JPH07508640A - 幹細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本件出願は１９９２年４月６日に出願された米国特許出願箱０７７８６３．８８ ９号の一部継続出願である。本発明は、ヒト胚細胞（ｇｅｒｍｃｅｌｌ）腫瘍系 から単離されたオートクリン増殖因子に関する。特に、本発明は幹細胞増殖因子 （ＳＣＰＦ）の生産、精製および使用に関する。本発明のタンパク質は２つの形 態、即ち、可溶性形態と膜結合形態で存在し、膜結合形態は小割合のヒト骨髄細 胞の表面で検出でき、かかる細胞の増殖を刺激する。それ故、５ＣＰＦは広範囲 の用途を有すると考えられ、これらの用途は造血幹細胞の増殖を促進することを 含むが、これに限定されない。更に、抗体による該タンパク質の除去は腫瘍細胞 の増殖を制御するのに有用であるかもしれない。 ２、発明の背景 増殖因子をオートタリン様式で産生ずる細胞に刺激効果を与える増殖因子が開示 されている。同じ因子が他の標的細胞に対し同様の効果を示すことがある。しか しながら、神経系から得られた腫瘍細胞が造血系の細胞増殖を調節する因子を産 生ずることは、文献には記載されていない。 ２．１．胚細胞腫瘍 中枢神経系の胚細胞腫瘍は稀であり、３％未満の小児固形ガンがここに含まれる 。これらの腫瘍は最も普通には松果腺および視床下部に生じるが、視床および脳 神経節に生じると記載されてきた。組織学的には、これらの腫瘍は最も多くの場 合胚細胞層であることか判明している。それ程多くないサブタイプとして、絨毛 癌、胎児性胚細胞腫瘍、および混合胚細胞腫瘍が挙げられる。これらの腫瘍の型 は一般に予後が悪い。 これらの腫瘍の治療には、胚細胞腫に対する手術および放射線治療や、また非胚 細胞腫の胚細胞の腫瘍、転移性疾患、または再発性疾患の患者に対し重要な役割 を果たす白金をベースとする集中的化学療法プロトコルおよび自己骨髄移植があ って多様式である。心室シャントによる転移拡大が報告されており、これはシャ ントの道に沿ってどこにでも起こり得る。首および肺中の転移沈着物が報告され ているが、最も普通にはこれらの沈着物は心室腹膜シャントおよび大きな腹膜移 植片と関連している。頭”蓋内の胚細胞腫瘍から培養された細胞系が稀に報告さ れているが、幾つかの細胞系は神経外の起源の胚細胞腫瘍に由来していた。連続 １ｎｖｉｔｒｏ細胞系がラット癌腫から誘導されている。これらの細胞系は、原 始的多能性細胞の分化の研究に非常に有益であることが判ヒト医学において、造 血を開始し、それを調節する能力は非常に重要である（ＭｃＣｕｎｅら、　１９ ８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：１６３２）　ｏ悪性疾患を含む種々の疾患およ び免疫障害は、リンパ−造血系内の分裂に関係があるように思われる。これらの 障害の多くは、造血系に前駆細胞（これらは、分化への引き金が引かれた場合に は、患者の欠陥を克服するであろう）を再び送りこむことにより軽減、かつ／ま たは治癒し得る。ヒトでは、現行の置換治療は骨髄移植である。白血病の治療に おける骨髄移植の使用とは別に、それはその他の新形成の治療に今頻繁に使用さ れている（　Ｅｐｓｔｅｉｎおよび５ｌｅａｓｅ、　１９８５．　Ｓｕｒｇ、Ａ ｎｎ、　１７：１２５）　、しかしながら、この型の治療は侵襲性の処置を含む ために（ドナーおよびレシピエンドの両方に痛いものであり、そして特に移植片 が同種異系であり、移植片宿主病（ＧＶＨＤ）が生じる場合に、レシピエンドに ひどい合併症を与え得る。それ故、ＧＶＨＤのリスクは、骨髄移植の使用をこの 移植をしなければ死亡する疾患をもつ患者に制限する。可能性としてはさらに興 味深い、造血障害に対する別の治療は、コロニー刺激因子のいずれか一つまたは 組み合わせを用いた患者の治療である（Ｄｅｘｔｅｒ、　１９８７．　Ｊ、Ｃｅ １ｌ　Ｓｃｉ、　８８：１）。 血球形成のプロセス（これにより、少数の自己再生幹細胞が系列特異性前駆細胞 を生じ、これらがその後増殖および分化を経て成熟循環血球を産生ずる）は、特 定のホルモンの制御下にある。 これらのホルモンは総括してコロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ）として知られている（ Ｍｅｔｃａｌｆ、　１９８５．５ｃｔｅｎｃｅ　２２９：１６；　Ｄｅｘｔｅｒ 、　１９８７．　Ｊ。 Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、　８８：Ｉ；　ＧｏｌｄｅおよびＧａ５５ｏｎ、　１９８８ ．５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｔｎｅｒ−ｉｃａｎ、　Ｊｕｌｙ：６２；　Ｔａｂ ｂａｒａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、　１９９１．　Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ。 １１：８１；　Ｏｇａｗａ、　１９８９．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｈｅａｌｔｈ　Ｐ ｒｅｓｐ、８０：１９９；　Ｄｅｘｔｅｒ。 １９８９、　Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、　４５：３３７）。組換えＤＮＡ技術の 出現により、これらのＣ３Ｆの多くが今やクローン化され、そして発現された（ Ｓｏｕｚａら、１９８６．　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：６１；　Ｇｏｕｇｈ　ら 、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：　７６３；ＹＯｋｏｔａら、１９８４． 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、８１：１０７０；　Ｋ ａｗａｓａｋｉら、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：２９１）。これらの 組換えＣ３Ｆが今や利用でき、そしてそれらの治療上の可能性に関する広範な研 究が開始された。医療におけるそれらの潜在的用途は広範囲に及び、輸血、骨髄 移植、免疫抑制障害の矯正、ガン治療、創傷治癒、および免疫応答の活性化の如 き領域を含む（ＧｏｌｄｅおよびＧａ５５ｏｎ、　１９８８゜５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　Ｊｕｌｙ：６２）　ｏ造血前駆細胞の増殖および分 化の誘発とは別に、Ｃ３Ｆはまた成熟血球の幾つかの機能を活性化することが示 されており（Ｓｔａｎｌｅｙら、　１９７６、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４ ３：６３１；　５ｃｈｒａｄｅｒ　ら、１９８１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：３２３；Ｍｏｏｒｅ　ら、１９８０．　Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２５：１３０２；　Ｋｕｒｌａｎｄら、１９７９．　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：２３２６；　Ｈａｎ ｄｍａｎおよびＢｕｒ−ｇｅｓｓ、　１９７９、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２２： １１３４；　Ｖａｄａｓら、１９８３．　Ｂｌｏｏｄ　６１：　１２３２；　Ｖ ａｄａｓら、　１９８３．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３０ニア９５）　、これ には成熟造血細胞の移動に影響すること（Ｗｅｉｂａｒｔら、　１９８６．　Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：３５８４）が含まれる。 ３、　発明の要約 本発明は、幹細胞増殖因子（ＳＣＰＦ）、造血幹細胞を含む種々の幹細胞集団の 増殖を刺激することにおけるその使用、および胚細胞腫瘍により産生されるその 他の増殖因子またはサイトカインを同定する方法に関する。５ｃｐｐは、３２． ０００ダルトンの分泌された形態および分子量３７．０００ダルトンの膜結合形 態で発現される新規なオートクリン増殖因子である。５ＣＰＦは、それを産生ず るだけでなく、ＣＤ３４”″ヒト骨髄幹細胞を産生ずる胚細胞腫瘍系の増殖およ び成長を刺激する。 本発明は、胚細胞腫瘍系７５１がオートクリン増殖因子を培地に放出するという 本件出願人の発見に一部基いている。精製された３２ｋＤａのタンパク質に対し 産生されたポリクローナルウサギ抗体（ＳＡＭ、　１）は３２ｋＤａの分泌産物 および３７ｋＤａの細胞結合タンパク質の両方を認識する。また、この抗体は、 ヒト骨髄中のある細胞集団を同定でき、２．６％未満の正常な（付着性枯渇）骨 髄細胞と反応できる。この５ＣＰＦ＋骨髄細胞集団は、幹細胞マーカーＣＤ３４ を同時発現する。本明細書に記載された実施例に示されるように、５ＣＰＦは既 知の骨髄コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）のいずれとも異なる。なぜなら、ＧＭ−Ｃ ３Ｆ、　Ｇ−Ｃ３Ｆ　、　Ｍ−Ｃ３ＦおよびＩＬ−３に特異的な抗体は５ＣＰＦ の生物活性を抑制しないからである。更に、５ＣＰＦはまたｃ−ｋｉｔガン遺伝 子産物（ＳＣＦ）のリガンドとは異なる。なぜなら、抗５ＣＰＦ抗体はＳＣＦ機 能を中和しないからである。 本発明は、胚細胞腫瘍が患者より単離され、５ＣＰＦが腫瘍細胞により産生され たオートクリン増殖因子として同定され、そしてその因子の生化学的および生物 学的性質が特性決定される例により説明される。この新規なタンパク質の多種の 用途が、本明細書に記載された本発明に包含される。 ４、

【図面の簡単な説明】

図１．　フローサイトメトリー分析による表現型特性決定。７５１−胚細胞系を 、非神経外胚葉胚細胞（抗ＰＡＰ　、抗ＨＣＧ）、および神経起源の胚細胞（抗 サイトケラチン、ビメンチン、ＮＳＥ　、　ＧＦＡＰ、およびＮＦＰ）の細胞骨 格構造に特異的な抗原マーカーに対し誘導された抗体で染色した。抗ＨＬＡクラ スＩを対照として使用した。ボックス中に示された染色のパターンは、この細胞 系が神経系列またはダリア系列の細胞に分化できる原始的神経外胚葉細胞である ことを示す。 図２．　［”Ｓ　］−メチオニン代謝標識後の７５１胚細胞腫瘍からの上澄みの ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフおよびアムビス（Ａｍｂｉｓ）スキ ャン。上澄みをｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖後のｓｓ３をノ（ルスした７５１−ＧＣ（ 原胚細胞）の２４時間後に回収した。７５１−Ｔ２＝ｎｕ／ｎｕネズミ継代細胞 を原発性皮下腫瘍から単離した。７５１−Ｍｅｔ　ｎｕ／ｎｕネズミ継代細胞を 肝臓転移から単離した。アムビススキャンは３２ｋＤａのタンパク質を対象とし て実施され、ネズミ腫瘍、転移腫瘍および、組織培養中のみで継代した原胚細胞 系からの３２ｋＤａのタンプくり質分泌の定量的な差異を示す。 図３．　５ＡＭ、１抗体を使用する３７ｋＤａのゲル精製タンプくり質（ＳＣＰ Ｆ）のウェスタンプロット分析。（Ａ）３７ｋＤａのタンプくり質を示す５ＤＳ −ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色。（Ｂ）　／＜ネル３Ａｌこおけるゲル のウェスタンプロット。 図４．　抗体による腫瘍増殖の阻止。ＳＡＭ、　１抗体（抗５ＣＰＦ）を使用し て軟質寒天（メチルセルロース）中の腫瘍細胞コロニー形成を阻止した。棒グラ フは抗体濃度の関数としてコロニー（絶対数）の阻止を示す。ＮＲ３はｌ：２０ 希釈における正常なウサギ血清である。 下のパネルは、メチレンブルーで染色されている実際のコロニーを示す。 図５．　抗体による腫瘍増殖の阻止。この図は、ＤＮＡ複製を測定するためのト リチウム化チミジン取り込みの関数としての、ＳＡＭ、　１抗体による腫瘍増殖 の阻止を示す。細胞を１０．０００個／ウェルの濃度で９６ウエルのマイクロプ レートに入れ、そして様々な希釈率の抗血清をそれぞれのウェルに添加した。そ れぞれの希釈を３回繰り返した。培養４８時間後に、細胞を３Ｈ−チミジン（１ ０／ウエル）で標識し、１２時間にわたって再度培養し、その後、細胞を回収し 、放射性同位体のとり込みをシンチレーション・カウンターを使用して測定した 。データは、胚細胞７５１および非常に原始的な骨髄細胞系（ＢＯ−ＢＭ、　１ ）の増殖が抗体により阻止されたが、Ａ２５１神経芽腫細胞系が阻止されなかっ たことを示す。 図６．　クローン原性活性：　ＣＤ３４発現から単離されたヒト骨髄芽細胞のフ ローサイトメトリー分析。 図７．　長期のｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養におけるＣＤ３４＋細胞の複製：　ＣＤ３ ４＋細胞を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養の前に精製５ＣＰＦを使用して誘導した。 図８．　５ＣＰＦに応答する正常なヒト骨髄の増殖ニトリチウム化チミジン取り 込みアッセイ。 図９．　３ＡＭ、１（抗５ＣＰＦ）抗体で染色した付着性枯渇ヒト骨髄（９Ａ） および謄帯血（９Ｂ）のフローサイトメトリー分析。黒い線は、ＦＩＴＣヤギ抗 ウサギ対照を表し、青い線はヤギ抗マウスＦＩＴＣ対照を表す。 ＨＬＡクラス■　（緑の線）を陽性対照として使用した。 図１０、ヒト謄帯血の二重染色（ＳＡＭ、　１およびＣＤ３４）集団の分析。 図１１．免疫磁性ビーズにより単離されたＣＤ３４＋細胞へのＳＡＭ、　ｌ結合 の単色および二色のフローサイトメトリー分析。（ｌａ）ヤギ抗つサギＦＩＴＣ 対照、（Ｉｂ）ＳＡＭ、　ｌ抗体で染色されたＣＤ３４＋細胞、（ｌｃ）ＨＬＡ クラスＩマウスモノクローナル抗体で染色されたＣＤ３４＋細胞、（２ａ）ヤギ 抗マウスＰＥ対照、（２ｂ）抗ＣＤ３４抗体で染色されたＣＤ３４＋細胞、（２ ｃ）ヤギ抗マウスＦＩＴＣ対照、（３ｂ）ＳＡＭ、　１抗体（ＦＩＴＣ）および 抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＰＥ）で二重染色されたＣＤ３４＋細胞。 図１２．３ＡＭ、　１　および抗ＣＤ３４の単独および組み合わせの結合効率の フローサイトメトリー分析による比較。 図１３．３ＣＰＦを使用するＣＤ３４＋細胞の長期ｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖。 図１４．３ＣＰＦを使用する長期培養で増殖したＣＤ３４＋細胞のフローサイト メトリー分析（３色）。ゲートＣ 図１５．３ＣＰＦを使用する長期培養で増殖したＣＤ３４＋細胞のフローサイト メトリー分析（３色）。ゲート８ 図１６．３ＣＰＦの骨髄クローン原性活性。（Ａ）Ｃ３Ｆの混合物（ｌｏｏｕ／ ｍｌのＧＭ−Ｃ３Ｆ、１００ｕ／ｍｌのＩＬ−３、ｌｕ／ｍｌのＥＰＯ）単独の ＢＦＵ活性、（Ｂ）種々の濃度の５ＣＰＦのＢＦＵ活性、　（Ｃ）ＳＣＰＦ１０ ０ｎｇ／ｍｌと混合したＣ３ＦのＢＦＵ活性。データは、５ＣＰＦが単独でＢＦ Ｕ活性を誘発でき（Ｂ）、またＣ５Ｆ混合物と相乗作用する（Ｃ）ことを示す。 図１７．５ＣＰＦの骨髄クローン原性活性。（Ａ）（１００ｕ／ｍｌのＧＭ−Ｃ ３Ｆ、１００ｕ／ｍｌのＩＬ−３、ｌｕ／ｍｌのＥＰＯ）の混合物単独のＣＦＵ −ＧＭ活性、（Ｂ）種々の濃度の５ＣＰＦのＣＦＵ−ＧＭ活性、（Ｃ）ＳＣＰＦ １００ｎｇ／ｍｌと混合したＣ３ＦのＣＦＵ−ＧＭ活性。データは、５ＣＰＦが 単独でＣＦＵ−ＧＭ活性を誘発でき（Ｂ）、またＣ３Ｆ混合物と相乗作用する（ Ｃ）ことを示す。 図１８．３ＣＰＦの骨髄クローン原性活性。（Ａ）（１００ｕ／ｍｌのＧＭ−Ｃ ３Ｆ、１００ｕ／ｍｌのルー３、Ｉｕ／ｍｌのＥＰＯ）の混合物単独のＣＦＵ− Ｇ［７ＭＭ活性、（Ｂ）種々の濃度の５ＣＰＦのＣＦＵ−ＧＥＭＭ活性、（Ｃ） ＳＣＰＦ１００ｎｇ／ｍｌと混合したＣ５ＦのＣＦＵ−ＧＥＭＭ活性。データは 、５ＣＰＦが単独でＣＦＵ−ＧＥＭＭ活性を誘発できないが（Ｂ）、またＣ３Ｆ 混合物と相乗作用する（Ｃ）ことを示す。 ５、　発明の詳細な説明 本発明は、幹細胞増殖因子（ＳＣＰＦ）、通常のＤＮＡ技術または組換えＤＮＡ 技術による５ＣＰＦの生産方法、５ＣＰＦの使用方法、および同様に誘導された 胚細胞腫瘍系からの５ＣＰＦフアミリーのその他のメンバーを同定し、単離する 方法に関する。 新規なオートクリン増殖因子である５ＣＰＦは、膜結合形態および分泌形態の両 方で胚細胞腫瘍系７５１により発現される。また、５ＣＰＦからの膜形態がＣＤ ３４＋ヒト骨髄細胞の小フラクションの細胞表面で発現される。更に、５ｃｐｐ はＣＤ３４＋骨髄幹細胞の増殖を刺激し、それが造血細胞増殖の加速を必要とす る条件、即ち、骨髄移植、または造血を調節するためのｉｎ　ｖｉｖｏの治療に おける使用のための幹細胞の培養に有益であり得ることを示す。