JPH07508885A

JPH07508885A - コレラワクチンとしての欠失変異体

Info

Publication number: JPH07508885A
Application number: JP6503412A
Authority: JP
Inventors: ジョーンジェーメカラノス; デビッドビッティー; ケビンキリーン; イッヒェンルー
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1992-07-06
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2023-11-12
Also published as: EP0672116B1; BR9306707A; EP0672116A4; DE69333028D1; CA2139655A1; PT672116E; DK0672116T3; TW266228B; ATE242319T1; AU4660893A; EP0672116A1; CA2139655C; MX9303992A; ES2199944T3; JP2004159660A; US5631010A; DE69333028T2; ZA934736B; WO1994001533A1; CN1083524A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

コレラワクチンとしての欠失変異体発明の１Ｙ景本発明の分野はビブリオ・コレラ　ワクチンである。１００年以上のコレラの研究の後、効果的なコレラワクチンの必要が残っている。“古典的“な生物型に属するとブリオ・コレラの株により起こされたこの疾患の６度の汎発性流行があった。現在（第７）汎発性流行の病原体は“エルトール°生物型に属する（ＦＬ９７−１０９８．１９９１）。近年、第７汎発性流行が新たな場所、南アメリカの地に及んでいる。１９９１年の１月に始まり、コレラの流行がペルー、エクアドル、コロンビア、およびチリにおいて２５０，０００以上の症例そして２．　０００名以上の死石を出した。この流行前、主にインド、バングラブシュ、アフリカ、および西アジアにおいて年間２００，０００以上のコレラの症例が起こったと見積もられていた（Ｔａｃｋｅｔら、Ｃｈｏｌｅｒａ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、■ ｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｅｌｌｉｓ、Ｒ，Ｗ、編、Ｂｕｔｔｅｒｗ。ｒｔｈ−Ｈｅｊｎｅｍａｎｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９２）。１９９２年１１月、インドとバングラブシュに抗原的に異なる非ｏｌ型とブリオ・コレラが現われ、８ケ月以内に推定５００，０００の症例と６，０００の死石を出した。血清型０１３９、別名“ベンガル”と命名されたこの新規株の汎発性流行の可能性は確実のようであり、発展途上財界中の新しい懸念の杜である。これら最近の経験は、ビブリオ・コレラのエルトール０１およびベンガル０１３９両血清型による疾患に対する効果的なコレラワクチンの必要性を予告している。コレラの自然感染およびコレラからの回復は、少なくとも３年間は継続する免疫を誘発するので（Ｔａｃｋｅｔら、上記ＨＬｅｖｉｎｅら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。Ｄｉｓ、１４３：８１８−８２０．１９８１ＨＣａｓｈら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。Ｄｉｓ、よ１旦：３２５−３３３．１９７４）、経口投与された場合、その免疫特性において疾患と類似の状態になるが、免疫処置された個体において有害な症状または反応を起こさない（すなわち低い反応産生性を示す）生菌弱毒化コレラワクチンを産生ずるために多くの努力がなされている。この型のワクチンは、コレラ毒素のＡサブユニット、すなわち、この疾患にみられる大部分の下痢の原因であるタンパク質をコードする遺伝子を不活性化する欠失変異を必要とする（Ｍｇ２；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５５：４７７−４８１．１９８７　；Ｔａｙ　ｆｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　６：１５１−１５４．