（Ｔｅｒａｗｏｔｏ）ら、ジャーナ ル・オブ・モレ番ニラ−・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１１．Ｂｉｏｌ、）　、２１ ５・１７５−１８２　（１９９０））。
Ｌ　ｙ　ｓ　９４はこの位置において、塩橋を形成することによりＣＤＲ３のコ ンフォーメーションに影響しうる（上で引用のコチ力およびレスク（１９８７） の文献）。
鋳型ＤＮＡはＮｉ１３ｍｐ１９に基づくものであり、ＮＥＷＭフレームワークお よび無関係なＣＤＲからなるＶＨ遺伝子を含み、リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｎ）ら、不イチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３３２　：　３２３−３２７　（１ ９８８）記載のものと類似である。５ｉ１３ＶＬＰＣＲ１の構築に関して上で記 載したように、変異を行った。
用いたオリゴヌクレオチドは ＶＨＣＤＲＩ　：　５’　ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＴＡ ＧＣＴＧＣＴＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣ３’　［配列番号　５１コ Ｖ）（ＣＤＲ２：５°　ＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＴ ＧＧＧ　Ｔ　Ｔ　ＡＴ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＣＧ 　ＣＣＡ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　ＣＧ　Ｔ　ＣＴ　ＣＣへ、へＧＣＣ，へ ＣＴ　ＣＡ　Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＣ３°　［配列番号　５２］ＶＨＣＤＲ３：　５° 　ＣＡＡＧＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＣＧＣ ＣＣＴＴＧＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＡＣ ＣＡＡＣＡＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧＡＣＣＧＣ３°　［配 列番号　５３コ および一般的なＭ１３／ｐＵＣ−２０プライマー、５°　ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧＴ３°　［配列番号　５４コである。
３つのＢ４　ＣＤＲすべてを含むＶＨをコードしているＤＮＡをＭ１３から切り 出し、実施例１１および１９においてキメラＶＨに関して記載された発現ベクタ ー中にクローン化し、ｐＳＶｇｐｔＢ４ＨｕＶ’ＨＨｕ１ｇＧ１を得た。
ｐｓＶｇｐｔＢ４ＨｕＶＨＨｕ１ｇＧ１を、実施例１１記載のようにしてキメラ なＬ鎖ベクター、Ｉ）ＳＶｈｙｇＢ４ＢｏＶＬＨＨｕＶＫとともｉ：同時形質転 換した。それゆえ、生じた部分的なヒト化抗体Ｂ４ＨｕＶＨ／ＢｏＶＬは、Ｂ４ Ｌ鎖のキメラなり４ＢｏＶＬＨｕＶＫとともにヒト化Ｂ４Ｈ鎖（Ｂ４ＨｕＶＨ） を含む。Ｂ４ＨｕＶＨ／ＢｏＶＬ抗体を分泌する細胞を培養し、抗体を４００ｍ １のならし培地から精製した。
ＥＬＩ　ＳＡにてＲ３Ｖ株Ａ２に感染した細胞溶解に対する結合に関して、Ｂ４ ＨｕＶＨ／ＢｏＶＬ抗体とキメラ抗体Ｂ４ＢｏＶＨ／ＢｏＶＬを比較した。この 比較は、キメラおよびヒト化Ｈ鎖の相対的な結合能力の評価を可能にした。
ヒト化Ｈ鎖ＨｕＶＨはＲＳ　Ｖ感染した細胞溶解物に結合するが、キメラＨ鎖Ｂ ｏＶＨと比較すると２ないし３倍結合能力が劣っている。
付加的なネズミ由来の残基を組み込み、結合能力を高めることを試みた。ＨｕＶ Ｈ遺伝子を変異させ、以下の変化をコードさせた　ＮＳＶに対して、７３番目に Ｔ、７６番目にＮ、７８番目にＦｏこれらの残基は、抗体結合表面の４番目の環 状構造を形成するβ−ターンの一部である。
ＨｕＶＨＮＳ〜’／ＢｏＶＬ抗体を調製し、ＥＬＩ　ＳＡを用いて、ＲＳＶのス ヌーク株で感染させた細胞の溶解物に対する結合に関して試験した。ＲＳＶの残 基の取り込みは、もともとのＨｕ　Ｖ　８以上の利点を生じなかった。
結合に影響するかも知れないＢｏＶＨおよびＨｕＶＨの間の他の１つの相違は、 ６７−７０番目のアミノ酸領域である。ウシ・Ｂ４の残基であるＬを６７番目に 、ｌを６９番目に含むようにすることは、それらの側鎖がドメイン内部を埋めて いるため、抗原相互作用に、より影響しそうであると予想される。そのうえ、６ ７番目をＬ１６８番目をＧ、６９番目を１および７０番目をＴとするブロック的 変化もまた有利であると予想される。
Ｂ、Ｂ４ヒト化り鎮 Ｂ４ＬｉａのＢ　４　Ｈｕ　’ｖ’　Ｌのヒト化した形態を、ウシ・Ｂ４ＶＬフ レームワークについての部位特異的変異法により構築し、ヒト・ＫＯＬラムダ可 変可変域領域１１参照）を生じさせた。Ｈ鎖発現ベクター上に見い出されるｇｐ ｔ遺伝子の存在に関して細胞を選択した。
ノーザン・ブロッティングを用いて、ＨｕＶＬＲＮＡが正しいサイズであるがど うかを調べた。全ＲＮＡをＢｏＶＨ／ＨｕＶＬおよびＢｏＶＨ／ＨｕＶＬ　ＦＲ ４形質転換体から調製し、ＢｏＶＨ／ＢｏＶＬ形質転換体および感染していない ＹＢ２１０を陽性および陰性の対照とした。ＢｏＶＬおよびＨｕＶＬプローブを 用いた最初の結果は、はぼ同じサイズのバンドを示した。同様の実験において、 ｃＤＮＡを各細胞系から調製し、不変部領域プライマーおよびＶＬ３ＢＡＣＫを 用いてＰＣＲを行った。３種のＬ鎖すべてについて、再び同じサイズの生成物が 得られ、重大なスプラインングの問題がないことが示された。
さらに２種のヒト化り鎖構築物−Ｌ鎖のヒト・ＲＥＩカッパー構造に基づく形態 およびヒトＫＩＭ４６Ｌラムダ鎖のフレームワークを伴ったＣＤＲに連結された し鎖を、ＫＩＭ４６Ｌ　ＶＬ遺伝子（ケイルンス（Ｃａｉｒｎｓ）ら、ツヤ−ナ ル・オブ・イムノロノー〇、Ｉｍｍｕｎ、）　、１４３　：　６８５　６９１　 （１９８９））の実際のヌクレオチド配列を用いて構築してもよい。
これがヒト化されたウシ・抗体の最初の例であると信じられている。データベー スにおいてウシ・可変部領域配列が欠けていることは、ＰＣＲ増幅用のプライマ ーを設計すること、ならびに最初のクローニングおよび配列決定のためのＤＮＡ を単離することが困難であることを意味する。
ＶＯ４の効果 ５匹のマウスからなる群に、約１０’ＰＦｕのＲＳＶのＡ２株を鼻腔内接種し、 感染４日目に、下表１０に示すように、異なる量のＲ３ＢＶＯ４を、単独または ０．５ｍｇ／ｋｇのＲ３Ｈ２１９と併用のいずれかにより腹腔的注射した。ＲＳ ■感染感染５ト目ウスをと殺し、肺のウィルスのレベルをＣＫ細胞上で測定した 。
結果を表１０に示し、Ｒ３Ｈ２１９およびＲ５ＢＶＯ４を同時に用いる治療の効 果は、相乗的というよりむしろ付加的であることが示されている。
表１０ 投与量（ｍｇ／ｋｇ）’　肺におけるＲ３Ｖ力価群　Ｒ３Ｈ２１９Ｒ３ＢＶＯ４ ＰＦＵ／ｇのＩＯｇｔ。
Ａ　０．５　−−　３．６±０７ Ｂ　Ｏ，５０，５２，２±０６ ＣＯ，５０，２５２，３±０８ Ｄ　Ｏ，５０，１２５２，６±０９ Ｅ　−−１，０’　２．１±０８ Ｆ　−−０，７５２，３±０６ Ｃｉ　−−０，６２５２，６±０７ 本発明の種々の改変および変更は上で確認、された明細書に包含され、当業者に 自明であると考えられる。かかる改変および変更は本請求の範囲の範囲内に包含 されると信じられている。