７５１腫瘍細胞 培養中の抗体による５ＣＰＦの除去は腫瘍細胞コロニー形成の減少をもたらし、 ５ＣＰＦが腫瘍細胞増殖を支持することに関与し、こうして５ＣＰＦ活性の抑制 が成る種の腫瘍の治療に有益であり得ることを示唆する。これはｉｎ　ｖｉｖｏ 実験により更に支持され、この場合、抗５ＣＰＥ抗体および７５１細胞の同時注 入が細胞系の低下した腫瘍形成性をもたらす。加えて、５ｃｐｐの膜形態はまた 抗５ｃｐｐ抗体の使用による多能性骨髄幹細胞の小集団の同定および単離の細胞 表面マーカーとして有益であり得る。 ５ＣＰＦ、またはそのフラグメントおよび誘導体は、造血の制御だけでなく成る 種の胚細胞癌の治療に広範な潜在的用途を有し得る。 さらなる胚細胞腫瘍系が本発明の実施の際に培養中に発生し得る。このような腫 瘍細胞は、特に造血系の細胞、および一般の種々の組織型の胚細胞／幹細胞に対 し増殖強化活性を有するサイトカインの源であり得る。 単に説明の目的のために、また限定のためではなく、下記のサブセクションで本 発明を更に詳細に説明する。説明の明瞭化のために、本発明を特別な５ＣＰＦお よび胚細胞腫瘍系に関して記載する。 しかしながら、これらの原理は、その他の胚細胞腫瘍系に由来するその他のオー トクリン因子に同様に適用し得る。 ５、■、神経外胚葉胚細胞系 中枢神経系の胚細胞腫瘍は、胚形成中のその他の組織部位への移動中の神経域中 に滞在した原始細胞の産物であると考えられる。 このような腫瘍細胞は、神経系の外部の組織に作用する種々のサイトカインを産 生じ得る（Ｂｈａｎｄａｒ、　１９８８．　Ｍｅｄ、Ｈｙｐｏｔｈ、　２７：　 ２９１）。 それ故、胚細胞腫瘍から生じた細胞系は、造血系の細胞を含む種々の細胞型の増 殖に影響する初期作用性増殖因子の源であり得る。 本発明は、脳室腹膜シャント（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　５ ｈｕｎＤに沿って多発性皮下塊を有すると診断された患者から得られた手術によ り除去された胚細胞腫瘍から生じた一つのこのような長期細胞系７５１を例示す る。培養された細胞は非付着性であり、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏて７〜８時間の 極めて短い倍加時間を示す。また、この迅速な増殖速度論がＢＮＸマウスへの培 養細胞の移入後にｉｎ　ｖｉｖ。 で確認され、これらのマウスは、マウスモデルにおける大半の異種腫瘍について は２〜３ケ月であるのに対し、７日間で１０’個の細胞の接種物から目視できる 皮下腫瘍を発生した。 特定の細胞決定基に対し誘導された抗体を使用するフローサイトメトリー分析は 、７５１細胞が原始脳神経外胚葉細胞系（これは適当な刺激後に神経細胞系列ま たはダリア細胞系列に更に分化し得る）に相当することを示した。それ故、それ は増殖ポテンシャルおよび分化ポテンシャルの両方を有する原始多能性細胞系で ある。７５１細胞はＣＤ３４を含む既知の白血球表面マーカーのいずれをも発現 しない。加えて、癌遺伝子叶ｍｙｃおよびｃ−ｆｍｓのｍＲＮＡが、癌遺伝子配 列のパネルに特異的な分子プローブを使用して検出された。ｃ−ｆｍｓはマクロ ファージ−コロニー刺激因子のレセプターであることが示されたので、７５１細 胞は骨髄の始原細胞に成る様式で関係し得る。 ５．２．　幹細胞増殖因子 本明細書の実施例に記載されたような７５１細胞系により産生された幹細胞増殖 因子は、二つの形態、即ち、約３２ｋＤａの分子量を有する分泌形態、および分 子量３７ｋＤａの膜結合形態で存在する。 約７．０〜８．０の範囲のＰ、１．を有する５ＣＰＦの複数のイソフオームが同 定される。 ３２ｋＤａの５ＣＰＦはウサギでポリクローナル抗血清を産生ずるのに使用され た。ＳＡＭ、　１と称される特定のポリクローナル抗体が、７５１細胞により主 要分泌タンパク質のさらなる生化学特性決定を容易にするのに使用された。その 抗体が最初に５ＣＰＦタンパク質に特異的であることが示された。何となれば、 それはウェスタンイムノブロッティング実験で７５１全細胞溶解産物中の３７ｋ Ｄａのタンパク質種と反応したからである。この知見は、対象のタンパク質が３ ２ｋＤａの分泌形態および３７ｋＤａ分子量の膜形態（これはアンカーリングの ための膜貫通成分を含み得る）で存在し得ることを実証している。こうして、同 じタンパク質は、相互作用する細胞間で可溶性分子および細胞表面タンパク質の 両方として機能し得る。 このタンパク質（以下、幹細胞増殖因子、５ＣＰＦと称される）の生物活性を概 説するために、コロニー抑制アッセイが行われ、ここで、７５１細胞コロニー形 成が種々の濃度のウサギ抗血清の存在下で評価された。これらの結果は、その抗 体が腫瘍細胞コロニー形成を抑制したことを示し、これは分泌タンパク質が７５ １細胞の増殖を促進するオートクリン増殖因子であることを示す。更に、その抗 体の増殖抑制効果は、神経芽腫細胞系の増殖が抑制されない点で胚細胞系または 幹細胞系に特異的である。 ５ＣＰＦが精製され、そしてヒト骨髄細胞の増殖を刺激するその能力につき試験 された。５ＣＰＦはクローン原性アッセイにおいて芽細胞の増殖を誘発し、これ らが続いてフローサイトメトリー分析によりＣＤ３４マーカーおよびＨＬＡクラ スＩ抗原を発現することが示された。同細胞が長期ゴートン培地中で５ＣＰＦの 不在下で増殖され、そして組換えＧＭ−Ｃ３Ｆの存在下で複製効率（ｒｅｐｌａ ｔｉｎｇ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）につき試験された場合、細胞は応答して顆粒 球、単球および混合表現型のコロニーを生じた。それ故、５ＣＰＦはＣＤ３４＋ 骨髄細胞（これらはコロニー刺激因子によるその後の刺激に応答して分化する能 力を保持する）の集団の複製を誘発できる。 抗５ＣＰＦ抗体がヒト骨髄細胞と反応させられた場合、細胞の小さいが、検出可 能なフラクションが陽性に染色されることが示された。また、同細胞は、造血幹 細胞により発現されたマーカーであると報告されたＣＤ３４タンパク質を発現す る。しかしながら、５ＣＰＦ産生７５１胚細胞腫瘍がＣＤ３４発現につき陰性で あり、そして抗５ＣＰＦおよび抗ＣＤ３４抗体が精製ＣＤ３４　”細胞への結合 において互いに競合的に抑制しないという知見は、ＳＡＭ、　１抗体がＣＤ３４ マーカーに対し誘導されないが、５ＣＰＦの膜形態に対し誘導されることを実証 している。ＳＡＭ、　１抗体は異なる非ヒト動物種のいずれのタンパク質とも交 差反応しない。何となれば、それはマウス、ウシおよびヒツジの骨髄から得られ た細胞と反応しなかったからである。 ５ＣＰＦの生物学的性質を更に特性決定するために、ＣＤ３４＋細胞の長期培養 を外在性精製５ＣＰＦの存在下で開始した。組換えＩＬ−３またはＩＬ−６に応 答して迅速に増えた培養物と違って、５ＣＰＦを添加した培養物には、細胞死の 初期段階が見られたが、ＣＤ３４＋細胞（これはその後５ＣＰＦに応答して増殖 し得た）の残留集団がもたらされた。５ＣＰＦ処理細胞は、ＩＬ−３またはＩＬ −６中で増殖した培養物とは対照的に、より一様な形態で現れる。しかしながら 、５ＣＰＦ処理培養物は、細胞表面マーカー発現に基いて二つの細胞集団を生じ た。 両方の集団はＣＤ３４を発現したが、一つの集団はＣＤ３８およびＩＩ、Ａ−Ｄ Ｒ発現に対し陰性であり、別の集団は低レベルの両方のマーカーを発現した。従 って、総合すると、５ＣＰＦは、分化を生じないでＣＤ３４ナルに応答する能力 を保持する）オートクリン増殖因子である。 その因子は培養細胞の悪性形質転換を誘発しない。何となれば、５ＣＰＦの除去 はＣＤ３４＋細胞生存度の迅速な低下をもたらしたからである。 更に、５ＣＰＦは、その他のコロニー刺激因子と組み合わせて使用される場合に 骨髄細胞に対する刺激作用を増強できる。しかしながら、５ＣＰＦは既知の造血 増殖因子のいずれにも似ていない。何となれば、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ、　Ｇ−Ｃ３ Ｆ　、　Ｍ−Ｃ３Ｆおよびルー３に特異的な抗体が５ｃｐｐの生物活性を中和し ないからである。更に、抗５ＣＰＦ抗体は最近同定された幹細胞因子（ＳＣＦ） 　（これはｃ−ｋｉｔ癌遺伝子によりコードされたレセプターのリガンドである ことが示された（Ｙｏｋｏｔａら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：１０７０；　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ら。 １９９０、　Ｃｅ１ｌ　６３：１６７；　Ｚｓｅｂｏら、　１９９０．　Ｃｅｌ ＋　６３：１９５））の機能を抑制しない。 ｃＤＮＡの調製のためのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は５ＣＰＦを産生す る細胞源から得ることができ、一方、５ＣＰＦのゲノム配列はあらゆる細胞源か ら得ることができる。例えば、７５１−ＮＡ細胞、７５１−ＬＩＶ細胞または７ ５１−ＬＮ細胞が５ＣＰＦのコード配列の源として使用でき、かつ／またはｃＤ ＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーを調製するために使用し得る。５ ＣＰＦコ一ド配列を含む遺伝子操作された微生物または細胞系が、この目的のた めのＤＮＡの都合のよい源として使用し得る。 ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーは、当業界で周知の技術を使用 して生成されたＤＮＡフラグメントから調製し得る。 ５ＣＰＦをコードするフラグメントは、このようなライブラリーを５ＣＰＦ配列 （これはその精製タンパク質から得られたアミノ酸配列情報に基く）の一部に相 同のヌクレオチドプローブでスクリーニングすることにより同定し得る。また、 抗体プローブは、λｇｔｌｌ（ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｒｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、　８０：１１９４−１１９８）の如き発 現クローニング方法により生じたライブラリーをスクリーニングするのに使用し 得る。コード配列の部分はクローニングおよび発現に使用し得るが、完全長クロ ーン、即ち、５ＣＰＦの全コード領域を含むクローンが発現に好ましいことがあ る。これらの目的のために、ＤＮＡの単離、適当な制限フラグメントの生成、ク ローンおよびライブラリーの構築、並びに組換え体のスクリーニングに関して当 業者に周知の技術が使用し得る。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９．Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、に記 載された技術を参照のこと。 ５ＣＰＦコ一ド配列を同定し、クローン化するのに選ばれた方法にかかわらず、 発現クローニング方法がスクリーニングの努力を実質的に軽減するのに使用し得 る。最近、抗体遺伝子をクローン化し、発現するための一工程操作が報告された （ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、　１９９０、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２−５５ ４；　ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１．　Ｎａｔｕｒｅ、３４ ９：　２９３−２９９）。この技術に基いて、５ＣＰＦ遺伝子が、λまたはｆｄ の如きバクテリオファージのコートタンパク質遺伝子に隣接した部位でベクター に直接に同様にクローン化し得る。５ＣＰＦ遺伝子を有するファージはその表面 で融合タンパク質を発現し、その結果、５ＣＰＦ特異性抗体を含むカラムが結合 活性を有するファージ粒子を選択し、そして単離するのに使用し得る。ラムダ− Ｚａｐ−ブルースクリプト（Ｓけａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ ）を使用する市販の発現クローニング系がまた５ＣＰＦ　ｃＤＮＡライブラリー のクローニングおよび抗体スクリーニングに使用し得る。一過性の遺伝子発現系 が適正な５ＣＰＦ遺伝子を同定するのに使用し得る。例えば、ＣＯ８細胞系（例 えば、Ｇｅｒｈｒｄ＆ＧＩｕｚｍａｎ、　１９８６．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ ｏ１６（１２）　４５７０−４５７７）が使用し得る。 ヌクレオチドコード配列の縮重のために、既知の５ＣＰＦ遺伝子の類似のアミノ 酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列が、５ＣＰＦのクローニングおよび発現 のために本発明を実施する際に使用し得る。 このような変更として、同一または機能上均等な遺伝子産物をコードする配列を 生じる欠失、付加または異なるヌクレオチド残基の置換が挙げられる。遺伝子産 物は、その配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでもよく、これ らがサイレント変化を生し、こうして生理活性生産物を生産する。このようなア ミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／ま たは両親媒性の類似性に基いてなし得る。例えば、負に帯電されたアミノ酸とし て、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ：正に帯電されたアミノ酸と して、リシンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性の値を有する帯電され ていない極性ヘッド基を有するアミノ酸として下記のアミノ酸が挙げられる：ロ イシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミ ン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン。オリゴヌクレオチド配 列が、ポリメラーゼ連鎖反応によりユニークな遺伝子配列のコピー数を増加する のに使用し得る。この方法は、縮重オリゴヌクレオチドを使用して得られるもの よりも更に特異的なプローブを与えるであろう。 加えて、構造上の変更を含むが、コードされた５ＣＰＦタンパク質の生物活性の 実質的な変化を生じないその他のＤＮＡ配列がまた本発明の実施の際に使用し得 る。このような変更として、付加的なプロセシング部位を生じるための５ＣＰＦ 中のアミノ酸残基の付加、欠失または置換および／またはグリコジル化部位の排 除が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、成るタンパク質中のＮ−結 合グリコシル化部位の除去が、酵母発現系に特に有益である発現産物につきグリ コジル化の減少をもたらす。 ５．４．　組換えＤＮＡ技術による５ＣＰＦの発現生物活性５ＣＰＦを発現する ために、５ＣＰＦをコードするヌクレオチド配列、または機能上均等なヌクレオ チド配列が、適当な発現ベクター、即ち、挿入されたコード配列の転写および翻 訳に必要な要素を含むベクターに挿入される。５ＣＰＦコ一ド配列の変更型が発 現産物の安定性、生産、精製または収率を増進するように操作し得る。例えば、 ５ＣＰＦおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質または開裂可能な融合タン パク質の発現が操作し得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロ マトグラフィーにより、例えば、異種タンパク質に特異的なカラムへの固定化に より容易に単離し得る。開裂部位が５ＣＰＦ部分と異種タンパク質の間で操作さ れる場合、５ｃｐｐタンパク質が、開裂部位を分断する適当な酵素または薬剤に よる処理によりクロマトグラフィーカラムから放出され得る（例えば、Ｂｏｏｔ ｈら、　１９８８．　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．Ｌｅｔｔ、　１９：６５−７０；およ びＧａｒｄｅｌｌａら、　１９９０．　Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１ ５８５４−１５８５９を参照のこと）。 当業者に周知である方法が、５ＣＰＦコ一ド配列および適当な転写／翻訳調節シ グナルを含む発現ベクターを構築するのに使用し得る。これらの方法として、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ　ｖｉｖｏの組換え ／遺伝子技術が挙げられる。例えば、Ｍａｎ−ｉａｔｉｓ　ら、１９８９．　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、に 記載された技術を参照のこと。 種々の宿主発現ベクター系が、５ＣＰＦコ一ド配列を発現するのに使用し得る。 