１９８８；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｉｎｆｏ、Ｉｍｍｕｎ、５６：　１６１−１６７＋　１９８８；Ｈｅｒｒ＋ｎｇｔｏｎら、Ｊ、Ｅｘｐｅ　ｒ、Ｍｅｄ、１６８肝１４８７− １４９２゜１９８８；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　ｉ　：４６７−４７０，１９８８；Ｋａｐｅｒら、Ｒｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４１：９０１− ９０６，１９９０；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｒｅｓ、Ｍｉ　ｃ　ｒｏｂ　ｉ　ｏ　１．１４１　：　８９３−８９９゜１９９０）。また本出願の参照文献として編入したＭｅｋａｌａｎｏｓ米国特許第５．０９８．　９９８ｑおよび第４，８８２．２７８号そしてＫａｐｅｒら米国特許第４．９３５，３６４号を参照。経口の死菌仝細胞ワクチンおよびいくつかの生菌弱毒化コレラワクチンが開発されたが、これらの最も有望なものがビブリオ・コレラのエルトール生物型に対してほとんど保護を提供せず、そして０１３９血清型に対しては恐らく保護を提供しない。コレラワクチンに関係した主要な争点は安全性、安定性およびそれらの抗原性の度合である。ビブリオ・コレラの毒素遺伝子に関して、毒素産生株と毒素非産生株との遺伝的多様性がＣｈｅｎら（１９９１，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、Ｉｎｆｅｃｔ、１０７：２２５）により調べられている。Ｍｅｋａｌａｎｏｇ（１９８３，Ｃｅ１１　３５：２５３）はビブリオ・コレラ毒素遺伝子のｆｆｉ複および増幅に関して報告しており、Ｍｉｌｌｅｒら（１９８４，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１　：　３４７１）は；Ｘ遺伝学の転写調節を論じている。他のビブリオ・コレレ遺伝子（その産物がこの生物の病原性に役割を果たしている）は毒素とともに調節されている綿毛遺伝子（Ｓｈａｗら、１９９０．Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５８：３０４２；Ｓｈａｒｍａら、１９８９．Ｖａｃｃｉｎｅ、７：４５１；Ｓｕｎら、１９９０．Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６１：１２３１；Ｈａｌｌら、１９９１．　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５９：２５０８；Ｔａｙｌｏｒら、］９８７．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：２８３３）および腸内定着因子をコードする遺伝子（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８．Ｖａｃｃｉｎｅ　６：１５１）を含む。発明の要約本発明はコレラに対し免疫学的保護を誘発する生菌経口ワクチンとして有用である毒素非産生性で遺伝学的に安定なビブリオ・コレラ変異株を特徴としている。＆異味は機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠き、またいかなる機能性のａｔｔＲ５１配列も欠いている遺伝子操作された変異体である。ａｔｔＲ３１配列とは、ＣＴＸ逍伝因子の組み換えおよび増幅に８蟹であるＣＴＸ遺伝因子内に含まれる１７塩ＪＡ＆、Ｉの配列または、そのような組み換えおよび増幅をｉ’Ｊ能にするために充分なその配列を意味する。゛いかなる機能性のａｔｔＲ５１配列も欠いている“変異体はａｔｔＲｓ１含有伝播体との効果的な部泣特異的組み換えを実質的に行うことができないものである。なぜなら、野生型ａｔｔＲ３１配列が全て欠失されているか、またはそのような組み換えを防ぐために充分に欠失されているか、または変異されているからである。その結果、本発明によるビブリオ・コレレ株は、それらがｃｔｘＡをコードするＤＮＡを含む野生型ａｔｔＲ５１含ｈ゛伝播体と組み換えできないので、より安全である。本発明はまた上二己のビブリオ・コレレ株を作成する方法を特徴としている。本１５法は、ｃｔｘＡおよびａｔｔＲ３１配列に変異を含むビブリオ・コレラＤＮＡの断片を含むプラスミドの野生型ビブリオ・コレラへの導入を必要とする。