配列表 （１）一般的情報・ （１）出願人　ティラー、・ノエラルディンストット、ニドワード　ノエイ （１１、発明の名称　動物およびヒトにおける呼吸合胞体ウィルス感染治療なら びに予防用新規抗体 （ｉｉｉ）配列数、５９ （ｉｖ）連絡先 （Ａ）宛名　スミスクライン・ビーチャム・コーポレー７ヨンーコーポレート・ パテンッ （Ｂ）通り名　スウエーデランド・ロード（Ｃ）都市名・キング・オブ・プロノ ア（Ｄ）州名　ベンノルバニア （Ｅ）国名　アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ　１１９４０６−２７９９（Ｖ）コンビニーター読み込み可能な形 す（Ａ）媒体形式　フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター　ＩＢＭ　ＰＣ コンパチブル（Ｃ）オペレーティンルシステム　ＰＣ−ＤＯ８／Ｍｓ−ＤＯ５（ Ｄ）ソフトウェア　パテントイン・リリース（Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓ ｅ）（Ａ）出願番号　Ｗ　０ （Ｂ）出願日 （Ｃ）分類 （ｖｉｉ）ｆ失権データ （へ）出願番号　ＧＢ　９２０７４７９．８ＣＢ）出願日　１９９２年４月６日 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人の情報。
（八）氏名、ツヤ−ビス、バーバート　エイチ（Ｂ）登録番号：３１．１７１ （Ｃ）代理人等における処理番号＋Ｐ５０１５３（２）配り１１番号・ｌに関す る情報 （２）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１１２アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （１１）分子形態・蛋白 （ｘｌ）配列の記載：配列番号　１・ （２）配列番号　２に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・不明 （１１）分子形態　蛋白 （ｘｉ）配列の記載　配列番号・２ （２）配列番号　３に関する情報 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ・１３７アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、不明 （ｉ　ｉ）分子形態　蛋白 （ｘｌ）配列の記載　配列番号　３ （２）配列番号　４に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１４１アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー。不明 （ＩＪ）分子形態　蛋白 （ｘｌ）配列の記載　配列番号　４゜ （２）配列番号　５に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１２９アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）ｌ−ポロノー　不明 （１１）分子形態　蛋白 （ｘｌ）配列の記載　配列番号　５ （２）配列番号　６に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１０９アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態、蛋白 （Ｘ］）配列の記載　配列番号　６ （２）配列番号　７に関する情報 （１）配列の特徴 （４へ）配列の長さ　１３３アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉ　ｉ）分子形Ｑ　蛋白 （ｘｉ）配列の記載・配列番号・７・ （２）配列番号　８に関する情報・ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・１１１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （＋１）分子形態　蛋白 （ｘｉ）配列の記載・配列番号　８゜ （２）配列番号　９に関する情報 （１）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ　３４８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）Ｍの数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態：　Ｇｅｎｏ＋＋ｉｃ　ＤＮＡ（Ｘｌ）配列の記載：配列番号 ；９・ （２）配列番号　１０に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロン−・不明 （ｉ　ｉ）分子形態　蛋白 （］Ｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　６ （Ｄ）他の情報　６番目の位置のアミノ酸を、ＧｌｕまたはＧｌｎで置換しても よい。
（Ｘｌ）配列の記載　配列番号　１０ （２）配列番号：１１に関する情報。
（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　３３７塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー・不明 （＋１）分子形態　ＤへＡ（ゲノム） （ｘｉ）特徴 （Ａ）配列を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　１．　、　３３３ （ｘｉ）配列の記載　配列番号　１１ （２）配列番号、１２に関する情報。
（１）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ　１１１アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 ＣＤ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　蛋白 （ｘｉ）配列の記載　配列番号　１２ （２）配列番号　１３に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　蛋白 （ｘｌ）配列の記載　配列番号：１３ （２）配列番号、１５に関する情報 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｘｌ）配列の記載、配列番号　１５・（ｘｉ）配列の記載　配列番号、１６゜ （２）配列番号　１７に関する情報 （Ａ）配列の長さ　１１２アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トボロノー　不明 （１ｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１４．．