これらとして、５ＣＰＦコ一ド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ　、 プラスミドＤＮＡまたはニスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリ アの如き微生物；　５ＣＰＦコ一ド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転 換された酵母、　５ＣＰＦコ一ド配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例え ば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ　；タバコモザイクウィルス、Ｔ ＭＶ）で感染され、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラス ミド）で形質転換された植物細胞系、　５ＣＰＦコ一ド配列を含む組換えウィル ス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）で感染された昆虫細胞系；または ５ＣＰＦコ一ド配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、レトロウィル ス、アデノウィルス、ワクチニアウィルス）で感染された動物細胞系、もしくは 安定に発現するように操作された形質転換動物細胞系が挙げられるが、これらに 限定されない。５ＣＰＦは炭水化物を含むことが確認されていなかったので、バ クテリア発現系だけでなく、翻訳修飾および翻訳後修飾を与える発現系、例えば 、哺乳類、昆虫、酵母または植物の発現系が、使用し得る。 使用した宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導可能なプロ モーター、転写エンハンサ−要素、転写ターミネータ−１等を含む幾つかの適当 な転写要素および翻訳要素のいずれをも発現ベクター中で使用し得る（例えば、 Ｂｉｔｔｅｒら、　１９８７゜Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　 １５３：５］６−５４４を参照のこと）。例えば、バクテリア系中のクローニン グの場合、誘導可能なプロモーター、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、　 ｐｌａｃ、　ｐｔｒｐＳｐｔａｃ　（ｐＬｒｐ−１ａｃハイブリツドプロモータ ー）等が使用し得る。哺乳類細胞系中のクローニングの場合、哺乳類細胞のゲノ ムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺 乳類ウィルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウィルスロングターミナ ルリピート；アデノウィルス後期プロモーター；ワクチニアウィルス７．５にプ ロモーター）が使用し得る。また、組換えＤＮＡ技術または合成技術により生産 されたプロモーターが、挿入５ＣＰＦコ一ド配列の転写を与えるのに使用し得る 。 バクテリア系において、幾つかの発現ベクターが、発現された５ＣＰＦに意図さ れた用途に応じて有利に選択し得る。例えば、多量の５ＣＰＦが生産される場合 、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生産物の発現を誘導するベクター が望ましいことがある。 ５ＣＰＦを回収することを助けるために開裂部位を含むように操作されているも のが好ましい。このようなベクターとして、Ｅ、ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２ ７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３．　ＥＭＢＯＪ、　２：ｌ７９１）　［ここで は、５ＣＰＦコ一ド配列がｌａｃ　Ｚコード領域を含む枠中でそのベクターに連 結されてもよく、その結果、ハイブリッド５ＣＰＦ−１ａｃ　Ｚタンパク質が生 産される］；ｐｌＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆　１ｎｏｕｙｅ、　１９８５゜Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：３１０１−３１０９；　ｖａｎ　 Ｈｅｅｋｅ＆５ｃｈｕｓｔｅｒ、　１９８９゜Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６ ４：５５０３−５５０９）；等が挙げられるが、これらに限定されない。 酵母において、構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターを含む幾つか のベクターが使用し得る。総説に関して、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　２巻、　１９８８゜ Ａｕ５ｕｂ−ｅｌら編集、　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈ、Ａｓ５ｏｃ、　＆ 　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ。 １３章；　Ｇｒａｎｔ　ら、１９８７．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　５ｅ ｃｒｅｔｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒ　Ｙｅａｓｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｗｕ　＆　Ｇｒｏｓｓｍａｎ編集、　３１９８７、 　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、、　１５３巻、　５１６−５４４頁；　 Ｇｌｏｖｅｒ、　１９８６゜ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１１巻、　ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈ、、　Ｄ、Ｃ，、３章；およびＢｉｔｔｅｒ、　１９８７ ．　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｙｅ ａｓｔ、　Ｍｅｔｔ＋ｏｄｓｔｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｂｅｒｇｅｒ　＆ Ｋｉｍｍｅ１編集、　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、、　１５２巻、　６７ ３−６８４頁；およびＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　１９８２．５ｔｒａｔｈｅｒ ｎら編集、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、Ｉ巻および１ １巻を参照のこと。構成的酵母プロモーター、例えば、ＡＤＨもしくはＬＰ０１ または誘導可能なプロモーター、例えば、ＧＡＬが使用し得る（Ｃｌｏｎｉｎｇ 　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ、　３章、　Ｒ，Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ：　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　１１巻、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＤＭ　Ｇｌ ｏｖｅｒ編集、　１９８６、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈ、、Ｄ、Ｃ，） 。また、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターが使用し 得る。 植物発現ベクターが使用される場合、５ＣＰＦコ一ド配列の発現が幾つかのプロ モーターのいずれかにより誘導し得る。例えば、ウィルスプロモーター、例えば 、ＣａＭＶの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターおよび１９５　ＲＮＡプロモーター（ Ｂｒｉｓｓｏｎら、　１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：５１１−５１４）ま たはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、　 １９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６：３０７−３１１）が使用し得る。また、植物プ ロモーター、例えば、ＲＵＤ　ｌ５ＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら、 　１９８４．　ＥＭＢＯＪ、３：１６７１−１６８０；　Ｂｒｏｇｌｉｅ　ら、 １９８４．　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：８３８−８４３）；または熱シヨツクプ ロモーター、例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−８またはｈｓｐ１７．３−Ｂ　（Ｇ ｕｒｌｅＹ　ら、１９８６．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　６：５５９−５ ６５）が使用し得る。これらの構築物が、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植 物ウイルスベ久ター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレク トロポレーション、等を使用して植物細胞に導入し得る。このような技術の総説 に関して、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ　＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、　１９８８． 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 、　Ａｃａ−ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　５ｅｃｔｉｏｎ　Ｖｌｌ＋、 　４２１−４６３頁：およびＧｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ、　１９８８．　Ｐ ｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２編、　Ｂｌａｃｋｉｅ、 ロンドン、７−９章を参照のこと。 ５ＣＰＦを発現するのに使用し得る別の発現系は昆虫系である。−（Ａｕｔｏｇ ｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が外 来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。そのウィルスで増殖する 。５ＣＰＦコ一ド配列がそのウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘトリン遺伝 子）にクローン化され、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドリン プロモーター）の制御下に置かれてもよい。５ＣＰＦコ一ド配列の成功した挿入 は、ポリヘトリン遺伝子の不活化および非封入（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組 換えウィルス（即ち、ポリヘトリン遺伝子によりコードされたタンパク質コート を欠いているウィルス）の生産をもたらすであろう。次に、これらの組換えウィ ルスは、挿入遺伝子が発現されるスポドブテラ・フルギペルダ細胞を感染するの に使用される（例えば、Ｓｍｉ　ｔｈら、　１９８３、　Ｊ、Ｖｉｏｌ、　４６ ：５８４；　Ｓｍ１ｔｈ、米国特許第４．２１５．０５１号明細書を参照のこと ）。 （本頁以下余白） 真核生物発現系（好ましくは、哺乳動物発現系）では発現された哺乳動物タンパ ク質の適切な翻訳後修飾が可能である。−次転写物の適切なプロセシング、グリ コジル化、リン酸化、そして遺伝子産物の分泌をつかさどる細胞機構を有する真 核細胞を５ＣＰＦ発現用の宿主細胞として使用することができる。哺乳動物細胞 系が好ましい。かかる宿主細胞系にはＣＨＯＳＶＥＲＯｌＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃ Ｏ８，ＭＤＣＫ、−２９３およびＷＩ３８が含まれるが、これらに限らない。 発現のために組換えウィルスまたはウィルス要素を利用する哺乳動物細胞系を遺 伝子操作することができる。例えば、アデノウィルス発現系を使用する場合は、 ５ＣＰＦのコード配列をアデノウィルスの転写／翻訳調節複合要素（例えば、後 期プロモーターおよび３分節リーダー配列）に連結させる。次に、このキメラ遺 伝子をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｌｌ　ｖｉｖｏ組換えによってアデノウィルス のゲノムに挿入する。該ウィルスにとって必須ではないゲノム領域（例えば、Ｅ ｌまたはＥ３の領域）に該キメラ遺伝子を挿入すると、生存可能であるうえに感 染宿主内で５ＣＰＦを発現することができる組換えウィルスが得られる（例えば 、Ｌｏｇａｎ　＆　５ｈｅｎｋ。 １９８４、　ｒ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１ ：　３６５５−３６５９を参照のこと）。また、ワクシニアウィルスの７．５に プロモーターを使用することもてきる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、　１９８２ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：　７４１５−７４１９；　Ｍａｃｋｅｔｔ　 ら、１９８４．　Ｊ、Ｖｉｒｏ！。 ４９：　８５７−８６４＋　Ｐａｎ１ｃａｌｉ　ら、１９８２．　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７９：　４９２７−４９３１を参照のこと） 。ウシ乳頭腫ウィルスを土台にしたベクターには特に興味をそそられ、これは染 色体外要素とじて複製する能力がある（　５ａｒｖｅｒら、　１９８１．　Ｍｏ １．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１：４８６）。このＤＮＡをマウスの細胞に入 れると、まもなくプラスミドが細胞１個あたり約１００〜２００のコピー数へと 複製される。挿入されたｃＤＮＡの転写には宿主染色体へのプラスミドの組込み が必要でないため、高レベルの発現が生じる。安定した発現のためにこれらのベ クターを使用するにあたっては、プラスミドに例えば二且旦遺伝子のような選択 マーカーを挿入する。また、レトロウィルスのゲノムは、宿生細胞内に５ＣＰＦ 遺伝子を導入してそれを発現させるためのベクターとして使用するための修飾が 可能である（Ｃｏｎｅ　＆　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　８に６３４９−６３５３）。さらに、誘導性プロモーター（メタロチオ ネインＩＩＡプロモーターや熱シヨツクプロモーターを含むがこれらに限らない ）を使うことによっても高レベルの発現を達成することができる。 組換えタンパク質を長期間、高収量で生産するためには、安定した発現が好まし い。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現調 節要素（例えば、プロモーター、エンハンサ−配列、転写ターミネータ−、ポリ アデニル化部位など）により制御される５ＣＰＦｃＤＮＡおよび選択マーカーを 用いて、宿主細胞を形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択マー カーはその選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定し た状態で組み込み、増殖してフォーカス（細胞増殖巣）を形成するのを可能にす る。続いて、クローニングを行い、細胞系へと発展させることができる。例えば 、外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作した細胞を富化培地で１〜２日間増殖させ、 その後選択培地に変える。多くの選択系を使用することができ、例えば単純ヘル ペスウィルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、　１９７７、　Ｃｅ１ｌ　１ １：　２２３）　、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ　＆　５ｚｙｂａｌｓｋａ。 １９６２、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　４８： 　２０２６）　、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｔ、ｏｗ ｙら、　１９８０．　Ｃｅ１ｌ　２２：８１７）の遺伝子をそれぞれｔｋ−１ｈ ｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用することができるが、これらに限 らない。また、選択の土台として代謝拮抗物質耐性を用いることもでき、メトト レキセート耐性を付与するｄ　ｈ　ｆ　ｒ　（Ｗｉｇｌｅｒら、　１９８０．　 Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７：　３５６７；　Ｏ’Ｈａｒｅ　 ら、１９８１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：　１５２７）　、ミコフェノール酸耐性 を付与するｇ　ｐ　ｔ　（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　＆　Ｂｅｒｇ、　１９８１．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ７８：　２０７２）　、 アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅ。 （Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、　１９８１．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、　１５０：　ｌ）　、並びにヒグロマイシン耐性を付与するｈ　ｙ　ｇ　 ｒ　ｏ　（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、　１９８４゜Ｇｅｎｅ　３０：　１４７）の遺 伝子がある。最近になって、更なる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファ ンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの 代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈ　ｉ　ｓ　Ｄ　（Ｈａｒｔｍａ ｎ　＆　Ｍｕｌｌｉｇａｎ。 １９８８、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５： 　８０４７　）　、並びにオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤の２−（ジフル オロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与するＯＤＣ（ オルニチンデカルボキシラーゼ）　（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ　Ｌ、、　１９８７ ．　Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ編集）の遺伝子が開示されている。 ５．５．　５ＣＰＦの生産 本発明は、膜結合型と分泌型の両方の５ＣＰＦに関する。５ＣＰＦはヒトの胚細 胞腫瘍系７５１によって自然界で分泌される。 連続細胞系の馴化培地から５ＣＰＦを単離し、種々のタンパク質精製法を使って 均質に精製することができる。また、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは化学 合成法によっても５ＣＰＦを生産することができる。 ５．５．１．　５ＣＰＦの精製 ５ＣＰＦはそれを分泌する細胞（すなわち、胚細胞系列の腫瘍細胞または遺伝子 操作された組換え宿主細胞の発現系）の培養上清から精製し得る。特定の実施態 様では、以下の実施例によると、７５１細胞系の馴化培地を集め、５ＤＳ−分離 用ゲル電気泳動により５ＣＰＦを精製する。また、抗５ＣＰＦ抗体を用いるイム ノアフィニティー法によって５ＣＰＦを精製してもよい。さらに、等電点電気泳 動法を使って５ＣＰＦを精製することもできる。 細胞の粗培養培地から５ＣＰＦを精製する方法はクローン化して発現させた産物 の精製に適している。加えて、５ＣＰＦのコード配列を切断可能な融合タンパク 質をコードするように遺伝子操作した場合は、５ＣＰＦをアフィニティー精製技 術を用いて簡単に精製しうる。例えば、プロテアーゼファクターＸａの切断認識 配列を５ＣＰＦのカルボキシル末端とマルトース結合タンパク質の間に遺伝子操 作により挿入す、る。得られた融合タンパク質はアミロース（マルトース結合タ ンパク質が結合する）を結合させたカラムを使って容易に精製できる。かくして 、マルトース含有バッファーを用いてカラムから５ＣＰＦ融合タンパク質を溶出 し、続いてファクターＸａで処理する。切断した５ＣＰＦは第２のアミロースカ ラムを通してさらに精製し、マルトース結合タンパク質を除＜（マサチューセッ ツ州ベバリー、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）。本発明のこの態 様を用いると、切断部位または酵素切断基質を、５ＣＰＦ配列と第２のペプチド またはタンパク質（精製のために使用しうる結合相手であって、例えば抗原を有 し、そのためのイムノアフィニティーカラムを作製し得る）の間に遺伝子操作に より挿入することができる。 本発明の５ＣＰＦの単離に使用できる方法はタンパク質の単離に常用されている 方法であり、例えば、５ＣＰＦ含有試料を慣用のタンパク質沈殿剤で処理し、次 にイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾 過、またはこれらの種々の組合せといった分画化を行う。例えば、米国特許第４ 、８８５．２３６号および同第４．８８２．２６８号に記載される方法を用いて 細胞の浮遊液から５ＣＰＦを精製し得る。本発明のポリペプチドの他の精製法は 当業界で公知である（例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｃｏｌｉｇａｎら編集、　１９９２年を参照のこと；参考 としてここに組み入れる）。 ５ＣＰＦ含有画分は適当な条件のもとで５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、５ＣＰＦ活性 を含むかまたは５ＣＰＦの分子量に一致するゲル切片を回収する。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥはＬａｅｍｍｌ　ｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０．１９７０ 　）に従って行う。適当な範囲内におさまる諸条件の変更はこの精製法に包含さ れることが理解されよう。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥから得られた５ＣＰＦ含有画分は分離後さらにＯ’　Ｆａｒｒ ｅｌｌの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５０：４００７．１９７５　 ）に従って二次元のゲル電気泳動にかけることができる。第一次の等電点ゲル電 気泳動は約３．８〜８．０のｐｒ値を有するタンパク質を分離するために広範囲 の両性電解質を使って標準方法により行う。 対象のタンパク質のｐｒ値に応じてｐＨ２〜１１の両性電解質溶液を様々な量で 加える。狭いｐＨでの広くて増強された分離能を希望する場合は、狭い範囲の両 性電解質を広い範囲の両性電解質に２：１の比率で加える。好ましくは約５〜９ のｐｒ値、特に約７〜８のｐｒ値を有するタンパク質の分離を可能にする両性電 解質を用いて、５ＣＰＦとその対応するイソフオームを分離する。 第二次のゲルは一般に１０〜２０％のアクリルアミドゲルとして操作されるが、 従来のスラブゲルも使用できる。 二次元のゲル電気泳動により分離されたタンパク質はクーマシーブルーや銀染色 のような標準法により検出することができる。 また、ゲル中のタンパク質を電気泳動的にプロットトランスファー膜に移行させ て、インディアインクまたはコロイド金を用いた染色により、あるいはウェスタ ンブロッティングにより検出することも可能である。本発明の５ＣＰＦは本発明 の抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出することが好ましい。 また、５ＣＰＦ含有画分は、逆相ＨＰＬＣにがけて、例えばアセトニトリルで溶 出することもできる。得られる５ＣＰＦは実質的に純粋で、Ｎ末端アミノ酸の配 列決定が可能である。溶液を真空下で乾燥し、小容量のアセトニトリル９５％十 ＴＦＡ　（０，０８％）に再溶解する。その後、濃厚な試料をフェニルチオヒダ ントイン（ＰＴＨ）アナライザに接続したシークエンサーに導入す本発明の５Ｃ ＰＦのようなゲル精製したサイトカインの生物学的活性は、指示細胞系の増殖の 促進（および／または抑制）についてのバイオアッセイで調べることができる。 例えば、５ＣＰＦ活性はＭＬ−１またはＫＧ−１ａ細胞により試験される。 ５、５．２．　化学合成法 ５ＣＰＦ分子は、全部または一部を、そのアミノ酸配列に基づいて固相化学合成 法により製造することもできる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ。 １９８３、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ、　Ｗ、Ｈ。 Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｎ、Ｙ、　ｐｐ、　５０−６０；　Ｓｔｅ ｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　１９８４゜Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓ ｉｓ、　２ｎｄ　ｅｄ、、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、を参照の こと）。このアプローチは１以上の５ＣＰＦの生物学的活性領域に相当する５Ｃ ＰＦセグメントを作製するのに特に有用である。 ５．６．　抗５ＣＰＦ抗体の生産 ５ＣＰＦまたは関連タンパク質を認識するポリクローナルならびにモノクローナ ル抗体の生産も本発明の範囲内に含まれる。 ５ＣＰＦのエピトープに対するポリクローナル抗体の生産には当分野で知られた 種々の方法を用いることができる。抗体の生産にあたっては、各種の宿主動物（ ウサギ、ハムスター、マウス、ラットなどを含むが、これらに限らない）に５Ｃ ＰＦタンパク質または５ＣＰＦペプチドを注射して免疫する。免疫学的反応を増 強するために、宿主動物種に応じて種々のアジュバントを使ってもよく、アジュ バントとしてはフロイント（完全および不完全）、無機ゲル、例えば水酸化アル ミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリア ニオン、ペオタイド、オイルエマルジョン、キーホールリンベットヘモシアニン 、ジニトロフェノール、ならびに有効でありうるヒトのアジュバント例えばＢＣ Ｇ　（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・バルバム（Ｃｏｒ ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）を挙げることができるが、これらに 限らない。 本発明の特定の実施態様では、５ＣＰＦ特異的抗体の生産のために、ゲル精製し た５ＣＰＦによりウサギを免疫した。１つの抗血清（ＳＡＭ、ｌ）が５ＣＰＦと 特異的に反応する抗体を含むことが実証され、オートクリン様式で７５１細胞の 増殖を刺激する５ＣＰＦの活性を阻止した。以下の第７．２．２．節を参照され たい。 ５ＣＰＦのエピトープに対するモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞系によ る抗体分子の生産をもたらす任意の技法を使うことにより生産することができる 。これらの技法にはＫｏｈｌｅｒとＭｉ　１ｓｔｅｉｎが最初に開発したハイブ リドーマ技法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５−４９７　）　、比較的 最近のＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３．　Ｉｎ＋ｍｕｎ ｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニア２；　Ｃｏｔｅ　ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０：２０２６−２０３０　）およびＥＢ Ｖ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、　１９８５．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、　７７−９６　）が含まれるが、これらに限 らない。適当な抗原特異性を有するマウスの抗体分子の遺伝子をヒトの抗体分子 の遺伝子とつなぎ合わせて“キメラ抗体”をつくるべく開発された技法を使用し てもよい（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、８１：６８５１−６８５５ＨＮｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４ ．　Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４−６０８；　Ｔａｋｅｄａ　ら、１９８５゜ Ｎａｔｕｒｅ、　３１４：４５２−４５４　）　、さらに、−末鎖抗体の作製に ついて述べた技法（米国特許第４．９４６．７７８号）を改良して一本鎖抗体を つくることもできる。 抗体分子の結合部位を含む抗体のフラグメントを既知の技法により作製してもよ い。かかるフラグメントには、例えば、抗体分子のペプシン消化により生成され るＦ　（ａｂ’　）　ｓフラグメントならびにＦ　（ａｂ’　）２フラグメント のジスルフィド橋を還元することにより得られるＦａｂフラグメントが含まれる が、これらに限らない。 ５ＣＰＦに対する抗体は、成熟型、前駆体型およびサブコンポーネント型の膜に 結合したあるいは分泌された５ＣＰＦの定性ならびに定量検出に、５ＣＰＦタン パク質のアフィニティー精製に、５ＣＰＦの生合成、代謝および機能の解明に、 そして免疫原性エピトープをコードする遺伝子配列についての５ＣＰＦ発現ライ ブラリーのスクリーニングに利用することができる。また、５ＣＰＦに対する抗 体は胚細胞や他の腫瘍の診断薬ならびに治療薬としても有用でありうる。 ５．７．　５ＣＰＦの用途 ５ＣＰＦの機能的活性および標的細胞特異性はｉｎ　ｖｉｔｒｏならびにｉｎ　 ｖｉｖｏにおいて様々な用途を提供する。単独であるいは他の生物活性を有する 増殖因子、インヒビターまたは免疫調節剤との組合せて増殖刺激活性を示す、５ ＣＰＦまたはそのフラグメントもしくは誘導体を含む化合物はどれも本発明の実 施および方法において使用し得る。５ＣＰＦ、５ＣＰＦ関連分子ならびにその組 成物は胚／幹細胞（造血幹細胞を含むが、これに限らない）の増殖を高めるのに 特に有用である。 造血幹細胞に外因性の遺伝子を安定した状態で組み入れようとする際の目下の主 な障害は、既存のサイトカインがこの種の細胞の増殖を分化を伴わずに刺激する ことができない点にある。５ＣＰＦは細胞周期に入って長期培養下で増殖するよ うにＣＤ３４”細胞を誘導し得ることがわかっている（以下の第７．２．５．節 ）。５ＣＰＦを使うことにより、鎌型赤血球貧血症などの血液疾患の遺伝子治療 に使用するための幹細胞の遺伝子操作を促進することができよう。 ５ＣＰＦが神経外胚葉山来の細胞系によって産生されるオートクリン増殖因子で あり、しかも造血系列の細胞にも作用するという知見は、５ＣＰＦが異なる組織 に由来する原始的な胚／幹細胞に特異的なサイトカインでありうることを示唆す る。幹細胞の集団は脳、肝臓、皮膚を含めて種々の臓器および組織に存在するこ とが知られている。さらに、毛髪の減少も毛嚢の周囲にある幹細胞の増殖に欠陥 があることと関係している。それ故、５ＣＰＦはその由来する組織にかかわらず 幹細胞集団の増殖を必要とする症状（毛髪の減少を含むが、これに限らない）を 治療するための有効な薬剤であり得る。 さらに、５ＣＰＦ受容体を発現する細胞は、受容体結合アッセイにおいて標識し た５ＣＰＦまたは５ＣＰＦ関連分子を使うことにより、あるいは５ＣＰＦ受容体 に対する抗体を用いることにより検出することが可能である。５ＣＰＦ受容体の 存在および密度により細胞を識別することができ、これにより５ＣＰＦの生物学 的活性に対する細胞の応答性を予測する手段が得られる。 ５．８．　胚細胞からのサイトヵインの同定方法本発明は、種々の胚／幹細胞に 対して生物学的活性を有する増殖因子またはサイトヵインを同定し、単離するた めの新規な方法を提供する。