JPH07508657A - ｒａｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ｒａｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害関連出願 本出願は１９９１年６月１４日に出願された米国特許出願第７１５，１９６号、 １９９２年１０月５日に出願された米国特許出願第９５８．１３４号および１９ ９３年１月２１日に出願された米国特許出願第０８１００７，９９６号の一部継 続出願であり、それらの各々はここに引例として全文含まれている。 発明の分野 本発明は、自然に発生し、腫瘍形成との関係が示唆されている活性型に散発的に 変換する遺伝子であるｒａｓ遺伝子の発現阻害のための組成物と方法に関する。 本発明はまた、活性型ｒａｓ遺伝子の発現の特異的な阻害に関する。さらに本発 明は、細胞と組織中のｒａｓ遺伝子の正常型と活性型の検出に関し、これは研究 と診断のための研究試薬とキットのための基礎を形成する。さらに、本発明はｒ ａｓ遺伝子の活性化によって生ずる病態の処置に関する。本発明はまたｒａｓ遺 伝子の発現阻害のための安定化オリゴヌクレオチド、ｒ　ａ　ｓ　ＲＮＡ１ｆｌ 的への親和性を促進するためにさらに修飾されているようなオリゴヌクレオチド 、およびｒａｓＲＮＡ標的の配列特異的排除を得るためにさらに修飾されている ようなオリゴヌクレオチドにも関する。 発明の背景 細胞増殖と分化を直接的または間接的に調節する細胞遺伝子の変換は、癌の主要 な原因と考えられる。ヒトの腫瘍形成との関係が示唆される、癌遺伝子と呼ばれ る遺伝子は約３０フアミリーある。そのようなファミリーのメンバーであるｒａ Ｓ遺伝子ファミリーは、しばしば、ヒト腫瘍中で突然変異を起こしていることが 見いだされる。正常状態においては、ｒａｓ遺伝子によって産生されるタンパク 質は、正常な細胞増殖と成熟に寄与していると考えられる。産生されるタンパク 質中の３つの重要な部位の１つにおいてアミノ酸の変換を生ずるｒａｓ遺伝子の 突然変異は、腫瘍形成との関係が示唆される型への変換を起こす。そのような突 然変異を持つ遺伝子は、″活性型”と呼ばれる。そのようなｒａｓ活性化を引き 起こす点突然変異は、発癌性物質や他の環境因子によって引き起こされ得ると考 えられる。９０％以上の膵腺癌、およそ５０％の結腸腺腫と腺癌、およそ５０％ の肺腺癌と甲状腺腫、および、急性骨髄性白血病やを髄異形成症候群といった血 液の悪性腫瘍の大部分が活性化されたｒａｓ癌遺伝子を有することが見つかって いる。全体としておよそ１０から２０％のヒト腫瘍が３つのｒａｓ遺伝子（Ｈ− ｒａｓ、に−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ）の１つに突然変異を有している。 現在のところ、特定の腫瘍細胞中で活性化されている癌遺伝子の発現を抑制する ことにより、細胞をより正常な増殖状態に戻しつると信じられている。たとえば 、Ｆｅｒａｍｉｓｃｏら（Ｎａｔｕｒｅ、３１４：６３９−６４２．１９８５年 ）は、活性化ｒａｓ遺伝子により悪性腫瘍化した細胞に、ｒａｓ遺伝子によって 産生されるタンパク質に結合する抗体をマイクロインジェクションすると、細胞 は増殖速度を低下させ、より正常な形態に変化する。このことは、典型的な癌細 胞の制御されない増殖における、活性化ｒａｓ遺伝子産物の関与を支持するもの と説明されている。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、即座に治療が施されない場合には突然の死をしばしば引き 起こす遺伝病であるＩｏｎｇＱ−Ｔ症候群と呼ばれる重篤な心不整脈との関係が 示唆されている。乱れた鼓動の始まりには前兆がないことがしばしばである。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子が正確にＩｏｎｇ’Ｑ−Ｔ症候群の原因であるかはどうかはは っきりしない。しかし、この症候群の遺伝と第１１染色体上のＨ−ｒａｓ遺伝子 周辺領域の特定の変異の存在との間には、非常に高い相関がある。このため、Ｈ −ｒａｓ遺伝子は、］ｏｎｇＱ−Ｔ症候群による心臓突然死の高リスクの優れた 指標となる。 ｒａｓ遺伝子の発現を調節しつる構成物の提供と、そして特に活性化型ｒａｓ遺 伝子の発現を特異的に調節する構成物の提供が強く望まれている。動物における ｒａｓ遺伝子の検出と診断の方法の提供が強く望まれている。また、ｒａｓ遺伝 子活性化から生ずる病態の診断と治療の方法を提供することが望まれている。 加えて、ｒａｓ遺伝子の検出と研究のための、改良された研究キットと試薬が望 まれている。 癌遺伝子発現の阻害はアンチセンス配向のＫｉ−ｒａｓ前癌遺伝子の２−キロ塩 基セグメントを発現するレトロウィルスベクターまたはプラスミドベクターを用 いて達成されている。Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ、Ｔ、　ら（１９９１）Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５１．１７４４−１７４８；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ ／ＵＳ９２１０１８５２　（ＷＯ９２／１５６８０）；Ｇｅｏｒｇｅｓ、Ｒ，Ｎ 。 ら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５３．１７４３−１７４６ ゜アンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌遺伝子の抑制は、様々な癌遺伝子フ ァミリーの役割を理解するための有用な道具であるということが証明されている 。 アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、その遺伝子の”センス″、またはコーデ ィング鎖に相補的な小さなオリゴヌクレオチドを意味し、これは結果としてその 遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対してもまた相補的であり、これに対しても特異的に ハイブリダイズしつる。Ｈｏｏｔら（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　、８．９ ６３−９７３．１９８８年）は、癌遺伝子Ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ転写物に特異的 にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養されたＨＬ−６０ 白血病細胞に添加すると、増殖が抑制され、分化が誘導されることを示した。Ａ ｎｆｏｓｓｉら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８６．３３７９− ３３８３．１９８９年）は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子のｍＲＮＡ転写物に特異的にハ イブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト骨髄性白血病細胞株 の増殖を抑制することを示した。Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８５．１０２８−１０３２．１９８８年）は、培養したＨ Ｌ６０白血病細胞の増殖ならびに、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子のタンパク質産物の発現 が、ｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌ クレオチドによって抑制されることを示した。米国特許４８７１８３８　（Ｂｏ ｓら）は、Ｎ−ｒａｓの第１３コドン中の突然変異を検出するための、その変異 に相補的なオリゴヌクレオチドを開示している。 これら全てのケースにおいて、修飾されていないオリゴヌクレオチドの不安定性 が主要な問題点である。これらは細胞内酵素により分解されるからである。ＰＣ Ｔ／ＵＳ８８１０１０２４　（Ｚｏｎら）は、ＨＬ−６０白血病細胞の増殖およ びこれらの細胞中のＤＮＡ合成を抑制するための、増幅されたｃ−ｍｙｃ癌遺伝 子の翻訳開始領域にハイブリダイズするホスホロチオエート誘導体オリゴヌクレ オチドの作用を開示した。Ｔｉｄｄら（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄ ｅｓｉｇｎ、３，１１７−１２７．１９８８年）は、活性化されたＮ−ｒａｓ癌 遺伝子に特異的にハイブリダイズするメチルホスホネート誘導体アンチセンスオ リゴヌクレオチドを検討し、これが生化学的分解に耐性であり、培養したヒトＨ Ｔ２９細胞に毒性を示さない一方で、これがＮ−ｒａｓ遺伝子の発現を抑制せず 、この細胞に影響を与えないことを見いだした。Ｃｈａｎｇらは、Ｂａ１ｂ−ｒ ａＳ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に特異的にハイブリダイズする、メチルホスホネー ト誘導体およびホスホロチオエート誘導体オリゴヌクレオチドの両方が、インビ トロにおいてこの遺伝子のタンパク質産物の翻訳を抑制しうることを示した。ｃ ｈａｎｇら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、４．２２１− ２３２．１９８９年ＨＢ　ｒｏｗｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ４゜２４３−２５２．１９８９年。Ｔ、、はｒａｓ　ｐ２１タンパク質生成物の インビトロ翻訳に対するこれらのオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性とはよ く相関しなかったことが指摘されている。Ｃｈａｎｇらが使用したアンチセンス オリゴヌクレオチドは、ｒａｓ遺伝子の翻訳開始領域に特異的にハイブリダイズ するため、活性化ｒａｓに選択性を示すことが期待されず、これらオリゴヌクレ オチドのｒａｓ遺伝子の正常型（野生型）と変異型（活性化型）に対する結合能 力は比較されなかった。 Ｈｅ１ｅｎｅおよび共同研究者はアクリジン挿入剤および／または疎水性の尾に 連結された９−ｍａｒホスホジエステルを用いて活性化（コドン１２Ｇ−４Ｔ転 位）Ｈ−ｒａｓ　ｍＲＮＡ発現の選択的阻害を示した。この化合物は低マイクロ モル濃度でＲＮアーゼ　Ｈおよび細胞増殖アッセイの両方において突然変異体ｒ ａｓ遺伝コード単位を選択的に標的とする事を示した。Ｓａ　ｉ　ｓｏｎ−Ｂｅ ｈｍｏａｒａｓ、Ｔ、ら、ＥＭＢＯＪ、１０．１１１１−１１１８．１９９１年 。 Ｃｈａｎｇおよび共同研究者は突然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝コード単位の選択的標 的化について開示している：この時標的はＡ→Ｔトランスバージョンを含むＨ− ｒａｓコドン６１であり、用いられたオリゴヌクレオチドは１１−ｍｅｒメチル ホスホネートまたはそのソラーレン誘導体であった。活性に７．５−１５０μＭ の濃度を必要とするこれらの化合物は免疫沈降により、正常ｐ２１と比較して突 然変異体Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１発現を選択的に阻害することが示された。Ｃｈａｎ ｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０．８２８３−８２８６．１９９１年。 塩基不適正のΔΔＧ’３□を増加させる修飾ヌクレオチドは選択性の増加に使用 できる。最も安定な不適正における１−２ｋｃａ　ｌ／ｍｏ　ｉから最も不安定 な不適正における５−６ｋｃａ　ｌ／ｍｏ］のΔΔＧ０３７の範囲が観察されて いる。従って、突然変異体標的への選択性を最大にすることが可能な場合、不安 定不適正（例えば、Ｃ−４Ｇ、Ｕ−Ｇ、Ａ→Ｃ）を発生する突然変異が安定な不 適正（例えば、Ｇ−Ａ）を発生する突然変異より好ましい。この例は家族性アル ツハイマー病に付随する常染色体優性に観察できる。β−アミロイド前駆体遺伝 子の３つの異なった点突然変異がこの疾患を持つ血族で示されている。これらの 突然変異はＧ−４Ａ（ΔΔＧ’　ｓｙ＝＋１．２ｋｃａ　ｌ／ｍｏ］）　、Ｇ− ＋Ｔ　（ΔΔＧ’　３７＝＋３゜９ｋ　ｃ　ａ　ｌ／ｍｏ　＋）およびＴ−＋Ｇ （ΔΔＧ’　ｓｔ＝＋６．　３　ｋ　ｃ　ａ　ｌ／ｒｉｏ　１）を含んでいる。 Ｇｏａｔｅら、’Ｎａｔｕｒｅ、３４９．７０４−７０６．１９９１年ＨＭｕｒ ｒｅｌら、５ｃｉｅｎｃｅ、２５４．９７−９９．１９９１年；Ｃｈａｒｔｉｅ ｒ−Ｈａｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５３，８４４−８４６．１９９１年。こ のケースではＴ→Ｇ突然変異の標的化によりアンチセンスオリゴヌクレオチドに よる突然変異体β−アミロイドに対し最も強い選択性が得られると信じられる。 非修飾ホスホジエステルヌクレオシド間結合または修飾ホスホロチオエートヌク レオシド間結合は細胞性ＲＮアーゼＨの基質である：すなわち、それらはＲＮア ーゼによる標的ＲＮＡの切断を活性化する。（Ｄａｇ　ｌ　ｅ、Ｊ、　Ｍ、　、 　Ｗａ　Ｉｄｅｒ、Ｊ、Ａ、およびＷｅｅｋｓ、Ｄ、Ｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１８．４７５１．１９９０年；Ｄａｇｌｅ、Ｊ、Ｍ 、、Ｗｅｅｋｓ、　Ｄ、Ｌ、およびＷａｌｄｅｒ、Ｊ、Ａ、、Ａｎｔｉｓｅｎｓ ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１，１１．１９９１ 年；ＤａｇＩｅ、Ｊ、Ｍ、、Ａｎｄｒａｃｋｉ、Ｍ、Ｅ、、ＤｅＶｉｎｅ、Ｒ， Ｊ、およびＷａｌｄｅｒ、Ｊ、Ａ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、１９．１８０５．１９９１年）。ＲＮアーゼはＲＮＡ：ＤＮＡデユープ レックスのＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼである：従ってこの酵素の活 性化はＲＮＡ標的の切断を生じ、標的ＲＮＡ発現を阻害するためのアンチセンス オリゴヌクレオチドの能力を非常に促進できる。Ｗａｌｄｅｒらはゼノパス胎児 においてホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方がまたエキ ソヌクレアーゼ分解の対象であることを指摘している。そのようなヌクレアーゼ 分解はＲＮＮアーゼ活性化に利用可能なオリゴヌクレオチドを急速に激減させる ので有害である。ＰＣＴ公開ＷＯ３９１０５３５８（Ｗａｌｄｅｒら）は３°末 端ヌクレオシド間結合が修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドはＲＮアーゼの基 質として働く一方それらをヌクレアーゼ耐性にしていることを開示している。 ＲＮアーゼ１１の基質必要性を保ちながら、一方オリゴヌクレオチド修飾の有益 な性質を利用する試みとしてキメラオリゴヌクレオチドが用いられた。Ｇｉ　Ｉ ｅｓ、Ｒ，Ｖ、ら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、７，３ ７．１９９２年；Ｈａｙａｓｅ、Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９．８７ ９３．１９９０年；Ｄａｇｌｅ、Ｊ、Ｍ、らＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａ以上の化学的に異なった領域を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチド は典型的には一つまたはそれ以上の有益な性質（例えば、増加したヌクレアーゼ 耐性、増加した細胞内取り込み、ＲＮＡ標的への結合親和性の増加）を与える修 飾されたヌクレオチド領域およびＲＮアーゼ切断を指示する能力を保つ非修飾領 域を含んでいる。この方法は種々の主鎖に用いられている、最も普通には単独で はＲＮＮアーゼ−基質ではないメチルホスホネート。 ＲＮＮアーゼ−感受性ホスホジエステル結合を含むメチルホスホネートオリゴヌ クレオチドはインビトロでＲＮＮアーゼ−よる標的ＲＮＡ切断を指示できること が観察されている。大腸菌ＲＮアーゼＨを用いて、標的ＲＮＡ鎖の効率的なＲＮ Ｎアーゼ切断を指示するのに必要とされる最小のホスホジエステル長は３つまた は４つの結合であることが報告されている。Ｑｕａｒｔ　ｉｎ、Ｒ，Ｓ、ら、Ｎ １７．９１９３．１９８９年。類似の研究がインビトロで哺乳類ＲＮＮアーゼ切 断アッセイを用いて報告されている。Ａｇｒａｗａｌ、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７，１４０１．１９９０年。この場合、 異なったホスホジエステル長を含む一連の主鎖修飾（メチルホスホネートを含む ）の切断効率が試験された。この性質のオリゴヌクレオチドにより指示される効 率的なＲＮＮアーゼ切断に要求される最小ホスホジエステル長は５結合であった 。 より最近、メチルホスホネート／ホスホジエステルキメラはインビトロでの大腸 菌ＲＮアーゼＨを用いる標的ＲＮＡ切断で特異性および効率が増強されているこ とが示されている。Ｇ１１ｅｓ、Ｒ，Ｖ、ら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕ ｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、７，３７．１９９２年。これらの化合物はまたゼノパス卵母 細胞および培養哺乳類細胞において有効なアンチセンス阻害剤であると報告され ている。Ｄａｇｌｅ、Ｊ、Ｍ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、１８，４７５１．．１９９０年；Ｐｏｔｔｓ、Ｊ、Ｄ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８，１５１６．１９９１年。 ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０６５　（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら）はＲＮ７−ゼＨ活性 化を行う一方エキソヌクレアーゼに対する安定性を提供するため、ホスホロチオ エートまたはホスホロジチオエート結合で３′および／または５′末端を”キャ ップした”キメラオリゴヌクレオチドを開示している。ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１ ２３２３　（Ｐｅｄｅｒｓｏｎら）はＲＮＮアーゼ切断を活性化する中心デオキ シヌクレオチド領域に隣接するＲＮＮアーゼ−活性化しない修飾された主鎖（メ チルホスホネート、ホスホロモルホリゾート、ホスホロピペラジデートまたはホ スホロアミデート）を持つ２つの領域があるキメラオリゴヌクレオチドを開示し ている。２°−デオキシオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ分解に対して安定化 されており、一方、ホスホロアミデート、アルキルホスホネートまたはホスホト リエステル結合を持つ主鎖修飾の部分の間にホスホジエステル結合ヌクレオチド の短い部分を位置させることによりＲＮＮアーゼ活性化を提供する。Ｄａｇｌｅ 。 Ｊ、　Ｍ、　、　Ｗａｌｄｅｒ、Ｊ、　Ａ、およびＷｅｅｋｓ、Ｄ、Ｌ、、Ｎｕ ｃ　Ｉｅ　ｉｃ　、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１８，４７５１．１９９０ 年：Ｄａｇｌｅ。 Ｊ、〜ｉ０．　Ｗｅｅｋｓ、Ｄ、Ｌ、およびＷａｌｄｅｒ、Ｊ、Ａ、、Ａｎｔｉ ｓｅｎｓｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１．１１． １９９１年：Ｄａｇｌｅ、Ｊ、Ｍ、、Ａｎｄｒａｃｋｉ、Ｍ、Ｅ、、ＤｅＶｉｎ ｅ。 ミデートはエキソヌクレアーゼに対して安定化されるが、各々のボスホロアミデ ート結合はオリゴヌクレオチド含有ホスホロアミデートのＴ１を１．６℃損失し ている。Ｄａｇｌｅ、Ｊ、Ｍ、、Ａｎｄｒａｃｋｉ、Ｍ、Ｅ、、ＤｅＶｉｎｅ。 クレオチドおよびその標的鎖間のハイブリダイゼーションの減少の指標である。 Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ、Ｔ、、Ｔｏｃｑｕｅ、Ｂ、Ｒｅｙ、Ｉ、。 Ｃｈａｓｓ　ｉｇｎｏｌ、Ｍ、、Ｔｈｕｎｇ、Ｎ、Ｔ　およびＨｅ１ｅｎｅ、Ｃ ，。 ＥＭＢＯＪ、１０．１１１’ｌ−１１１８，１９９１年、はオリゴヌクレオチド はＲＮＮアーゼの基質であるにもががゎらず、ｍＲＮＡへの弱いハイブリダイゼ ーションのためＲＮアーゼ■１による切断効率は低かったことを観察した。 ＲＮアーゼＨ感感受性ネオキシ残基混合された２°　リボース修飾含有キメラオ リゴヌクレオチドは主鎖キメラのようによく特徴付けがなされていないが、キメ ラオリゴヌクレオチドは主鎖修飾に限られない。ＥＰ公開２６０．０３２　（Ｉ ｎｏｕｅら）および０ｈｔｓｕｋａら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、２１５，３２７ −３３０．１９８７年、は相補的ＲＮＡ鎖内の特定の部位の大腸菌ＲＮアーゼＨ によるインビトロ切断を指示するための非修飾デオキシギャップを含む２°−０ −メチルオリゴヌクレオチド（単独ではＲＮＮアーゼの基質ではないであろう） を用いた。しかしながら、この性質のオリゴヌクレオチドは哺乳類ＲＮアーゼＨ を用いる切断効率は試験されておらずまた、細胞中のアンチセンス活性も試験さ れていない。これらのオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して安定化されて いない。 ０−メチル以外の２゛　リボース修飾のＲＮＮアーゼ切断を指示する能力および アンチセンス活性に関する研究は非常に限られている。Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｓ、ら 、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＮアーゼを用いる標的ＲＮＡ鎖の 切断は有用であろうと認められているが、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐 性およびハイブリダイゼーションの忠実度もまた非常に重要である。ＲＮＮアー ゼを活性化し同時にハイブリダイゼーション性を維持または改良し、およびヌク レアーゼ耐性を提供する方法または材料に対する長い間の要求がある。アンチセ ンス活性を促進する方法または材料に対する長い間の要求が未だにある。 発明の目的 本発明はｒａｓ遺伝子の発現を阻害するｒａｓ　ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌク レオチドを提供することを目的とする。 本発明はｒａｓ遺伝子の活性化（突然変異体）型発現を特異的に阻害するｒａｓ 　ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを提供することを別の目的とする。 本発明はｒａｓ：ａ伝子の発現を阻害する安定化オリゴヌクレオチドを提供する ことをさらに別の目的とする。 本発明はｒａｓ　ｍＲＮＡに相補的でｒａｓ　ｍＲＮＡ標的へのその親和性が増 強されるように修飾されたｒａｓ遺伝子の発現を阻害する安定化オリゴヌクレオ チドを提供することを別の目的とする。 本発明はｒａｓ　ｍＲＮＡに相補的でおよびＲＮＮアーゼの基質であるオリゴヌ クレオチドを提供することをさらに別の目的とする。 本発明は癌細胞の増殖を阻害するオリゴヌクレオチドを提供することを別の目的 とする。癌細胞の増殖を阻害する方法もまた本発明の目的である。 また本発明はｒａｓ遺伝子の正常型（野生型）から活性型への突然変異の検出も 別の目的とする。 また本発明は、活性化したｒａｓ遺伝子の存在に起因する、形態的に類似した腫 瘍を区別する診断および高リスク状態の同定を目的とする。 また本発明は、ｒａｓ遺伝子の野生型から変異型（すなわち活性型）への変異に 起因する病態の診断と治療の方法の提供を目的とする。 発明の要約 本発明に従うと、ヒトｒａｓ遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと相補的なオ リゴヌクレオチドが提供される。一つの好ましい態様ではヒトＨ−ｒａＳ遺伝子 に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドが提供される。 好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドは、遺伝子の転写開始コドンに相補的 であり、また好ましくはこれらのオリゴヌクレオチドはＣＡＴの配列を含む。他 の好ましい態様によれば、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子の第１２コドンと相補的なオ リゴヌクレオチドが提供され、これらは好ましくはＧＡＣの配列を含む。他の好 ましい態様においては、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子の変異した第１２フドンと相補 的でありおよび優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。 この態様においては、そのようなオリゴヌクレオチドは好ましくはＧＡＣの配列 を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容しうる担体中に含まれ ることが都合よ（そして望ましい。別の好ましい態様によれば、ヒトＫｉ−ｒａ Ｓ遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドが提供さ れる。これらのオリゴヌクレオチドがＫｉ−ｒａｓ遺伝子の５′−非翻訳領域、 ３゛−非翻訳領域、第１２コドンまたは第６１コドンと相補的であるのが好まし い。別の好ましい態様に従うと、活性化Ｋｉ−ｒａｓの第１２コドンに相補的で あるオリゴヌクレオチドが提供され、好ましくは配列ＡＣＣを含んでいる。別の そのような態様に従うと、活性化Ｋｉ−ｒａｓの変異第１２コドンに相補的であ りおよび優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。この態 様においては、そのようなオリゴヌクレオチドは好ましくはＡＡＣの配列を含む 。 そのようなオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容しうる担体中に含まれることが 都合よくそして望ましい。 オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによる分解に耐性が増強するように修飾され ていることが好ましい。現在の所、ヌクレアーゼへの増強された耐性は少なくと も一つの硫黄含有ヌクレオチド（最も好ましいのはホスホロチオエートまたはボ スホロジチオエート）により運ばれるのが好適である。 別の好ましい態様に従うと、ｒａｓ発現を阻害しおよび同時にヌクレアーゼへの 増強された耐性を持ち、ｒａｓ　ｍＲＮＡ標的への増強された結合親和性を持ち およびＲＮＮアーゼの基質である、ｒａｓ　ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオ チドが提供される。 現在の所、増強された結合親和性が少なくとも一つのヌクレオチドの糖の２゜位 での修飾（最も好ましくは２°−０−アルキル、２’　−０−アルキルアミノま たは２°　−フルオロ修飾）により運ばれるのが好ましい。 いくつかの態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドは相補的ｒａｓ　ｍＲＮ Ａへの結合親和性が増強されるように修飾された少なくとも一つの領域およびＲ ＮＮアーゼ切断の基質である領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。一つ のそのような態様によれば、ＲＮＮアーゼ基質領域は増強されたｒａｓ　ｍＲＮ Ａ結合親和性を持つ２つの領域により隣接されている。 他の態様によれば、本発明は、細胞または組織中のヒトｒａｓ遺伝子の発現を調 節する方法、および、活性化を誘導する変異を有していると疑われる細胞または 組織中において、活性化されたｒａｓ遺伝子の発現を特異的に調節する方法に関 する。 本発明のい（つかの態様はｒａｓ遺伝子の発現阻害のための方法および活性化ｒ ａｓ遺伝子の発現を特異的に阻害する方法に関する。 本発明の別の態様は、細胞または組織中のｒａｓ遺伝子を検出、および細胞また は組織中の活性化ｒａｓ遺伝子を特異的に検出する方法に関する。そのような方 法はヒトｒａｓ遺伝子を有していると疑われる細胞または組織と本発明に従うオ リゴヌクレオチドを接触させて該遺伝子を検出することを含む。 さらに別の態様によれば、本発明は、ｒａｓ遺伝子の活性化を誘導する変異を有 すると疑われる動物の診断法と治療法に関する。そのような方法は、この遺伝子 の発現を阻害し、この遺伝子の活性化によって生ずる状態を治療し、またはその 診断を行うために、動物、細胞、組織または体液と本発明にしたがうオリゴヌク レオチドを接触させることを含む。 図面の簡単な説明 図１は、Ｈ−ｒａｓ転写開始コドン（ＡＵＧ）を標的としたオリゴヌクレオチド を使用したｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑制の用量依存性を示 す棒グラフである。発現は、ルンフエリンを添加した時に発する光の量にょうて アッセイされたルシフェラーゼ活性の測定によって定量される。 図２は、活性化Ｈ−ｒａｓの変異した第１２コドン領域を標的としたオリゴヌク レオチドを使用したｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑制の用量依 存性を示す棒グラフである。発現は、ルシフェリンを添加した時に発する光の量 によってアッセイされたルシフェラーゼ活性の測定によって定量される。 図３は、アンチセンスホスホチオエート化合物によるｒａｓ−ルシフェラーゼ融 合タンパク質の発現の単一用量による抑制を示す棒グラフである。発現は、ルシ フェリンを添加した時に発する光の量によってアッセイされたルシフェラーゼ活 性の測定によって定量される。 図４は、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子と特異的にハイブリダイズしうる１３のアンチ センスヌクレオチドから得られたデータを要約した表および棒グラフである。 それぞれのオリゴヌクレオチドについて、その長さ、特異的にハイブリダイズす る活性化ｒａｓ遺伝子の領域、ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑 制活性を示す。 図５は、ｒａｓ　ｍＲＮＡ１ｌｉ的配列（５′から３゛で示されている）および Ｈ−ｒａｓ翻訳開始コドン（ＡＵＧ）および第１２コドン領域を標的とするアン チセンスオリゴヌクレオチドの位置および配列を示している。アンチセンスオリ ゴヌクレオチドは３°から５゛に示される。図５ＡはＡＵＧを標的とする２つの ２０−ｍｅｒ　（２５０２および２５０３）および第１２コドンを標的とする５ から２５ヌクレオチド長の一連のオリゴヌクレオチドを示す。図５Ｂは、ｒａｓ 　ｍＲＮＡ標的配列との関係におけるオリゴヌクレオチド２５０２．２５０３． ６１８６および２５７０を示す。 図６は、オリゴヌクレオチド２５０２．２５０３．６１８６およびこれらのホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドの均一な２゛−０−メチル体の種々の用量に よるｒａｓ−ルシフェラーゼの抑制を示す棒グラフである。 図７は、種々の長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異体（斜線 の棒）および正常（黒塗りの棒）ｒａｓ−ルシフェラーゼのアンチセンス抑制を 示す棒グラフである。 図８は、用量依存様式でのｒａｓ抑制を示す一連の８つの図を示している。直線 は野生型に対する活性であり、点線は活性型ｒａｓに対する活性を示している。 図９は、４７−ｍｅｒ　Ｈ−ｒａｓ　ＲＮＡヘアピン標的へのアンチセンスオリ ゴヌクレオチド結合を示す２部分からなる図である。図９Ａは均一２’　−０− メチルオリゴヌクレオチドによるヘアピン標的の（デオキシ数＝０）および９つ の塩基デオキシギャップを持つ２′−〇−メチルキメラオリゴヌクレオチドによ るヘアピン標的の（デオキシ数＝９）、オリゴヌクレオチドの濃度の関数として のゲルシフト分析である。レーン１−８は以下のオリゴヌクレオチド濃度を含ん でいる：１）なし；　２）１０−１１Ｍ、３）１０−”Ｍ＋　４）１０−’Ｍ； 　５）１０−’Ｍ、６）１０−７Ｍ：　７）１０−’Ｍ：　８）１０−５Ｍ０図 ９Ｂはアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度に対してシフトしたヘアピン標的 の分画を示すグラフである。 （◇）・デオキシ数＝１７；（・）：デオキシ数＝９：　（ム）・デオキシ数＝ ７；　（○）、デオキシ数＝５；　（△）・デオキシ数＝３；　（■）：デオキ シ数＝１；（ロ）・デオキシ数＝０；　（挿入図：４７−ｍｅｒ　Ｈ−ｒａｓ　 ＲＮＡヘアピン標的の構造がオリゴヌクレオチド２５７０の配列とともに示され ている）。 図１０は、２゛−０−メチルキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによ る相補的Ｈ−ｒ、ａｓ　ＲＮＡのＲＮアーゼＨ依存性切断を示すゲルである。レ ーン指示は中心にあるデオキシギャップの長さを示している。 図１１は、ｒａｓ第１２コドンＲＮＡ配列を標的とするホスホロチオエート２° 　−０−メチルキメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を示す２部分から なる図である。図１１Ａは均一２′−〇−メチルオリゴヌクレオチド、均一チオ キンオリゴヌクレオチドおよび中心に１−１３−１５−１７−１または９−塩基 デオキシギャップを持つキメラ２’　−〇−メチルオリゴヌクレオチドの単一用 量活性（１００ｎＭ）を示す棒グラフである。図１１Ｂは均一デオキシ（マ）ま たは中心に４−１、◆）、５−（・）、７−（＋）または９−塩基（ム）デオキ シギャップを含む２゛−０−メチルオリゴヌクレオチドの用量応答活性を示す線 グラフである。 図１２は、ｒａｓ−ルシフェラーゼに対する均一デオキシホスホロチオエートお よび短くしたキメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を示す棒グラフで図 １３は、ｒａｓを標的とするホスホロチオエート２’　−０−メチルオリゴヌク レオチドを用いた場合のデオキシギャップの長さの関数としてのアンチセンス活 性およびＲＮアーゼＨ活性化能力間の相関を示す線グラフである。 図１４は、７塩基デオキシギヤツプを含むホスホロチオエート２°修飾キメラオ リゴヌクレオチドの用量応答性アンチセンス活性を示す線グラフである。（ム） 均一デオキ／ホスホロチオエート；　（■）、２°−０−ペンチルキメラ；　（ ・）。 ２′−〇−プロピルキメラ；　（◆）、２’−０−メチルキメラ：　（マ）、２ ’−フルオロキメラ。 図１５は、種々の組み合わせのホスホロチオエートおよびホスホジエステル主鎖 および２′−〇−メチルおよび２゛−デオキシヌクレオチドを持つキメラオリゴ ヌクレオチドによるｒａｓ−ルシフェラーゼの用量依存性オリゴヌクレオチド抑 制を示す棒グラフである。 図１６は、ヌードマウスにおいてのＡ３４９ヒト細胞腫瘍に対するｌ５ＩＳ２５ ０３の抗腫瘍活性を示す線グラフである。 図１７は、ヌードマウスにおいてのＡ３４９ヒト細胞腫瘍に対するｌ５ＩＳ２５ ０３の抗腫瘍活性（カチオン性脂質と一緒に投与された場合）を示す線グラフで ある。 図１８は、種々の２°糖修飾およびホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）主鎖を持つオリ ゴヌクレオチドのＨａ−ｒａｓに対する活性をホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）主 鎖を持つ２゛デオキシオリゴヌクレオチドと比較した棒グラフである。 図１９は、３つのヒト結腸癌腫細胞株、Ｃａ　Ｉｕ　ｌ、５Ｗ４８０および５Ｗ ６２０におけるＫｉ−ｒａｓ　ｍＲＮＡ発現のアンチセンス抑制を示す棒グラフ である。 図２０は、Ｋｉ−ｒａｓ特異的オリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ６９５７およびｌ５ ＩＳ６９５８による５Ｗ４８０ヒト癌腫細胞株増殖の抑制を示す棒グラフである 。 図２１は、突然変異体Ｋｉ−ｒａｓ第１２コドンを標的とするオリゴヌクレオチ ドで処置した場合、突然変異体ｋｉ−ｒａｓを発現するヒト癌腫５Ｗ４８０細胞 と野生型Ｋｉ−ｒａｓを発現するＨｅ１ａ細胞のＫｉ−ｒａｓ　ｍＲＮＡ発現の 選択的抑制を示す棒グラフである。 発明の詳細な記述 悪性腫瘍は、癌細胞に特徴的な制御された増殖の喪失、すなわち連続的な制御不 能の増殖、周辺組織への侵入能力、および他の臓器への転移能力を誘導する、一 連の段階的で進行性の変化を通して発達する。厳密に制御されたインビトロの研 究によって、正常細胞と癌細胞の増殖を性格付ける因子が定義され、細胞増殖と 分化を制御する特定のタンパク質が同定されてきた。さらに、厳密に制御された 定量的なインビトロアッセイで細胞の形質転換を研究することが可能であること によって、形質転換した細胞の表現型を誘導しつる特定の遺伝子が同定されてき た。そのような癌の原因遺伝子または癌遺伝子は、それらが産生ずるタンパク質 の発現調節の変化を誘導する突然変異によって形質転換誘導能を獲得すると信じ られている。ある場合には、そのような変化はプロモーターやエンハンサ−とい った非コードＤＮＡ調節領域のＤＮＡ中において起こり、癌遺伝子の転写活性の 変化を誘導し、その遺伝子産物の過剰または過小産生を引き起こす。他の場合に は、遺伝子変異は癌遺伝子のコード領域内において起こり、非活性、過剰な活性 または正常型（野生型）の遺伝子産物とは異なった活性を示す遺伝子産物の産生 を誘導する。 今日までに３０以上の細胞性癌遺伝子ファミリーが同定されている。これらの遺 伝子は、それらの細胞内局在とそれらのタンパク質産物の推定上の作用機構によ って分類することができる。ｒａｓ癌遺伝子は、細胞膜の内側に存在する類縁タ ンパク質をコードする遺伝子ファミリーのメンバーである。ｒａｓタンパク質群 はアミノ酸レベルで高度に保存され、ＧＴＰに対して高親和性かつ特異的に結合 し、そしてＧＴＰａｓｅ活性を有している。細胞内におけるｒａｓ遺伝子産物の 機能は明らかでないが、ＧＴＰ結合タンパク質、またはＧタンパク質として知ら れている信号伝達タンパク質群とかなりの配列ホモロジーを有するという生化学 的性質は、ｒａｓ遺伝子産物が細胞膜を介しての細胞外信号の伝達に関係して、 基本的な細胞調節機能において基礎的な役割を果たしていることを示唆する。 Ｈ−ｒａｓ、に−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓと呼ばれる３つのｒａｓ遺伝子は、 哺乳類のゲノム中で同定されている。哺乳類ｒａｓ遺伝子は、それらのコード配 列内の単一の点突然変異により形質転換を誘導する性質を獲得する。自然に発生 するｒａｓ癌遺伝子中の突然変異は、第１２番、第１３番、第６１番のコドンに 存在する。Ｈ−ｒａｓ、に−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓの配列は既知である。Ｃ ａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３０２，３３−３７．１９８３年；Ｈａｌ］および Ｂｒｏｗｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１３．５２５５ −５２６８．１９８５年。ヒト腫瘍中で見っがる活性型ｒａｓ変異で最もよく検 出されるのは、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の第１２コドン中の変異であり、これはＧＧＣ からＧＴＣへの塩基の変化によりｒａｓタンパク質産物のＧＴＰａｓｅ調節領域 ら、Ｎａｔｕｒｅ　３００，７６２−７６５．１９８２年。この単一アミノ酸の 変化はｒａｓタンパク質機能の正常な調節を喪失させると考えられ、それにより 正常に制御された細胞タンパク質を常に活性なタンパク質に変換する。そのよう な正常ｒａｓタンパク質機能の親制御が、正常から悪性の増殖への形質転換の原 因であると信じられている。 本発明は、ヒトｒａｓ癌遺伝子発現抑制のためのオリゴヌクレオチドを提供する 。そのようなオリゴヌクレオチドはヒトｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮ ＡまたはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。本発明はまた、ｒａｓの変異 型発現を選択的に抑制するのためのオリゴヌクレオチドを提供する。 本発明においては、”オリゴヌクレオチド“とはリボ核酸またはデオキシリボ核 酸のオリゴマーまたはポリマーを意味している。この用語は天然に存在する塩基 、糖および糖量（主鎖）結合からなるオリゴマーならびに同様に機能するが天然 には存在しない部分を持つオリゴマーを含んでいる。そのような修飾または置換 オリゴヌクレオチドは例えば促進された細胞への取り込みおよび増強されたヌク レアーゼ存在下での安定性のような性質のため天然型より好適である。 本発明の為に企図されたいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの特別の例には ホスホロチオエート、ホスホジエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルま たはシクロアルキル糖量結合または短鎖ヘテロ原子またはへテロ環式糖量結合が 含まれる。最も好ましいものは、ＣＨ２ＮＨＯＣＨ２、ＣＨ２Ｎ　（ＣＨ３）− ０−ＣＨ２、ＣＨｔ　ＯＮ　（ＣＨ３）　ＣＨ２、ＣＨｚ　Ｎ　（ＣＨｓ）　Ｎ 　（ＣＨｓ）　ＣＨｚおよび０−Ｎ　（ＣＨ３）−ＣＨ，−ＣＨＩ主鎖（ここで ホスホジエステルは０−Ｐ−０−ＣＨＩ）を持つものである。モルホリノ主鎖構 造を持つオリゴヌクレオチドもまた好ましい。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ｊ、Ｅ、　 およびＷｅｌｌｅｒ、　Ｄ、　Ｄ、　、米国特許第５．０３４，５０６号。別の 好ましい態様においては、タンパク質−核酸（ＰＮＡ）主鎖のように、オリゴヌ クレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖で置換され、塩基がポリア ミド主鎖のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合されているであろう。Ｐ、 Ｅ、Ｎ１ｅｌｓｅｎ、Ｍ。 Ｅｇｈｏｌｍ、Ｏ，Ｂｕｃｈａｒｄ、５ｃｉｅｎｃｅ　２５４．１４９７．１９ ９１年。別の好ましいオリゴヌクレオチドは２°位に以下のものの１つを含むア ルキルおよびハロゲン置換糖部分を含むであろう：ＯＨ，ＳＨ，５ＣＨｓ、Ｆｌ ｏＣＮ、Ｏ（ＣＨｚ）−ＮＨｚまたはＯ（ＣＨｚ）−ＣＨｓ　（式中、ｎは１か ら約１０である）；Ｃ１から０１゜の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカ リールまたはアラルキル；Ｃ１；Ｂｒ　；ＣＮ；ＣＦｓ；０ＣＦｓ、０−１Ｓ− またはＮ−アルキル；０−１Ｓ−またはＮ−アルケニル；　５ＯＣＨｓ；　ＳＯ ＊ＣＨｓ；０ＮＯｘ；ＮＯｘ；Ｎｓ；ＮＨｚ；ヘテロシクロアルキル：ヘテロシ クロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ：置換シリル、 ＲＮＡ切断基；コンジュゲート；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの 薬物動態学的特性を改良する基；オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良する 基および類似の性質を持つその他の置換基。