１７３５ （Ｘｌ）配列の記載：配列番号：１８：ＡＣＴＡＴＣＴＧＣＴ　ＣＡＴＡＧＡＣ ＡＡＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＡ　ＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＣＴＧ　１ ８２５ＴＡＧＡＴＴＣＣＴＡ　ＧＴＴτＡＴＡＧＴＴ　ＡＴＡＴ　１８９９（２ ）配列番号・１９に関する情報： （１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　５７４アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子形態、蛋白 （ｘｉ）配列の記載・配列番号、１９ Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｍｅセ　 Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｍ ｅｔ　Ｓａｒ　Ｉｌｅ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａ ｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａ１Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ （２）配列番号　２０に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、４２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー・不明 （ｉ　ｉ）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位１ｔ：１．．３９ （Ｘ］）配列の記載、配列番号・２０ （２）配列番号　２１に関する情報・ （］）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子形態、蛋白 （ｘｉ）配列の記載、配列番号　２１ ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌτｈｒ　Ｖａｌ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ（２）配列番号・２２に関する情報・ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３９塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数・不明 （Ｄ）トポロノー、不明 （Ａ）配列の長さ、２０塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎮 （Ｄ）トポロジー　不明 （＋１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列番号　２８ ＣＴＣＡＧττωτＣＣττＧＣＴＴＡＧ（２）配列番号　２９に関する情報。
（１）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ　３２塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎮 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形Ｑ：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｘｌ）配列の記載　配列番号　２９ ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧ　ＡＣＴＴＴＣＧＧＧＧ　ＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡ　ＧＧ（ ２）配列番号　３０に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎮 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘ］）配列の記載　配列番号　３０ ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡ　ＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧ　ＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧ（２ ）配列番号　３１に関する情報 （］）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２１塩基対 （Ｂ）配ダリの型４核酸 （Ｃン鎖の数、一本鎮 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉ　ｉ）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載、配列番号・３１ ＡＧＧＴＳＭＲＣＴＧ　ＣＡＧＳＡＧＴＣＷに　Ｇ（２）配列番号・３２に関す る情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３４塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎮 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉｉ）分子形Ｑ：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載　配列番号、３２ ＴＴＧＡＣＧＣＴＣＡ　ＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧ　ＡＣＫＣＡＧＳＭＧＣＣＣＴＣ （２）配列番号、３３に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３４塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー・不明 （１１）分子形態：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載、配列番号　３３ （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数、−末鎖 （Ｄ）トポロジー・不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（、ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列番号　３９ （２）配列番号　４０に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　４５塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉｉ）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列の記載　配列番号。４０ ＧＣＴＴＣＧＣＡＣＡ　ＣＣＡＧＡＡＭ、ＴＣＧＧＴＴＧＧＭＡＣＴＣＴＧＴＡ ＧＡＴＣＡＧＣＡＧ　４５（２）配列番号　４１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　５１塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形管　Ｄ凡Ａ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載　配列番号　４１ ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＡＡＣＧＴＣＣＧＡＧ　ＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡ　ＡＣＣＴ ＴＧＡＡＡＧ　ＣＡにＴＡＧＴＡＧに　Ｔ　５１（２）配列番号　４２に関する 情報 （］）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　２８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー。不明 （ｉｉ）分子形態・ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載　配列番号　４２゜ ＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧ　ＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡ　ＡＴＡＧＡＣＣＧ　２［１（２ ）配列番号　４３に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３４塩基力 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トボロノー、不明 （１］）分子形管　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載　配列番号　４３ ＴＧＡＧＧＡＧＡＣに　ＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ　ＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ 　３４（２）配列番号　４４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３６塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロ／−不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列番号、４４： ＴＧＧＧＣＴＣＴＧＧ　ＧＴＴＭＣＡＣＧＧ　ＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧ　ＧＡＣＡ ＣＣ３６（２）配列番号、４５に関する情報。
（り配列の特徴： （Ａ）配列の長さ１３３ｔｊ！基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー・不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列番号　４５ ＡＴＴＣＴＡＣＴＣＡ　ＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧ　ＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴ　ＧＧＴ 　３３（２）配列番号　４６に関する情報・ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２５塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列番号　４６ ＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡ　ＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧ　２５（２）配列番号 　４７に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉｉ）分子形態：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｘｌ）配列の記載・配列番号　４７ （２）配列番号　４８に関する情報 （１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　２２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー。不明 （ｉ　ｉ）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載　配列番号・４８ ・ＣＴにＴＣＴＣＡＧＧ　ＧＣＣＡＧＧＣＧＧＴ　ＧＡ　２２（２）配列番号　 ４９に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２７塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ（ゲノム） （Ｘｌ）配列の記載　配列番号　４９ ＴＣＴＧＴＧＴＴＡＡ　ＣＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧ　２７（２）配列 番号　５０に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　２７塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数、−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態：ＤＮＡ（ゲノム） （Ｘｌ）配列の記載・配列番号　５０・ＧＧＣＴにＡＣＣＣＡ　ＴＧＧＣにＡＴ ＣＡＧ　ＴＧＴＧＧＴＣ２７（２）配列番号　５１に関する情報 （１）配列の特徴 （、Ａ）配列の長さ　４８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載　配列番号　５１： ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＡＣＡＧ　ＡＡＴＡＧＣＴＧＣＴ　ＣＡＡＴ ＧＡＧＡＡＧ　ＣＣＡＧＡＣＡＣ４Ｂ（２）配列番号　５２に関する情報。
（ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　７８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載　配列番号　５２ （２）配列番号　５３に関する情報 （ｉ）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ　１０２塩基対 （Ｂ）配列の型８核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー　不明 （＋１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載、配列番号　５３ （２）配列番号　５４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・１７塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 ＣＣ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー、不明 （１１）分子形態　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載　配列番号　５４ ＧＴＭＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ （２）配列番号　５５に関する情報 （１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　４３８アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態、蛋白 （ｘ　ｉ）配列の記載　配列番号　５５Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙ ｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓ ｎ　ＬｙｓＳｅｒ　Ａｓｎ　ｋ！：ｑ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　ＣｙＳ　Ａｓｐ　Ｔｈ ｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。
