JPH07508494A

JPH07508494A - Ｒ―ｉｆｎ―ベータエピトープ部位を代表するペプチド、それに対する抗体、およびその用途

Info

Publication number: JPH07508494A
Application number: JP1510708A
Authority: JP
Inventors: ヘプリッチ，ポール　ディー　ジュニア
Original assignee: ベルレックス、ラボラトリーズ、インコーポレイテッド
Priority date: 1988-10-14
Filing date: 1989-10-04
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2013-02-18
Also published as: DE68925365T2; US5869603A; JP2717319B2; EP0440686A1; ATE132502T1; CA2000420C; DE68925365D1; WO1990003982A1; CA2000420A1; EP0440686B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｒ−Ｉ　ＦＮ−ベータエピトープ部位を代表するペプチド、それに対する抗体、およびその用途ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）はサイトカインの生物学的に強力なファミリーの一員である。これらタンパクの既知の活性は、抗ウィルス、抗増殖および免疫調節活性を含む。インターフェロンの３種の抗原的に別々のタイプ、すなわちα （白血球）、β（！維芽細胞）およびＴ（免疫）が知られている。それらすべては高い親和性細胞表面へ結合する。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βはＩＦＮ−γが結合するものとは別のレセプターを占める。レセプター結合以外の生物学活性に責任ある事象は良く理解されていない。しかしながら、ある種のウィルス病および癌治療におけるＩＦＮの有効性を示す最近の研究は有望である。これらの臨床的観察は活性の分子レベルのより良き理解への関心を刺激している。このため遺伝子工学ＩＦＮの研究は構造と機能との関係への洞察を提供した。線維芽細胞インターフェロンの変換形ｒｌＦＮ−βｓｅｒはそのようなタンパクの１種である。それはその配列がヒト線維芽インターフェロンに基いている組換え分子である。このタンパクにおいては、１７位のシスティンが部位指向突然変異生成によってセリンで置換された。

生成する分子は完全に活性であり、天然ＩＦＮ−βと同し生物学的活性を有し、今や臨床的に有用なタンパク治療剤である。本明細書においては、ＩＦＮ−βはＩＦＮ−βの天然型および組換え型の両方を指称するように使用されるであろう。臨床使用において、ある患者はＩＦＮ−βの生物学的活性を中和するそれに対する抗体を往産することが見出された。換言すれば、これら抗体はＩＦＮ−βの有益な活性の全部または一部を阻害する能力を存する。本発明は、中和する抗体がＩＦＮ−βへ結合する部位を代表するペプチドの発見に関する。これらのペプチドはＩＦＮ−βの生物学的活性に責任ある同しエピトープであり得る。本発明のペプチドはＩＦＮ−βに対する中和抗体の中和効果を阻害するのに有用であり得る。それらはまた、中和抗体の検出のため診断用途を有する。前記のペプチドに対して上昇されそしてそれに対して特異的結合親和性を存する抗体は、治療コースの間患者のＩＦＮ−βレベルを検出し、モニターするために使用できるので、やはり本発明の一部である。

本発明は、天然および組換えＨｕｌＦＮ−βのエピトープ部位を代表する合成ペプチドを開示する０本発明の一面において、前記エヒトープペプチドは中和抗体がＴＦＮ−βへ結合し、それによってその活性を減少またはなくす部位を代表する。本発明の他の一面は、ＩＦＮ−β療法を受けている患者がＩＦＮ−β中和抗体の生産について評価されることができる診断または予後的アッセイを提供する。

本発明の第３面は、ＩＦＮ−β療法の間、中和抗体の効力を減少または排除するため患者を処置する方法を提供する。本発明の第４面は、サンプル中のＩＦＮ− βレベルを検出する方法を提供する。本発明のペプチドはまた、ＩＦＮ−βの生物学的活性に責任あるエピトープを代表し得る。

第１図は、中和ｍＡｂ、この例ではＡＩと、そしてｒｒＦＮ−βの配列をカバーする配列的に重複するオクタペプチド、すなわちペプチド１は残基１−８を含み、ペプチド２は残基２−９を含む等、残基１５７−１６４を含むペプチド１５７までの組と反応させた時の抗体結合ＥＬＩＳＡにおいて得た吸収のプロットである。

第２．３．４および５図は、中和および非中和ｍＡｂのペプチドＩＢ、ＩＣ，ＩＥおよび対照ペプチドそれぞれへの結合を図示する。

第６図は、ペプチドＩＢ、ＩＣおよび対照ペプチドの存在下、ＩＦＮ−βへのｍＡｂの結合の阻害を表わす。

第７図は、合成ペプチドＩＢおよびＩＣに対して上昇させたウサギポリクローナル抗体のＩＦＮ−βへの結合を表わす。

ＩＦＮ−β治療中、このサイトカインに対する中和抗体を発生し、ウィルスおよび増殖病に対する治療としてのその有効性を強力に減少させることが知られている。本発明は、ＩＦＮ−βの活性を中和するｍＡｂを妨害する能力を有するペプチドを開示する。これら抗体はｒｌＦＮ−βに対して生産され、そしてこのサイトカインに共通して関連する生物学的機能についてスクリーニングされた０本発明は、ＩＦＮ−β活性を中和するｍＡｂが結合する特異性エピトープを同定する。これらエピトープは、活性化したポリエチレンロンド上の多数ペプチド合成を含むＧｅｙｓｅｎ法エピトープマツピング（Ｇｅｙｓｅｎ、Ｈ，Ｍ、、Ｍｅｌｏｅｎ、Ｒ，Ｈ，。

Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、Ｓ、Ｊ、（１９８４）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８１．３９９８−４００２）を使用して発見された。Ｇｅｙｓｅｎ法は、次に抗体結合についてアッセイすることができる数百種ものペプチドの同時合成を提供する。ｒｌＦＮ−βのアミノ酸配列に基いて、ｒｌＦＮ−βの全配列を通して１回に１個のアミノ酸を移動させることにより、１５７種のオクタペプチドが２個づつ合成された。合成されたペプチドは次に中和ｍＡｂとそれらの間の結合を測定するために反応させられた。典型的な結果は第１図に示されている０本発明のペプチドの第１のクラスは以下の配列から選ばれる。

Ｘ−ＡＡ、−Ｐｒ　ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｕ−ＡＡｔ−ＡＡ、−Ｇｉｎ−ＡＡ、− Ｙ式中、ＸはＮＨｚ、または以下の配列から配列が選ばれたアミノ酸長さ１０個までのアミノ酸配列である。

Ｔｒｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ− ＡｓｐＹはＣ０ＯＨ，または以下の配列から配列が選ばれたアミノ酸長さ１３個までのアミノ酸配列である。

Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−ＴｙｒＡ　Ａ　＋は！　Ｉｅ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａ　Ｉ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＮｏｒＬｅｕである。

ＡＡ２はＩ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｖａ　ＩまたはＮｏｒＬｅｕである。

ＡＡ、はＬｙｓ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＶａｌまたはＮｏｒＬｅｕである。

ＡＡ、はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉ　ｌｅ、Ｖａ　ｌ、ＡｒｇまたはＮｏｒＬｅｕである。

もっと好ましくは、ＡＡ、はｌｉｅ、ＰｈｅまたはＬｅｕである。

ＡＡ□はｌｉｅ、ＬｅｕまたはＡｒｇである。

Ａ　Ａ　２はＬｙｓ、ＩｌｅまたはＬｅｕである。

Ａ　Ａ　ａはＬｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒである。

さらに好ましくは、本発明のペプチドは以下の配列の一つである。

（ＩＡ） χ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｒｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ　−式中、ＸおよびＹは上の式Ｉのものと同しである。

最も好ましくは、これらペプチドは以下の配列の一つである。

（ＩＢ）Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−１１ｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（ＩＣ）１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ− Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ（ＩＤ）Ｌｅ　ｕ−Ｌｙ　５−Ａｓ　ｐ−Ａｒ　ｇ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓ　ｎ−Ｐｈ　ｅ　− Ａａｐ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃ；１ｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ −Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ（ＩＥ）Ｎｈｚ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｒｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌ　ｎ −Ｌ　ｅ　ｕ−ＣＯＯＨ最も好ましくは、本発明のペプチドはｒｌＦＮ−βの残本３〇−６０の間に見られ、そして上の式１−ＩＥのどれかの配列を少なくとも有するものである。本発明のペプチドの最終用途に応じて、例えば溶解度を増強または配座を安定化するため、ペプチド化学の分野において知られた手段によってペプチドを修飾することが必要であり得る。また、本発明の一部として、ｒｌＦＮ−β配列からの追加のアミノ酸を追加することにより、より長いペプチドも企図される０本発明の他の一面は、上の式１−ＩＥのペプチドに対して上昇され、そしてそれに対して結合親和性を有する抗体である。

本発明のペプチドは、ペプチド合成のための慣用のプロセスによた、さらに詳しくは、５ｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ、Ｔｈｅ−己ｅ　ｔｉｄｅｓ、Ｖｏｌ、１．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏ、ｒｋ　（１９６６）発行、またはＩｚｕｍｉｙａ、ｅむ、１０． −ジュヨ、工」−□ユ」−□−ヨ、ニー〜Ｌよヨヨ旦ｉｄ□１−１丸善（１９７５）発行に記載されているプロセスを使用して製造することができる。例えば、アンド法、酸クロライド法、対称無水物法、混合無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、またはＤＣＣ／アディティブ法を使用することができる。固相および溶液相合成の両方が以上のプロセスに通用できる。

本発明のペプチドは、ペプチド合成に典型的に採用される上のプロセスニ従って、末端アミノ酸へ一つのアミノ酸を１個づつ順番に縮合することよりなるいわゆる段階的プロセスにより、またはペプチドフラグメントを末端アミノ酸へカップリングすることによって（カップリング反応に使用されないアミノ基は間違った位置におけるカンプリングを防止するため保護しなければならない）好適に製造される。