オリゴヌクレオチドはまたペントフ ラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模倣物を含んでいてもよい。 別の好ましい態様においては少なくとも一つの修飾塩基が含まれている。そのよ うな修飾塩基のいくつかの特別の例には、２−（アミノ）アデニン、２−（メチ ルアミノ）アデニン、２−（イミダゾイルアルキル）アデニン、２−（アミノア ルキルアミノ）アデニンまたはその他のへテロ置換アルキルアデニンが含まれる 。 本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、同時に、ヌクレアーゼ耐性を増強する ように修飾されたヌクレオチドを含み、ｒａｓ　ｍＲＮＡに対する親和性を増強 するように修飾されたヌクレオチドを含み、およびＲＮアーゼＨの基質であるヌ クレオチドを含んでいるであろう。一つの好ましい態様においては、キメラオリ ゴヌクレオチドはｒａｓ　ｍＲＮＡに対する結合親和性を増強するように修飾さ れた少な（とも一つの領域、およびＲＮアーゼＨの基質である領域を含んでいる 。オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレアーゼ耐性を促進させるように修飾されて いる。より好ましい態様においては、ＲＮアーゼＨの基質である領域にｒａｓｍ ＲＮＡに対する結合親和性を増強するように修飾された２つの領域が隣接してい る。そのような修飾の効果はｒａｓ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチ ド抑制を非常に促進させることである。 本発明に従うオリゴヌクレオチドは好ましくは約８から約５０の核酸塩基単位を 含んでいる。そのようなオリゴヌクレオチドは約８から約３０の核酸塩基単位を 含んでいるのがより好適であり、約１３から約２５の核酸塩基単位を含んでいる ものがさらにより好適である。核酸塩基単位とはホスホジエステルまたはその他 の結合で隣接する核酸塩基に適切に結合された塩基−糖の組み合わせであること が理解されるであろう。 本発明において”ハイブリダイゼーション”とは、通常相対する核酸鎖または核 酸鎖の２つの領域の相補鎖間の水素結合（ワトソンークリック塩基対としても知 られている）を意味する。グアニンおよびシトシンはそれらの間に３つの水素結 合を形成することが知られている相補的塩基の例である。 ”特異的にノゾブリダイズできる“とは非標識配列へのオリゴヌクレオチドの非 特異的結合を避けるのに十分な程度に相補的であることを意味している。特異的 にハイブリダイズできるためには、オリゴヌクレオチドはその標的核酸配列と１ ００％相補的である必要はないことがわかっている。 ｒａｓ−ルソフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド抑制：Ｈ −ｒａｓ翻訳開始コドンまたは活性化Ｈ−ｒａｓの第１２コドン点突然変異を標 的とした一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが実施例２−５に記載したｒａ Ｓ−ルンフエラーゼレポーター遺伝子システムを用いてスクリーニングされた。 この最初の７リーズの６つのオリゴヌクレオチドがｒａｓ−ルシフェラーゼ活性 の有意でおよび再現性のある抑制を与えることが同定された。これらのオリゴヌ クレオチド（すべてホスホロチオエートである）の塩基配列、配列参照番号およ び配列ＩＤ番号が表１に示されている。 表１ オリゴ参照番号　配列　配列［）番号 図１は、正常ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子または突然変異体ｒａＳ −ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞がホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチド２５０３（配列ＩＤ番号：２）の濃度を増加させて処理された用量 一応答実験を示している。この化合物はＨ−ｒａｓ　ＲＮＡ転写体の翻訳開始コ ドンを標的としている。図１に示したようにこのオリゴヌクレオチドにより細胞 を処理するとｒａｓ−ルシフェラーゼ活性の用量依存性抑制を起こし、正常およ び突然変異体ｒａｓ標的の両方に対して約５０ｎＭのＩＣ５０値を示した。対照 オリゴヌクレオチドは２０塩基の長さのランダムホスホロチオエートオリゴヌク レオチドである。結果はオリゴヌクレオチドで処理されていないトランスフェク ト細胞中のルシフェラーゼ活性のパーセントとして表現されている。ｒａｓ翻訳 開始コドンを標的としているオリゴヌクレオチドは突然変異体および正常ｒａＳ 発現の両方を減少させるのに等しく有効であるという観察結果は、２つの標的は ＡＵＧ翻訳開始部位周辺の領域に同一の配列組成を持っているので予期されるも のである。 図２は、突然変異体（活性型）Ｈ−ｒａｓ　ＲＮＡの第１２コドン点突然変異を 標的とする化合物であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２５７０　（配 列ＩＤ番号＝３）で細胞を処理した用量一応答実験を示している。対照オリゴヌ クレオチドは２０塩基の長さのランダムホスホロチオエートオリゴヌクレオチド である。結果はオリゴヌクレオチドで処理されていないトランスフェクト細胞中 のルシフェラーゼ活性のパーセントとして表現されている。図に示されているよ うに、このオリゴヌクレオチドの濃度を増加させて細胞を処理すると、ｒａｓ− ルシフェラーゼの突然変異体型または正常型を発現している細胞中のｒａｓ−ル シフェラーゼ活性の用量依存性抑制を示した。しかしながら、データを注意深（ 検討すると、低濃度ではオリゴヌクレオチド２５７０は正常型に比較してｒａｓ −ルシフェラーゼの突然変異体型に対し約３倍の選択性を示した。実際、２５７ ０はｒａｓ−ルシフェラーゼの突然変異体型に対し約１１００ｎのＩＣ５０値を 示し、一方、同じ化合物が非突然変異体型に対して約２５０ｎＭのＩＣ５０値を 示した。 図３はＨ−ｒａｓ翻訳開始コドンまたは第１２コドン点突然変異を標的とするオ リゴヌクレオチドの単一用量（０５μＭ）で、ｒａｓ−ルシフェラーゼの正常型 または突然変異体型を発現している細胞を処理した典型的な実験の結果を示して いる。試験されたアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは表１に 示されている。対照オリゴヌクレオチド（２５０４）は２０塩基の長さのランダ ムホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。結果はオリゴヌクレオチドで 処理されていないトランスフェクト細胞中のルシフェラーゼ活性のパーセントと して表現されている。図３に示されているように、ｒａｓ翻訳開始コドンを標的 とする化合物２５０３　（配列ＩＤ番号：３）がｒａｓ−ルシフェラーゼ活性の 抑制に最も有効であった。活性化Ｈ−ｒａｓの第１２コドン点突然変異を標的と する３つの化合物の内、１７−ｍａｒオリゴヌクレオチド２５７０　（配列ＩＤ 番号：３）のみが正常型に比較してｒａｓ−ルシフェラーゼの突然変異体型に対 する選択性を示した。このことは、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子と相補的な１３すべ でのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにランダムにした対照オリゴヌク レオチド（１９６６）および野生型のｒａｓの第１２コドンの領域と相補的な対 照オリゴヌクレオチド（２９０７）から得られたデータを要約した図４にもまた 示されている。各々のオリゴヌクレオチドに示されているのはその長さ、それが 相補的である領域およびｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現を抑制す るその活性である。より長い第１２コドン点突然変異を標的とするホスホロチオ エートはｒａｓ−ルシフェラーゼ発現に対して実体のあるアンチセンス活性を示 すが、ｒａｓ−ルシフェラーゼの突然変異体型の発現の選択的抑制を示さなかっ た。１７ヌクレオチドの長さ未満の第１２コドン点突然変異を標的とするホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドはｒａｓ−ルシフェラーゼの両方の型に活性を 示さなかった。これらの結果はｒａｓ配列を標的とするホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドの効果的なアンチセンス活性を示している。 オエートオリゴヌクレオチドのｒａｓ−ルシフェラーゼ発現の抑制能力が実施例 ２−５に記載されたような過渡トランスフエクンヨンアッセイにより比較された 。 結果は図５Ａおよび５Ｂに示されている。表２に示されているこれらのオリゴヌ クレオチド、ｌ５ＩＳ２５０２　（配列ＩＤ番号：　１）　、２５０３　（配列 ＩＤ番号＝２）および６１８６　（配列ＩＤ番号＝７）はＨｅ１ａ細胞において 単一量での（１００ｎＭ）ｒａｓ−ルシフェラーゼ発現の抑制が試験された。３ つすべてのＡＵＧ−標的化オリゴヌクレオチドがｒａｓ−ルシフェラーゼ発現の 抑制に有効であった。これらの３つのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは また各々の積上に２°−０−メチル修飾を持つものとしても製造された。ｌ５Ｉ Ｓ２５０３（配列ＩＤ番号＝２）の２゛−〇−メチル体もまたｒａｓ−ルシフェ ラーゼ発現を抑制した。このことは図６に示されている。 突然変異体Ｈ−ｒａｓを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌ クレオチド配列は５゛から３°で示されている）オリゴ　長さ　標的　配列　配 列ＩＤ番号２５０２　２０　ＡＵＧ　ＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴ Ｃ１２５０３２０＾１１Ｇ　ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ　２６ １８６　２０　ＡＵＧ　ＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡ　７２５６ ３　５　コドン　１２　ＣＧＡＣＧ　８２５６４　７　コドン　１２　ＣＣＧＡ ＣＧＧ　９２５６５　９　コドン　１２　＾ＣＣＧＡＣＧＧＣ１０２５６７１１ コドン　１２　ＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧ　１１２５６８　１３　コドン　１２　 ＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣ１２２５６９１５コＦ用２　ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧ ＧＣＧＣＣ１３３４２６１６コドン　１２　ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣ １４３４２７１６ｆｆトン　１２　ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ１５２５ ７０１７コドン　１２　ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ３３４２８１８コ ドン　１２　ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ１６３４２９１８コドン　 １２　ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ＾　１７２５７１　１９　コド月２ 　ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡ　４２５６６　２１　コド用２　Ｇ ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣ５２５６０２３コドン　１２　ＴＧ ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣ６２４６１２５コドン　１２　Ｔ ＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣ＾　１８９０７　１７　コド 用２　ＣＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＣ１９（野生型） ｒａｓ第１２コドン点突然変異を標的とするオリゴヌクレオチド（ままｔこｒａ ｓ−ルシフェラーゼ発現の抑制に有効であった。５から２５塩基の長さの一連の １１のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが作製され、実施例２−５に記載 されている過渡トランスフェクションアッセイで突然変異体および野生型ｒａｓ −ルシフェラーゼを抑制する能力が試験された。オリゴヌクレオチドは表２に示 される。１００１Ｍオリゴヌクレオチド濃度では、１５塩基またはそれより長い オリゴヌクレオチドが突然変異体Ｈ−ｒａｓ標的の発現を抑制することが観察さ れた。 １５および１９塩基の長さの間のオリゴヌクレオチドに野生型ｒａｓ−ルシフェ ラーゼ発現に対する突然変異体の選択的抑制が観察された。野生型に比較して突 然変異体のｒａｓ−ルシフェラーゼ抑制に対して観察された最大の選択性は１７ −ｍｅｒ２５７０（配列ＩＤ番号：３）であり、約４倍であった。２５７０が配 列特異的様式で作用していることを示すために、この化合物の変異体（２９０７ ：配列ＩＤ番号：１９）が試験された。これは中心のアデノシン残基がシトシン に置き換えられており、そのことはこのオリゴヌクレオチドを野生型Ｈ−ｒａｓ 標的に完全に相補的なものにしている。それゆえ、このオリゴヌクレオチドは突 然変異体Ｈ−ｒａｓ配列へ十分にハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチド ／ＲＮＡデユーブレックスの中心に一つの誤適正を含むであろう。図７に示した ように、オリゴヌクレオチド２９０７は突然変異体ｒａｓ−ルシフェラーゼに対 して野生型ｒａｓ−ルシフェラーゼの発現を選択的に抑制し、その相違は１１０ ０ｎのオリゴヌクレオチド用量で約５倍であった。 突然変異体第１２コドン領域に相補的な２つの１５−ｍａｒおよび２つの１８− ｍａｒが実施例２−５に記載したように試験された（図５および表２）。図８は 、用量依存性様式でオリゴヌクレオチドの長さ１３．１５．１６．１７．１８お よび１９塩基に対して決定されたアンチセンス活性および突然変異体選択性の実 験の結果を示している。これらのオリゴヌクレオチドで得られた結果は、突然変 異体Ｈ−ｒａｓ配列に対して活性であった化合物はまた選択性も発揮したことを 示している。長さ１６のオリゴヌクレオチド（配列！Ｄ番号＝１４および配列Ｈ ）番号：１５）および１７塩基（配列ＩＤ番号・３）は最も高い選択性を示した （各々４−および５−倍）。１３塩基化合物、２５６８　（配列ＩＤ番号・１２ ）は試験された濃度でアンチセンス活性を示さなかった。 デオキシギャップを持つキメラ２°　−０−メチルオリゴヌクレオチド：突然変 異体−選択的１７−ｍｅｒ　（２５７０）の配列に基づいて、末端領域が２゛− 〇−メチルヌクレオシドから成り、中心の残基が”デオキシギャップ”を形成す る一連のキメラホスホロチオニー）２’　−０−メチルオリゴヌクレオチドが合 成された。デオキシの数はゼロから（全部２′−〇−メチル）から１７（全部デ オキシ）の範囲である。これらのオリゴヌクレオチドは表３に示されている。 表３ ２゛−〇−メチル末端（ボールド）および中央にデオキシギャップを持つキメラ ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（突然変異体コドン−１２標的） オリゴ＃　デオキシ　配列　配列ＩＤ番号４１２２　０　ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣ ＧＧＣＧＣＣＣ３３９７５１ＣＣＡＣ＾α石＾ＣＧＧＣＧＣＣＣ３３９７９３Ｃ ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ３４２３６４ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧ　ＧＣ ＧＣＣＣ３４２４２４ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ３３９８０５ＣＣＡ ＣＡＣＣＧＡＣＧ　ＧＣＧＣＣＣ３３９８５７ＣＣＡＣＡ　ＣＣＧＡＣＧＧ　Ｃ ＧＣＣＣ３３９８４９ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ３２５７０１７ＣＣ ＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ３これらのオリゴヌクレオチドは実施例６に記 載したようなハイブリダイゼーション効率、実施例８に記載したような哺乳類Ｒ ＮアーゼＨを用いるインビトロでのＲＮＮアーゼ切断を指示する能力、およびア ンチセンス活性について特徴付けられた。完全長Ｈ−ｒａｓ　ｍＲＮＡに対する アンチセンス活性は、実施例９に記載されているように、レポーター遺伝子ルシ フェラーゼに連結されているｒａＳ一応答性エンハンサ−要素を用いてＨ−ｒａ ｓ遺伝子発現がモニターされる過渡的同時トランスフェクションレポーター遺伝 子システムを用いて決定された。 −重鎖２５−ｍｅｒ　ＲＮＡ標的へのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌ クレオチドのハイブリダイゼーション・図５および表２はコドン１２Ｇ→Ｕ点突 然変異を含む活性化Ｈ−ｒａｓ　ｍＲＮＡを標的とする１５のボスポロチオエー トオリゴヌクレオチドの配列が示されている。これらのオリゴヌクレオチドは５ から２５塩基の長さの範囲にあり、点突然変異の辺りを中心としている。突然変 異体および野生型２５−ｍｅｒ　ＲＮＡ標的に対するこれらのアンチセンスポス ホロチオエートの融解温度（Ｔ、）が４μＭオリゴヌクレオチド濃度で測定され た。Ｔ７は鎖長が長（なるにつれて増加し、および任意の鎖長に対し、突然変異 体標的へのハイブリダイゼーションのＴ、は野生型標的のＴはりも大きかった。 オリゴヌクレオチド２９０７は２５７ｏのホスホロチオエート１７−ｍｅｒ変異 体であり、中央のアデノシン残基がシトシンで置き換えられているためこのオリ ゴヌクレオチドを野生型Ｈ−ｒａｓ標的へ完全に相補的にしている。予期される ように、野生型標的への二のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの融 解温度は、オリゴヌクレオチド／ＲＮＡデユーブレックス中の点突然変異の部位 に一つの誤適正を含む突然変異体の温度よりも高がった。また、突然変異体Ｈ− ｒａｓ標的と完全に相補的である１７−ｍａｒホスホロチオエート（２５７０） について、オリゴヌクレオチド濃度に対するＴ、の依存性から熱力学パラメータ ーを得た。これらのデータを用いて突然変異体標的および野生型標的へのオリゴ ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの間の自由エネルギーの相違（ΔΔＧ０ ．７）を決定した。与えられたオリゴヌクレオチドに対し、ΔΔＧ０，７はオリ ゴヌクレオチド濃度へのＴ、＠依存性から得ることができる。Ｂｏｒｅｒ、Ｐ、 Ｎ、ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、８６，８４３−８５３．１９７４年。２５７ｏ に対するΔΔＧ６３７は＋１．ｇｋｃａｌ／ｍｏｌｅであると計算された。 最大度の選択性は野生型ｒａｓに対して突然変異体への標的化をΔΔＧ０．７が 増加するように有意に増加させることにより達成できる。従って、ΔΔＧ０，７ を増加させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの化学修飾は選択性を促進する。 そのような修飾の一つは２．６−ジアミツプリンであり、それはＵに対してｄＡ より堅く結合し、力りＧに対してｄＡより弱く結合させると信じられており、従 って、Ａ−Ｕ’−−→Ａ−Ｇ誤適正に対しΔΔＧ０３７が増加する。ＲＮＮアー ゼの基質必要条件は本発明の教示に従った選択性を得るために利用される。もし 酵素が誤適正部位に結合またはその部位を切断できないならば、ＲＮＮアーゼ認 識部位を誤適正部位に置いたキメラオリゴヌクレオチドを用いることによりΔΔ Ｇ０，７により与えられた選択性を超える追加の選択性が得られるであろう。こ のことは次の場合に事実であることが観察されている；ＲＮＮアーゼが完全に適 正なデユープレックスおよび一つの誤適正を含むものを本当に判別できる場合。 短いオリゴヌクレオチド標的への”デオキシギャップ”オリゴヌクレオチドのハ イブリダイゼーション：実施例６に記載されたような２５−ｍａｒ合成オリゴヌ クレオチド補体に対する２°−〇−メチル　デオキシギャップ系列のハイブリダ イゼーション分析は、与えられたオリゴヌクレオチドのＴ１値が２′−Ｏ−メチ ル含有量と直接的に相関していることを示した。２′−〇−メチル修飾がデオキ シ置換基に！き換えられるにつれて、Ｔ７値は１修飾当たり約１．５℃減少した 。これらの実験において、２’　−０−メチル修飾を含むオリゴヌクレオチドの Ｔ、値は同一の配列の全デオキシ化合物のＴ、値よりも高かった。 ｒａｓ標的にオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる実験が行われた。構造 を持つＨ−ｒａｓ標的へのアンチセンスハイブリダイゼーションにおける２°− 〇−メチル修飾の影響が実施例７に記載されているようなゲルシフト分析により 決定された。 