胚細胞腫を外科的に切除した材料から入手し、本発 明の実施のためにｉｎ　ｖｉけ０培養用に調製する。細胞系はある種のマーカー の発現あるいはある種の増殖因子への応答に基づいて選択し、付着細胞と非付着 細胞の両方を維持する。樹立された細胞系の組織系列特性は、種々の細胞表面要 素ならびに内部の細胞骨格要素（白血球抗原および中間フィラメントを含む）に 対する抗体を使用してフローサイトメトリー分析により調べることができる。さ らに、分子プローブの使用により、ｃ−ｍｙｃＳｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｒａｓＳ　ｃ −ｍｙｂＳ　ｃ−ｆｏｓＳ　ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ｅｒｂ、ｃ−ｒｏｓ、およびｃ− ｓｉｓを含むガン遺伝子の発現を検査することもできる。 樹立された細胞系により産生される新たなサイトカインを同定するために、細胞 を代謝的に標識し、分泌されたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。これ とは別に、バイオアッセイで特定のサイトカインに応答することが知られていて 、指示細胞として用いられる種々の細胞型に培養上清を供給することにより、培 養上清を直接分析してもよい。５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または生物学的活性に より主要なタンパク質が同定されたら、そのタンパク質を５ＤＳ−分離用ゲル、 イオン交換クロマトグラフィー、および等電点電気泳動ゲルで精製する（第５． ５．１．節を参照のこと）。タンパク質の純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥで確かめ、タ ンパク質アッセイで定量し、バイオアッセイでその活性を確認し、そしてポリク ローナルおよびモノクローナル抗体生産用の免疫原として使用する。 精製されたタンパク質は、さらに、異なる組織型の種々の指示細胞系の増殖を刺 激および／または抑制する能力についてバイオアッセイで試験する。放射性標識 タンパク質を使って、親和性標識のような方法によりその細胞表面受容体を同定 することもできる。サイトカインに対する特異的抗体を使用することにより、そ のサイトカインの膜結合型および分泌型を同定・定量したり、そのサイトカイン の生合成経路を研究したり、タンパク質をアフィニティー精製したり、上記のア プローチおよび技法を使ってコード配列の分子クローニングのために発現ライブ ラリーをイムノスクリーニングしたりすることもできる。 ６、　実施例：　５ＣＰＦを産生ずる７５１胚細胞腫瘍系の作製以下の文節では 、７５１腫瘍細胞系が、増殖および細胞表面マーカーの発現において異常な性質 を示す非常に原始的な神経外胚葉細胞系にあたることを示す実験について述べる 。この細胞系の増殖はこれまでに記載されたことのない１種以上の因子によって 調節されている。 ７５１胞系を工０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（ペニシリン ／ストレプトマイシン）を補給したＲＰＭ１１６４０に維持した。トリバンブル ー排除を使って細胞の生存と濃度を調へた。細胞の濃度がｌＸｌ０’細胞／ｍｌ となるように調整し、７５ｃｍの組織培養フラスコにまき、空気中５％ｃｏ２の 雰囲気下に３７℃でインキュベートした。 ６、１．、２．　動物 三重免疫欠損ｂｙ／ｍｕ／ｘｉｄ雌マウス（ＢＮＸママウスをインディアナ州の Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ社から入手し、無菌動物コロニー として維持した。マウスに無菌のＲｏｄｅｎｔ　Ｂｌｏｘと酸性水を自由に与え 、７〜９週齢になった時点で実験に使用した。 ６．１．３．　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞増殖速度７５１細胞系のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 増殖速度を次のように調べた。最適な出発細胞濃度が得られるように初期増殖曲 線を作成する実験を計画した。かくして、初期増殖曲線は５Ｘ１０’、５Ｘ１０ ’およびｌＸｌ０’細胞／ウエルで実施した。細胞カウントを１２時間おきに７ 日間行った。細胞カウントは１つの試料につき３回行った。これらの予備実験か ら、すべての後続の増殖曲線に最適な細胞数は５ＸＩＯ’であることが明らかに なった。かくして、７５１細胞を１２ウエルプレートで培養して最終濃度（２ｍ ｌ容量中）を５ｘ１０’　／ウェルとした。すべてのカウントを１２時間おきに ７日間行い、生存率も記録した。細胞カウントは１つの試料につき３回行った。 ６．１．４．　ｉｎ　ｖｉｖｏ細胞増殖速度この細胞系のＢＮＸマウスへの移植 能を試験した。腫瘍の増殖速度を測定するため、７５１−ＮＡｍ胞系のＬｏｇ、 。連続希釈液をＢＮＸマウスの後半部に皮下接種した（０．１ｍ１）。１つの希 釈液あたり８匹のマウスを使用した。接種したマウスは腫瘍の発生について１週 間に２回検査した。腫瘍の発生がはっきりしたら、腫瘍の大きさをはさみ尺を使 って２日ごとに測定した。腫瘍の測定は２つの直角をなす直径を測定して行い、 ２つの数値を掛は合わせることにより腫瘍の面積を概算した。 ６、１．５．　フローサイトメトリー分析７５１細胞は白血球の細胞表面マーカ ー：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤＩ　０ＳＣＤＩ　 ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＨＬＡクラスＩおよびクラス１ １に対して特異的なモノクローナル抗体を用いてスクリーニングした。これらの 抗体はカリフォルニア州のＢｅＣｌ０ｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎがら入手した。フ ローサイトメトリック分析は次のように行った（Ｇｒｉｅｂｅｌ　ら、１９８８ ）、７５１腫瘍細胞を遠心分離しく１，０００　ｒｐｔｎでｌＯ分間Ｌ０．２％ ゼラチン、１ｍＭ窒化ナトリウム、および２％正常ウサギ血清を含有する０、１ ＭのＰＢＳ中に２Ｘ１０’の濃度で再度浮遊させた。５０μＩの細胞浮遊液を９ ６ウエルの平底マイクロタイタープレートにて５０μｍのモノクローナル抗体に 加え、４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を水冷したＰＢＳ−ゼラ チンで３回洗い、ＰＢＳ−ゼラチンで１／７５に希釈した１００μｌのＦＩＴＣ 標識Ｆ　（ａｂ’　）　、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｈ鎖およびＬ鎖に特異 的）（ペンシルバニア州マルバーン、Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ１社） とともに４℃でさらに３０分間インキュベートした。２ミリミクロンを通して予 備濾過することにより全試料がらｍ胞の集合体を除いた。ＦＡＣＳ分析の直前に ナイロンモノフィラメントメッシュを通した（フロリダ州マイアミ、Ｓｎ＋ａｌ ｌ　Ｐａｒｔｓ社）。非特異的な標識を検出するための対照実験も行った。これ らの対照実験では、骨髄をＦＩＴＣ標識Ｆ　（ａｂ’　）２単独と、または無関 係の抗原に対して特異的でイソタイプが合致したモノクローナル抗体と反応させ た。ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｆａｃ−３ｃａｎフローサイトメーター を使ってＦＩＴＣ標識された７５１腫瘍細胞を分析した。２０．０００個の細胞 から得られたデータを集めて、モノクローナル抗体の反応性のパターンを解析し た。前方光散乱（ＦＡＬＳ）と９０％光散乱（Ｌ　Ｉ　９０）の２パラメ一ター 分析を使用するのは、ＦＡＬＳ対蛍光のプロットを排除するためと、蛍光対細胞 数のヒストグラムとして使用するためであった。また、データは所定の表現型マ ーカーが陽性である細胞の％としても得られた。 各種の抗原に対する抗体は商業源から購入した：抗すイトケラチン、抗ＮＦ２０ ０、抗ＮＦ１６０、抗ＮＦ６８（ミズーリ州セントルイス、Ｓ　ｉ　ｇｍａ社） ；抗ビメンチン（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）；抗ＧＦＡＰおよ び抗ＮＳＥ　（デンマーク国グロストラップ、ＤａｋｏｐａｔＬｓ社）、ＦＩＴ Ｃを結合させた第２抗体試薬はＳ　ｉ　ｇｍａ社から購入した。 １９８９年に、１９歳の白人女性が、地元の医師に頭痛と後視の病状を訴えた。 ＣＴスキャンで検査したところ、彼女は大きな枝上の塊をもつと診断された。外 科手術によりこの塊を取り除き、適所に脳質腹膜（ＶＰ）シャントをつくった。 手術後、総線量５０００　ＣＧＶの局所放射線を照射した。彼女は残っている腫 瘍をコントロールすることにより健康状態が良好なように見えたが、１年後再び 頭痛を訴えた。またしても、彼女はｖＰシャントに沿って皮下に複数の腫瘍塊の あることが判明した。身体検査により、ｖＰシャントの近くの頭蓋骨の右側に腫 瘍塊が１つ、そしてシャントのチューブに沿って胸壁上に腫瘍塊が２つ存在する ことが明らかになった。頭部のＣＴスキャンからは局所的再発とシャント付近に 軟組織塊のあることがはっきりした。さらに、腹部にも転移性の沈着物が存在し ていた。頭蓋骨にある病変部は吸引によって取り除いた。この部位から得られた 細胞の細胞学は胚細胞腫と一致した。１９９０年の２月に、その組織学的所見を さらに明確に規定するために、胸壁の塊の１つを切除した。この腫瘍の組織学的 検査を行ったところ、１９８９年に採取した最初の生検組織に類似した非胚細胞 腫様の混成胚細胞腫瘍であることがわかり、小さい原始細胞の集団が目立ってい た。 ６．２．２．　７５１細胞系の起源 １９９０年２月に手術した際に、胸壁から取った腫瘍の一部を、細胞の単離なら びに細胞培養下でのｉｎ　ＶｉｔｒＯ増殖のために実験室にもち込んだ。腫瘍を およそ３ｍｍの大きさに細分した。細かく切った腫瘍をバーセン（ｖｅｒｓｅｎ ｅ）　−）リブシンを使って３７℃で１０分間限定消化した。酵素で処理した後 、未消化組織を沈降により取り除き、上澄み液を集め、遠心分離し、そして細胞 ペレットを回収した。この細胞ペレットを培地に再度浮遊させて、培養した。 一次培養物を毎日検査し、培地を毎週変えた。最初の細胞培養物はプラスチック 皿に付着する細胞と付着しない細胞の両方を含んでいた。次の２か月間にわたっ て、形態学的に異なる細胞型の数がある位置まで減少し、そこでは共培養物とし て複製する２種類の明確な集団、つまり付着細胞として増殖するものと、非付着 細胞として増殖するもの、のみが存在するように見えた。この胚細胞系の培養を 開始して約１６週間経過後、非付着細胞が付着細胞より多くなって、限界希釈に よりクローン化された主要な細胞型となり、７５１−ＮＡと命名された。７５１ −ＮＡは細胞集団の多数継代を通して上記の増殖培地を使って安定した状態で１ ｎｖｉｔｒｏ培養下に維持された。７５１−ＮＡ細胞系からマウスの腫瘍モデル を開発するために、細胞をベージュ色のＸ染色体連関免疫欠損（ＢＮＸ）ヌード マウスの皮下組織に注入し、そしてもとの患者の腫瘍に組織学的外観が類似して いる胚細胞の腫瘍を発現させた。ＢＮＸマウスの皮下組織から腫瘍を無菌的に切 り出し、上記のようにバーセン−トリプシンで処理し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養下 で新たな非付着細胞系を再樹立し、これを７５１’−ＭＵと名づけだ。 さらに、肝臓およびリンパ節の転移性沈着物から２つの別の細胞系を樹立し、そ れぞれ７５１−ＬＩＶおよび７５１−ＬＮと名づけた。 ６．２．３．　７５１細胞系の特性決定樹立した７５１細胞系の特性決定を行う にあたり、増殖速度と表現型の両方を調べた。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖を増殖曲線 の解析により調べたところ、遅滞期がほとんどまたは全く見られないが、初期の 対数増殖、短い定常期、その後の劇的な生存能の減衰を示す特徴的な増殖パター ンが見られた。増殖の急速性は対数期における倍加時間が７〜８時間であると算 出されることからもわかる。 この細胞系のｉｎ　ｖｉｖｏ増殖はＢＮＸマウスモデルを使って調べた。マウス に細胞を注入したときの細胞の増殖速度を測定するために、各種の７５１細胞系 の連続対数希釈液をマウス後半部の皮下組織に接種した。マウスを１週間に２回 検査し、腫瘍の大きさを２つの直角をなす直径を測って調べた。腫瘍は１００個 の細胞はどの小さい接種物から発生し、接種後２０日目には腫瘍が明らかに存在 することが判明した。報告された大半のマウス腫瘍モデルが腫瘍の発生に２〜３ か月を要するのに対して、ｌＸ１０３個の細胞の接種からたった７日で腫瘍が発 生した。さらに、報告された腫瘍のほとんどは５ＸｌＯｓより少ない細胞数の接 種物では増殖しない。 細胞ノ見地カラコノ細胞集団（７５１−ＮＡ、７５１−ＬＩＶ、７５１−ＬＮ） の起源を調べるため、神経外胚葉の胚細胞、ニューロン系列、およびダリア細胞 系列の特定の細胞決定基に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両 方を使ってフローサイトメトリーにより分析した。この実験を完成させるべく次 の抗体を使用した：胎盤のアルカリホスファターゼ（ＰＡＰ）およびヒトの絨毛 性腺刺激ホルモン（Ｘ　ＣＧ）は非ニューロン細胞の胚細胞を検出するためのマ ーカーとして；サイトケラチンおよびビメンチンは神経外胚葉山来の胚細胞のマ ーカーとして；グリアフィラメント酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）はダリア細胞系 列のマーカーとして；ならびに、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）およびニュー ロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）−６８，１５０および２００はニューロン 系列の細胞のマーカーとして、それぞれ使用した。この実験の結果は、細胞集団 （７’５ｌ−ＮＡ、７５１−ＭＵ、７５１−ＬＮ）が適当な条件下でニューロン 系列がダリア細胞系列の細胞を形成しうる脳の原始胚細胞にあたるというもので あった（図１参照）。この表現型を示すヒト由来の他の細胞系はどれもｉｎ　ｖ ｉけ０で培養できなかった。 ７５１細胞系がＨＰＣＡ−１（ＣＤ３４）を含む既知の白血球マーカーを発現す るか否かを確かめるための実験を計画した。ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、Ｃ Ｄ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ７ １およびＣＤ３４の発現に関する７５１胚細胞腫のＦＡＣ８分析から、この原始 細胞系はＣＤ３４マーカーを含めて全ての白血球マーカーを欠くことがわかった 。 ６．２．４．　７５１細胞系によるガン遺伝子の発現ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉ ｎ　ｖｉｖｏで細胞の悪性表現型の発現においてガン原遺伝子が果たす役割につ いて、多くの細胞培養系を用いて実験を行った。多数の異なるガン遺伝子に対す るＤＮＡプローブを用いて、ノザン分析を実施した。これらの分析から、７５１ 細胞はガン遺伝子Ｃ−ｍｙｃならびにガン遺伝子受容体ｃ−ｆｍｓのｍＲＮＡを 豊富に含むことがわかった。ｃ−ｆｍｓガン遺伝子はマクロファージ−コロニー 刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）の受容体として作用するので、これは特に重要となる。 Ｍ−ＣＳＦ受容体は脳の小ダリア細胞に存在することが知られているが、神経由 来の原始細胞にそれが存在するという報告はこれまでにない。しかし、それは骨 髄の前駆細胞に存在し、単球／マクロファージ細胞の系列特異的分化に関与する 成長因子の１つである。この受容体の発現は、原始的な胚細胞の増殖および分化 におけるＭ−Ｃ３Ｆの役割を示すものである。 ７、　実施例＝７５１細胞系由来の幹細胞増殖因子下記の実験により、５ＣＰＦ は分泌されたときは３２ｋＤａで、細胞に結合しているときは３７ｋＤａである ことを示す。精製したタンパク質の二次元ゲル電気泳動によれば、ｐＩ値が約７ ．　０〜８．０の範囲にあるタンパク質のイソフオームが複数存在している。 ７５１腫瘍細胞系を、３０ｍ１の培養フラスコ内で１０％ウシ胎児血清および抗 生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を補給したダルベツコの最少必須培 地（ＤＭＥＭ）にて１０’細胞／ｍｌの密度へ増殖させた。必要な密度に達した ら、細胞を洗浄して増殖培地を除き、そしてメチオニンを含有するＤＭＥＭを２ ５％および〔３ｓＳ〕メチオニン（イリノイ州、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を２％補 給したメチオニン不含ＤＭＥＭ７５％中で再度培養し、再度インキュベートした 。