固相合成が採用される場合、Ｃ−末端アミノ酸はそのカルボキシル基によって不溶性坦体もしくは支持体へ結合される。不溶性担体はそれが反応性カルボキシル基への結合能力を持っている限り、特に限定されない、そのような不溶性担体の例は、クロロメチル樹脂またはプロ七メチル樹脂のようなポリスチレンのハロメチル樹脂、フェノール樹脂、Ｌ−アルコキシカルボニルヒドラジッド化樹脂等を含む。

アミノ基保護アミノ酸は、成長する鎖の末端アミノ基へのその反応性カルボキシル基の縮合によって順番に結合される。完全な配列は合成した後、ペプチドは不溶性担体から除去される。この固相法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、８５．２１４９−１２５６　（１９６３）に一般に記載されており、それを参照としてここに取入れる。

以上のプロセスにおいて、ヒスチジン、チロシン、グルタミン酸、リジン、セリン、システィン、スレオニンおよびアスパラギン酸のそれぞれのアミノ酸は、その側鎖官能基を保護するのが好ましい。

これら側鎖官能基は通常の保護基で保護され、最終反応終了後除去される。

イミダゾール部分の保護基の例は、ベンジルオキシカルボニル。

Ｂｏｃ、ｔ−アミロキシカルボニル、イソボルニルオキシカルポニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、０−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルフォスフイノチオイル等を含む。

ヒスチジンのイミノ基の保Ｗｉ基の例は、Ｔｏｓ、Ｂｚｌ、ＤＮＰ。

トリチル等を含む。

チロシンのヒドロキシ基の保護基の例は、Ｂｚ　Ｉ、Ｃ１，−Ｂｚｌ、Ｂ　ｒ　Ｚ、ヘンシルオキシカルボニル、アセチル、Ｔｏｓ等を含む。

リジンのアミノ基の保護基の例は、ヘンシルオキシカルボニル。

ＣＩ−Ｚ、Ｃ１，−Ｂｚ　ｌ、Ｂｏｃ、Ｔｏｓ等を含む。

グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル基の保！を基の例は、カルボキシル酸のヘンシルアルコール、メタノール、エタノール、Ｌ−ブタノール等によるエステル化を含む。

セリンのヒドロキシ基の保護基の例は、０−ベンジル、ｏ−ｔ−ブチル等を含む。

スレオニンのヒドロキシ基の保護基の例は、０−ヘンシル、〇−ｔ−ブチル等を含む。

ンスティンの保護基の例は、パラメトキシヘンシル、アセタミドメチル、Ｓ−トリチル１　Ｓ−ブチル等を含む。

活性化アルボキシル基の例は、対応する酸クコライＦ、対称無水物、混合無水物、アジドおよび活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシヘンヅトリアヅール、Ｎ−ヒドロキシル５−ノルボルネン−２，３−ノカルポキシジイミド等とのエステル）を含む。

本発明のペプチドはＤＮＡ技術によっても製造することができる。

所望のペプチドのアミノ酸配列が慣用の合成技術（多重遺伝子コピー技術を含む）を使用して合成された単一スドライドＤＮＡに対するコードン配列を演鐸するために使用し、次に二重ストランドＤＮＡを製造し、そしてクローニングビヒクル、ベクターまたはプラスミド中の適切な部位へ挿入する。バクテリア細胞、イースト細胞または哺乳類細胞のような適切な生物が所望のペプチドの表現を得るために形質転換される。

製造された本発明のペプチドは、ペプチド分離手段により、例えば抽出２向流分配、カラムクコマドグラフィー、ＨＰＬＣ等によって反応混合物から単離し、精製することができる。

本発明のペプチドは、種々の無機または有機塩基と塩を形成する。

非毒性の薬剤学に許容し得る塩が好ましいが、他の塩も生成物の単離または精製に有用である。そのような薬剤学的に許容し得る塩は、ナトリウム、カリウムまたはリチウムのようなアルカリ金属塩、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属塩、およびアルギニンまたはリジンのようなアミノ酸から誘導された塩を含む。

これら塩は、ペプチドの酸の形を所望イオンを供給する塩基のモル当量と塩が沈澱する媒体中または水性媒体中で反応させ、凍結乾燥することによって得られる。

同様に、これらペプチドは種々の無機また有機酸と塩を形成する。

再び非毒性の薬剤学的に許容し得る塩が好ましいが、他の塩も生成物の単離または精製に有用である。そのような薬剤学的に許容し得る塩は、塩酸、メタンスルホン酸、硫酸、マレイン酸、酢酸、パルミチン酸等と生成する塩である。塩は生成物を塩が沈澱する媒体中で酸のモル当量と反応させることによって得られる。

前述したように、本発明のペプチドに対して上昇された抗体も本発明の重要な面である。例えば、式１−ＩＤのペプチドに対する抗体または抗体フラグメント例えばＦ（ａｂ’）ｚまたはＦａｂフラグメントは、治療的にはｒＩＦＮ−βを受けている患者の体液中の該タンパクのレベルを検出するためのイムノアッセイにおいて有用であり得る。従って本発明による抗体の生産を容易化するため、好ましくは本発明のペプチドはその抗原性を最適化するｖＡ様に処理または調製される。