図９に示したように、全デオキシ１７−ｍｅｒはヘアピン標的と最も不安定なデ ユーブレックスを形成した：全２′−Ｏ−メチル１７−ｍｅｒは最も安定なデユ ープレックスを形成した。これらのオリゴヌクレオチドにおいてはデオキシギャ ップの大きさが減少しており、２°　−０−メチル残基の数が増加するにつれて デユーブレックスの安定性が増加した。 ＲＮＡ標的の二次および三次構造はアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリ ダイゼーションに影響を及ぼす。ｒａｓヘアピン標的の種々の領域にハイブリダ イズする一連の１１−ｍｅｒキメラオリゴヌクレオチドが作製された。ｌ５ＩＳ ５０５５はステム領域の左側に（ヘアピンを図９のように示して）ハイブリダイ ズする。ｌ５ＩＳ５０５６はループの左側にハイブリダイズする。ｌ５ＩＳ５０ ９１はループの右側に、およびｌ５ＩＳ５１４７はステムの右側にハイブリダイ ズする。すべて均一なホスホロチオエートであり、２°−〇−メチル領域が隣接 する中心部５−デオキシギャップを持っている。ループの左側を標的とする１１ −ｍｅｒのみが測定可能なほど標的に結合された。他の１１−ｍｅｒは測定可能 なほどは結合されながった。これらのオリゴヌクレオチドに対応するより長いオ リゴヌクレオチドもまた作製された；これらの１３−ｍｅｒオリゴヌクレオチド はすべてヘアピン標的への測定可能な結合を示し、ループの左側を標的とするオ リゴヌクレオチドがゲルシフトアッセイで最も強い結合を示した。 デオキシギャップを持つオリゴヌクレオチドにより指示されるＲＮＮアーゼ切断 ：実施例８に記載したようにＲＮアーゼＨ源としてＨｅＬａ核抽出物を用い、相 補的ＲＮＡのＲＮＮアーゼ切断を指示する２’　−０−メチノげオキシギャップ オリゴヌクレオチドの能力がインビトロで決定された。図１０に示したように、 完全修飾２゛−〇−メチルオリゴヌクレオチドまたは一つのデオキシ残基を含む オリゴヌクレオチドでは切断は観察されなかった。３．４．５．７または９のデ オキシ長を持つオリゴヌクレオチドはＲＮＮアーゼ切断を指示できた。５．７ま たは９のデオキシギャップが好適であり、７または９のギャップが最も好適であ った。 完全長ｒａｓ　ｍＲＮＡに対するデオキシキャップオリゴヌクレオチドのアンチ センス活性：２’−〇−メチル修飾により与えられた標識親和性促進の有益な性 質は、もしこれらの化合物が適当な長さのＲＮＮアーゼ感受性デオキシギャップ を備えていればアンチセンス抑制に利用できる。２′−〇−メチルデオキシギャ ップオリゴヌクレオチドは実施例９に記載したＨ−ｒａｓ）ランス活性化レポー ター遺伝子システムを用いて完全長Ｈ−ｒａｓ　ｍＲＮＡに対するアンチセンス 活性が試験された。アンチセンス実験は最初に単一オリゴヌクレオチド濃度（１ ００ｎＭ）で実施された。図１１に示されたように、５またはそれ以上のデオキ ソギャップを含むキメラ２゛−〇−メチルオリゴヌクレオチドはＨ−ｒａｓ遺伝 子発現を抑制した。これらの化合物は全デオキシの粗化合物よりも強い活性を示 した。 これらの活性な化合物は、４つのデオキシ残基を含む２°−０−メチルキメラと 一緒に用いて用量応答試験が実施された。図１１Ｂに示したように、これらのオ リゴヌクレオチドによる完全長Ｈ−ｒａｓのオリゴヌクレオチド仲介抑制は用量 依存性であった。最も活性な化合物は７残基デオキシキメラであり、それは全デ オキシオリゴヌクレオチドの活性よりも約５倍強い活性を示した。 短（したキメラオリゴヌクレオチド＋２’−０−メチル修飾により与えられる標 的親和性の促進は短いキメラオリゴヌクレオチドに活性を与えることが観察され た。一連の短い２’　−０−メチルキメラオリゴヌクレオチドは実施例９に記載 されているように、完全長ｒａｓに対してのＴ、、およびアンチセンス活性が試 験された。表４は５塩基長または７塩基長のデオキシギャップを持っ１１．１３ ．１５および１７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのＴ、を示している。全 デオキシ１３−ｍａｒとはっきり対照的に、２゛−〇−メチルキメラ１３−ｍｅ ｒの両方ともｒａｓ発現を抑制し、１１−ｍｅｒの一つもまた活性であった。こ のことは図１２に示されている。 表４ 長さ　Ｔ、（℃）　配列　配列ＩＤ番号：１７　７７、２　ＣＣＡＣＡＣＣＧＡ ＣＧ　ＧＣＧＣＣＣ３１５６９、８ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧ　ＧＣＧＣＣ１３１３ ６２、Ｉ　ＡＣＡＣＣＧＡＣＧ匝　１２１１　４７、３　ＣＡＣＣＧＡＣＧ　Ｇ ＣＧ　１１１７　７４、６　ＣＣＡＣＡ　ＣＣＧＡＣＧＧαｎ℃３１５　６６、 ２　ＣＡＣＡ　ＣＣＧＡＣＧＧ　ＣＧＣＣ１３１３５８，０＾ＣＡ　ＣＣＧＡＣ ＧＧα℃１２１１　２７、７　ＣＡ　ＣＣＧＡＣＧＧ　ＣＧ　１１キメラ２゛− ０−メチルオリゴヌクレオチドによる相対的アンチセンス活性およびインビトロ でＲＮアーゼＨ切断を活性化する能力はデオキシ長とよく相関している（図１３ ）。 非対称チオキシギャップ：デオキシギャップはキメラ分子の中心にある必要はな い。結合を促進させるため２゛位で修飾された１つの末端の領域のヌクレオチド を持ち、および残りの分子は修飾されていない（２°デオキシ）キメラ分子が依 然ｒａｓ発現を抑制できることが観察されている。１７−ｍａｒの５′または３ ゛側に、または分子の真ん中の異なった部位に７−ジオキシギヤ・ツブが位置し ている配列ＩＤ番号：３（突然変異体コドン１２に相補的である１７−ｍｅｒ） のオリゴヌクレオチドは全て、ＲＮアーゼＨ活性化およびアンチセンス活性を示 した。しかしながら、５−塩基ギャップが配置により敏感であることが観察され 、いくつかのギャップ位置ではデュプレックスはＲＮアーゼＨを弱（活性化し、 アンチセンス抑制剤としての働きが弱まる。従って、７−塩基デオキシギヤ・ノ ブが好ましい。 ２′糖修飾のアンチセンス活性に対する影響が試験された。これらの修飾、なら びに実施例６に記載されているように、７−塩基デオキシギヤ・ノブに隣接する ２′−修飾ヌクレオチドを持つ１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドが２５−ｍａｒ オリゴヌクレオチド補体とハイブリダイズされた場合に得られたＴＪが表５１こ 掲げられている。これらのオリゴヌクレオチドにおいて２゛位のアルキルとＴ． 間に関係が観察された。アルキルの長さが増加するにつれＴ．は減少した。 ２°−フルオロキメラオリゴヌクレオチドはこの系列の中で最も高いＴ．を示し た。 Ｔ．とアンチセンス活性の相関 ７−デオキシギャップを持つ２′−修飾１７−ｍｅｒＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧ ＣＧＣＣＣ　（配列ＩＤ番号：３）２°修飾　Ｔ，、　（℃）　Ｉ　Ｃ　５　０ 　（ｎＭ）デオキシ　６４．　２　１５０ ０−ペンチル　６８．　５　１５０ ０−プロピル　７０．４　７０ ０−メチル　７４．　７　２０ フルオロ　７６、９　１０ これらの２゛修飾オリゴヌクレオチドは実施例９に記載したトランス活性化レポ ーター遺伝子アッセイを用いてＨ−ｒａｓに対するアンチセンス活性を試験した 。図１４および表５に示したように、これら全ての２′修飾キメラ化合物がｒａ Ｓ発現を抑制し、２゛　−フルオロ　７−ジオキシ−ギヤ・ツブ化合物が最も活 性であった。中心に５−デオキシギャップを持つ２°　−フルオロキメラオリゴ ヌクレオチドもまた活性であった。 ５−塩基または７−塩基デオキシギャップ周辺の領域に２′−〇ープロピルを持 つ配列ＩＤ番号．３のキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが２°−Ｏ −メチルキメラオリゴヌクレオチドと比較された。Ｔ２４細胞におけるｒａｓ発 現は７−デオキシギャップおよび均一なホスホロチオエート主鎖を持つ２°　− ０−メチルおよび２°　−０−プロピルキメラオリゴヌクレオチドの両方で抑制 された。デオキシギャップが５つのヌクレオチドに減少した場合、２′−〇ーメ チルオリゴヌクレオチドのみがｒａｓ発現を抑制した。 癌細胞におけるＨ−ｒａｓ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド抑制・ ｒａｓ　ＡＵＧ領域に相補的な２つのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ ２５０２、２５０３）が、同一の配列および２゛−Ｏ−メチル領域が隣接する７ −塩基デオキシギャップを持つキメラオリゴヌクレオチド（４９９８、５１２２ ）とともに実施例１０に記載されたように試験された。これらのキメラオリゴヌ クレオチドは表６に示されている。 表６ ２′−〇ーメチル末端（ボールド）および中央デオキシギャップを持つキメラホ スホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＡＵＧ標的）オリゴ＃　デオキシ　配列 　配列ＩＤ番号：２５０２　２０　ＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣ 　１４９９８　７　ＣＴｒＡＴＡ　ＴＴＣＣＧＴＣ　ＡＴＣＧＣＴＣ　１化合物 ２５０３はＴ２４細胞におけるｒａｓ発現を７１％抑制し、キメラ化合物（４　 ９　９　８）はｒａｓ　ｍＲＮＡをさらに抑制した（８４％抑制）。またＡＵＧ 領域に相補的である化合物２５０２はｒａｓ　、ＲＮＡレベルを２６％減少させ 、このオリゴヌクレオチドのキメラ体（５１２２）は１５％抑制を示した。また 、突然変異体コドン１２を標的とする２つのオリゴヌクレオチドもこのアッセイ が行われた。化合物２５７０　（配列ＩＤ番号：３）はｒａｓ　ＲＮＡを８２％ 減少させ、７−デオキシギャップを持つこのオリゴヌクレオチドの２°　−Ｏ− メチルキメラ体（３　９　８　５）はｒａｓ　ＲＮＡを９５％減少させた。 オリゴヌクレオチド２５７０および２５０３はまた野生型（活性型ではない）Ｈ −ｒａｓ第１２コドンを持つＨｅＬａ細胞におけるｒａｓ発現へのそれらの効果 を決定するために試験が行われた。これらのオリゴヌクレオチドの両方がＴ２４ 細抱（活性型第１２コドンを持つ）ではｒａｓ発現を抑制するが、ｒａｓ　ＡＵ Ｇと特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（２　５　０　３）のみ がヒーラ細胞においてｒａｓ発現を抑制した。活性型第１２コドンと特異的にハ イブリダイズできるオリゴヌクレオチド２５７０　（配列ＩＤ番号：３）がＨｅ Ｌａ細胞におけるｒａｓ発現を抑制しないのは、これらの細胞が活性型第１２コ ドン標的を持たないからである。 活性型Ｈ−ｒａｓの第１２コドン領域に相補的である１７−ｍｅｒホスホロチオ エートオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド２５７０が、２５７０と同一の 配列を持ち５．７および９塩基のデオキシギャップを持つキメラホスホロチオエ ート２゛−〇−メチルオリゴヌクレオチド３９８０．３９８５および３９８４（ 表３に示されている）とともにＴ２４細胞でｒａｓ発現の抑制が試験された（実 施例１０に記載しているように）。完全２°−デオキシオリゴヌクレオチド２５ ７０および３つのキメラオリゴヌクレオチドが７２４細胞におけるｒａｓｍＲＮ Ａレベルを減少させた。化合物３９８５　（７−デオキシギャップ）および３９ ８４（９−デオキシギャップ）はｒａｓ　ｍＲＮＡを８１％減少させた：化合物 ３９８０（５−デオキシギャップ）はｒａｓ　ｍＲＮＡを６１％減少させた。 この配列を持ち、５−デオキシ（４６８９）または７−デオキシ（４６９０）ギ ャップが隣接する２゛　−フルオロ修飾ヌクレオチドを持つキメラオリゴヌクレ オチドはＴ２４細胞においてｒａｓ　ｍＲＮＡ発現を抑制し、７−デオキシギャ ップが好適であった（８２％抑制、５−デオキシギャップを持つ２′−フルオロ キメラでは６３％抑制）。 癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害：活性型ｒａｓのコドン１２ 領域に相補的な同一の配列を持つ３つの１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドが実施 例１１に記載したようにＴ２４癌細胞増殖に対する効果を試験された。３９８５ は２′−〇−メチルヌクレオチドが隣接している７＝デオキシギヤツプを持ち、 ４６９０は２′−Ｆ　ヌクレオチドが隣接している７−デオキシギャップを持っ ている（全てホスホロチオエートである）。これらのオリゴヌクレオチドの癌細 胞増殖に対する効果は、ノーザンプロット分析により示されたそれらのｒａｓｍ ＲＮＡ発現に対する効果とよく相関している：オリゴヌクレオチド２５７０は細 胞増殖を６１％抑制し、２°　−０−メチルキメラオリゴヌクレオチド３９８５ は細胞増殖を８２％抑制し、および２°−フルオロキメラ類似体は細胞増殖を９ ３％抑制した。 細胞増殖に対するこれらのオリゴヌクレオチドの用量応答研究では、２５ｎＭ− １００ｎＭの範囲で用量依存性であることが示された。４４ｎＭ、６１ｎＭおよ び９８ｎＭのＩＣ５０値が各々オリゴヌクレオチド４６９０．３９８５および２ ５７０に対して決められた。ランダムオリゴヌクレオチド対照は試験された用量 では何の効果も示さなかった。 細胞増殖へのｌ５ＩＳ２５７０の効果は細胞型特異的であった。このオリゴヌク レオチドによるＴ２４細胞増殖の抑制は、同じオリゴヌクレオチドによるＨｅＬ ａ細胞の抑制より４倍の効果を示した（１００ｎＭオリゴヌクレオチド濃度）。 ｌ５ＩＳ２５７０は活性型（突然変異体）ｒａｓ第１２コドンを標的としており 、それはＴ２４には存在するが、野生型第１２コドンを持つＨｅＬａ細胞には存 在しない。 キメラ主鎖修飾オリゴヌクレオチド：前の実施例で議論されてきたオリゴヌクレ オチドは均一なホスホロチオエート主鎖を持っていた。これまで議論した２゛修 飾キメラオリゴヌクレオチドは均一ホスホジエステル主鎖では活性ではない。 ５−ヌクレオチドデオキシギヤ°ツブが隣接する２゛−〇−メチル領域を持ち、 Ｐ＝Ｓ主鎖のギャップ領域およびＰ＝Ｏ主鎖の隣接領域を持つキメラオリゴヌク レオチドが合成された（ＩＳＩ　３４２２６）。ギャップにＰ＝Ｏ主鎖および隣 接領域にＰ＝Ｓを持つ別のキメラオリゴヌクレオチドも合成された（ＩＳＩＳ４ ２２３）。これらのオリゴヌクレオチドは表７に示されている。 完全に２゛デオキシであり、および１つのホスホジエステル（Ｉ　Ｓ　Ｉ　５４ ２４８）、２つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５４６）、３つのホスホジエス テル（ＩＳＩＳ４５５１）、４つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５９３）、５ つのホスホジエステル（Ｉ　Ｓ　ｌ５４６０６）または１０のホスホジエステル 結合（ｌ５ＩＳ４２４１）を分子の中央に含むホスホロチオエート主鎖を持つオ リゴヌクレオチドが合成された。これらのオリゴヌクレオチドもまた表７に示さ れている。 ２°−０−メチル末端（ボールド）および中央デオキシギヤ・ノブを持つキメラ 主鎖（Ｐ＝Ｓ／Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチド（主鎖結合はｓ　（Ｐ＝Ｓ）または ｏ　（Ｐ＝Ｏ）で示されている）突然変異体コドン−１２標的 オリゴ＃　Ｐ＝Ｓ　配列　配列ＩＤ番号４２３３　１’ｌ　ＣｓＣ５Ａ５ＣｓＡ ｓＣｏ　ＣｏＧｏ＾ｏＣｏＧｓ　Ｇ５Ｃ５ＧｓＣｓＣｓＣ３４５５１１３ＣｓＣ ５Ａ５ＣｓＡｓＣｓＣｓＧｏ＾ｏＣｏＧｓＧｓＣｓＧｓＣｓＣｓＣ３４２４１６ ＣｓＣｓＡｓＣｏ＾ｏｃｏｃｏＧｏ＾ｏＣｏＧｏＧｏＣｏＧｓＣｓＣｓＣ３Ｄ　 ｉ　ｇｎａｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１．１４７５−１４ ８９．１９８３年に記載されているように、ヌクレアーゼ分解への感受性を決定 するためにオリゴヌクレオチドを粗ＨｅＬａ細胞抽出物と３７℃でインキユベー トシた。ホスホロチオエート／２°　−０−メチルウィング間に５つのジエステ ルギャップを持つオリゴヌクレオチド（４２３３）は７時間のＴ１７２を持って いた。ホスホロチオエート／２’　−０−メチル分子中に５つのホスホロチオエ ートギャップを持つオリゴヌクレオチドは３０時間のＴ、７２を持っていた。１ から１０のジエステル結合を持つオリゴヌクレオチドの組において、一つのホス ホンエステル結合を持つオリゴヌクレオチド（４２４８）は全ホスホロチオエー ト分子（ＩＳＩＳ２５７０）同様にヌクレアーゼに対して安定であり、ＨｅＬａ 細胞抽出物で５時間後でも分解を起こさなかった。２．３および４のジエステル ギャップを持つオリゴヌクレオチドは各々約５．５時間、３．７５時間および３ ．２時間のＴ１７２を持うており、５または１０のデオキシ結合を持つオリゴヌ クレオチドは各々１．７５時間および０．９時間のＴ　Ｉ／！を持っていた。 キメラ主鎖修飾オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性：均一ホスホロチオエー ト主鎖はアンチセンス活性には必要とされない。ｌ５ＩＳ４２２６およびｌ５Ｉ Ｓ４２３３が、ｌ５ＩＳ２５７０　（完全ホスホロチオエート／全デオキシ）、 ｌ５ＩＳ３９８０　（完全ホスホロチオエート、デオキシギャップを持つ２゛− 〇−メチルウィング）およびｌ５ＩＳ３９６１　（完全ホスホジエステル、デオ キシギャップを持つ２°　−０−メチルウィング）と−緒に実施例２−５に記載 されたようにｒａｓ発現に対する効果がｒａｓ−ルシフェラーゼレポーターシス テムで試験された。ｐ＝ｓ　＜すなわち、ヌクレアーゼ耐性）ギャップ領域を持 つ全てのオリゴヌクレオチドがｒａｓ発現を抑制した。このことは図１５に示さ れている。 １つのホスホジエステル（ＩＳ１５４２４８）または１０のホスホジエステル結 合（ＩＳＩＳ４２４１）を分子の中央に含むホスホロチオエート主鎖を持つ２つ の完全２′デオキシオリゴヌクレオチドもまた活性がアッセイされた。単一のＰ ２Ｏを含む化合物は完全Ｐ＝Ｓ分子と全く同じ活性であったが、一方、１０のＰ ＝Ｏを含む同じ化合物は完全に不活性であった。 ７−塩基デオキシギャップ領域のみにホスホロチオエート主鎖を持ち、隣接領域 にホスホジエステル（２°−〇−メチルまたは２′−〇−プロピル）を持つ配列 ＩＤ番号、３のキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが作製された。 ２゛−〇−プロピルジエステル隣接領域を持つオリゴヌクレオチドはｒａｓ発現 を抑制できた。 ノ）アデニンを持ち、活性型ｒａｓの第１２コドン点突然変異に相補的な一連の アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが前に記載したように合成 された。アデニンの２−位のアミノ基はウラシルの２−位の酸素と水素結合がで きるので、通常の２つに代わって３つの水素結合が形成される。このことは活性 型ｒａｓ遺伝子への２−（アミノ）アデニン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチ ドのハイブリダイゼーションを非常に安定化させるが、一方、この位置での修飾 Ａ−Ｇ不適正のため野生型第１２コドンへのこのオリゴヌクレオチドの安定性を 不安定化するかまたは最終的には同等影響を与えない。このことは所望の標的へ の修飾オリゴヌクレオチドの特異性を増加させる。 この位置に一つの２．６−（ジアミノ）アデノシンを持ち、他は修飾されていな い均一ホスホロチオエート１７−ｍｅ　ｒ　（２５７０、配列ＩＤ番号：３と同 一の配列）がＲＮＮアーゼ系質として少なくとも２５７０配列同様に有効である ことが観察された。従って、それは有効なアンチセンス分子として期待される。 同一の配列のデオキシギャップを持つホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中 のこの位置に一つの２．６−（ノアミノ）アデノシンを持つオリゴヌクレオチド もまたＲＮアーゼＨ活性化を示した。 インビボ抗腫瘍データ：実施例１３および１４に記載されているように、ｌ５Ｉ Ｓ２５０３　（配列ＩＤ番号：２）の、インビボでのヒト腫瘍に対する活性が評 価された。これらの研究ではヌードマウス内へ皮下に移植され、移植部位で腫瘍 増殖したヒト肺癌腫細胞株（Ａ５４９）が用いられた。これらの細胞はＨａ−ｒ ａＳ遺伝子での突然変異を含んでいず、正常Ｈａ−ｒａｓを発現しているので、 ＡＵＧ−配向オリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ２５０３のみの抗腫瘍活性が評価され た。 第一の研究では、食塩水に溶解したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２ Ｑｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により投与した。薬剤処置は腫瘍が最初に見え るようになった時点で開始しく腫瘍細胞接種から２８日後）、処置は１日おきに 実施された。図１６に示したように、関係のない対照ホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドｌ５ＩＳ１０８２で処置しても腫瘍増殖には何の効果も観察されな かった。しかしながら、Ｈａ−ｒａｓ−特異的オリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ２５ ０３（配列ＩＤ番号＝２）では著しい腫瘍増殖の抑制が観察された。Ｈａ−ｒａ Ｓ化合物の抗腫瘍効果は薬剤処置を開始して２０日後に最初に観察され、研究を 継続している間を通して維持された。 第二の研究では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはカチオン性脂質処方 として（ＤＭＲＩＥ　：ＤＯＰＥ）調製され、実施例１５に記載したように皮下 注射により投与された。薬剤処置は腫瘍細胞を接種して１週間後に開始され、４ 週間のみの間１週間に３回実施された。第一の研究で観察されたように、Ｈａ− ｒａｓ−特異的化合物ｌ５ＩＳ２５０３　（配列ＩＤ番号＝２）では著しい腫瘍 増殖の減少が起こったが、関係のない対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０８ ２）は何の効果も観察されなかった（図１７）。腫瘍容量の減少は目に見える腫 瘍が現れて２０日後に最初に観察され研究の残りの期間を通して維持された。 細胞内での２°　−修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの安定性：ヌクレ アーゼ安定性を与えるオリゴヌクレオチドの修飾が細胞内でのアンチセンス活性 に必要とされる。糖の２°位でのある種の修飾が主鎖修飾することなく細胞内で アンチセンス効果を引き出すのに十分なヌクレアーゼ耐性を与えることが見いだ されている。図１８に示したように、均一に２°　−プロポキシ修飾したホスホ ジエステルオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号＝３）が同じ配列を持つホスホロ チオエート２゛　−チオキンオリゴヌクレオチドと等しいレベルで、投与２４時 間後、Ｔ２４細胞でのＨａ−ｒａｓ発現を抑制することが観察された。均一な２ ′　−メトキシホスホジエステルオリゴヌクレオチドもまたいくらかの活性を示 した。２°−ペントキシ修飾は少なくとも２′−プロポキシと同様に活性である ことが観察された。 Ｋｉ−ｒａｓに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド活性：ヒトＫｉ−ｒａＳ 癌遺伝子の５゛−非翻訳領域、３゛　−非翻訳領域およびコード領域に相補的で あるようにオリゴヌクレオチドが設計された。ＭｃＧｒａｔｈ、Ｊ、Ｐ、ら、Ｎ ａｔｕｒｅ　３０４．５０１　５０６．１９８３年。オリゴヌクレオチドはコー ド領域のうちＫｉ−ｒａｓ−媒介形質転換を誘導する突然変異の部位であること が知られている第１２および６１コドン、および形質転換には関与することは知 られていない第３８コドンを標的としている。オリゴヌクレオチドは表８に示さ れている。 ヒトＫｉ−ｒａｓに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ＃　配列 　標的　配列ＩＤ番号６９５８　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　Ｃ ＧＧ　ＣＣ５°　ＵＴＲ１５’　キャップ　２０６９５７　ＣＡＧ　ＴＧＣＣＴ Ｇ　ＣＧＣＣＧＣＧＣＴ　ＣＧ　５°−ＵＴＲ２１６９５６ＡＧＧ　ＣＣＴ　Ｃ ＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧ　５’　−ＵＴＲ２２６９５３ＴＴＣＡＧＴ　ＣＡ Ｔ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＣＡＵＧ　２３６９５２　ＴＴＡ　ＴＡＴ　Ｔ ＣＡ　ＧＴＣＡＴＴ　ＴＴＣＡＧ　ＡＵＧ　２４６９５１　ＣＡＡ　ＧＴＴ　Ｔ ＡＴ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴ　Ａ［ＩＧ　２５６９５０　ＧＣＣＴＡＣ ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣコドン　１２　（曹Ｔ）　２６６９４９　ＣＴ ＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡ　コＦｙ１２（ＷＴ）　２７６９４８　Ｇ　Ｔ ＡＣＴＣＣＴＣＴ、ＴＧＡ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴ　）Ｆン　６１　（ＷＴ）　 ２ｇ６９４７　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＣＧＡ　＾ＴＣＣＴＣＴＡＴ　ＴＧＴ　］コド ン　３８　２９６９４６　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　 ＧＣ３°−ＵＴＲ３０６９４５ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＣＧ Ａ　ＧＧ　３°−ＵＴＲ’　３１７４５３　ＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣコ ドン　１２　（Ｇ−Ｔ　ｍｕｔ、）　３２７６７９　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　 ＧＧＣＣＴＣＴＣＴ　ＣＣ５°−ＵＴＲ／ＡＵＧ　３３１２のＫｉ−ｒａｓ特異 的オリゴヌクレオチドが、Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子内の第１２コドンに突然変異を 含む３つの結腸癌細胞株に対するアンチセンス活性でスクリーニングされ、Ｋｉ −ｒａｓ　ｍＲＮＡレベルの測定により評価された。 図１９に示したように、試験化合物の半数がＫｉ−ｒａｓ転写体に対して著しい 活性を示しく少なくとも４０％阻害）、最も活性な化合物は５°−および３°　 −非翻訳領域を標的とするものであった。しかしながら、Ｋｉ−ｒａｓ発現の著 しい抑制は野生型筒１２および６１コドンに対する化合物でも観察された。著し い活性を示した化合物は試験された３つの癌細胞株全部に有効であった。 ３つの化合物の用量応答分析は、ｌ５ＩＳ６９５８およびｌ５ＩＳ６９５７（両 方とも５°　−ＵＴＲを標的とする）がこの系統のオリゴヌクレオチドにおいて 最も強力なＫｉ−ｒａｓの抑制剤であった。これらのオリゴヌクレオチドはＫｉ −ｒａｓ形質転換細胞株の増殖を抑制する能力が試験された。結腸癌細胞株５Ｗ ４８０がオリゴヌクレオチドの単一用量で（２００ｎＭ）処置され、５日間に渡 って細胞数が決定された。図２０に示したように、Ｋｉ−ｒａｓ特異的オリゴヌ クレオチドの両方が５ＷＪ８０細胞増殖の有効な抑制剤であり、Ｉ　Ｓ　Ｉ　５ ６９５７（配列ＩＤ番号：２１）がｌ５ＩＳ６９５８　（配列ＩＤ番号＝２０） より強い活性を示した。この活性の相違は、Ｋｉ−ｒａｓ　ｍＲＮＡ発現の抑制 とよく相関している（図１９）。 正常Ｋｉ−ｒａｓと比較した突然変異体Ｋｉ−ｒａｓ抑制の選択性：Ｋｉ−ｒａ Ｓを標的とするオリゴヌクレオチドが正常Ｋｉ−ｒａｓと比較して突然変異体Ｋ ｉ−ｒａｓを選択的に抑制する能力が試験された。２つの細胞株が使用された： 突然変異体Ｋｉ−ｒａｓ（コドン１２、ＧからＴへのトランスバージョン）を発 現する５Ｗ４８０細胞株および正常Ｋｉ−ｒａｓを発現する細胞株（ＨｅＬａ） 。２つのオリゴヌクレオチドが試験された：　ｌ５ＩＳ６９５７　（配列ＩＤ番 号：２１）　、Ｋｉ−ｒａｓの５°−非翻訳領域を標的とする２０−ｍａｒホス ホロチオエート、およびｌ５ＩＳ７４５３　（配列ＩＤ番号：３２）、Ｋｉ−ｒ ａｓの第１２コドン領域を標的とする１５−ｍｅｒホスホロチオエート。Ｋｉ− ｒａｓｍＲＮＡレベルが処置２４時間後に測定された。第１２コドンを標的とす る化合物は突然変異体Ｋｉ−ｒａｓを発現する細胞株に有効であった。しがしな がら、図２１に示したように、５°−非翻訳領域を標的とするＫｉ−ｒａｓオリ ゴヌクレオチドは両方の細胞株でのＫｉ−ｒａｓ発現の強力な抑制剤であった。 突然変異体Ｋｉ−ｒａｓに対する選択性はオリゴヌクレオチド濃度およびＲＮＡ 標的に対する親和性に依存していることが観察された。 デオキシギャップを持っＫｉ−ｒａｓオリゴヌクレオチド＝６または８のヌクレ オチド長の中央２°　−デオキシギャップ領域と隣接する２°　−０−メチル修 飾を持つホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号・２１、Ｋｉ− ｒａＳの５゛−非翻訳領域を標的とする）が合成された。両方のギャップを持つ オリゴヌクレオチドともＫｉ−ｒａｓ発現に活性であることがノーザンプロット 分析により決定された。均一に２′−〇−メチル化された化合物（デオキシギャ ップなし）は不活性であった。６−または８−ヌクレオチドデオキシギャップを 持つように合成された別のオリゴヌクレオチド、Ｉ］５７６７９　（配列ＩＤ番 号：３３、Ｋｉ−ｒａｓの５°非翻訳／ＡＵＧ領域に相補的）もまた活性である ことが観察された。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは固相合成のよく知られた技術に より都合よ（およびルーチンに作製されるであろう。そのような合成のための装 置はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの販売元から販売さ れている。そのような合成に任意の他の手段を用いてもよいが、しかしながら、 オリゴヌクレオチドの実際の合成は日常的に仕事をしている人にはよ（解ってい るであろう。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌ クレオチドの製造にも類似の技術が使用されることが知られている。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、Ｈ−ｒａｓ遺 伝子に由来するメツセンジャーＲＮＡとハイブリダイズしうるように設計される 。そのようなハイブリダイゼーションは、それが達成される際には、そのメツセ ンジャーＲＮＡの正常な役割を抑制し、細胞中におけるその機能の喪失を生ずる 。抑制されるべきメツセンジャーＲＮＡの機能は、タンパク質への翻訳場所への ＲＮＡの移動、ＲＮＡからタンパク質への実際の翻訳、一つまたは複数のｍＲＮ Ａ種の生成のためのＲＮＡのスプライシング、および、恐らくはＲＮＡ自身によ って行われるかも知れない独立の異化活性等の、生体に重要な全ての機能を含む 。ＲＮＡ機能のそのような抑制の全体としての効果は、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の発現 の抑制である。本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドはｒａｓ　ｍＲＮＡのＲ ＮアーゼＨ切断を活性化するように設計されている。 Ｎ−ｒａｓ、に−ｒａｓといった他の哺乳類のｒａｓ遺伝子のタンパク質産物は 、最初の８５アミノ酸に渡ってＨ−ｒａｓと同一である。３つのｒａｓ遺伝子の 塩基配列は、同一ではないが、周知であり、当業者はＮ−ｒａｓおよびに−ｒａ Ｓ遺伝子と特異的にハイブリダイズしつるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク レオチド誘導体を調製する指針として本発明を使用し得るであろう。本発明の好 ましい態様はＨ−ｒａｓ　ｍＲＮＡの第１２コドンと特異的にハイブリダイズし うるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関しているが、当業者はｒａｓ遺伝子の 他の点突然変異、特に明確にされている配列が既知のＨ−ｒａｓ、Ｎ　−ｒａｓ 。 およびＫ　−ｒ　ａ　ｓの第１２コドン、第１３コドンおよび第６１コドンの点 突然変異と特異的にハイリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを調製する指針とし て本発明を使用し得るであろう。 本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療、および研究試薬とキットとして利 用し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、ｒａｓ遺伝子とハイブリダイズする ため、この事実を利用するサンドイツチ法または他のアッセイ法が容易に構築可 能である。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはｒａｓ癌遺伝子の変異型（活 性型）に特異的にハイブリダイズするため、細胞もしくは組織の野生型のｒａＳ から活性型のｒａｓへの変換をスクリーニングするためのアッセイを工夫し得る 。そのようなアッセイは、形態的に類似の腫瘍を区別する診断や、ｒａｓ遺伝子 の活性化に由来して高まる癌のリスクの検出に利用し得る。オリゴヌクレオチド のｒａｓ遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出するための手段のための準備 は、日常的に成し得る。そのような準備は、酵素コンジュゲーション、放射活性 ラベルまたは他の適当な検出システムを含み得る。ｒａｓ遺伝子または活性化ｒ ａｓ遺伝子の存在または不在を検出するキットもまた製造しつる。 以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではな い。 置換および非置換オリゴヌクレオチドは、標準のヨードによる酸化およびホスホ ロアミデート化学を用いて、自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ）で合成した。ホスホロチオネートオリゴヌ クレオチドのためには、亜リン酸結合の段階的なチオ化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）の ために、標準酸化ボトルを、０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３− オン　１，１−ジオキシド溶液を含むアセトニトリルに交換した。チオ化の待ち 段階は６８秒に延ばし、続いてキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラムからの 分離および濃水酸化アンモニウム中での脱ブロック（５５℃、１８時間）の後、 オリゴヌクレオチドを２、゛５倍体積のエタノールと０．５Ｍ塩化ナトリウムで ２回座澱させて精製した。分析ゲル電気泳動は、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿 素、４５４ｍＭトリス−ホウ酸緩耐液、ｐＨ＝７．０で行った。オリゴヌクレオ チドは、完全長物質が８０％以上であることをポリアクリルアミドゲル電気泳動 から判断した。　゛ 第１ｊゴヌリボクレオチドは自動イし合成機および５°　−ジメトキシ−トリチ ル−２’　−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル　３°−Ｏ−ホスホロアミダイト （Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いて合 成された。Ａ、ＣおよびＧの環外アミンの保護基はフェノキシアセチルであった （Ｗｕ。 添加後の待ち時間を９００秒に延長する標準合成サイクルの修正を行った。オリ ゴヌクレオチドはメタノール性アンモニア中、家屋で一夜インキユベーションす ることにより脱保護された。真空下で乾燥後、ＩＭテトラブチルアンモニウムフ ルオリド（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉ　Ｉｗａｕｋｅｅ、Ｗｌ）のテトラヒト０７ラ ン溶液中、室温で一夜インキユベーションすることにより２°−シリル基が除去 された。オリゴヌクレオチドはＣ−１８５ｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅ ｒｓ　；Ｍｉ　Ｉ　ｆｏｒｄ、ＭＡ）続いて１多ノール沈澱により精製された。 分析用変性ポリアクリルアミド電気泳動はＲＮＡオリゴヌクレオチドは完全長物 質が９０％以上であることを示した。 ＣＲ技術を用いて構築された。突然変異体（第１２コドン）および非突然変異体 （野生型）ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子両方のエクソン１の５°−領域のＰＣＲクロー ニングのプライマーとして使用するためにオリゴヌクレオチドブライマーが合成 された。ｃ−Ｈ−ｒａｓｌ活性化癌遺伝子（第１２コドン、ＧＧＣ−ＧＴＣ）を 含むプラスミドｐＴ２４−Ｃ３、およびｃ−Ｈ−ｒａｓ原癌遺伝子を含むｐｂｃ −ＮはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から得られた。１．９ｋｂホタルルシフエラーゼ遺伝 子を含むプラスミドｐＴ３／Ｔ７　１ｕｃはＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ　（Ｐａｌｏ、ＡＩ　ｔｏ、ＣＡ）から得られた。オリゴヌクレオチ ドＰＣＲプライマーは突然変異体および芋突然変異体Ｈ＝ｒａｓ遺伝子を鋳型と して用いる標準ＰＣＲ反応に用いられた。これらのプライマーはＮｈｅｌおよび Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ制限酵素部位に接した正常および突然変異体Ｈ−ｒａｓの配 列−５３から＋６５（翻訳開始部位に関して）に対応する１４５塩基対のＤＮＡ 産物を産生ずる。ＰＣＲ生成物は標準的な方法によりゲルで精製し、沈澱させ、 洗浄して水に再懸濁した。 Ｐ、ｐｙｒａｌｉｓ　（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのため のＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物がアミノ末端のメチオニン残基を除いて完全 長のルシフェラーゼタンパク質をコードするように設計された。このメチオニン 残基はアミノ末端がリジン、続いてロイシンという２つのアミノ酸で置き変わら れるようにした。ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのために使用されたオリ ゴヌクレオチドブライマーは、鋳型としてルシフェラーゼレポーター遺伝子を含 む商業的に入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ ）を用いる標準的なＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは、Ｈｉｎｄ　と Ｂｓ５Ｈ制限酵素部位に接した約１．９ｋｂのルシフェラーゼ遺伝子に相当する 産物を与えることが期待された。この断片は、標準的な方法によりゲル精製し、 沈殿し、洗浄し、そして水に再懸濁した。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の構築を行うために、ｒａｓおよ びルシフェラーゼのＰＣＲ産物を適当な制限酵素により切断し、制限酵素Ｎｈｅ ｌ、Ｈｉｎｄ　、およびＢｓ５Ｈを用いて、３部分のライゲーションによって、 ステロイドで誘導されるマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）のプロモーターを含む 発現ベクター中にクローン化した。この結果、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子に フレームがあった形で融合されたＨ−ｒａｓの配列（−５３から＋６５）の挿入 を含むクローンが得られた。このようにして得られた発現ベクターは、ステロイ ド誘導性のＭＭＴＶプロモーターによって発現が調節されるｒａｓ−ルシフェラ ーゼ融合産物をコードする。これらのプラスミド構築物はホタルルシフェラーゼ をコードする配列と読み枠内に融合された活性化（ＲＡ２）または正常（ＲＡ４ ）Ｈ−ｒａｓタンパク質の１−２２のアミノ酸をコードする配列を含んでいる。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合ｍＲＮＡの翻訳開始は天然のＨ−ｒａｓ　ＡＵＧコ ドンに依存している。突然変異体および正常Ｈ−ｒａｓルシフェラーゼ融合構築 物は標準的な方法を用いるＤＮＡ配列分析により確認された。 実施例３　プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフエクンヨントランスフエク ションは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ。 Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｒ，Ｂｒｅｎｔ 。 Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、ＭｏｏｒｅＳＪ、Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｊ、 Ｇ。 Ｓｅｉｄｍａｎ、に、５ｔｒａｈ１編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎ ｓ、ＮＹ）中のＭ、Ｅ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによる記載を以下のように変更して 行った。Ｈｅ１ａ細胞を、５Ｘ１０５細胞／デイツシユになるように６０ｍｍの ディツシュに播種した。全部で１０μｇまたは１２μｇのＤＮＡを各ディツシュ に添加したが、このうち１μｇは、恒常的に発現するラウス肉腫ウィルス（Ｒ８ ■）プロモーターにより調節されるラットグルココルチコイド受容体を発現する ベクターであり、残りはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミドであった 。 １６から２０時間後に、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物を、３ｍＭ　ＥＧＴＡ を含むトリス緩衝生理食塩液（５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐｉ−１７，５）　、１ ５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄して除去した。次に、１０％牛脂児血清を含む 新鮮な培地を細胞に添加した。この時点において、レポーター遺伝子発現をデキ サメタシンで活性化する前に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理 した。 