２４時間おきに上澄み液を取り、遠心分離して非付着細胞を取り出し、−２０ ℃で保存した。次に、ｍｉｓで標識した上澄み液を試料バッファー（トリス−Ｈ Ｃｌ、２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、および０ ゜００１％ブロモフェノールブルー）に加え、１００℃で５分間加熱した。その 後、この試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供し、以前に記載されたとおりに電気泳動を 行った。電気泳動後、ゲルをＴＣＡ（１０％ｗ／ｖ）、氷酢酸（１０％ｖ　／　 ｖ　）およびメタノール（３０％Ｖ　／　Ｖ　）中で固定した。固定後、ゲルを フルオローハンス（Ｆｌｕｏｒｏ−ｈａｎｃｅＴＭ）　（イリノイ州プロスペク ト、Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ社）中にさらに３０分間浸漬した。ゲル を取り出し、ファイバーペーパー（予め湿らせたもの）の上におき、減圧下に加 熱（６０８Ｃ）　して乾かした。乾燥後、ゲルを高速Ｘ線フィールド（Ｋｏｄａ ｋ　Ｘ−ｏｍａｔ　ＡＲ）に露出し、−７０℃で２４〜４８時間貯蔵し、その後 オートラジオグラフを現像して分析した。 ７５１細胞系からの細胞溶解液、精製タンパク質ならびに上清は電気泳動バッフ ァー中で可溶化し、Ｌａｅｍｍｅｌｉ　（１９７０）の不連続バッファー系を用 いて１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。特に指定しない限り 、電気泳動は変性条件下で行った。各実験において、分子量マーカー（Ｂｉｏ　 Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を並行して泳動させ、クーマシーブルー染 色により視覚化した。 ７．１．２．　５ＣＰＦのゲル精製 培養後４８時間で７５１−ＮＡ細胞から血清を含まない上清を回収した。上清を ５ａｖａｎｔ濃縮により２０倍に濃縮し、次いて透析した。その後、濃縮した試 料を１２％分離用５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳゲル電気泳動後、ゲルを０ ．３Ｍ　ＣｕＣｌ□によるネガティブ染色に付した。目的のタンパク質バンドを ゲルから切り出し、小片に切断し、２００μｌの溶出バッファー（２５ｍＭトリ ス−グリジン、ｐＨ８，３）を含む透析バッグ（分子量カットオフ１２〜１４， ０００）に入れた。その後、試料を１゜ＯＶ、４℃で１８時間電気溶出した。電 気溶出後、電流を３０〜４０秒間逆にし、透析バッグを取り出し、試料を回収し て一夜透析した。すべての分離調製物は免疫原として使用する前に、または細胞 増殖アッセイで使用するために、５ＤＳ−ＰＡＧＥで純度を調べた。 ７、１．３．　抗５ＣＰＦ抗体の生産 免疫に先立ってニューシーラント白ウサギから採血し、この免疫前血清を用いて 基線を作成した。７μｇの精製５ＣＰＦポリペプチド（Ｒｉｂｉアジュバントを 含む）を皮下注射してウサギを免疫した。最初の注射の２週間後、ウサギにポリ ペプチドとＲｉｂｉアジュバントを含む２回目の注射を行った。ウサギは免疫原 とＲｉｂｉアジュバントによる皮下接種を少なくとも５回受けた。それぞれの接 種時点でウサギから採血し、血清を３２ｋＤａタンパク質に反応性の抗体の有無 についてウェスタンプロットで試験した。３２ｋＤａタンパク質に特異的な抗体 を高濃度で含む血清はすべて小分けして、−７０℃で保存した。 ７、１．４．　ウェスタンイムノブロッティング７５１−ＮＡ腫瘍細胞系から細 胞溶解液を電気泳動バッファー中に調製し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動（Ｌａｅｍｍｅｌｉ、　１９７０）を用いてタンパク質の分離を行った。 ゲル中に存在するタンパク質は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｓｅｍ１−Ｄｒｙ　Ｔｒａｎ ｓｂｌｏｔ装置を使って、Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９）の技法に従ってニトロセ ルロースに移行させた。ゲルを電気プロットバッファー（２５ｍＭ））リス（１ ９２ｍＭ）グリシンおよび（５％ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ８，３中で平衡化し た。ニトロセルロース膜もこのバッファー中で平衡化した。その後、ニトロセル ロース膜を白金アノード上の濾紙に載せ、上部にゲルを重層し、最後に予め浸漬 した濾紙を載せた。 カソードを配置した後、試料を２５ボルトで３５〜４０分間プロット／電気泳動 した。移行させた後に、膜／プロットをゼラチンとトゥイーン２０を含有するリ ン酸バッファー（ＰＢＳ−ゼラチンートウィーン）で４回洗った。ＰＢＳ−）ウ ィーンで前もって希釈しておいたウサギポリクローナル抗体とともにプロットを −夜インキュベートした。インキュベーション後、プロ・ソトをＰＢＳ−ゼラチ ンートウィーンで４回洗い、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（ミズ ーリ州セントルイス、Ｓ　ｉ　ｇｍａ社）と１時間インキュベートし、ＰＢＳ− トウイーンで２回、続いてＰＢＳのみで２回洗った。基質（０，０５％（Ｗ／Ｖ ）の４−クロロ−１−ナフトールおよび３０％のＨ２ＣＬ）を加え、プロ・ノド を暗室で室温にて６０分間インキュベートした。陽性反応は暗青色のバンドの出 現により示される。 ？、　１．５．　クローン原性アッセイ７５１腫瘍細胞系は１０％のＦＢＳを補 給したＤＭＥＭを含むメチルセルロース中でコロニー（＞１２８細胞／コロニー ）を形成する能力がある。１．Ｏｍｌのメチルセルロースに１０”個の細胞を加 え、これに３２ｋＤａタンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体の様々な希 釈液を１００μｌの容量で加えた。試料をよく混ぜ合わせ、２０ｍｍのペトリ皿 に入れ、空気中５％ＣＯ２の雰囲気下に３７℃でインキュベートした。培養後４ ８時間で、コロニーの数を倒立顕微鏡で数えた。 種々のコロニー刺激因子に特異的な抗体はＧｅｎｚｙｍｅ社（マサチューセッツ 州ボストン）から購入した。 ７、１．６．　長期培養（ゴートン型培養）ヒトの造血幹細胞を長期ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ培養で増殖させるためには、可溶性の細胞接触依存性因子を供給する付着 細胞の集団が必要である。ヒトの骨髄吸引液を防腐剤不含ヘパリンを含む培地中 に集め、長期培養培地で希釈して２５ｃｍ”の組織培養フラスコ中の最終容量を ８ｍｌ　（２ＸＩＯ’個の有核細胞を含む）とした（Ｇｏｒｄｏｎら、　１９８ ７．　Ｅｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　１５ニア７２）　、増殖培地はイノシトー ル（４０ｍｇ／ｍｌ）　、葉酸（１０ｍｇ／ｍ］）　、ヒドロコルチゾン（１０ −’Ｍ）　、２−メルカプトエタノール（２Ｘ１０−’Ｍ）、およびウマ血清と ＦＢＳのｌ＝１混合物（最終血清濃度２５％）を補給したα−ＭＥＭから成るも のであった。付着を促進するために、培養物を３７℃においた。４日後、培地と 非付着細胞を集め、Ｆ　ｉ　ｃｏ　Ｉ　Ｉ／Ｈｙｐａｑｕｅで遠心分離して顆粒 球と赤血球を除き、軽い密度画分を培養フラスコに戻した。その後、増殖培地の 半分と非付着細胞を、密集した付着単層が形成されるまで、１週問おきに新鮮な 培地と交換した。 長期培養物から培地と非付着細胞を取り除き、新鮮な培地２ｍｌを加えた。次に 、フラスコを２０００ラツドで照射し、付着層内に存在する造血細胞を排除した 。照射の後で培地を除き、精製した細胞集団を含む新鮮な培地８ｍｌと置き換え 、それらが再構成されて培養下で骨髄造血を開始するかどうかを調べた。対照と して、一部の長期培養物を培地により再構成させた。これは単に照射が造血前駆 細胞をすべて排除するのに十分であることを実証するためであった（陰性対照） 。さらに、一部の長期培養物を正常な骨髄細胞により再構成させた（陽性対照） 。再構成の後、培地の半分と非付着細胞を週１回集め、カウントし、増殖因子を 含有するメチルセルロース培養液中に入れた。さらに、ある時点で、培養フラス コを犠牲にし、付着細胞をトリプシンで処理して造血コロニーアッセイ用の単細 胞浮遊液を得た。 ７．１．７．　ｉｎ　ｖｉけ０前駆細胞アッセイ次のアッセイは細胞のＣＦＵ活 性の測定に使用した標準的なプロトコールである。 ヒト骨髄中の早期の造血前駆細胞を検出する目的で、プレコロニー形成単位（プ レＣＦＵ）アッセイを計画した（Ｓｍｉｔｈら。 １９９１、　Ｂｌｏｏｄ、　７７：２１２２）　。分離した細胞をｒｌＬ−１（ Ｚ（１００Ｕ／ｍｌ）およびｒＩＬ−３（５０ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベ ートし、回収し、そして培養して７日後に数えた。１Ｘ１０５個の細胞を０．３ ６％アガロース中に１００ＯＵ／ｍｌの組換えＧＭ−Ｃ８Ｆとともにまき、イン キュベーション後１４日でコロニー（〉５０細胞）を評価した。 骨髄単球／赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および赤芽球系列の前駆細胞 （ＢＦＵ−Ｅ）を検出するために、混成ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／ＢＦＵ−Ｅアッセイ を採用したＣＡｓｈら、　１９８１゜Ｂｌｏｏｄ　５８：３０９）　、簡単に述 べると、ｌＸｌ０’個の精製した幹細胞を直径３５ｍｍのプレートにおいて総量 １．Ｏｍｌのイスコベ（Ｉｓｃｏｖｅ）改良ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）培 地（５Ｘ１０ＳＭ　２−メルカプトエタノール、３０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍ＋ のヒトｒＩＬ−３および１．ＯＵ／ｍｌのＥｐｏ、そして０．９％メチルセルロ ースを補給した）にまいた。この培養物を空気中５％ＣＯ２および１０％０□を 含む湿った雰囲気中で３７℃にて１４日間インキュベートした。倒立顕微鏡を使 ってコロニー（〉５０細胞）を数えた。 また、ＣＦＵ−ＧＭを代表する早期の造血前駆細胞も検出した（　１ｓｃｏｖｅ ら、　１９７１．　Ｂｌｏｏｄ　３７：Ｉ）　。簡単に述べると、ｌＸｌ０’個 の精製した幹細胞を直径３５ｍｍのペトリ皿において総量１゜Ｏｍｌのａ−ＭＥ Ｍ（２％ＦＢＳ、０．６％Ｌ−グルタミン、０゜９％メチルセルロース、および １００Ｕ／ｍ＋のヒトｒＩＬ−３を補給した）にまいた。この培養物をＣＦＵ− ＧＥＭＭアッセイについて記載したとおりにインキュベートし、倒立顕微鏡を使 ってコロニーを数えた。 （本頁以下余白） ７．２．　結果 ７５１細胞系によって分泌されたタンパク質を視覚化するため、［”Ｓ］　−メ チオニンを用いてパルスチェイス実験を行なった。 メチオニンを含まない培地中で細胞を１２時間標識し、その後細胞をメチオニン 含有のコールド培地に入れた。次に、！ｓＳで標識された上清を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにかけた。１個の主要タンパク質が７５１腫瘍細胞から分泌されることが分っ た。その見掛は分子量の計算値［回帰分析によるコは、３２ｋＤａであった。さ らに、このタンパク質の最大分泌は培養後２４〜３６時間に起ることが分った（ 図２参照）。 このタンパク質の単離は、分泌されたポリペプチドを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって 分離し、分子量マーカーに比較した移動によって３２ｋＤａポリペプチドを同定 することにより達成された。いったん同定した後、タンパク質を電気プロッティ ングによりニトロセルロースに移し、３２ｋＤａタンパク質に対応する領域を切 り出してジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。これを、ポリクローナ ル抗体の産生のため、ウサギに注射した。 抗体の特異性は、７５１−ＬＮ由来の全細胞溶解物に対して、ウェスタンイムノ プロット技法を用いて試験した。この試験系では、Ｂｉｏ−Ｒａ６社のセミトラ イトランスファー装置を用いてタンパク質をニトロセルロースに移し、次に比色 定量ＥＬ　Ｉ　ＳＡの変法にかけた。暗青色バンドの出現により陽性バンド反応 が示された。これらのアッセイは、見掛は分子量（回帰分析により計算されたも の）３７ｋＤａを有する単一のタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗 体を示した（図３参照）。これは、上記の分泌されたタンパク質の分子量（３２ ｋＤａ）と考え合わせると、以下のことを示唆する。すなわち、（１）分泌され たタンパク質を細胞表面へ輸送するシグナル配列が存在する。（２）分子への膜 貫通成分がそのタンパク質を膜に固定する。（３）このタンパク質には２つの形 態が存在し、一方は膜結合型（３７ｋＤａ）で、他方は分子量３２ｋＤａの可溶 性で細胞外の型である。 両方の形態とも「増殖因子Ｊとして働くことができ、膜結合型の方はさらに正常 な胚細胞発達の過程で細胞−細胞間の相互作用にも関与する。 ？、２．２．　３ＣＰＦによる胚細胞腫瘍系のオートクリン増殖の調節３２ｋＤ ａタンパク質に対して誘導されたポリクローナル抗体を用いて、メチルセルロー ス中でコロニー阻止アッセイを実施した。先の実験で、７５１細胞はメチルセル ロース中で４８時間以内に細胞数５０以上のコロニーを形成することが示された 。もし３２ｋＤａタンパク質が腫瘍細胞の増殖を調節する自己分泌因子であるな らば、このタンパク質とその細胞性受容体との結合をブロックすると、細胞複製 およびコロニー増殖が減少するはずである。ウサギポリクローナル抗３２ｋＤａ 抗体の連続的希釈液を用いて、７５１−ＮＡ、７５１−ＭＵ、および７５１−Ｌ Ｎ腫瘍細胞を種々の血清希釈物を含有するメチルセルロースと混合し、３７℃で ４８時間インキュベートし、新らしく形成されたコロニーを数えた。逆希釈率（ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）　１　／　２０で、抗体はコロニー 形成の９８％を阻止した。この阻止は抗体濃度依存性で、有意な阻止（２５％以 上）は血清希釈率１／１２０で起こることが示された。希釈率１／２０の正常な ウサギ血清はコロニー形成を阻止しなかった（図４参照）。さらに、抗３７ｋＤ ａ抗体の細胞増殖阻止能を、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイにより試験した（ 図５参照）。この図は、抗体が事実上細胞増殖を阻止し、かつこの阻止が胚／幹 細胞特異的であることを示している。なぜなら、７５１−Ｍｕ　ＭｅｔおよびＢ ＯＢｍ、　１細胞のみが阻止されているからである。Ａ２５１神経芽細胞腫系は 阻止されなかった。 ７．２．Ｌ　５ＣＰＦと一ヒト骨髄細胞集団との相互作用以下に記述する実験結 果は、抗ＳＣ’ＰＦ抗体（ＳＡＭ、＋１）が骨髄細胞の小集団と特異的に相互作 用し、さ１ら１にこの集団はＣＤ３４＋区画に該当するように思われることを示 している。最終的には、抗５ＣＰＦ抗体はＣＤ３４タンパク質とは別個のマーカ ーを認識する。そして、この抗体はある幹細胞集団の明確な描写に重要であるか もしれない。 ７５１細胞の原始的な性質、およびこれが自己分泌増殖因子（ＳＣＦ’Ｆ）によ って制御されているように思われることにより、精製された天然の５ＣＰＦが骨 髄細胞と相互作用するかどうかを決定するため、以下の実験を考案した。この相 互作用は、（１）骨髄−メチルセルロース　クローン原性アッセイ、（２）　３ Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、および（３）フローサイトメトリーを用いて分 析した。図３は、これらのアッセイに用いられた精製された天然の３７ｋＤａタ ンパク質の、クーマシーブルーによって染色されたＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　 Ｅ−ゲルおよびＳＡＭ、ｌポリクローナル抗体を用いたウェスタンプロットを示 す。ゲル上に、３７ｋＤａに移動している単一バンドが現れた（図３Ａ参照）。 このゲルのニトロセルロースプロットをＳＡＭ、１抗体と反応させると同じ位置 に１本のバンドが現れた（図３Ｂ参照）。この精製５ＣＰＦを種々の濃度でクロ ーン原性アッセイに用いたところ（表１参照）、明確な形態のコロニーは全く観 察されなかった。 （本頁以下余白） しかし、これらのアッセイでは、非常にゆるい集団をなす芽球様細胞が観察され た。これらの芽球様細胞はクローン原性アッセイより取り除き、間質支持細胞層 を含むおよび含まない懸濁培養にかけ、５ＣＰＦを用いて増殖させた。