抗原性ペプチドは、本発明のペプチドのペプチドまたはフラグメントをハプテンとして使用し、該ペプチドまたはフラグメントを適当な担体とハプテン／担体結合剤の存在下反応させることによって調製することができる。この場合、抗原の調製に普通使用される高分子量の天然または合成タンパクがハプテンを結合すべき担体として採用できる。そのような担体の例は、動物血清のアルブミン、動物のヘモグロビン、Ｋ　ｅ　ｙ　ｈ　ｏ　ｌ　ｅチオガイヘモシアニンのような動物ヘモシアニン、姻虫から抽出したタンパク、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン／グルタミン酸共重合体、およびリジンまたはオルニチンを含存する共重合体を含む。

ハプテン／担体結合体としては、抗原の調製に普通に使用されるものを使用することができる。これら剤の特定例は、芳香族残基を架橋するためのジアゾニウム化合物、アミノ基をアミノ基へ架橋するための脂肪族ジアルデヒド、チオール基とチオール基へ架橋するためのシマレイミド化合物、アミノ基をチオール基へ架橋するためのマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびアミノ基とカルボキシル基からアミド結合が生成する慣用のペプチド結合形成反応に使用される剤を含む。またハプテン／担体結合剤として、ｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸のようなジアゾニウムアリールカルボキシル酸を、上に記載した脱水および縮合剤のような慣用のペプチド結合形成剤と組合せて使用することができる。

本発明のペプチドの抗原形を調製するためのカップリング反応は、水溶液中、または７ないし１０のｐＨを有する慣用の緩衝液中、好ましくは７，５ないし９のｐＨを有する緩衝液中で、約０″Ｃなしい４０°Ｃの範囲内の温度、好ましくは室温付近において適当に実施される。

カップリング反応は約１ないし約２４時間以内に、好ましくは３ないし５時間に一般に終了する。上のプロセスに使用できる緩衝液の代表例は以下のものを含む。

０．２Ｎ水酸化ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２塩化カリウム緩衝液０．２Ｍ炭酸ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２Ｍ塩化カリウム緩衝液０．０５Ｍテトラホウ酸ナトリウムー０．２Ｍホウ酸−０，０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液食塩緩衝液、および０．１Ｍリン酸二水素カリウム−０，０５Ｍテトラホウ酸ナトリウム緩衝液ハプテン、ハブテン／担体結合剤、および担体の比率は適当に決定する二さができるが、しかし担体に対するハプテンのモル比が約２０ないし約１であり、そしてハプテンに対する結合剤のモル比が約１０ないし約１であることが好ましい、カップリング反応において、ハプテンは、ペプチド／担体複合体よりなる所望の抗原を得るため、ハブテン／担体結合剤を介して担体へ結合される。

カップリング反応終了後、抗原は透析、ゲル濾過、分別沈澱等によって単離し、精製することができる。

本発明のペプチドに対して上昇された本発明の抗原はモノクローナルまたはポリクローナルであることができるが、しかしモノクローナルが好ましい。一般に、抗体は慣用の技術に従って、所望の免疫原または抗原を種々のを椎動物に注射することによって得ることができる。適当なを椎動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギを含み、マウスが好ましい。通常動物は、改良された力価および特異性を有する継続的採血をもって周期的に採血される。抗原は筋肉内、腹腔内、皮下等によって注射し得る。遺伝子工学によって製造されたキメラ抗原（マウスヒトハイブリッド）も本発明によって企図される。

ポリクローナル抗体は、抗原による動物の高度免疫によって調製される０次に繰り返した免疫直後動物の血液が集められ、ガンマグロブリンが単離される。ポリクローナル抗体製造のための適切な方法は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ±ｍｍｕｎｏ±Ｕ　第３版（Ｗｅ　ｉ　ｒ編、１９７　Ｂ）中に記載されており、それを参照としてここに取り入れる。

モノクローナル抗体を得るため、所望の抗体レスポンスを示す免疫化したを椎動物からの肺臓細胞が不死滅化される。不死滅化の態様は重要でないか、しかし最も普通の方法はミエローマ融合パートナ−との融合である。他の不死滅化技術はＥＢＶ形質転換、腫瘍遺伝子またはレトロウィルスのような裸のＤＮＡでの形質転換、または細胞ラインの安定な維持およびモノクローナル抗体の生産を提供する任意の他の方法を含む、モノクローナル抗体を得るための一般的方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより、Ｎａｔｕｒｅ、２５６，４９５−４９７　（１９７５）に記載されており、それを参照としてここに取入れる。ヒトモノクローナル抗体は、ヨーロッパ特許用＠Ｉｋ８２　３０１１０３．６に記載されている。肺臓細胞とＷｒ−Ｌ、のような適当なヒト融合パートナ−との融合によって得ることができる。該出願の適切個所を参照としてここに取入れる。マウス×マウスモノクローナル抗体生産のための詳しい技術は、ＯｌおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇにより、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ±ｍｍｕｎｏ±±ｌ工、５３１−３７２　（Ｍｉｓｈｅ＋およびＳｈｉｉｇｉ＃ｌＡ、１９８０）に教示されており、これも参照としてここに取入れる。生成するハイブリドーマは、各自抗原を認識することができる単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離するため、スクリーニングされる。