ビブリオ・コレラＤＮＡ断片は生物体内で野生型ビブリオ・コレラＤＮＡと組み換えを行い変異株を作成できる。ビブリオ・コレラのどの血清型も用いることができるが、好ましい実施態様において、ビブリオ・コレラの変異株はエルトール血１１７Ｍに属し、さらに好ましくは、イナバまたはオガワ血清型またはビブリオ・コレラ非０１血清型、好ましくは０１３９“ベンガル血清型である。好ましくは、変異体はＣＴＸコアおよびａｔｔＲ５１配列の全てを欠いており、さらに好ましくは、変異株はペルー２、バング２、バー２または下ス己のベンガル２（“バング２”）またはベンガル３（゛ベンダ３゛）のようなベンガル血清型の弱毒誘導体である。本発明による変異株は安全性および／またはワクチンの免疫原性を改善するために導入されたさらに別の変異を選択的に含む。そのような更に別の変異は、例えば、株にコードされているｒｅｃＡ遺伝子のようなりＮＡ組み換えに必要な１以上の遺伝子の不活性化した株およびビブリオ・コレラ染色体、好ましくはビブリオ・コレラのＩａｃＺ遺伝子に導入されるさらに別の遺伝子の導入した株を含むがこれらに限定されない。好ましいさらに別の遺伝子は、ビブリオ・コレラのＢサブユニットまたはンガ様毒素のＢサブユニットのような任意の異種抗原をコードする遺伝子、またはＥ、ｃｏｌｉ　ＣＦＡ抗原または抗原性ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子を含む。異種抗原とはビブリオ・コレラにより通常発現されない任意の抗原を意味する。例えば、異種抗原はシゲラリボ多糖（ＬＰＳ）抗原、シガ毒素、毒素原性大腸菌株の種々のＣＦＡ抗原、炭痘毒素、シュードモナス内毒素Ａ、Ｉ（ＩＶキャプシド、百日咳毒素、破傷風毒素からの抗原性断片；ヘルペスウィルス、風疹ウィルス、インフルエンザウィルス、おたふくかぜウィルス、麻疹ウィルス、ポリオウィルスからの抗原；そしてマラリア、ススーモシスチス肺炎およびトキソプラズマ症を生じるＱＢ生物寄生体からの免疫原性ポリペプチドであり、ビブリオ・コレラ生ワクチンにおいて発現される。好ましくは、さらに別の変異を６する変異種はペルー１４、ペルー３、ペルー４、ペルー５、゛バング３、バング５、バー３、バー４、バー５またはベンガルの弱毒化誘導体である。ｃｔｘＡサブユニットとは、機能している場合、コレラの多くの症状（例えば、悪心、下痢、その他）の原因となるコレラ毒素のＡサブユニットを意味する。最も好ましくは、株はいわゆる“コア遺伝因子１全体、すなわち下記により詳細に記載される、ｃｔｘＡ／ＢだけでなくＩＣＦ（腸内定着因子、恐ら＜ＣＥＰ”ピリンをコードしたコア“と同等）およびＺＯＴとして知られている領域の欠失も含む。他の態様において、本発明は、コレラに対して免疫学的保護を誘発するための生菌経口ワクチンとして有用である毒素非産生性の遺伝的に安定なとブリオ・コレラ変異株を特徴としている。変異株は機能性ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠く遺伝子操作された変異体である。株は、また軟寒天侵入欠損株である。軟寒天侵入欠損とは粘性の高い培地に侵入する能力を欠くことを意味し、０．２５−０．４％の寒天である寒天培地上および培地内を遊走させることによりｉｎ　ＶｉｔｒＯで測定される。好ましい株はまた、線状、すなわち対数増殖の条件下で２５％以上の細胞が１５０Ｍ長よりも長い株である。好まＬ７い実施態様において、株はまたＡＴＴ−である。好ましい実施態様において、本発明は、機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠き、かつ軟寒天侵入欠損株でもある毒素非産生性の遺伝的に安定な変異体であるビブリオくルレの少なくとも２つの異なる株から成るワクチンを含む。２つの株のうちひとつは、好ましくはペルー株から得られ、他のひとつはベンガル株から得られる。本発明はまた成分株のそれぞれがｃ　ｔ　ｘ”−１ａｔｔ−ｌおよびｒｅｃＡ−であるワクチンを含む。関係する地方の流行病により、ワクチン株は単一用量でいっしょに、またはさらに好ましくは別々に７−２８０間隔をおいて投与される。ひとつの血清型だけが疾患の脅威を示す場所では、ひとつの株だけからなるワクチン処方を施すことが好ましい。本発明は、少なくとも株の２つが異なる血清型であり、混合物中の全ての株が機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠いている少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株からなる死菌経口コレラワクチンも特徴とする。