間質支持 細胞層を含まない懸濁物から培養９６時間後に細胞を集め、モノクローナル抗体 ＨＰＣＡ−１（抗ＣＤ３４）を用いたフローサイトメトリー分析にかけた。陰性 対照としてアイソタイプ対照を、また陽性対照としてＷ６／３２（抗ヒトＨＬＡ クラスｌ）モノクローナル抗体を用いた。図６はこれらの細胞のフローサイトメ トリー分析である。すべての細胞がＷ６／３２抗ＨＬＡクラスＩによって染めら れ、さらに高いパーセンテージの細胞が抗ＣＤ３４とも反応した。すべての細胞 がＣＤ３４＋というわけではないことが明白であった。これは以下の理由による ものだったかもしれない。すなわち、（１）懸濁培養による増殖に先立つ、非Ｃ Ｄ３４“細胞のクローン原性アッセイからの除去、または（２）懸濁培養中の細 胞の分化である。しかし、このことは５ＣＰＦタンパク質がＣＤ３４’表現型細 胞と相互作用したことを示すものであった。間質支持細胞層を含む長期培養物に 入れた細胞は（図７参照）、ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）培養条件下での連続増殖 について分析した。 図７は、これらの細胞が長期ゴートン培養において５ＣＰＦの不在下で増殖した ことを示す。間質細胞は、可溶性因子にとっても細胞−細胞接触にとっても、十 分な増殖と生存能力を維持するために重要であるように思われる。間質馴化培地 のみを与えられた細胞は増殖、つまり生残しなかった。細胞は７２時間目にゴー トン培養物から除去し、組換えＧＭ−Ｃ３Ｆの存在下での複製効率を試験した（ 表２参照）。 コロニーアッセイで誘導され、次にゴートン培養で増殖された細胞は、ＧＭ−Ｃ ３Ｆに反応し、また顆粒球（Ｇ）、単球（Ｍ）、およびＧＭ混合細胞のコロニー を形成することができ、したがって骨髄様細胞への系列分化を経る能力を示して いるようであった。 ３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定された骨髄細胞の増殖も、５ＣＰＦが骨髄 起源の細胞を増殖させることを示した（図８参照）。 これまでの実験により、５ＣＰＦが骨髄細胞の集団と相互作用することは明白で ある。ポリクローナルウサギ抗体（ＳＡＭ、１）は５ＣＰＦに対して産生された ものであり、また５ＣＰＦは細胞に結合しているので、骨髄細胞のフローサイト メトリー分析を行ない、５ＣＰＦと相互作用する骨髄的細胞の表現型の性質を確 めた。着生欠如ヒト骨髄細胞およびヒト謄帯血の両方を新しい造血幹細胞の供給 源として用いて、ＳＡＭ、１のヒト骨髄細胞認識能を試験した。図９は、ＳＡＭ 、ｌが骨髄内および謄帯血内の非常に小さい細胞集団（それぞれ２．５％および １．９６％）と結合することを示している。この集団を明らかにする試みにおい て、抗ＣＤ３４フィコエリトリン（ＰＲ）標識抗体およびＳＡＭ、１フルオレセ インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）系を用いた、２色ＦＡＣ８分析が実施され た（図１Ｏ参照）。これらの実験と、７５１細胞はＣＤ３４を発現しないのでＳ ＡＭ、１はＣＤ３４マーカーそれ自体に向けられたものではないという先の知見 より、次のことが明らかである。すなわち、ＳＡＭ、１はＣＤ３４マーカーと５ ＣＰＦの両方を共発現するある細胞集団を認識するのである。 ＣＤ３４′″でかつ５ＣＰＦ＋である細胞の集団は、検査した全細胞集団の１． ６５％にあたる（図１Ｏ参照）。ＳＡＭ、１の、ネズミ、ウシおよびヒツジの骨 髄中の細胞集団認識能もフローサイトメトリーにより検査した。いずれの場合も 、ＳＡＭ、１はこれら非ヒト動物種の骨髄由来の有意な細胞集団をなんら認識し なかった。 精製ＣＤ３４“細胞について、抗５ＣＰＦ抗体を用いたフローサイトメトリー実 験を行なった。ＣＤ３４＋集団は、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体と結合した免 疫磁性ビーズを用いて正常なヒト骨髄から分離し、フローサイトメトリーに使用 する前に液体窒素中に保存しておいた（Ｋｅｓｓｌｅｒら、　１９８７．　Ｂｌ ｏｏｄ　７０：３２１）　、単色および２色分析の両方について、ＳＡＭ、ｌは ＣＤ３４選択集団を認識する（図１１参照）。さらに、ＳＡＭ、１と抗ＣＤ３４ の間には全く競合が見られない（図１２参照）。これらの実験において、ＣＤ３ ４＋細胞はＳＡＭ、１単独と、まタハＳＡＭ、１／抗ＣＤ３４の混合物と共にイ ンキュベートされた。図１２から分カルヨウニ、抗ＣＤ３４は、ＳＡＭ、１のＣ Ｄ３４”細胞トノ結合能を妨げなかった。ＣＤ３４”″細胞を抗ＣＤ３４単独と 、またはＳＡＭ、１／抗ＣＤ３４の混合物と共にインキュベートした点だけを変 えて、これらの実験を繰り返した。図１２Ａに示されるように、ＳＡＭ、ｌは抗 ＣＤ３４抗体の結合を妨げなかった。 これは、ＳＡＭ、１抗体が別個の細胞表面抗原を認識することを再度示すもので ある。 ７．２．４．　５ＣＰＦを用いたｃＤ３４４細胞の長期培養ＣＤ３４＋細胞の長 期培養を、外部から加えた精製天然５ｃＰＦの存在下で開始した。外部からなに も増殖因子を加えない対照培養物と、１００Ｕ／ｍＬのインターロイキン３　（ ＩＬ−３）および１００Ｕ／ｍＬのインターロイキン６　（ＩＬ−６）を含有す る培養物も合わせて培養した。２４ウエルのプレートの各ウェルに２００，００ ０細胞／ｍＬの濃度で精製ＣＤ３４＋細胞をまき、適切な増殖因子を加えた。精 製５ＣＰＦを種々の濃度で（ｊｕｇ／　ｍ　Ｌから１０ｎｇ／ｍＬ）加えた。３ 日ごとに培地を取替え、外因性増殖因子を加えた。すべての培養物を毎日検査し て、細胞の生存能力と状態を評価した。 これらの実験の結果は図１３にまとめである。ＩＬ−３またはＩＬ−６を受け取 った培養物は、生存不能細胞がほとんどなく迅速に増殖した。第７日までにこれ らの培養物は継代が必要となった。他方５ＣＰＦで処理した培養物は、急速に細 胞生存能力が低下し、第７日までに１０〜１５％の細胞が生きているのみとなっ た。しかし、ＣＤ３４＋細胞のこの残留集団は今や５ＣＰＦ反応性であり、培養 下で１２週間増殖を続けてきた。対照培養物（増殖因子無し）は、それらが死滅 するまで３週間維持した。ＩＬ−３またはＩＬ−６を受け取った細胞は、混合形 態であり、付着性および非付着性細胞の両方を含有する。細胞遠心分離による調 製物は、これらの培養物が多数の成熟顆粒球細胞および成熟芽球様細胞を含有す ることを示す。これらのＩＬ−３またはＩＬ−６で処理された細胞は、１６週間 まで連続培養で維持した。５ＣＰＦで処理された細胞は、サイズがより均一で、 すべて単核で外見は芽球様で、かつ非付着性である。用Ｉ反応実験から、５ＣＰ Ｆの最適濃度は５０ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬの間であると思われる。 培養１２週間後に５ＣＰＦで処理したＣＤ３４＋細胞を、フローサイトメトリー により、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＤ　Ｒ／ＨＬＡクラス■発現の有無について 調べた。図１４および１５に示すデータは、５ＣＰＦによって増殖したＣＤ３４ ″″細胞はサイズに基づく２種類の形態集団からなることを例証している。図１ ４　［ゲート領域（ｇａｔｅｄ　ａｒｅａ）　Ｃ］は、表現型ＣＤ３４”″、Ｃ Ｄ３８−およびＤＲ−をもっ小さい細胞を示している。大きい集団（図１５−４ −　ト領域Ｂ）　ハ、ＣＤ３４”、ＣＤ３８”お、Ｊ：びＤＲｌａｗである。し たがって、５ＣＰＦはｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養においてＣＤ３４゛という表現型を 維持しながら（つまり、ＣＤ３４＋細胞が分化しないで）、ＣＤ３４＋細胞の増 殖を誘導することができるように思われる。５ＣＰＦによって増殖したＣＤ３４ ＋細胞およびＩＬ−３によって増殖したＣＤ３４＋細胞両者の複製効率を培養８ 週間後に試験した（表３参照）。 ここでもデータは、ＩＬ−３の存在下で増殖した細胞は（組換えＩＬ−３および ＧＭ−Ｃ３Ｆを用いた）複製能に乏しいことを示唆している。他方、５ＣＰＦで 処理したＣＤ３４＋細胞は、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で良好な複製 効率を有し、再度５ＣＰＦにより増殖した細胞の原始的性質を示した。５ＣＰＦ はＣＤ３４″′細胞にいかなる悪性表現型をも付与しなかった。なぜなら、ＣＤ ３４＋細胞は５ＣＰＦを取り去った後４〜５日以内に死亡したからである。 この増殖因子の一次信号として骨髄幹細胞と相互作用する能力を調べるため実施 した実験は、５ＣＰＦがＢＦＵおよびＣＦＵ−ＧＭの両方のコロニーを誘導可能 であるごとを示している（図１６および１７参照）。５ＣＰＦはＣＦＵ−ＧＥＭ Ｍを誘導できないように見える。しかし、この因子はコロニー刺激因子の混合物 （ＧＭ−Ｃ８Ｆ、ＩＬ−３およびＥＰＯ）の活性を増強することができ、それに よってＢＦＵ　（図１６ＡおよびＣ）　、ＣＦＵ−ＧＭ（図１７ＡおよびＣ）お よびＣＦＵ−ＧＥＭＭ　（図１８ＡおよびＣ）コロニーに対するＣ３Ｆ活性を有 意に増大させる。 ７．２．５．　５ＣＰＦによるＣＤ３４＋細胞の細胞周期への誘導以下の実験は 、５ＣＰＦおよび■Ｌ−３の、精製ＣＤ３４＋骨髄細胞に複製を引き起こす能力 を分析したものである。その結果は、５ＣＰＦおよびＩＬ−３の両方とも、単独 で与えられた場合、該細胞を刺激して細胞周期を開始させることができることを 実証している。この２種類のサイトカインを組み合わせて、培養した細胞に加え ると、６２期における細胞パーセンテージの増加に対する付加的効果が見られる 。 ７、２．６．　抗体阻止研究 以下の研究は、メチルセルロース骨髄コロニーアッセイにおいて５ＣＰＦによっ て誘導される芽細胞コロニーの形成を中和するために、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ、Ｇ− Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ３ＦおよびＩＬ−３に特異的なポリクローナル抗体の使用を検討 したものである（表５参照）。 実験データは、これらのポリクローナル抗体のどれも５ＣＰＦによる芽細胞コロ ニーの誘導を中和することができなかったが、ＳＡＭ、１はその誘導を中和でき たことを示している。しかし、ＳＡＭ、１抗体はＧＭ−Ｃ８ＦおよびＩＬ−３の ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）増強を阻止することはできなかった。これは、５ＣＰ Ｆが公知のＳＣＦではないことを示し、またＳＡＭ、１抗体はｓｃＦの機能を阻 止しないので５ＣＰＦはＳＣＦとは機能的に異なっているように思われる。 ７、２．７．　二次元電気泳動 化学薬品。アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−−メチレンビスアクリルアミド、尿素、過 硫酸アンモニウム、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラメチルエチレンジアミンおよびＡＧ 　５０１−Ｘ８分析グレード混床樹脂をＢｉｏ−Ｒａｄ社にューヨーク、ロック ビルセンター）より購入した。 両性電解質Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ　ｐＨ３−１０およびＢｉｏｌｙｔｅ　ｐＨ３ −１０，および分子量標準物質（Ｍｒ２０，１００、トリプシンインヒビター、 大豆、２４，０００、トリプシノーゲン、２９，０００．カルボニックアンヒド ラーゼ、３６，０００、グリセルアルデヒド−３−フォスフェート脱水素酵素； ４５．ｏｏｏ、アルブミン、卵；６６．０００、アルブミン、ウシ、９７，４０ ０．フォスフォリラーゼＢ、１１６，０００、β−ガラクトシダーゼ）は、Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（ミズーリ州セントルイス）製であった。ＢＣＡタ ンパク質アッセイ試薬はＰｉｅｒｃｅ社（イリノイ州ロックフォード）製であっ た。他のすべての化学薬品は分析グレードで、Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃまたはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ製であった。 第一＆５泳動　等電点電気泳動ゲル（Ｉ　ＥＦ）　（０’Ｆａｒｒｅ１１．　Ｊ 。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５０：４００９．１９７５）を内径０．３ｃｍ長 さ１１ｃｍのガラス管内に調製し、ガラス管の底をパラフィルムでシールした。 ガラス管のゲルは４％のアクリルアミド、９Ｍの尿素、２％のノニデット（Ｎｏ ｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０および２％の両性電解質を含有するものであるが、こ れを２工程で調製した。まず以下の成分を混合し、ＡＧ　５０１−Ｘ８樹脂（４ ５ｍｇ／ｍＬ混合物）の存在下で約ＩＯ分間穏やかに撹拌した：２．５ｍＬのア クリルアミドストック溶液［３８％（ｗ／ｖ）アクリルアミドおよび２％（ｗ／ ｖ）Ｎ。 Ｎ−−メチレンビスアクリルアミドの水溶液］、５．０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ） ノニデットＰ−４０水溶液、１３．７５ｇの尿素および３．７５ｍＬの水。この アクリルアミド混合物を次にグラスウール栓を通して濾過し、樹脂を除去した。 次に、各タンパク質について、４．２３ｍＬのアクリルアミド混合物、５％のｐ Ｈ３−１Ｏの両性電解質（５０％ＰｈａｒｌｌｌａｌｙｔｅＳおよび５０％Ｂｉ ｏｌｙｔｅｓ）　、適切な容量の可溶化したタンパク質試料および全容量を４． ９８ｍＬとするだけの脱イオン水を混合してゲルを調製した。 約２分間ガスを抜いた後、５．０μＬの新たに調製した１０％（ｗ　／　ｖ　） 過硫酸アンモニウムおよび３．５μＬのＮ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトラメチルエ チレンジアミンを加えた。ゲルを素早くガラス管に注ぎ、上を脱イオン水で覆っ て、３時間重合させた。すべてのタンパク質試料はゲル混合物に加える前に３分 間１３，０００ｘｇで遠心にかけた。 これらのガラス管を、下部（アノード）室に０．０１Ｍリン酸と上部（カソード ）室にガス抜きした０、０２Ｍ水酸化ナトリウムを含有するＢｉｏ−Ｒａｄモデ ル１５５ゲル電気泳動セルにセットした。等電点電気泳動を、室温で１８時間、 ３５０ｖの一定電圧を用いて実施した。等電点電気泳動が完了すると、ガラス管 底部の末端に空気充填シリンジ／ゴムチューブアセンブリーを取り付け、少量の 圧力を加えて、そっとゲルを押し出した。ＩＥＦｐＨ勾配は表面電極（Ｂｉｏ− Ｒａｄ製）を用いて決定した。 次に、ゲルを５．０ｍＬの平衡緩衝液［０，０６２トリス−塩酸、ｐＨ６，８中 の２．３％ドデシル硫酸ナトリウム、５％β−メルカプトエタノールおよび１０ ％（Ｖ／Ｖ）グリセロールコ中でｌＯ分分間中かに撹拌するか、またはエタノー ル／ドライアイス浴中で急速に凍結し、使用するまで一７０℃で保存した。 第二次泳動　Ｌａｅｍｍｌｉの方法にしたがって、試料をスラブ５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより４％アクリルアミドのスタッキングゲルを用いて１０％のゲル上（厚さ １．５ｍｍ、長さ１４．５ｃｍ）に分離した。第一次電気泳動のＩＥＦゲルおよ び分子量標準物質は、平衡緩衝液中で１％のアガロース中に埋め込まれているが 、これらを０．１２５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ６，８中の１％アガロースを用いて スタッキングゲルに固着した。電気泳動を室温で（２０〜２５°Ｃ）でｔｏｏｍ Ａ／ゲルの一定電流を用いて染料がゲルの長さの先端部に到達するまで行なった 。 固定および染色　第二次スラブゲル内で分離されたタンパク質は一晩メタノール ／酢酸／水（４０／１０１５０）混合物中で固定した。固定したゲルを標準的技 法によりクーマシーブルーで染色するか、または以下の変法にしたがって銀染色 した。固定したゲルを染色の前に最低１時間、２０％エタノールを３回取り換え て洗浄した。標準的方法により染色を行なった（Ｍｅｒｒｉｌら、　Ｍｅｔｈａ ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１０４　：４４１．１９８４）　６ゲルは３０〜４ ５分かけて常に穏やかに撹拌しながら染色した。次に、色を出す前に、染色した ゲルを合計２０回、２０％エタノールを２回取り換えて洗浄した。色出しは、ゲ ルをエタノール／酢酸／水（２０／１０／７０）の混合物に入れて停止させた。 バックグラウンド染色はゲルを２〜５分間コダックラピッドフィクサー（Ｋｏｄ ａｋ　Ｒａｐｉｄ　Ｆｉｘｅｒ）　（フィルム強度）に入れて除去した。次にゲ ルを合計３０分間、水を３回取り換えて洗浄し、その後Ｋｏｄａｋ製ハイポ洗浄 剤に５分間漬けてゲルから定着剤を除去した。