ペプチドおよび／または抗体は修飾することなく使用することもできるし、または種々の方法で、例えば標識化によって修飾することができる。標識化とは、検出手段を直接または間接に提供する部分を共有結合的または非共有結合的に結合することを意味する０種々の標識が知られており、そして放射性核種、基質、補因子、阻害剤、螢光剤、ケミルミネセンサー、磁性粒子等を含む。

ペプチドを適当な標識へ結合するための技術の多くは、ペプチド結合を形成するためカルボジイミドまたは活性エステルの使用を経由するそれらのカルボキシル基の使用、クロロメチルスチレンのような活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとのメルカプト基の反応によるスルフィドの形成、グルタルケアルデヒドのようなジアルデヒドとアミノ基との反応および水素化シアノホウ素ナトリウムによる還元による２級アミンの形成等を含む。

本発明のペプチドおよび抗体は、イムノアッセイのような診断テストの調製に使用することができる。そのような診断技術は、例えば単一また二重抗体技術による酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素倍増イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）、酵素免疫抗体測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアンセイ（ＲＩＡ）、螢光イムノアッセイおよび本発明のペプチドまたは抗体がある種の検出し得る標識で標識される他の技術を含む。一般的にはＭａｇｇｉｏによるＥｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ（１９８１）を見よ。好ましくは式Ｉのペプチドおよびそれに対する抗体がそれぞれＩＦＮ−βに対する中和抗体を検出し、そしてＩＦＮ−βのレベルを測定するために使用される。

本発明のペプチドは、抗体が仲介するＩＦＮ−β活性の中和に対する治療剤として使用することができる。本発明のペプチドは、隣接するペリペプチド繰返し単位が酸化されたシスティンによって一体に結合されるポリマーとして、または担体へ結合した複合体として、直鎖形または環状リング形で単独に使用することができる。

新規なペプチドまたはフラグメントまたは誘導体の治療用製剤は、任意の投与製剤で投与することができる。活性成分は単独でも投与することは可能であるが、それは医薬製剤として存在するのが好ましい。製剤は上に定義した少なくとも１種の活性成分と、１種以上の許容し得る担体と、そして場合によって他の治療剤とを含む。各担体は、他の成分と共存でき、そして患者に対して有害でないという意味において許容し得るものでなければならない。製剤は、経口、経直腸、経鼻または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮肉を含む）投与に通した剤形を含む。製剤は便利には単位投与形で提供され、そして製剤学分野で良く知られた任意の方法によって製造することができる。

実施例１ぺ１±１會底ペプチド合成に使用した試薬は、指示した販売者から購入した。

Ｂｏｃアミノ酸、Ｐｅｍ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

カリフォルニア州へルモント；ジイソプロピルカルボジイミドおよびｌ−ヒドロキシヘンシトリアゾール、Ａｌｄｒｉｃｈ、　ウィスコンシン州ミルウォーキー；１４Ｃ標識アミノ酸、Ａｍｅｒｓｈａｍすべてのペプチドは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　（カリフォルニア州サンラフアニル）からの自動化機器モデル９５００を使用し、確立されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成操作（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　ｅｔａｌ、、（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　２．ｐｐ２５６−５２７およびＳｔｅｗａｒｔ　ｅＬ　ａｌ、、（１９８４）ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　イリノイ州ロックフォード）に従って合成された。最初のアミノ酸、すなわちカルボキシル末端残基は、以前にＨｏｅｐｒｉｃｈおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２．ｐｐ２０４９に記載されているように、クロロメチル化ポリスチレン／ジビニルヘンゼン共重合体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１％架橋、１．３４ｍｅｑ／ｇ）へエステル化された。以後のアミノ酸はカップリング剤としてジイソプロピル力ルポジカミドを使用して２回連結された。一般に、Ｂｏｃ基は保護ペプチド樹脂をジクロロメタン中４５％トリフルオロ酢酸（Ｖ／Ｖ）で２０分間処理し、ジクロロメタ７９５％ジイソプロピルエチルアミン（Ｖ／Ｖ）で２回の５分間中和によって除去された。樹脂は各脱保護、中和およびカップリング工程の前および後で、適当な溶媒で洗浄した。Ｂｏｃｉ除去およびカップリング終了は、ニンヒドリン呈色テスト（Ｋａｉｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７０）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３４．ｐｐ５９５）によって定量的にモニターした。１４Ｃ含有アミノ酸、例えばグリシンは最初はジイソプロピルカルボジイミド仲介反応により、そして２回目はあらかじめつくったｌ−ヒドロキシヘンシトリアゾールエステルを利用することによってカップルされた。

すべてのペプチドは、１０％アニソール（Ｖ／Ｖ）の存在下０〜４°Ｃにおいて４０分間無水フン化水素へｗｓｎにより、同時に側鎖保護基除去と共に樹脂から分離された。水吸引によるフン化水素除去後、アニソールを除去するため樹脂を無水エチルエーテルで洗った。