実施例４　細胞のオリゴヌクレオチドによる処理プラスミドトランスフエクンヨ ンに続いて、前もって３７℃に暖められたリン酸緩衝生理食塩液で細胞を洗浄し 、５μｇ／ｍｌのＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］　−Ｎ、 　Ｎ、　Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）を含むＯ ｐｔ　ｉ−ＭＥＭを、各プレートに添加した（ウェル当たり］、、０ｍ１）。オ リゴヌクレオチドは５０μＭ保存液から各プレートに添加して、３７℃で４時間 インキュベートした。培地を除き、１０％ウシ胎児血清および指示された濃度の 適当なオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで置き換え、最Ｐ：ａ度０．　２μＭ のデキサメタシンで細胞を処理することにより、レポーター遺伝子の発現を活性 化させる前にさらに３７℃で４時間細胞をインキュベートした。 デキサメタシンで刺激して１５時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をア ッセイした。 実施例５　ルシフェラーゼのアッセイ ルシフェラーゼは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ 。 Ｋｉｎｇｓ　ｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、Ｊ、Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｊ、Ｇ、、 Ｓｅｉｄｍａｎ、に、５ｔｒａ、ｈ１編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏ ｎｓ、ＮＹ）中のＭ、Ｅ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによる記載にしたがって、界面活 性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００による細胞溶解物から抽出した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ 　ＭＬＩ０００ルミノメータ−を用いて、６２５μＭのルシフェリン（Ｓ　ｉ　 ｇｍａ）の添加により発生する蛍光のピークを測定した。アッセイの直線域にデ ータが確かに集まるように、各抽出物毎に抽出物の量を変えて、ルシフェラーゼ アッセイを複数回行った。 実施例６　融解曲線 ＩＢＭ　ＰＣコンピューターおよびＧ１１ｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ＩＩ分 光光度計を接続したＧ１１ｆｏｒｄ　２６０分光光度計を用いて２６０μｍで吸 光度に対する温度曲線を測定した。Ｉｌ衝液は１００ｍＭ　Ｎａ”、１０ｍＭリ ン酸および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ１ｐＨ７、を含んでいた。オリゴヌクレオチド 濃度は４μＭであり、各々の鎖は８５℃の吸光度から決定され、吸光係数はＰｕ ｇｌｉｓｉおよびＴｉｎｏｃｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８ ０．３０４−３２５．１９８９年、に従って計算された。Ｔ１、デユープレック ス形成の自由エネルギーおよび会合係数は二重勾配ベースラインによる二状態モ デルへのデータの適合により得られた。Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ、Ｍ　およびＴｕ ｒｎｅｒ、Ｄ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２．２５６−２６３．１９ ８３年。報告されたパラメーターは少な（とも３回の実験の平均である。い（つ かのオリゴヌクレオチドに対し、デユープレックス形成の自由エネルギーがＴ、 −’　ｖｓ　１ｏｇ＋ｏ（濃度）のプロットからも得られた。Ｂａｒｅｒ、Ｐ、 Ｎ、。 Ｄｅｎｇｌｅｒ、Ｂ、、Ｔｉｎｏｃｏ、１．、Ｊ　ｒ、、およびＵｈｌｅｎｂｅ ｃｋ、０．Ｃ，、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、８６，８４３−８５３．１９７４年 ）。 実施例７　ゲルシフトアッセイ 変異第１２コドンを含む４７−ヌクレオチドヘアピンである構造を持つｒａｓ標 的転写体はＬｉｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１．１２０５５−１２０ ６１．１９９１年、により記載されているように製造され地図が作製された。 ハイブリダイゼーション反応は１００ｍＭナトリウム、１０ｍＭリン酸、０．Ｉ ＥＤＴＡ、１１００ｃｐのＴ７−発生ＲＮＡ　（約１０ｐＭ）および１μＭから １０ｐＭの濃度範囲のオリゴヌクレオチドで行われた。反応液は３７℃で２４時 間インキュベートされた。ハイブリダイゼーション後、負荷用緩衝液を反応液に 加え、反応生成物は４５ｍＭトリス−ホウ酸および１ｍＭ　ＭｇＣｌ、（ＴＢＴ ）で調製した２０％天然ポリアクリルアミドゲルで分離した。電気泳動は１０℃ にて実施し、ゲルはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒ 。 ｉｍａｇｅｒを用いて定量した。 実施例８　ＲＮアーゼＨ分析 ＲＮ７−ゼＨ７ノセイは活性型（第１２ｆｆトン、に−ｅｌＪ））ｉ−ｒａｓｍ ＲＮＡの＋２３から＋４７に対応する化学合成２５−塩基オリゴリボヌクレオチ ドを用いて実施された。５°　−末端樟識ＲＮＡが２０ｎ〜ｉの濃度で使用され 、２０ｍＭトリス−ＣＩＳｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　ＭｇＣ ｌ２．１ｍＭジチオスレイトール、１０μｇ　ｔＲＮＡおよび４Ｕ　ＲＮＮアシ ン含む最終用量０μｍの反応液で１０倍モル過剰のアンチセンスオリゴヌクレオ チドとインキュベートされた。反応組成物は３７℃で１５分前もってアニールし 、放置して徐々に室温まで冷却した。ＨｅＬａ細胞核抽出物を哺乳類ＲＮアーゼ Ｈ源として使用した。２μｇの核抽出物（５μ）の添加により反応が開始され３ ７℃で１０分間進行させた。反応はフェノール／クロロホルム抽出により停止さ れ、エタノールで沈澱された。等しいＣＰＭが７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリ ルアミドゲルにのせられ、ＲＮＡ切断生成物は分離され電気泳動後のオートラジ オグラフィーにより可視かした。切断生成物の定量はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｙ ｎａｍｉｃＳデンシトメーターを用いて実施された。 実施例９　ｒａｓトランス活性化レポーター遺伝子システム構成ＳＶ４０プロモ ーターの制御下の活性型（第１２コドン、ＧＧＣ→ＧＴＣ）Ｈ−ｒａｓｃＤＮＡ 挿入物を含む発現プラスミドｐＳＶ２−ｏ１ｉはＢｒｕｎ。 Ｔｏｃｑｕｅ博士（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ　５ａｎｔｅ、Ｖｉｔ、ｒｙ、 Ｆ腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの制御を受けるＨ　−ｒ　ａ　ｓ発現 プラスミドのＰＣＨによる構築に鋳型として使用された。Ｈ−ｒａｓをコードし ている配列を得るには、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の５７０ｂｐコード領域がＰＣＲによ り増幅された。ＰＣＲプライマーは、クローニングを容易にするためその５°− 領域に特別の制限酵素部位を持つように設計された。Ｈ−ｒ　ａ　ｓ第１２コド ン突然変異体癌遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ生成物はゲルで精製され、消化 し、クローニングに先だってもう一度ゲルで精製された。この挿入物を発現プラ スミドｐＭＡＭｎｅｏ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ ）内にクローニングすることにより構築が完成した。 ｒａｓ一応答性レポーター遺伝子ｐＲＤ５３がｒａｓ発現の検出に使用された。 Ｏｗｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８７．３ ８６６−３８７０．１９９０年。 実施例１０　インビボにおけるｒａｓ発現のノーザンプロット分析ヒト膀胱癌細 胞株Ｔ２４はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ）から入手した。細胞は、１０％熱不活性化 ウソ胎児血清および各々５０Ｕ／ｍ＋のペニシリンおよびストレプトマイシンを 補給したＬ−グルタミンを含むＭａＣｏｙ　５Ａ　培地（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃｏ　Ｂ ＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ）中で増殖させた。細胞は１００ｍｍプ レートに播種した。それらがコンフルエントの７０％に達したとき、オリゴヌク レオチドで処理した。プレートを１０ｍ１の前もって暖めたＰＢＳおよび２．５ μＩＤＯＴＭＡを含むＯｐｔ　ｉ−ＭＥＭ低減血清培地で洗浄した。オリゴヌク レオチドを次に所望の濃度まで添加した。４時間処理後、培地をＭａＣｏｙ培地 に置換した。オリゴヌクレオチド処理４８時間後に細胞を集め、ＲＮＡを標準Ｃ ｓＣｌ精製法を用いて単離した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、ＣｕｒｒｅｎｔＰ ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ、Ｍ。 Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏ。 ｒｅｌＪ、Ａ、Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｇ、Ｓｅｉｄｍａｎ、に、５ｔｒａｈ１編、Ｊ ｏｈｎＷｉ　Ｉｅｙ　ａｎｄ　’５ｏｎｓ、ＮＹ）ヒト上皮癌細胞株Ｈｅ１ａ２ ２９はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　 （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ）から入手した。ＨｅＩａ細胞は６−ウェルプレー トで１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍ＋のペニシリンを補給したダルベツ コ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に単層で維持した。オリゴヌクレオチド処理 およびＲＮＡの単離は上にＴ２４細胞に対して記載した方法と実質的に同じであ る。 ノーザンブロットハイブリダイゼーション；各々のＲＮＡ１０μｇを１，２％ア ガロース／ホルムアミドゲルで電気泳動し、標準法を用いてＧｅｎｅＢｉｎｄ４ ５　ナイロン膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ） へ−晩移した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｒ 。 Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、Ｊ、Ａ、Ｓｍ１ ｔｈ、Ｊ、Ｇ、Ｓｅｉｄｍａｎ、に、５ｔｒａｈ１編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　ａ ｎｄ　５ｏｎｓ、、ＮＹ）。ＲＮＡは膜へＵＶ−架橋された。二本鎖３２ｐ標識 プローブはＰｒｉｍｅ　ａ　Ｇｅｎｅ標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓ ｏｎＷｌ）を使用して合成された。ｒａｓプローブは第１２コドンにＧＧＣから ＧＴＣへの突然変異を持つ活性型（突然変異体））ｌ−ｒＢｓ　ｍＲＮＡのｃＤ ＮＡクローンの５ａｌｌ−Ｎｈｅｌ断片であった。対照プローブＧ３ＰＤＨであ った。 プロットはＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）により６８℃で１５分間ブリハイブリダイゼーシ ョンを行った。１００μｌの１０ｍｇ／ｍＩサケ精子ＤＮＡと混合した熱変性放 射活性プローブ（２，５ｘ１０６カウント／２ｍ１ハイブリダイゼーション溶液 ）を加え、６８℃で１時間膜をハイブリダイズした。プロットは２ｘＳＳＣ１０ ゜１％ＳＤＳ中室温で１５分間２回、および０．１ｘＳＳＣ／領　１％ＳＤＳ中 ６０℃で３０分間１回洗浄した。プロットのオートラジオグラフィーを行い、信 号の強度はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃ ｕｊａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ、５ｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて定量した。 ノーザンプロットは最初にｒａｓプローブにハイブリダイズされ、次に０．　１ ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で１５分間煮沸して剥され、正しく試料が装填され たかを検査するために対照プローブと再ハイブリダイゼーションされた。 実施例１１　癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド抑制実施例１０に本 質的に記載したように細胞が培養されオリゴヌクレオチドで処理された。細胞は ６０ｍｍプレートに播種され、７０％コンフルエントに達したときＤＯＴＭＡ存 在下オリゴヌクレオチドで処理された。時間経過実験＝１１日目細胞は１１００ ｎの最終濃度で単一用量のオリゴヌクレオチドで処理された。３日目に一度増殖 培地を交換し、計数チャンバーを用いて５日毎に計数した。用量応答実験：種々 の濃度のオリゴヌクレオチド（１０，２５，５０，１００または２５０ｎＭ）を 細胞に加え、３日後に細胞を採取して計数した。オリゴヌクレオチド２５７０． ３９８５および４６９０のＴ２４癌細胞の増殖への影響が試験された。 実施例１２　２−（アミノ）アデニン−置換オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌ クレオチドは以下の例外を除いて実施例１に従って合成される＝２−（アミノ） アデニンが好ましい部位においては、標準ホスホロアミダイトを商業的に入手可 能な２−アミノデオキシアデノシン　ホスホロアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ ）で置き換える。 実施例１３　Ａ３４９細胞の培養 Ａ３４９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ 　ｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手）は６−ウェルプレート（Ｆａｌｃ ｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ、Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ、ＮＪ）を用い、１ｇグルコ ース／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２．Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆ　ｉｃ、５ａｎｔａ　Ａｎａ、ＣＡ）を含むダルベツコ改良イーグル培地 （ＤＭＥ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。 実施例１４　ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド治療−腹 腔注射　。 ヒト肺癌腫Ａ３４９細胞を採取し、５ｘｌＯ’細胞（２００μｌ）をヌードマウ スの内部線内へ皮下注射した。触診できる腫瘍に約１ケ月で発育した。ホスホロ チオエートオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ２５０３および１０８２　（非相関対照 ）は、２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１日おきに約１０週間マウスに投与した。こ の期間マウスの腫瘍増殖をモニターした。 実施例１５　ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド治療−カ チオン性脂質との皮下注射 ヒト肺癌腫Ａ３４９細胞を採取し、５ｘｌＯ’細胞（２００μｌ）をヌードマウ スの内部線内へ皮下注射した。触診できる腫瘍に約１ケ月で発育した。カチオン 性脂質処方（ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ、６０ｍｇ／ｋｇ）で調製したホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ２５０３および非相関対照オリゴヌクレオチ ド１０８２　（用量５ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍部位のマウスの皮下に投与した。薬剤 処置は腫瘍細胞接種１週間後に開始し、４週間だけ週に２回行った。マウスの腫 瘍増殖を総計で９週間モニターした。 実施例１６　Ｔ２４細胞における２゛修飾オリゴヌクレオチドの安定性Ｔ２４膀 胱癌細胞を実施例１０に記載したように増殖させた。細胞はオリゴヌクレオチド の単一用量（１μＭ）で処理し、２４時間後ノーザンプロット分析によりＨａ− ｒａｓ　ｍＲＮＡ発現でアッセイした。試験されたオリゴヌクレオチドはｌ５Ｉ Ｓ２５７０　（配列ＩＤ番号＝３）の類似体（Ｈａ−ｒａｓを標的とする１７ｍ ｅｒ）であった。 実施例１７３つの結腸癌腫細胞株に対するＫｉ−ｒａｓオリゴヌクレオチドの活 性 ヒト結腸癌腫細胞株Ｃａ１ｕｌ、５Ｗ４８０．５Ｗ６２０はＡｍｅｒｉｃａｎＴ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）から入手され、 実施例１０のＨｅＬａ細胞で記載したように培養および維持された。細胞はオリ ゴヌクレオチドの単一用量（２００ｍＭ）で処理され、２４時間後にノーザンプ ロット分析によりＫｉ−ｒａｓ　ｍＲＮＡ発現が測定された。増殖研究において は、０日目に細胞はオリゴヌクレオチドの単一用量（２００ｎＭ）で処理され、 ５日間にわたって細胞数がモニターされた。 実施例１８　突然変異体ｖｓ、野生型Ｋｉ−ｒａｓのオリゴヌクレオチド抑制５ Ｗ４８０細胞が前の実施例のごとく培養された。ＨｅＬａ細胞は実施例１０のご とく培養された。細胞はオリゴヌクレオチドの単一用量（１００ｎＭ）により処 理され、２４時間後にノーザンプロット分析によりｍＲＮＡレベルが決定された 。

【配列表】