１１ｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。
４１０　４１５　、　４２０ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　工１ｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ？ｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ （２）配列番号　５６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　８アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉ　ｉ）分子形態　蛋白 （ｉｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置・１ （Ｄ）他の情報　Ｘは、Ａｌａ、ＣｙｓＳＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｈｅＳＧｌｙ。
Ｈｉ　ｓ、ＬｅｕＸＰｒｏＳＧｌｎＳＡｒｇＳＳｅｒ＋Ｔｈｒ、Ｖａ　ｌ、Ｔｒ ｐまたはＴｙｒであってよい。
（ｘｉ）配列の記載　配列番号　５６ （２）配列番号　５７に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　８アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　不明 （１１）分子形態　蛋白 （ＩＸ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　％４ｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　５ （Ｄ）池の情報　Ｘは１．へｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｉ　ｌ　ｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅ 　ｔ。
、へｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＴｒｐであってよい。
（ＸＩ）配列の記載　配列番号　５７ （２）配列番号　５８に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　８アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トボロノー　不明 （ＩＩ）分子形態　蛋白 （ＩＸ）特徴 （Ａ）特徴を表ず記号　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　６ （Ｄ）他の情報　Ｘは１．へｓｐ、ＧｌｕＳＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ。
Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈ　ｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＧｌｎであってよい 。
（Ｘｌ）配列の記載　配列番号　５８ （２）配列番号　５９に関する情報 （１）配列の特徴。
（、へ）配列の長さ　８アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トボロノー　不明 （１１）分子形態　蛋白 （ｉｘ）特徴 （、へ）特徴を表す記号　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（Ｂ）存在位置　８ （Ｄ）他の情報　Ｘは、Ａｌ　ａ、Ｃｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであってよい。
（ｘｉ）配列の記載　配列番号　５９ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＸａａＦＩＧＩＩ ＲＥ　３Ａ Ｂ１抗体可変部軽鎖の一部 Ｔ５７酸配Ｗｌｌ　配７１１番１つ　１１′Ｘｌ　：３　、、　１３１．１抗＋ ４　”ｉ　’１１：部軽鎖の一部アヨ、酸配列　配列番号　２ ＦＩＧＵＲＥ　３Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　４Ａ Ｂ４抗体可変部重鎮の一部 アミノ酸配列　配列番号　３ Ｂ１３／Ｂｌ、４抗体可変部単鎖の一部アミノ酸配列　配列番号　４ Ｂ１３ＶＨ：　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇ Ｉ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。
Ｂ１３ＶＨ：　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　’Ｉ’ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ 　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｅｅ■ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｂ Ｂ４ＶＨ：　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａ ｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＴｈｒＢ１３ＶＨ：　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　５ｅｒＢ４ＶＨ：　−Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　−Ｒ ８〜′の抗体−エスケープ変異株に対するＦ　ｍＡｂの結合Ｆ工ＧＵＲＥ　１０ 「「正〒冨圃Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　Ｖａｌ　５ｅｒＦＩＧＵＲＥ　１１ Ｂ４　ＨｕＶＫ　配列番号　６ Ｆ工ＧＵＲＥ　１２Ａ Ｂ１３／Ｂ１４　ＨｕＶＨｔ’ｕ１１番’ｙ　：　７Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　 Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃ ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＧＩＹ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｍ ＦＩＧＵＲＥ　１２Ｂ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＳｅｒＦ工ＧＵＲＥ　１３ Ｂ１３／Ｂ１４　ＨｕＶＫ　ｉＥ列１　８Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓ ｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ厘正四］Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ 　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ［司１Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔ ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓｌｏｏ　１０５　１１０ ＦＩＧＵＲＥ　１４Ａ Ｒ５〜′１９重鎖可変部のＤＮＡ配列 配列番号、９ ＲＳＶ１９重鎖可変部のアミノ酸配列 配列番号、１０ ＣＡＧ　ＧＴＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＳＡＧ　ＴＣＷ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　Ｇ ＡＧ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＴＣＡ　ＧＧＧＧｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｎ　Ｘａａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＧＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＡＡＧ　ＴＴＧ　ＴＣＣＴＧＣＡＣＡ 　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴ　ＡＡＡＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ 　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ 　Ａｓｎ　工１ｅ　ＬｙｓＨＧＵＲＥ　１４Ｂ ＴＣＣＡＡＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧ 　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣ３＝ｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　 ＡｓｐＦＩＧＵＲＥ　１５Ａ Ｒ５〜′１９軽鎖可変部のＩ）　Ｎ　Ａ配列配列番号　１１ ＲＳ　Ｖ　１９軽鎖可変部のアミノ酸配列配列番号　１２ ＧＡＣ＃、ＧＧ　ＴＴＣＡＧＴ　ＧＧＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＡＣ Ａ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＣＡ　ＣＴＣＡＡＧ　ＡＴＣＡｓｐ　Ａｒｇ　ＰｈｅＳｅ ｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈ ｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　工１ｅＦＩＧＵＲＥ　１５Ｂ １．ト、　ヒト　【９Ｇ１　不変部 Ｖ４Ｑ プロモーター ”ヒト”　不変部 ｖＬＱ ＦＩＧＵＲＥ　１８ Ｒ３Ｖ１９ＶＨＥＷｌｌｉ’ｆｆ　：　１３Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　 Ｓｅｒ　ＧｌｙＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　工１ｅ　ＬｙｓＳＤ　Ｔｖｒ 　Ｔ　ｒ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　）ｌｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｐｒ ｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｔｒｐ　工１ｅ　Ｇｌｙ　ｒｐ　 Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔ 　ｒＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｖｓ　Ｐｈｅ　Ｇ〒７Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ 　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　５ｅｒＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　 Ｇｌｕ　ＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＰｈｅＣｙｓＡｓｎＳｅｒ　ｒ　ＧＩ 　５ｅｒＡｓｌｈｅＡｓ　ＨｉｓＴｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔ ｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＳｅｒＥ’工ＧＵＲＥ　１９ ｐＨｕＰ、５Ｖ１９ＶＨ配列番号、　１４Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐ ｒｏ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　証正１Ｔｒｐ 　Ｖａｌ　Ａｒｑ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ耐Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ 　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　５ｅｒＬｅｕ　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　 Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＡｌａＡｒｇ　Ｔｒｐ　ＧＩ 　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　ＧｌｙＧｌｎ　ＧｌｙＴｈ ｒ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒ ＦＩＧＵＲＥ　２０ ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮｓ　、、、、、、　、　、。
Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓ ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔ ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　回正Ｅ冨ｍＴｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　ＩｌｅｐＡｒｇ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　 Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　５ｅｒＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐ ｈｅ　ＣｙｓＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｖ　Ｓｅｒ　ＡＳＤ　Ｐｈｅ　Ａｓ ｐ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒ ＦＩＧＵＲＥ　２１ ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＮＩＫ　配列ａ　号：　１６Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａ ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ口正「 ｉ菊Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ］Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　１ｌｅｔ　Ｌ ｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　５ ｅｒＬｅｕＡｒａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ 　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓμ、ｓｎ　Ｓｓｒ 　Ｔｒｐ　Ｇｌｖ　Ｓｓｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｓ　ＡＳＤ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＶａP Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒ ＦＩＧＵＲＥ　２２ Ａｓｐ　Ｇｌｖ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｖｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　 Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡｌａＰｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｒａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｒ　Ｐｈ ｅ　Ｓｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒ。
Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅＳｅｒ　Ｓｓｒ　Ｌ ｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔ ｙｒ　Ｃｙｓ　１Ｆ工ＧＵＲＥ　２３ ＨｕＶＬフレームワーク４ 元のヌクレオチド配列　配列番＝：２０ヒト・ラムダＪ１遺伝配列列　配列番号 、２２田粉唄審報告 ｌｍｍ１ｌａｅｊｌ　Ａｍ１ｃｍ＋１ｗ　Ｎ＠　ρＣＴ／ＧＢ　９３１００７２ ５国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／１１ ５　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ １５１０９　ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） ９４５５−４Ｃ （７２）発明者　ストット、ニドワード・ジェームズイギリス国バークシャー・ アールジー１６・８テイーエヌ、シーベリー、ダウン・エンド、モフェッツ・レ ーン、ニュー・ヘンリエッタ・ファーム（番地の表示なし） Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＹ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．選択された第２のペプチドまたは蛋白配列に融合した抗−ＲＳＶ抗体の抗原 特異性を有するアミノ酸配列からなる融合蛋白。 ２．該第２の配列が、抗−ＲＳＶ抗原特異性を有する該配列とは異種である請求 項１記載の蛋白。 ３．該抗原特異性が、配列番号：１９の融合蛋白の２６６から２７３番目のアミ ノ酸配列またはそのアナログに対して向けられている請求項１記載の蛋白。 ４．該抗体がウシ・抗体である請求項１記載の蛋白。 ５．該抗体が、ウシ・モノクローナル抗体Ｂ４およびウシ・抗−ＲＳＶ抗体Ｂ１ ３／１４からなる群から選択される請求項４記載の蛋白。 ６．該アミノ酸配列が、該抗体の可変部Ｈ鎖、該抗体の可変部Ｌ鎖、該可変部Ｈ 鎖由来の少なくとも１つのＣＤＲ、該可変部Ｌ鎖由来の少なくとも１つのＣＤＲ 、その機能的断片またはアナログからなる群から選択される請求項１記載の蛋白 。 ７．該アミノ酸配列が、 （ａ）ＸがＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ 、Ｐｒｏ、Ｇｌｍ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒから なるアミノ酸から選択される配列番号：５６：【配列があります】、（ｂ）Ｙが Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなるアミノ酸から選択される配列番号：５７： 【配列があります】、 （ｃ）ＺがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ 、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＧｌｎからなるアミノ酸から選択され る配列番号：５８：【配列があります】 、および （ｄ）ＷがＡｌａ、Ｃｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕからなるアミノ酸から選択され る配列番号：５９：【配列があります】からなる群から選択される式を有する請 求項１記載の蛋白。 ８．該アミノ酸配列が、（ａ）図４Ａおよび４Ｂの配列番号：３の可変部Ｈ鎖配 列からなる配列、（ｂ）図３Ａおよび３Ｂの配列番号：４の可変部Ｌ鎖配列から なる配列、および（ｃ）（ａ）あるいは（ｂ）の機能的断片またはアナログから なる群から選択される請求項１記載の蛋白。 ９．