ペプチドは、ジメチルホルムアミド、５０％ジメチルホルムアミド／１０％酢酸、１０％酢酸および蒸留水の順次洗浄で樹脂から洗い、合併した洗液を凍結乾燥した。

ペプチドの精製は逆相ＨＰＬＣによって達成された。準備カラム（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｐａｒｔｉｓｉｌ　１０　０ＤＳ−３Ｍａｇｎｕｍ　２０，２．２Ｘ５０ｃ＋ａ）を使用して、所望のペプチドはクロマトグラムの勾配展開の間に溶出された。溶出プログラムは、溶媒Ａ　（０，１％トリフルオロ酢酸１５％アセトニトリル／水）と、５％溶媒Ｂ（０，１％トリフルオロ酢酸／ＣＨ３ＣＮ）から、５０％Ａおよび５０％Ｂまで６５分間の範囲であった。各精製ペプチドの一部分を６．０ＮＨＣＩ　（Ｐｉｅｒｃｅ）中１１０’Ｃで２４時間加水分解し、アミノ酸組成をベックマンアミノ酸アナライザーモデル１２１Ｍを使用して決定した。

実施例２ｍＡｂのＩＦＮ−）；のム　ペプチドへの　ム以前に記載したペプチド合成のＧｅｙｓｅｎ技術を使用して、１５７種のオクタペプチドをポリエチレンロンドもしくはピン上に２組合成した。各ペプチドは１回に１つのアミノ酸をｒｌＦＮ− βの配列中を移動させることによってつくった８−マーを代表する。適当な希釈度における各中和ｍＡｂ″溶液１７５μ！をペプチドピンの各自と一夜混合した。各ペプチドピンはヤギ抗マウスＩｇＧ／西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体と混合し、１ｍＭ２゜２′−アジノビス（３−エチルベンチアジンン− ６−スルホン＃）（Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　）基質と混合した。結果は、ｒｌＦＮ−β 配列内の各８−マーペプチドのＮ末端アミノ酸の番号上にプロットした、抗体結合ＥＬＩＳＡで得られた吸収に対応する垂直線として示す。このプロットは、アミノ酸番号約４０ないし４７において結合のピークを示す。（第１図を見よ。）実施例３および　ｍＡｂのム　ペプチドＩＢ　ＩＣおよびＩＥとの奴一連の酵素リンク免疫吸収体アンセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施し、Ａ１．Ａ５およびＡ７と同定された３種の中和ｍＡｂのパネル（ライスコンシン医学大学においてＰｈ１ｌ　ＲｅｄｌｉｃｈおよびＳｉｄ　Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇによって開発された）と、Ｂ２ｂと同定された単一非中和ｍＡｂ（ライスコンシン医科大学のＰ。

ＲｅｄｌｉｃｈおよびＳ、Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇから受ｆＩＪｉ）を合成ペプチドＩＢ、ＩＣ，ＩＥおよび対照への結合とについて測定した。

すべての場合、ペプチドは０．０５）リス緩衝液、ｐＨ９，５中に溶解し、１００μρづつをウェルあたり５０μｇペプチドの濃度でマイクロタイタープレート（コーニング）のウェルへ分配した。プレートを一夜真空デジケーター中に置き、ペプチドをウェル中乾燥した。−夜カツブリング後、標識的ＥＬ［ＳＡ操作、すなわち普通のプロノキックステノプ、洗浄、インキュベーション条件、およびＡＢＴＳＩＳ’Ｉによる適当なりギ抗マウス／西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体の発色を行った。ｍＡｂ　ＡｌはペプチドＩＢおよびＩＣと良く反応し、ＩＥとはより低い程度で反応した。ｍＡｂ　Ａ５はテストしたペプチドと弱く反応した。Ａ７はペプチドＩＢおよびＩＣと良く反応したが、しかしペプチドＩＥとは実質上活性が見られなかった。非中和ｍＡｂ　Ｂ２ｂはペプチドＩＢおよびＩＣと反応したが、しかし。ＩＥとは反応しなかった。すべての場合、ｍＡｂは中和または非中和活性に関係なく、匹敵する寸法および組成のしかしＩＦＮ−βに関連しない対照ペプチドとは殆ど反応しなかった。テストしたすべてのｍＡｂは合成ペプチドを結合するが、中和ｍＡｂは優先的な結合、特にペプチドＩＢおよびＩＣに対するＡ１およびペプチドＩＥに対するＡ５を示した。