ワクチンは血清型の少なくともひとつにより産生されるコレラ毒素Ｂサブユニ・ノドも含んでいる。好ましくは、ワクチン中の血清型のひとつはオガワ血清型であり、他の血清型はイナバ血清型である。最も好ましくは、死菌経口ワクチンは下記に定義しているように、バー３およびペルー３かまたはバング３、またはペルー３およびバング３の両名から成る。どんな経口ワクチンの組み合わせも下記に定義されるようにベンガル２とベンガル３を含むベンガル血清型の細胞を含んでいる。株は中独で、共に、または７−２８日間隔をおいて連続用量で投与される。本発明は死菌ビブリオ・コレラワクチンを生成する方法も特徴とする。本方法は、混合物中の６抹が機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠いている、少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株の増殖を必要とする。続いて、株を増殖培地から採収し、細胞を殺す。株を繁殖した培地から株の少なくともひとつにより産生されたコレラ毒素Ｂサブユニットを得、殺した細胞に加える。続いて死菌とコレラ毒素Ｂサブユニットの混合物を生理的に許容される担体に懸濁する。上記のような変異体はコレラワクチンとして有用であり、以前のワクチンと比較してそれらの遺伝的特性において改善されている。本発明の他の特徴および利点は次の本出願の好ましい実施態様の記載および特許請求から明らかであろう。発明の詳細な説明４、

【図面の簡単な説明】

４面図１は１１ヨ素産生ビブリオ・コレレ株Ｐ２７４５９−３ｍ、Ｃ６７０９−９ｍおよびＥ７Ｑ４６−３ｍのＣＴＸ逍伝因子の略図である。網１］で満たされたボツクスはＲ３Ｉ配列を表ず。Ｒ３Ｉ配列間にはｃ　ｔ　ｘＡＢ遺伝子およびｚｏｔ、腸内定着因子（ＩＣＦ）をコードする遺伝子を含む、網目のないボックス（コア領域と呼ぶ）として示されている領域がある。Ｒ８１配列の末端は円に斜線が入っており１７塩基対配列ａ　ｔ　ｔＲ３１（ＣＣＴＡＧＴＣ；ＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴ）［配列番号１］と１７塩基中１６が一致する配列のコピーを表す。Ｒ５Ｉおよびコア領域のコピー数に基づくと３つの株のＣＴＸ因子はその構造において異なるが、これらの因子はビブリオ・コレラの全てのエルトール株において同じ染色体の部位に挿入されることに注目されるべきである。図２（Ａ）　図１に略図で示されたＣＴＸ因子を有するＣ６Ｃ６７Ｏ９−５からのＣＴＸ領域を含む染色体の制限地図である。示されていないのは、図１に略図で示されているＣＴＸ囚子のコアまたはＲ３Ｉ配列内に位置している部位に観察される変異を除いては同じであるＰ２７４５９−３ｍおよびＥ７９４６−５ｍ株の制限地図である。（Ｂ）バング１、バー１およびペルー１株の対応する染色体領域の制限地図。図３（Ａ）　図１に略図で示したＣＴＸ囚子を存するＰ２７４５９−５ｍ株からのＣＴＸ領域を含む染色体に対応するＤＮＡ断片を担ｒ！ルでいるプラスミドｐＧＰ６０の制限地図。制限地図の下の２つの矢じりはプラスミドｐＡＲ６２において欠失されているＤＮＡを指摘している。（Ｂ）プラスミドｐＧＰ６０にクローニングされた領域の外側に位置している制限部位を含むＰ２７４５９−５ｍ株のＣＴＸ領域の制限地図を示す。（Ｃ）親株Ｃ６７０９−８ｍ％Ｐ２７４５９− ５ｍおよびＥ７９４６−５ｍから、それぞれの欠失変異体ペルー２、ノ（ング２、そしてバー２を生成するタイプ２欠失を生じるプラスミドｐＡＲ６２と染色体間の組み換え事象（破線）の表示。（Ｄ）ペルー２、ノ〈ング２およびノく一２株の染色体の制限地図。図４はプラスミドｐＧＰ５２の構築の略図表示である。図５はｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２の作成の略図表示である。プロモーターのないＢサブユニットをコードする０、６ｋｂ断片をＰＣＨにより生成した。このＤＮＡをｐｃＲｌｏｏに連結し、５ｐｅｌ／ＥｃｏＲ＋を用いて消化した。ｉ１７られた０、６ｋｂ制限処理断片をＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ消化したｐＶｃｌｏｏとｐＲＴ４１ベクターに連結し、それぞれｐＪＭｌｏｏｌおよび９１Ｍ４１１を得た。６ブラスミドをＢａｍＨ１／ＥｃｏＲＩで消化し、フレノウで処理し、Ｘｂａｌリンカ−を側面に結合し、そしてＸｂａｌで消化した。