配列番号：１： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｌ：ＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣ ＧＣＴＣ２０配列番号＝２＝ （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （ｐ）トポロジー・直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２：ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧ　ＣＴＣＣ ＴＣＡＧＧＧ　２０配列番号＝３＝ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３：ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣ ＣＣ１７配列番号：４゜ （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ＝１９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４：ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡ　ＣＧＧＣ ＧＣＣＣＡ　１９配列番号：５： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　５：ＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧ　ＡＣＧＧ ＣＧＣＣＣＡ　Ｃ２１配列番号＝６＝ （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２３ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６：ＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧ ＣＧＣＣＣＡＣＣ２３配列番号ニア： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ＝２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７：ＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡ　ＴＣＧＣ ＴＣＣＴＣ＾　２０配列番号：８： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：５ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　Ｎ０８８：ＣＧＡＣＧ　５ 配列番号＝９： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ＝７ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９：ＣＣＧＡＣＧＧ　７ 配列番号＝１０： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１０：＾ＣＣＧＡＣＧＧＣ９ 配列番号＝１１： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｌ）配列：　ｓＥＱ　Ｉｏ　Ｎｏ：　１１：ＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧ　１１ 配列番号：１２： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ＝１３ （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１２：＾ＣＡＣＣＧＡＣＧＧ　ＣＧＣ １３ 配列番号：１３： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１５ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｔａ：ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧ　ＧＣＧ ＣＣ１５配列番号＝１４・ （ｉ）配列の特性・ （＾）配列の長さ：１６ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１４：ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧ ＣＣ１６配列番号：１５： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ；１６ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１５：ＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧ　ＧＣＧ ＣＣＣ１６配列番号：１６： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｔａ：ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡ　ＣＧＧ ＣＧＣＣＣ１８配列番号：１７： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ＝１８ （Ｂ）配列の型：核酸 （０鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１７：ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧ ＣＣＣ＾　１８配列番号＝２４： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２４：ｎＡＴＡＴＴＣＡＧ　ＴＣＡＴ ＴＴＴＣＡＧ　２０配列番号＝２５： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２５：Ｃ＾＾ＧＴＴＴＡＴＡ　ＴＴＣ ＡＧＴＣＡＴＴ　２０配列番号：２６： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　２６：ＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡ　ＣＣＡ ＧＣＴＣＣＡＡ　Ｃ２１配列番号＝２７： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：１７ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２７：ＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴ ＣＣ＾　１７配列番号＝２８＝ （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ＝２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ｉＤ　Ｎｏ：　２８：ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴ　ＴＧＡ ＣＣＴＧＣＴＧ　Ｔ　２１配列番号：２９： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ二２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２９：ＣＣＴＧＴＡＧＧＡＡ　ＴＣＣ ＴＣＴＡＴＴＧ　Ｔ　２１配列番号：３０： （ｉ）配列の特性。 （Ａ）配列の長さ＝２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３０：ＧＧＴ＾＾ＴＧＣＴＡ＾＾ＡＣ Ａ＾＾ＴＧＣ２０配列番号：３１： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３１：ＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧ　ＣＡＣ ＴＴＣＧＡＧＧ　２０配列番号＝３２゜ （１）配列の特性・ （Ａ）配列の長さ＝１５ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３２：ＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡ　ＧＣＴ ＣＣ１５配列番号＝３３： （ｉ）配列の特性： （＾）配列の長さ＝２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３３：ＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧ　ＧＣＣ ＴＣＴＣＴＣＣ２０−１に・＝ｒ県 −Ｉに・＝ｒ基 −Ａｌ・・二二基 （薗征％）十・＝ｒ基 薗　杯　％ オリゴ濃度（１Ｍ） オリゴ濃度（１Ｍ） 龜 １１１　・・＠　４−ＩＬ＆＄ １１１１　１＊Ｉ・＠　ＩＦ　−ｓ−ｒａｓ　ＲＮＡＦＩＧ、　９Ａ ＦＩＧ、　１Ｏ Ｎぼ％ 薗　柾　％ 薔　征　％ ＲＮｗｓｅ　）ｌ活性 共姿　５ＤＪ （酊資宰）腑　４　％ （、ｕｌｕｌ）耐都奪曽 （、山田）　酎　勺　駆　動 首題　ＳＤＪ　ｌ−１ （酊貸￥％）宵並ＶＮｄｕｌ　’ＥＤＪ−）１皿匪皿対照　区＝コロ９５７　ｊ ７Σコロ９５８日 ［］　５Ｗ４８０　Ｚ］ＨｅＬ（Ｌ オリゴ標的（１００ｎＭ　） 手　続　補　正　書 平成７年り月／！日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的 にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド 。 ２．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コドンと特異的にハイブ リダイズしうる、請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。 ３．薬学的に受容しうる担体中の請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。 ４．ヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが硫黄含有修飾を含む請求項 第１項に記載のオリゴヌクレオチド。 ５．硫黄含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第４項に記載のオリゴ ヌクレオチド。 ６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の少なくとも１つが２′位で修飾さ れている請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。 ７．２′位での該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾であ る請求項第６項に記載のオリゴヌクレオチド。 ８．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的 にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含み、ＲＮアーゼＨの基 質であり、およびヌクレアーゼ耐性を促進するために少なくとも１つの修飾を、 および該ｒａｓＤＮＡまたはｍＲＮＡへの親和性を促進するために少なくとも１ つの修飾を持つオリゴヌクレオチド。 ９．配列ＩＤ番号：２または配列ＩＤ番号：３を含むオリゴヌクレオチド。 １０．Ｈ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含み、ヌクレアーゼに対し て安定化されており、および標的親和性を促進するために修飾された少なくとも １つのヌクレオチドを持つ第１の領域およびＲＮアーゼＨの基質である第２の領 域を含むキメラオリゴヌクレオチド。 １１．ＲＮアーゼＨの基質である領域に標的親和性を促進するために修飾された 領域が隣接する請求項第１０項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １２．標的親和性を促進するために修飾されたキメラオリゴヌクレオチドの領域 が２′位で修飾されたヌクレオチドを含む請求項第１０項に記載のキメラオリゴ ヌクレオチド。 １３．２′位での修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾であ る請求項第１２項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １４．ＲＮアーゼＨの基質である領域が２′−デオキシヌクレオチドを含む請求 項第１０項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １５．２′−デオキシヌクレオチド領域が４から９のヌクレオチド長である請求 項第１４項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １６．２′−デオキシヌクレオチド領域が５から７のヌクレオチド長である請求 項第１５項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １７．ヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが硫黄含有修飾を含む請求 項第１０項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １８．硫黄含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第１７項に記載のキ メラオリゴヌクレオチド。 １９．ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コドンと特異的にハイブリダイ ズしうる、請求項第１０項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２０．薬学的に受容しうる担体中の請求項第１０項に記載のキメラオリゴヌクレ オチド。 ２１．配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、１１、１２、１３、１４、 １５、１６、１７、１８および１９からなる群より選択される配列を持つ請求項 第１０項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 ２２．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子を含む組織または細胞とヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由 来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８から ３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドを接触させることからなるヒト Ｈ−ｒａｓ遺伝子発現の調節法。 ２３．該オリゴヌクレオチドがヒトｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コ ドンと特異的にハイブリダイズしうる請求項第２２項に記載の方法。 ２４．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少なくとも１つの結合基が硫 黄含有修飾を含む請求項第２２項に記載の方法。 ２５．硫黄含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第２４項に記載の方 法。 ２６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の少なくとも１つが２′位で修飾 されている請求項第２２項に記載のオリゴヌクレオチド。 ２７．２′位での該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾で ある請求項第２６項に記載の方法。 ２８．該オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの基質であり、およびヌクレアーゼ 耐性を促進するために少なくとも１つの修飾を、および該ｒａｓＤＮＡまたはｍ ＲＮＡへの親和性を促進するために少なくとも１つの修飾を含む請求項第２２項 に記載の方法。 ２９．該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して安定化され、および標的親 和性を促進するために修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを持つ第１の領 域およびＲＮアーゼＨの基質である第２の領域を含むキメラオリゴヌクレオチド である請求項第２２項に記載の方法。 ３０．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域に標的親和性 を促進するために修飾された領域が隣接する請求項第２９項に記載の方法。 ３１．標的親和性を促進するために修飾されたキメラオリゴヌクレオチドの領域 が２′位で修飾されたヌクレオチドを含む請求項第２９項に記載の方法。 ３２．キメラオリゴヌクレオチドの２′位での修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは ２′−Ｏ−フルオロ修飾である請求項第３１項に記載の方法。 ３３．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域が２′−デオ キシヌクレオチドを含む請求項第２９項に記載の方法。 ３４．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が４から９ のヌクレオチド長である請求項第３３項に記載の方法。 ３５．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が５から７ のヌクレオチド長である請求項第３４項に記載の方法。 ３６．該オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、１ １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９からなる群より選択 される請求項第２２項に記載の方法。 ３７．組織または細胞とヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまた はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含む オリゴヌクレオチドを接触させ、およびＨ−ｒａｓ遺伝子が存在するかどうかを 検出することからなる細胞または組織中のＨ−ｒａｓ遺伝子の存在の検出法。 ３８．該オリゴヌクレオチドがヒトｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コ ドンと特異的にハイブリダイズしうる請求項第３７項に記載の方法。 ３９．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが硫 黄含有修飾を含む請求項第３７項に記載の方法。 ４０．硫黄含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第３９項に記載の方 法。 ４１．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の少なくとも１つが２′位で修飾 されている請求項第３７項に記載のオリゴヌクレオチド。 ４２．２′位での該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾で ある請求項第４１項に記載の方法。 ４３．該オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの基質であり、およびヌクレアーゼ 耐性を促進するために少なくとも１つの修飾を、および該ｒａｓＤＮＡまたはｍ ＲＮＡへの親和性を促進するために少なくとも１つの修飾を含む請求項第３７項 に記載の方法。 ４４．該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して安定化され、および標的親 和性を促進するために修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを持つ第１の領 域およびＲＮアーゼＨの基質である第２の領域を含むキメラオリゴヌクレオチド である請求項第３７項に記載の方法。 ４５．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域に標的親和性 を促進するために修飾された領域が隣接する請求項第４４項に記載の方法。 ４６．標的親和性を促進するために修飾されているキメラオリゴヌクレオチドの 領域が２′位で修飾されたヌクレオチドを含む請求項第４４項に記載の方法。 ４７．２′位でのヌクレオチドの修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フ ルオロ修飾である請求項第４６項に記載の方法。 ４８．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域が２′−デオ キシヌクレオチドを含む請求項第４４項に記載の方法。 ４９．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が４から９ のヌクレオチド長である請求項第４８項に記載の方法。 ５０．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が５から７ のヌクレオチド長である請求項第４９項に記載の方法。 ５１．該オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、１ １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９からなる群より選択 される請求項第３７項に記載の方法。 ５２．組織または細胞とヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまた はｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含む オリゴヌクレオチドを接触させ、および細胞の増殖を抑制させることからなる癌 細胞の増殖抑制法。 ５３．該オリゴヌクレオチドがヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１ ２コドンと特異的にハイプリダイズしうる請求項第５２項に記載の方法。 ５４．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが硫 黄含有修飾を含む請求項第５２項に記載の方法。 ５５．硫黄含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第５４項に記載の方 法。 ５６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の少なくとも１つが２′位で修飾 されている請求項第５２項に記載のオリゴヌクレオチド。 ５７．２′位での該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾で ある請求項第５６項に記載の方法。 ５８．該オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、１ １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９からなる群より選択 される請求項第５２項に記載の方法。 ５９．該オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの基質であり、およびヌクレアーゼ 耐性を促進するために少なくとも１つの修飾を、および該ｒａｓＤＮＡまたはｍ ＲＮＡへの親和性を促進するために少なくとも１つの修飾を含む請求項第５２項 に記載の方法。 ６０．該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して安定化され、および標的親 和性を促進するために修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを持つ第１の領 域およびＲＮアーゼＨの基質である第２の領域を含むキメラオリゴヌクレオチド である請求項第５２項に記載の方法。 ６１．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域に標的親和性 を促進するために修飾された領域が隣接する請求項第６０項に記載の方法。 ６２．標的親和性を促進するために修飾されたキメラオリゴヌクレオチドの領域 が２′位で修飾されたヌクレオチドを含む請求項第６０項に記載の方法。 ６３．２′位でのヌクレオチドの修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フ ルオロ修飾である請求項第６０項に記載の方法。 ６４．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域が２′−デオ キシヌクレオチドを含む請求項第６０項に記載の方法。 ６５．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が４から９ のヌクレオチド長である請求項第６４項に記載の方法。 ６６．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が５から７ のヌクレオチド長である請求項第６５項に記載の方法。 ６７．Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化により生じる病態を持つ動物に、治療に有効 量のヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的 にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド を投与することからなるＨ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化により生じる病態の治療法 。 ６８．該オリゴヌクレオチドがヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１ ２コドンと特異的にハイブリダイズしうる請求項第６７項に記載の方法。 ６９．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが硫 黄含有修飾を含む請求項第６７項に記載の方法。 ７０．硫黄含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第６９項に記載の方 法。 ７１．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の少なくとも１つが２′位で修飾 されている請求項第６７項に記載のオリゴヌクレオチド。 ７２．２′位での該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾で ある請求項第７１項に記載の方法。 ７３．該オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、１ １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９からなる群より選択 される請求項第６７項に記載の方法。 ７４．該オリゴヌクレオチドがヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の活性型第１２コドンと特 異的にハイブリダイズしうる請求項第６７項に記載の方法。 ７５．該オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：３、４、５、６、１１、１２、１ ３、１４、１５、１６、１７または１８を含む請求項第７４項に記載の方法。 ７６．該オリゴヌクレオチドが活性型ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子を選択的に抑制する 請求項第６７項に記載の方法。 ７７．該オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：３、４、１３、１４、１５、１６ および１７からなる群より選択される請求項第７６項に記載の方法。 ７８．該オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの基質であり、およびヌクレアーゼ 耐性を促進するために少なくとも１つの修飾を、および該ｒａｓＤＮＡまたはｍ ＲＮＡへの親和性を促進するために少なくとも１つの修飾を含む請求項第６７項 に記載の方法。 ７９．該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して安定化され、および標的親 和性を促進するために修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを持つ第１の領 域およびＲＮアーゼＨの基質である第２の領域を含むキメラオリゴヌクレオチド である請求項第７８項に記載の方法。 ８０．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域に標的親和性 を促進するために修飾された領域が隣接する請求項第７９項に記載の方法。 ８１．標的親和性を促進するために修飾されたキメラオリゴヌクレオチドの領域 が２′位で修飾されたヌクレオチドを含む請求項第７９項に記載の方法。 ８２．２′位でのヌクレオチドの修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フ ルオロ修飾である請求項第８１項に記載の方法。 ８３．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域が２′−デオ キシヌクレオチドを含む請求項第７９項に記載の方法。 ８４．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が４から９ のヌクレオチド長である請求項第８３項に記載の方法。 ８５．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が５から７ のヌクレオチド長である請求項第８４項に記載の方法。 ８６．活性型Ｈ−ｒａｓを含んでいると疑われる細胞または組織を配列ＩＤ番号 ：３、４、１３、１４、１５、１６または１７を含むオリゴヌクレオチドと接触 させ；および細胞または組織の同−の試料を配列ＩＤ番号：１、２、５、７、１ ８または１９を含むオリゴヌクレオチドと接触させることからなる活性型Ｈ−ｒ ａｓに対する特定のオリゴヌクレオチドの異なった親和性に基づく活性型Ｈ−ｒ ａＳの検出法。 ８７．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド単位間の結合基の少 なくとも１つが硫黄含有修飾を含む請求項第８６項に記載の方法。．８８．硫黄 含有修飾がホスホロチオエート修飾である請求項第８７項に記載の方法。 ８９．オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド単位の少なくとも１ つが２′位で修飾されている請求項第８６項に記載のオリゴヌクレオチド。 ９０．２′位での核修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾で ある請求項第８９項に記載の方法。 ９１．該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＲＮアーゼＨの基質であり、お よびヌクレアーゼ耐性を促進するために少なくとも１つの修飾を、および活性型 Ｈ−ｒａｓＤＮＡまたはｍＲＮＡへの親和性を促進するために少なくとも１つの 修飾を含む請求項第８６項に記載の方法。 ９２．該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがヌクレアーゼに対して安定化さ れ、および標的親和性を促進するために修飾された少なくとも１つのヌクレオチ ドを持つ第１の領域およびＲＮアーゼＨの基質である第２の領域を含むキメラオ リゴヌクレオチドである請求項第８６項に記載の方法。 ９３．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域に標的親和性 を促進するために修飾された領域が隣接する請求項第９２項に記載の方法。 ９４．標的親和性を促進するために修飾されているキメラオリゴヌクレオチドの 領域が２′位で修飾されたヌクレオチドを含む請求項第９２項に記載の方法。 ９５．２′位での修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−Ｏ−フルオロ修飾であ る請求項第９４項に記載の方法。 ９６．ＲＮアーゼＨの基質であるキメラオリゴヌクレオチドの領域が２′−デオ キシヌクレオチドを含む請求項第９２項に記載の方法。 ９７．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が４から９ のヌクレオチド長である請求項第９６項に記載の方法。 ９８．キメラオリゴヌクレオチドの２′−デオキシヌクレオチド領域が５から７ のヌクレオチド長である請求項第９７項に記載の方法。 ９９．オリゴヌクレオチド配列および野生型ｍＲＮＡ配列との間で少なくとも１ つの不適正を生じるであろう配列を持ち、適正なおよび不適正なＲＮＡとのオリ ゴヌクレオチド結合の自由エネルギー差が１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな突然変 異体標的ｍＲＮＡへの結合のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。 １００．該自由エネルギー差が２ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい請求項第９９項に 記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 １０１．該自由エネルギー差が約５から約６ｋｃａｌ／ｍｏｌである請求項第１ ００項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 １０２．オリゴヌクレオチド配列および野生型標的ｍＲＮＡとの間に少なくとも １つの不適正塩基対があるように選択された配列を持ち、該不適正が標的ｍＲＮ Ａのグアニン塩基以外の塩基とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内の位置 に位置している突然変異体標的ｍＲＮＡへの結合のためのアンチセンスオリゴヌ クレオチド。 １０３．配列ＩＤ番号：１、２、３、４、５、６、７、１１、１２、１３、１４ 、１５、１６、１７、１８および１９からなる群より選択される配列を持つ請求 項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。 １０４．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子を含む組織または細胞と配列ＩＤ番号：２または 配列ＩＤ番号：３を持つオリゴヌクレオチドを接触させることを含むヒトＨ−ｒ ａＳ遺伝子発現の調節法。 １０５．癌細胞と配列ＩＤ番号：２または配列ＩＤ番号：３を持つオリゴヌクレ オチドを接触させることを含む癌細胞の増殖抑制法。 １０６．Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化により生じる病態を持つ動物と治療的に有 効量の配列ＩＤ番号：２または配列ＩＤ番号：３を持つオリゴヌクレオチドを接 触させることを含むＨ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化から生じる病態の処置法。 １０７．ｒａｓ遺伝子がヒトＨ−ｒａｓである請求項第１０項に記載のキメラオ リゴヌクレオチド。 １０８．ｒａｓ遺伝子がヒトＫｉ−ｒａｓである請求項第１０項に記載のキメラ オリゴヌクレオチド。 １０９．配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列 ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３ ２および配列ＩＤ番号：３３から成る群より選択される配列を持つ請求項第１０ ８項に記載のキメラオリゴヌクレオチド。 １１０．ヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと 特異的にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレ オチド。 １１１．ヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子の５′−非翻訳領域、３′−非翻訳領域、第１ ２コドンまたは第６１コドンと特異的にハイブリダイズしうる請求項第１１０項 に記載のオリゴヌクレオチド。 １１２．ヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つにホスホロチオエ−ト修 飾を含む請求項第１１０項に記載のオリゴヌクレオチド。 １１３．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ２′位で修飾されている請求項第１１０項に記載のオリゴヌクレオチド。 １１４．２′位の該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′−フルオロ修飾である 請求項第１１３項に記載のオリゴヌクレオチド。 １１５．配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列 ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３ ２および配列ＩＤ番号：３３から成る群より選択される配列を持つ請求項第１１ ０項に記載のオリゴヌクレオチド。 １１６．ヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子を含む組織または細胞とヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝 子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる ８から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドを接触させ、および遺伝 子の発現を調節することからなるヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子発現の調節法。 １１７．オリゴヌクレオチドがヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子の５′−非翻訳領域、３ ′−非領翻訳域、第１２コドンまたは第６１コドンと特異的にハイブリダイズし うる請求項第１１６項に記載の方法。 １１８．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ホスホロチオエート修飾を含む請求項第１１６項に記載の方法。 １１９．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ２′位で修飾されている請求項第１１６項に記載の方法。 １２０．オリゴヌクレオチドの２′位の該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′ −フルオロ修飾である請求項第１１９項に記載の方法。 １２１．オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列 ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３ １、配列ＩＤ番号：３２および配列ＩＤ番号：３３から成る群より選択される配 列を持つ請求項第１１６項に記載の方法。 １２２．細胞または組織とヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡ またはｍＲＮＡと特異的にハイプリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を 含むオリゴヌクレオチドを接触させ、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子が存在するかどうかを 検出する細胞または組織中のＫｉ−ｒａｓ遺伝子の存在の検出法。 １２３．オリゴヌクレオチドがヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子の５′−非翻訳領域、３ ′−非翻訳領域、第１２コドンまたは第６１コドンと特異的にハイブリダイズし うる請求項第１２２項に記載の方法。 １２４．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ホスホロチオエート修飾を含む請求項第１２２項に記載の方法。 １２５．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ２．位で修飾されている請求項第１２２項に記載の方法。 １２６．オリゴヌクレオチドの２′位の該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′ −フルオロ修飾である請求項第１２５項に記載の方法。 １２７．オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列 ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３ １、配列ＩＤ番号：３２および配列ＩＤ番号：３３から成る群より選択される配 列を待つ請求項第１２２項に記載の方法。 １２８．組織または細胞とヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡ またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を 含むオリゴヌクレオチドを接触させ、および細胞の増殖を抑制させることからな る癌細胞の増殖抑制法。 １２９．オリゴヌクレオチドがヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子の５′−非翻訳領域、３ ′−非翻訳領域、第１２コドンまたは第６１コドンと特異的にハイブリダイズし うる請求項第１２８項に記載の方法。 １３０．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ホスホロチオエート修飾を含む請求項第１２８項に記載の方法。 １３１．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ２′位で修飾されている請求項第１２８項に記載の方法。 １３２．オリゴヌクレオチドの２′位の該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′ −フルオロ修飾である請求項第１３１項に記載の方法。 １３３．オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列 ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３ １、配列ＩＤ番号：３２および配列ＩＤ番号：３３から成る群より選択される配 列を持つ請求項第１２８項に記載の方法。 １３４．Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化により生じる病態を持つ動物に、治療に 有効量のヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはｍＲＮＡと 特異的にハイブリダイズしうる８から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレ オチドを投与することからなるＫｉ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化により生じる病態 の治療法。 １３５．オリゴヌクレオチドがヒトＫｉ−ｒａｓ遺伝子の５′−非翻訳領域、３ ′−非翻訳領域、第１２コドンまたは第６１コドンと特異的にハイブリダイズし うる請求項第１３４項に記載の方法。 １３６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ホスホロチオエート修飾を含む請求項第１３４項に記載の方法。 １３７．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ２′位で修飾されている請求項第１３４項に記載の方法。 １３８．オリゴヌクレオチドの２′位の該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′ −フルオロ修飾である請求項第１３７項に記載の方法。 １３９．オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列 ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３ １、配列ＩＤ番号：３２および配列ＩＤ番号：３３から成る群より選択される配 列を持つ請求項第１３４項に記載の方法。 １４０．活性型Ｋｉ−ｒａｓを含んでいると疑われる細胞または組織を配列１Ｄ 番号：３２を含むオリゴヌクレオチドと接触させ；および細胞または組織の同− の試料を配列ＩＤ番号：２０、２１、２２、２６、２８、３１または３３を含む オリゴヌクレオチドと接触させることからなる活性型Ｋｉ−ｒａｓに対する特定 のオリゴヌクレオチドの異なった親和性に基づく活性型Ｋｉ−ｒａｓの検出法。 １４１．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ホスホロチオエート修飾を含む請求項第１４０項に記載の方法。 １４２．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少なくとも１つが ２′位で修飾されている請求項第１４０項に記載の方法。 １４３．オリゴヌクレオチドの２′位の該修飾が２′−Ｏ−アルキルまたは２′ −フルオロ修飾である請求項第１４２項に記載の方法。