実施例４ＩＦＮ−に・　る　ｍＡｂ　人のム　ペプチドによる第６図は、ＩＦＮ−βに対する中和ｍＡｂ、Ａｌ、Ａ５およびＡ７の結合が合成ペプチドＩＢおよびＩＣとのプレインキュベージ５ンによって有意に阻害されるＥＬＩＳＡの結果を示す、中和ｍＡｂはＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中１０４モル過剰のペプチドと４　’Ｃにおいて一夜インキユベートされた。比較のため、非中和ｍＡｂ、Ｂ２ｂも同し態様で処理された。各ｍＡｂは同し濃度、すなわち０．１＋ａｇ／ｄストンク溶液から１１５０００希釈度で使用された。ペプチドと一夜インキュヘート後、ｍＡｂ／ペプチド溶液を５０　ｎ　ｇ／ウェルの濃度の［ＦＮ−βに対するＥＬＩＳＡにかけた。後者は前に記載したように真空中ウェルの表面上に乾燥し、そしてＥＬＩＳＡを標準的方法で発色させた。第６図から、中和ｍＡｂ　ＡｌはペプチドＩＣによってＩＦＮ−βへの結合を完全に阻止され、そしてペプチドＩＢはｍＡｂ　Ａｌの結合を８０％阻止したことが見られる。ｍＡｂ　Ａ５のＩＦＮ−βへの結合は、ペプチド不存在下の結合に比較してどれかのペプチドとのプレインキュヘーションによって実質上なくなった。ペプチドＩＢおよびＩＣの存在下のＩＦＮ−βへのｍＡｂＡ７の結合は６０％減少した。非中和ｍＡｂ　Ｂ２ｂのＩＦＮ −βへの結合は、ペプチドＩＢおよびＩＣそれぞれのプレインキュヘーシジンによって約２０％減少した。

実施例５ム　ペプチドＩＢおよびＩｃに・　る　のＩＦＮ−への　ムペプチドＩＢおよびＩＣに対する抗体をＫＬＨ／ペプチド複合体で免疫化したウサギに上昇させた。

適当時間後採血し、各ペプチドに対するＡｂを含む採血清を得た。各抗体集団のそれ以上の精製は、各抗血清サンプルの硫安沈澱によって得られた。硫安カットをＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−βに対する反応性についてテストした。第７図は、各ペプチドに対して上昇させたポリクローナルＡｂ集団はそれらのそれぞれの免疫原、他の関連したペプチドおよびＩＦＮ−βを認識したことを示す、ペプチドＩＢはＩＣよりももっと免疫原性であるように見えるが、後者に対して上昇させたＡｂはＩＦＮ−βともっと強く反応する。両者ともＩＦＮ−βを良く認識するが、抗ＩＣはＩＦＮ−βレベルの測定に対してより大きい診断用途を持ち得る。