該アミノ酸配列が、 （ａ）配列番号：３の３１ないし３５番目のアミノ酸：【配列があります】；（ ｂ）配列番号：３の５０ないし６５番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｃ ）Ｘがいずれかのアミノ酸またはアミノ酸不存在である配列番号：３の１００な いし１２２番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｄ）配列番号：１および２ の２２ないし３４番目のアミノ酸：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−（Ｓｅｒ またはＡｓｐ）−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（ＡｒｇまたはＩｌｅ）−（Ｔｒｐ またはＰｈｅ）−（ＧｌｙまたはＡｌａ）−Ｖａｌ−（ＡｓｎまたはＧｌｙ）； （ｅ）配列番号：１の５０ないし５６番目のアミノ酸：【配列があります】；（ ｆ）配列番号：１の８９ないし９６番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｇ ）配列番号：１の８９ないし９７番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｈ） 配列番号：２の５０ないし５６番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｊ）配 列番号：２の８９ないし９９番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｊ）配列 番号：４の３１ないし３５番目のアミノ酸：【配列があります】；（ｋ）配列番 号：４の５０ないし６５番目のアミノ酸：【配列があります】；および （１）Ｙがいずれかのアミノ酸である配列番号：４の９８ないし１２２番目のア ミノ酸：【配列があります】 からなる群か ら選択される１つまたはそれ以上のＣＤＲペプチドからなる請求項１記載の蛋白 。 １０．選択された第２の融合相手の核酸配列に作動可能に連結された抗−ＲＳＶ 抗体の抗原特異性を有するアミノ酸配列をコードしている第１の融合相手の核酸 配列からなる融合分子。 １１．請求項９の（ａ）ないし（１）および、（ｍ）上記ペプチドのいずれかの 抗原特異性により特徴付けられるその断片またはそのアナログから選択される抗 −ＲＳＶＣＤＲペプチド。 １２．単離されたウシ・抗−ＲＳＶ抗体の可変部Ｌ鎖アミノ酸配列、該配列の抗 −ＲＳＶ抗原特異性を共有しているその断片またはアナログ。 １３．該抗体において該Ｌ鎖配列が天然に存在するものであるかまたは修飾され たものであり、図３Ａおよび３Ｂの配列番号：１および２、図１１の配列番号： ６ならびに図１３の配列番号：８の配列からなる群より選択される請求項１２記 載の抗体。 １４．単離されたウシ・抗−ＲＳＶ抗体の可変部Ｈ鎖アミノ酸配列、該配列の抗 −ＲＳＶ抗原特異性を共有しているその断片またはアナログ。 １５．該抗体において該Ｈ鎖配列が天然に存在するものであるかまたは修飾され たものであり、図４Ａおよび４Ｂの配列番号：３および４、図１０の配列番号： ５および図１２の配列番号：７の配列からなる群より選択される請求項１４記載 の抗体。 １６．選択された抗−ＲＳＶ抗体の可変部Ｈ鎖または可変部Ｌ鎖アミノ酸配列、 その機能的断片またはアナログをコードしており、所望の抗体フレームワーク中 への挿入あるいは選択された融合相手との融合を容易にするために、所望により 制限部位を有していてもよい単離された核酸配列。 １７．受容体抗体のＨ鎖可変部領域の少なくとも一部が呼吸合胞体ウイルスに特 異性を有する少なくとも１つの抗体のＨ鎖可変部領域の類似部分により置換され ているアミノ酸配列および適当なＬ鎖配列からなる改変抗体であって、該受容体 抗体は該供与体抗体とは異種である。 １８．供与体抗体の可変部Ｈ鎖領域が無処理であり受容体抗体の可変部Ｈ鎖領域 に融合している請求項１６記載の抗体。 １９．供与体抗体の可変部Ｈ鎖ＣＤＲ断片が受容体抗体のＨ鎖ＣＤＲ断片と置き 換わっている請求項１７記載の抗体。 ２０．Ｌ鎖が、 （ａ）受容体抗体のＬ鎖不変部領域に融合した供与体抗体の可変部Ｌ鎖領域 （ｂ）受容体抗体のＬ鎖ＣＤＲ断片と置き換わっている供与体抗体のＬ鎖ＣＤＲ 断片からなるＬ鎖 （ｃ）供与体抗体Ｌ鎖、および （ｄ）異種受容体抗体Ｌ鎖 からなる群より選択される請求項１７記載の抗体。 ２１．供与体抗体の可変部Ｌ鎖領域が図３Ａおよび３Ｂの配列番号：１のもので あるかまたはその機能的断片であり、供与体抗体の可変部Ｈ鎖領域が図４Ａおよ び図４Ｂの配列番号：３のものであるかまたはその機能的断片であり、生成した 改変抗体がｍＡｂＢ４に対する抗原結合特異性により特徴付けられる請求項１７ 記載の抗体。 ２２．供与体抗体の可変部Ｈ鎖領域が図３Ａおよび３Ｂの配列番号：２のもので あるかまたはその機能的断片であり、供与体抗体の可変部Ｈ鎖領域が図４Ａおよ び図４Ｂの配列番号：４のものであるかまたはその機能的断片であり、生成した 改変抗体がｍＡｂ　Ｂ１３／Ｂ１４に対する抗原結合特異性により特徴付けられ る請求項１７記載の抗体。 ２３．ヒト・受容体抗体のＨ鎖可変部領域の配列の少なくとも一部が少なくとも １つのウシ・供与体抗体のＨ鎖可変部領域のアミノ酸配列の類似部分により置換 されているアミノ酸配列および適当なＬ鎖配列からなるヒト化抗体であって、該 ヒト化抗体は、ウシ・供与体抗体に対する抗原特異性により特徴付けられる。 ２４．抗原特異性がＲＳＶのエピトープへの結合である請求項２３記載の抗体で あって、該抗体は図１０の配列番号：５の配列および図１２の配列番号：７の配 列からなる群より選択されるヒト化Ｈ鎖可変部領域配列からなる。 ２５．図１１の配列番号：６のヒト化し鎖配列、図１３の配列番号：８のヒト化 配列、図３Ａおよび３Ｂの配列番号：１のＬ鎖可変部配列により特徴付けられる 天然に存在するウシ・モノクローナル抗体Ｌ鎖、および図３Ａおよび３Ｂの配列 番号：１のＬ鎖可変部配列により特徴付けられ、ヒト・受容体抗体のＬ鎖不変部 領域に融合したキメラなウシ／ヒト・Ｌ鎖からなる群より選択されるＬ鎖により 特徴付けられる請求項２４記載の抗体。 ２６．配列番号：１９のＦ蛋白の２６６〜２７３番目のアミノ酸配列およびその 断片、そのＦａｂ断片あるいはそのＦ（ａｂ′）２断片を必須の構成要素とする ＲＳＶペプチドに結合能力のあるＢ４以外の抗体であって、該抗体はモノクロー ナル抗体または改変ヒト化抗体である。 ２７．ハイブリドーマ生成物からなる抗体ライブラリーおよびＢ４およびＢ１３ ／Ｂ１４からなる群より選択される１つまたはそれ以上の抗体とともに何等かの 種の免疫グロブリンから得られるライブラリーを検索することにより生成する抗 −ＲＳＶ抗体、そのＦａｂ断片またはＦ（ａｂ）２断片。 ２８．請求項１〜９記載の１つまたはそれ以上の融合蛋白、請求項１１記載のＣ ＤＲペプチド、生物学的に活性のある請求項１２〜１５記載の配列または請求項 １７〜２７記載の抗体および医薬上許容される担体または希釈剤からなる医薬組 成物。 ２９．予防または治療を必要とするヒトに請求項２８記載の医薬組成物の有効量 を投与することからなるヒト・ＲＳＶ感染の予防または治療方法。 ３０．請求項１６記載の核酸配列または請求項１０記載の融合分子の核酸配列か らなる組換えプラスミド。 ３１．請求項３０記載の組換えプラスミドにより形質転換された哺乳動物細胞系 。 ３２．該蛋白を複製し発現させる能力のある調節配列の支配下で該蛋白をコード している核酸配列により形質転換された適当な細胞系を培養することおよび該細 胞系から発現される蛋白を得ることからなる請求項１記載の融合蛋白の生産方法 。 ３３．融合蛋白または抗体をトランスジェニック動物において生産することから なる請求項１記載の融合蛋白あるいは請求項１７記載の改変抗体の生産方法。
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