ハイポ洗浄剤は、最低１時間２０ ％エタノールを３回取り換えて洗浄してゲルから除去した。最後に、染色したゲ ルは各ゲルを２枚のバイオゲルラップ（ＢｉｏＧｅｌＷｒａｐＸＢｉｏＤｅｓｉ ｇｎ社、ニューヨーク州カーメル）の間に包み、室温で乾燥した。 染色ゲルの写真撮影　コダック電気泳動複写フィルム（ＫｏｄａｋＥｌｅｃｔｒ ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｎｇ　Ｆｉｌｍ）を製造者の指示にし たがって用いて、銀染色ゲルの直接プリントを行なった。このフィルムはゲル中 に存在するタンパク質の永久的記録を提供し、またライトボックスの助けを借り ると数枚のゲルにまたがってのタンパク質パターンの視覚的マツチング（ｍａｔ ｃｈｉｎｇ）を可能とする。２〜３の場合には、コダックエクタバン（Ｋｏｄａ ｋ　Ｅｋｔａｐａｎ）　４　ｘ　５インチシートフィルムを用いてゲルの写真を 撮り、１６ｘ２０インチのオルソフィルム（Ｏｒｔｈｏｆｉｌｎ＋）にプリント した。出来上がったプリントは、タンパク質のスポットを大きな黒い点として透 明なフィルムベース上に示した。これらプリントの大きなフォーマットは検査が 容易であり、また留意すべきタンパク質パターン差異の正確な記録を直接プリン ト上に残すことを可能とした。 ？、２．８．　５ＣＰＦ活性のバイオアッセイ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル （−次または二次）からの溶出タンパク質における５ＣＰＦの有無を、ＣＤ３４ ＋細胞系（ＭＬ−１）（本発明者らの実験室で開発した）による［３Ｈ］−メチ ルチミジン（［’　Ｈ］　Ｔｄ　ｒ）取り込みを用いる増殖アッセイによって測 定した。または、他のＣＤ３４“細胞、例えばＫＧ−１ａＣＤ３４”″細胞（Ａ ＴＣＣＣＣＬ　２４６．１）等がこのアッセイにおいて調製物の５ＣＰＦ活性を 試験するのに使用できる。 要約すると、１ｘｌＯ’個のＭＬ−１細胞を丸底９６ウエルマイクロタイタープ レートのウェルに、１００μＬ／ウエルの容量でまいた。各ウェルはｌＯ％ＦＢ ＳおよびＬ−グルタミンを含有するイスコベ改良ダルベツコ培地を含有した。推 定上の５ＣＰＦタンパク質調製物の連続２倍希釈液をそれぞれ３個のウェルに加 えた（１００μＬ／ウエル）。次に培養物を４８時間３７℃で空気中５％ＣＯ２ の湿雰囲気下でインキュベートした。インキュベーションに次いで、培養物を培 養の最後の１６〜１８時間、ウェルあたり１μＣｉの［”Ｈ］Ｔｄｒで標識した 。放射性同位体の取り込み量を液体シンチレーションカウンティングにより定量 した。表６および７は、それぞれＫＧ−１ａおよびＭＬ−１細胞を用いたバイオ アッセイにおけるトリチウム化チミジンの取り込みを示す。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　 （第７．１．２．節参照）により得られた３７ｋＤタンパク質から単離した推定 上の５ＣＰＦの２倍希釈液を試験した。トリチウム化チミジンの取り込み結果が 、調製物中に５ＣＰＦの生物活性が存在すること（対照と比較して）を示した。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより同定された３７ｋＤタンパク質から単離した調製物を用 いて、第２次ゲルを実施した。クーマシーブルーで染色の後、第２次ゲル上に５ ＣＰＦの複数のイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を同定した。ゲルを切片に分割 し、タンパク質含有の８枚の切片を取り除いた。この８枚の切片から、第７．１ ．２．節に記述したようにタンパク質を溶出させた。各切片からの溶出タンパク 質を用いて、バイオアッセイを実施した。トリチウム化チミジンの取り込みは、 切片＃４で見いだされたイソフオームから調製されたタンパク質調製物において 相関性を示した（表８、データはＣＰＭで示しである）。切片＃４中に同定され た５ＣＰＦイソフオームは、表面電極分析によって測定して、ｐＨ７，０から８ ゜０の範囲のタンパク質を表わす。この画分における生物活性は、サイトカイン の２倍希釈液によるバイオアッセイに見られるような古典的な希釈効果を示した 。 表８に同定されている生物活性データを、ＳＡＭ、１抗体を用いたウェスタンプ ロット分析によりさらに確かめた。上記のように実施した２次元ゲル（ｐＨ勾配 ゲルおよびその後の分子量ゲル）をニトロセルロースまたはＰＶＤＦフィルター にプロットし、−次抗体としてＳＡＭ、１抗体および二次抗体としてアルカリ性 フォスファターゼ結合ヒツジ抗ウサギＩ　ｇＧ　（Ｈ＆Ｌ）　（Ｂ　ｉ　ｏＲａ ｄ製）を用いて、標準的ハイブリッド形成技法によりハイブリダイズさせた。こ のデータは、抗体がｐＨ７，０〜８．０の範囲のタンパク質と強く反応すること を示した。この範囲は、５ＣＰＦ生物活性を示す領域と一致する。５ＣＰＦは、 標準的イムノアフィニティー技法により、ＳＡＭ、１または他の５ＣＰＦ特異的 特異的用いて、第２次ゲル上の個々のスポットから均質に至るまでさらに精製が 可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ。 Ｃｈａｐｔｅｒ　８．Ｃｏｌｉｇｅｎら編集、　１９９２）　、　５ＣＰＦはイ ムノアフィニティーマトリックスより溶出し、次に上記した等電点電気泳動にか けるが、ここでのｐＨは６〜８の狭い範囲が望ましい。こうして、ゲル中で分離 されたタンパク質は、上記のバイオアッセイにより、５ＣＰＦ生物活性について スクリーニングが可能となる。 （本頁以下余白） ７、２．９．　他の増殖因子との相乗性アッセイヒト死体の椎骨体より単離した 骨髄からＭＬ−ＩＣＤ３４＋細胞を免疫選択した。免疫選択されたＣＤ３４＋細 胞は、サイトカインに暴露する前および後に、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ３８−ＦＩ ＴＣおよびＣｒ−ＰｅｒＣＰで染色した。ＣＤ３４＋細胞２Ｘ１０５個を、ダル ベツコ培地に種々のサイトカインを単独でまたは組み合わせて添加したものまた は取り除いたもの１．ＯｍＬ中で培養した（表９およびｌＯ参照）。培養前に細 胞数を数え、培養６日後に再度数えた。次に細胞を５ＣＰＦ抗体、すなわちＳＡ Ｍ、１で染色し、ＦＡＣＳ分析にかけた。ＣＤ３４＋細胞を側面光散乱とＰＥ蛍 光にしたがってリストモードで区分けした。２つの異なるサイズのＣＤ３４＋細 胞（大細胞および小細胞）の集団が前方光散乱に基づいて同定された。これらの 細胞は、ＣＤ３８およびＤｒの発現について分析した。このデータは、大および 小ＣＤ３４＋細胞集団についてそれぞれ表９および１０に示しである。これらの 結果は、５ＣＰＦとＩＬ−３は単独で与えられても細胞を刺激して細胞周期を開 始させることができることを示している。５ＣＰＦとＩＬ−３の組み合わせは、 大ＣＤ３４＋細胞および小ＣＤ３４＋細胞の総数を増加させるにあたり、付加的 な、場合により相乗的な効果を有する。 ８、細胞系の寄託 ５ＣＰＦを産生ずる７５１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（メリーランド州ロックビル）に寄託し、下記の受託番号を受けた。 細胞系　受託番号 ７５１−ＮＡ−１５ＣＲＬ　１００９２本発明は、発明の詳細な説明することの みを意図してここに記述された特定の態様に限定されるものではない。そして、 機能的に等価ないかなる細胞系、ＤＮＡ構築物または因子も本発明の範囲に属す る。実際、ここに示し記述したものに加え、本発明への種々の変更が、これまで の記述および添付の図面より当業者には明らかとなろう。これらの変更は、添付 した請求の範囲に含まれるものとする。 ウサギ抗　３７ｋｄ 腫瘍増殖の抗体抑制 抗体希釈率 ０．０００１　０．００１　０．０１　０．１　１　１０　’１００濃度　（ｒ ＋ｑ／ｍ１） ＦＩＧ、８ 骨髄の吸引 系列枯渇（陰性） 番 ＣＤ３４選択（免疫磁性微小球体） ＣＦｔＪ−ＧＭ ＦＩＧ、１７Ａ ＦＵ−ＧＭ ａｌ￥ｆｎｇ／ｍ１ｌ ＦＩＧ、１７Ｃ ＣＦＵ−ＧＥＭＭ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４１５２　 ８３１８−４ＨＣｌ３Ｆ　２１１００　Ｋ　９２８２−４ＢＧＯＩＮ　３３１５ ３　Ｄ　７０５５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１００ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｎ　９２８４−４Ｃ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。 ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。 ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、 　ＰＬ、ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ。 ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ ＦＩ Ａ６１Ｋ　３７／２４　ＡＤＵ （７２）発明者　バグウェル、チャールズ　イー。 アメリカ合衆国　３２６０５　フロリダ州　ゲイネスヴイル、　エヌ、ダブリュ 、１９ティーエイチ　ブレイス　４８０１番地 （７２）発明者　ローマン、パトリシア　ディー。 アメリカ合衆国　３２６０５　フロリダ州　ゲイネスヴイル、　エヌ、ダブリュ 、２２エヌディー　ストリート　１６０６番地

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．次の性質： （ａ）ヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激すること；（ｂ）（ａ）の幹細胞増殖作用を 阻止するＳＡＭ．１抗体と結合すること；および （ｃ）ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦと結合してそれを 中和する抗体の存在下でヒト骨髄幹細胞の増殖を刺激すること； を有するポリペプチドからなる幹細胞増殖因子。
2. ２．前記のポリペプチドがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定 で３２キロダルトンの分子量を有する、請求項１記載の幹細胞増殖因子。
3. ３．前記のポリペプチドが膜貫通ドメインを含み、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動による測定で３７キロダルトンの分子量を有する、請求項１記載の 幹細胞増殖因子。
4. ４．ヒト骨髄幹細胞がＣＤ３４を発現する、請求項１記載の幹細胞増殖因子。
5. ５．胚細胞腫瘍系により産生される、請求項１記載の幹細胞増殖因子。
6. ６．胚細胞腫瘍系が神経外胚葉に由来するものである、請求項３記載の幹細胞増 殖因子。
7. ７．胚細胞腫瘍系がＡＴＣＣに寄託されて受託番号ＣＲＬ１００９２を有する細 胞系７５１−ＮＡ−１５である、請求項４記載の幹細胞増殖因子。
8. ８．請求項１の幹細胞増殖因子に免疫特異的に結合する抗体。
9. ９．モノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体。
10. １０．幹細胞増殖因子の生物学的活性を中和する請求項９記載の抗体。
11. １１．モノクローナル抗体である、請求項１０記載の抗体。
12. １２．請求項１の幹細胞増殖因子の生産方法であって、（ａ）遺伝子発現を支配 する調節ヌクレオチド配列の機能的制御下に請求項１の幹細胞増殖因子をコード するヌクレオチド配列を含む細胞を培養して、生物活性を有する幹細胞増殖因子 を培養細胞において発現させ；そして （ｂ）生物活性を有する幹細胞増殖因子を培養物から回収する；ことからなる方 法。
13. １３．培養細胞が胚細胞腫瘍系である、請求項１２記載の方法。
14. １４．胚細胞腫瘍系が神経外胚葉に由来するものである、請求項１３記載の方法 。
15. １５．胚細胞腫瘍系がＡＴＣＣに寄託されて受託番号ＣＲＬｌ００９２を有する 細胞系７５１−ＮＡ−１５である、請求項１４記載の方法。
16. １６．培養細胞が、調節ヌクレオチド配列の機能的制御下に幹細胞増殖因子をコ ードする組換えＤＮＡベクターで形質転換された、遺伝子操作された宿主細胞で ある、請求項１２記載の方法。
17. １７．宿主細胞が原核細胞である、請求項１６記載の方法。
18. １８．宿主細胞が真核細胞である、請求項１６記載の方法。
19. １９．組換えベクターが選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含 んでいる、請求項１６記載の方法。
20. ２０．幹細胞増殖因子を培地から回収する、請求項１６記載の方法。
21. ２１．骨髄細胞を請求項１の幹細胞増殖因子と接触させることからなるヒト骨髄 幹細胞の増殖を刺激する方法。
22. ２２．骨髄幹細胞がＣＤ３４＋である、請求項２１記載の方法。
23. ２３．培養下で実施する、請求項２１記載の方法。
24. ２４．ｉｎ　ｖｉｖｏで実施する、請求項２１記載の方法。
25. ２５．腫瘍細胞を、幹細胞増殖因子に結合してそれを中和する抗体または抗体フ ラグメントと接触させることからなる、請求項１の幹細胞増殖因子によって刺激 される腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
26. ２６．培養下で実施する、請求項２５記載の方法。
27. ２７．ｉｎ　ｖｉｖｏで実施する、請求項２１記載の方法。
28. ２８．ヒト幹細胞の増殖を刺激する胚細胞腫瘍系由来のサイトカインを生産する 方法であって、 （ａ）遺伝子発現を支配する調節ヌクレオチド配列の機能的制御下に該サイトカ インをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を培養して、生物活性を有するサ イトカインを培養細胞において発現させ；そして （ｂ）生物活性を有するサイトカインを培養物から回収する；ことからなる方法 。
29. ２９．培養細胞が胚細胞腫瘍系である、請求項２８記載の方法。
30. ３０．培養細胞が、調節ヌクレオチド配列の機能的制御下にサイトカインをコー ドする組換えＤＮＡベクターで形質転換された、遺伝子操作された宿主細胞であ る、請求項２８記載の方法。
31. ３１．次の性質： （ａ）ヒト幹細胞の増殖を刺激すること；および（ｂ）請求項１の幹細胞増殖因 子、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦと結合してその活性 を中和する抗体の存在下でヒト幹細胞の増殖を刺激すること；を有するポリペプ チドからなる幹細胞増殖因子。
32. ３２．請求項１の幹細胞増殖因子をコードする、単離されたポリヌクレオチド配 列。
33. ３３．ポリヌクレオチドがＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３２記 載のポリヌクレオチド配列。
34. ３４．請求項３２のポリヌクレオチド配列を含む生物学的に機能しうる発現ベク ター。
35. ３５．プラスミドである、請求項３４記載のベクター。
36. ３６．ウイルスである、請求項３４記載のベクター。
37. ３７．ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項３６記載のベクター。
38. ３８．ウイルスがレトロウイルスである、請求項３７記載のベクター。
39. ３９．請求項３４のベクターにより安定した状態で形質転換された宿主細胞。
40. ４０．原核細胞である、請求項３９記載の宿主細胞。
41. ４１．真核細胞である、請求項３９記載の宿主細胞。
42. ４２．被検者における幹細胞増殖因子関連疾患を検出する方法であって、請求項 ８の抗体を、幹細胞増殖因子関連疾患を有する疑いのある被検者の検体と接触さ せ、そして抗体の結合を検出することからなる方法。
43. ４３．前記の疾患が白血病、再生不良性貧血、神経細胞障害、重症の複合免疫欠 損症、および脾機能亢進症よりなる群から選ばれる、請求項４２記載の方法。
44. ４４．検出をｉｎ　ｖｉｖｏで行う、請求項４２記載の方法。
45. ４５．検出をｉｎ　ｖｉｔｒｏで行う、請求項４２記載の方法。
46. ４６．抗体が検出可能に標識されている、請求項４２記載の方法。
47. ４７．検出可能な標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発 光化合物、および酵素よりなる群から選ばれる、請求項４６記載の方法。
48. ４８．骨髄細胞をさらにサイトカインと接触させる、請求項２１記載の方法。
49. ４９．サイトカインがＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦよりなる群がら選ばれる 、請求項２１記載の方法。
50. ５０．ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１００９１を有する胚細胞腫瘍系。