精製された断片をＸｂａｌ消化ｐＧＰ８４に連結し、ｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２を得た。図６はｃｔｘＢの染色体への挿入の略図表示である。非複製ｐＪＭ８４．１を相同的組み換えによりペルー２、バング２または、（−２に組み込んだ。続０てアンピンリン耐性１（１み換えコロニーをアンビンリンを含まずストレプトマイシンを含む（従って、アンビンリン耐性に対する選択圧力を減らす）培地１こ塗布しｔ二。ｉ′７られたアンピンリン感受性コロニーを単離し、相同ｒｅｃＡ　ＤＮＡ配列Ｃ；より隣接されるＤＮＡ間の欠失を選択した。本発明はコレラおよび可能性のある他の疾患に対して個体を保護するために、生菌、または死菌経口ワクチンとして用いることができる弱毒化ビブリオ・コレレ株を特徴としている。ワクチンの構築１９９１年にペルーにおけるコレラ患者から単離されたビブリオ・コレレ株Ｃ６７０９−５ｍの弱毒化誘導体（生菌経口コレラワクチンとして用いることができる）が構築されている。誘導体ペルー１およびペルー２は、コレラ毒素と関係のない腸内定着因子（ＩｃＦ）、ｚｏｔをコードしているＤＮＡに加えて、コレラ毒素をコードしているＤＮＡを取り除いている小さなタイプ１（コア）および大きなタイプ２欠失をそれぞれ担持している。過剰な腸内足前が初期の原型の生コレラワクチンを投与されたヒトにおいてみられた６害な副作用の原因なので、ペルー１およびペルー２においてコレラ毒素およびＩＣＦ両方をコードしている遺伝子の欠失は、これらの株を、披接種者においてその免疫原性と、その結果保３ＰＩ性を保持しながら、より少ない反応産生性にしている。ペルー２に存在する大きなタイプ２欠失は、ＣＴＸ遺伝因子と呼ばれる、より大きなりＮＡ上セグメント一部として２以上のコピーに存在しているＲ３Ｉと呼ばれる挿入片のような配列も取り除いている。Ｒ５１配列は、高頻度でｆｆｌｆｆ１でき、ビブリオ・コレラ染色体のａｔｔＲ３１と呼ばれる１７塩基対のターゲット部位にＣＴＸ因子の挿入を生じる部位特異的組み換え系をコードしている。ａｔｔＲ５１とほぼ同じ（そして、明らかに組み換え活性が全く同じ）配列がＲ５Ｉ配列の末端に存在している。これらの配列は下記のようである。ａｔｔＲ５１およびフランキング染色体配列：５−−ＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＴ−３’［配列番号２］ＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＣＡＴ、、、Ｒ５１，、、−３−［配列番号３］〔配列番号４］ＲＳＩの末端に存在するａｔｔＲ３１および類似の配列に下線を引く。ＲＳＩの左端のａｔｔＲ５１と同じである１７Ｉｉ；Ａ！配列、ａｔｔＲ５１と１７／１８塩基に・１適合する１８塩基対配列だけの重複を付し、ａｔｔＲ５１に隣接する染色体配列がＲＳＩの左側と右側に存在することに注口する。遺伝子操作された生菌弱毒化コレラワクチンは、それらが復帰できないが、ないしはコレラ毒素を産生する能力を回復できない場合のみ理論的には安全である。ａｔｔＲ５１配列のただひとつのコピーだけを担持する株はＰ因子接合またはバクテリファージの形質導入によるＤＮＡ導入を通してＣＴＸ因子の新しいコピーを効率的に獲得できる。従って、ビブリオ・コレラからＲＳＩおよびａｔｔＲ５１配＋１１を全＋１１す欠失は、ワクチン株がその自己の部位特異的組み換え系を通して自然におけるＣＴＸ遺伝因子を再獲得することを防ぐことができる。そのような欠失はペルー２株およびその誘導体に存在している。類似であるが同じではない特性を白するビブリオ・コレラの６つの変異株を構築した。ペルー１およびペルー２株と同じ２つの型の欠失（タイプ１およびタイプ２）を担持する４つの株をパングラデンユ（Ｐ２７４５９−３ｍ）およびバーレーン（Ｅ７９４６−５ｍ）の患者から単離したビブリオ・コレレ株に構築した。これらの４つの誘導体、バング１、バング２、バー１およびバー２も、それらが定容性および／または他の特性（例えば血清型）において異なり、従ってそれらが世界の他の地域においてワクチンとして用いるために対応するペルー株よりも、より適している可能性があるので本発明の対象である。ペルー１、バング１およびバー１の３株に存在するより小さなタイプ１欠失は全てのＲ５Ｉコピーを取り除いていないが、この特定の欠失はペルー２、バング２およびバング２に存在するより大きな欠失よりもいくつかのこれらの株の腸内定る特性に、より過酷な影響を与える。