１１１１１ＧＯ７’ｔｈ’ＪｔＪｕｊ　しＩｓ　護　）ピ＝ト、ｅＣ，ｏｔＹｈ’ｉ砿一４Ｕ５つ７　γｈ（− …１ＩｑＱブン１１１ｒ口 ”’Ｓｏ”Ｙｈ’ａｎ国際調査報告国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４３３４：ｕｓ−Ａ−４３１１６３９１９１０１／８２　Ｎ０ＮＥ　ｌ■ つき・　（ ■ □ □ □ ・　１ □ □ □ ！ □ □ □ フロントページの続き（５１）　ｌｏｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｕ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　７１０８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｐ　７０５５−２ＪＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下のアミノ酸配列：【配列があります】を持つ、ＩＦＮ−β中和抗体に対して特異的結合親和力を有するペプチド。式中、ＸはＮＨ２，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１０個までのアミノ酸長さのアミノ酸配列であり、ＹはＣＯＯＨ，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１３個までのアミノ酸長さのアミノ配列であり、ＡＡ１はＩｌｅ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ａｒｇ，ＴｙｒまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ２はＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，またはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ３はＬｙｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ４はＬｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＡｒｇまたはＭｅｔである。
２．ＡＡ１はＩｌｅ，ＰｈｅまたはＬｅｕ，ＡＡ２はｌｌｅ，ＬｅｕまたはＡｒｇ，ＡＡ３はＬｙｓ，ＩｌｅまたはＬｅｕ，ＡＡ４はＬｅｕ，ＰｈｅまたはＴｙｒ，である第１項のペプチド。
３．ＡＡ１はＩｌｅ，ＡＡ２はＩｌｅ，ＡＡ３はＬｙｓ，ＡＡ４はＬｅｕである第１項のペプチド。
４．ＸはＮＨ２，【配列があります】である第３項のペプチド。
５．Ｘは【配列があります】であり、ＹはＣＯＯＨである第３項のペプチド。
６．Ｘは【配列があります】であり、Ｙは【配列があります】である第３項のペプチド。
７．以下のアミノ酸配列：【配列があります】のペプチドに対して上昇されそしてそれに対して結合親和性を有する抗体。式中、ＸはＮＨ２，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１０個までのアミノ酸長さのアミノ酸配列であり、ＹはＣＯＯＨ，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１３個までのアミノ酸長さのアミノ配列であり、ＡＡ１は１ｌｅ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｖａ１，Ａｒｇ，ＴｙｒまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ２はｌｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，またはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ３はＬｙｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ４はＬｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＡｒｇまたはＭｅｔである。
８．ＡＡ１はＩｌｅ，ＰｈｅまたはＬｅｕ，ＡＡ２はＩｌｅ，ＬｅｕまたはＡｒｇ，ＡＡ３はＬｙｓ，ＩｌｅまたはＬｅｕ，ＡＡ４はＬｅｕ，ＰｈｅまたはＴｙｒ，である第７項の抗体。
９．ＡＡ１はＩｌｅ，ＡＡ２はｌｌｅ，ＡＡ３はＬｙｓ，ＡＡ４はＬｅｕである第７項の抗体。
１０．ＸはＮＨ２、Ｙは【配列があります】である第７項の抗体。
１１．Ｘは【配列があります】であり、ＹはＣＯＯＨである第９項の抗体。
１２．Ｘは【配列があります】であり、Ｙは【配列があります】である第９項の抗体。
１３．Ａ）ＩＦＮ−βに対する中和抗体を持っていると推定される宿主からの体液サンプルを以下の式：【配列があります】のペプチドと接触せることと、〔式中、ＸはＮＨ２，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１０個までのアミノ酸長さのアミノ酸配列であり、ＹはＣＯＯＨ，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１３個までのアミノ酸長さのアミノ配列であり、ＡＡ１はＩｌｅ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ａｒｇ，ＴｙｒまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ２はＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，またはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ３はＬｙｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ４はしｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＡｒｇまたはＭｅｔである。〕Ｂ）前記宿主中にＩＦＮ−β中和抗体の存在の診断として、前記体液中に含まれる前記中和抗体に対する前記ペプチドの結合レベルを測定すること、を含むＩＦＮ−βに対する中和抗体の存在を検出する方法。
１４．ＡＡ１はＩｌｅ，ＡＡ２はＩｌｅ，ＡＡ３はＬｙｓ，ＡＡ４はＬｅｕである第１３項の方法。
１５．ＸはＮＨ２，Ｙは【配列があります】である第１４項の方法。
１６．Ｘは【配列があります】であり、ＹはＣＯＯＨである第１４項の方法。
１７．Ｘは【配列があります】であり、Ｙは【配列があります】である第１４項の方法。
１８．Ａ）以下のアミノ酸配列：【配列があります】をもっているペプチドに対して上昇されそしてそれに対して結合親和性を持っている抗体を宿主からの体液のサンプルと接触させることと、〔式中、ＸはＮＨ２，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１０個までのアミノ酸長さのアミノ酸配列であり、ＹはＣＯＯＨ，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１３個までのアミノ酸長さのアミノ配列であり、ＡＡ１はＩｌｅ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ａｒｇ，ＴｙｒまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ２はＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，またはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ３はＬｙｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ４はＬｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＡｒｇまたはＭｅｔである。〕Ｂ）ＩＦＮ−βの存在の診断として、前記抗体のＩＦＮ−βへの結合レベルを測定すること、を含むＩＦＮ−βを検出する方法。
１９．ＡＡ１はＩｌｅ，ＡＡ２はＩｌｅ，ＡＡ３はＬｙｓ，ＡＡ４はＬｅｕである第１８項の方法。
２０．ＸはＮＨ２，Ｙは【配列があります】である第１９項の方法。
２１．Ｘは【配列があります】であり、ＹはＣＯＯＨである第１９項の方法。
２２．Ｘは【配列があります】であり、Ｙは【配列があります】である第１９項の方法。
２３．宿主へ第１項のペプチドの有効量を投与することを含むＩＦＮ−β活性の中和を防止する方法。
２４．宿主へ第３項のペプチドの有効量を投与することを含むＩＦＮ−β活性の中和を防止する方法。
２５．ＩＦＮ−βに対する免疫レスポンスにより活性ＩＦＮ−βの減少したレベルを有するヒトへ第１項のペプチドの治療的に有効量を投与することを含む治療方法。
２６．ＩＦＮ−βに対する免疫レスポンスにより活性ＩＦＮ−βの減少したレベルを有するヒトへ第３項のペプチドの治療的に有効量を投与することを含む治療方法。
２７．ＩＦＮ−βに対する免疫レスポンスにより活性ＩＦＮ−βの減少したレベルを有するヒトへ第４項のペプチドの治療的に有効量を投与することを含む治療方法。
２８．ＩＦＮ−βに対する免疫レスポンスにより活性ＩＦＮ−βの減少したレベルを有するヒトへ第５項のペプチドの治療的に有効量を投与することを含む治療方法。
２９．ＩＦＮ−βに対する免疫レスポンスにより活性ＩＦＮ−βの減少したレベルを有するヒトへ第６項のペプチドの治療的に有効量を投与することを含む治療方法。
３０．Ａ）ＩＦＮ−β中和抗体に対して特異的親和性を有し、そして以下のアミノ酸配列を持つペプチド、【配列があります】〔式中、ＸはＮＨ２，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１０個までのアミノ酸長さのアミノ酸配列であり、ＹはＣＯＯＨ，または以下の配列：【配列があります】から配列が選ばれた１３個までのアミノ酸長さのアミノ配列であり、ＡＡ１はＩｌｅ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｖａ１，Ａｒｇ，ＴｙｒまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ２はＩｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，またはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ３はＬｙｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌまたはＮｏｒＬｅｕであり、ＡＡ４はＬｅｕ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＡｒｇまたはＭｅｔである。〕Ｂ）免疫反応検出試薬、とを含む診断薬キット。