タイプ２欠失変異体の構築タイプ２欠失はＲ３Ｉ配列およびａｔｔＲ３１配列の全てのコピー（図１）を含むＣＴＸ；！ｉ伝囚子に対応する全ての配列を取り除く。タイプ２欠失をビブリオ・コレラの染色体と図３に示すプラスミドｐＡＲ６２にクロン化されたプラスミド配列との間の組み換えにより構築した。プラスミドｐＡＲ６２はプラスミドｐＧＰ６０の誘導体であり、図３に示すＨＬｎｄｌｌｌ断片を欠失したタイプ２欠失を担ｔ！ルテイル。プラスミドｐＧＰ６０１４．２Ｏ−３０ｋｂの５ａｕ３Ａ１分子ｆｉ化断Ｌ１をプラスミドｐＬＡＦＲ２（Ｆ　ｒ　ｉｅｄｍａｎら、１９８２．Ｇｅｎｅ１８：２８９）のＢａｍＨ１部位に挿入することにより、初めにＰ２７４５９株のゲノムライブラリーを作成することにより構築された。コロニーをｃｔｘ領域（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、１９８３．Ｃｅ１ｌ　３５：２５３）から得られたプローブを用いてハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。陽性のコロニーを採取しそこから単離されたプラスミドをｐＧＰ６０と命名した。このプラスミドの制限酵素分析により、それが全てのＣＴＸ因子配列および付加的なフランキングＤＮＡを含んでいることを確認した。プラスミドｐＡＲ６２はテトラサイクリンへの耐性をコードしている。このプラスミドを接合またはエレクトロポレーションによりビブリオ・コレレ株に導入し、続いて３μｇ／ｍ＋のテトラサイクリンを含む培地で選択した。続いて、そのようなプラスミドを担持する株をＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５ニア２３−７３１．１９８６）に記載されたように調製した放射性Ｌ−３プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。染色体に挿入されたタイプ２欠失を担持しているコロニーはＬ−３プローブにハイブリッド形成せず、驚くことに、高い開度で発生した（すなわちスクリーニングされたコロニーの約１％）。サザンブロソト分析を用いて、これらの株に予想された欠失の存在を確認した。゛コア欠失”はＣＴＸ因子のコアに対応する配列だけを取り除きＲ３Ｉ因子のコピーは染色体上にそのまま残しておく　（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５ニア２３−７３１．１９８６）（図２）。これらの欠失は図２に示すコア領域の右側と左側に位置するＲ５Ｉ配列間のｔ目間的組み換えにより自然発生的に起こる。コア欠失を含むビブリオ・コレラのコロニーは２つの方法で同定できる。第一に、株がコア領域にｔＩｐ人されたカナマイシン耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカーを担持していれば、その場合コア欠失によりそのような株はカナマイシンに対して感受性になる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、工旦旦　７２３−７３１．１９８６）、第二に、またこの欠失をｉＩＪ持している株にハイブリッド形成しない放射性ＣＴ−１プローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより、コア欠失を含むコロニーは同定できるＣＧｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６旦：　７２３−７３１゜１９８６）。どちらの方法でも、これらの欠失を担持するコロニーはスクリーニングされた１０００のコロニーに付き約１個の開度て起こる。続いて、サザンブロソトハイプリダイゼーションによる分析を用いて、これらの株における予想された欠失を確認した。プラスミドｐＧＰ５２の和み込みに基づく機能性ａｔｔＲ３１配列のアッセイプラスミドｐＧＰ５２はＳ　Ｍ　１０λｐｉｒのようなＥ、ｃｏｌｉｌｉにおいてのみ複製可能である自殺プラスミドであるＣＰｅａｒｓｏｎら、１９９０．Ｒｅｓ。ｋｌｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４１　：８９３）ｏプラスミドルＣ，Ｐ５２は、初めにプラスミドｐＧＰ７（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、１９８３．Ｃｅ１ｌ　３５：２５３）をＣ１ａｌと５ｐｈｌで消化することにより構築された。このプラスミドはビブリオ・コレラｉＥ７９４６−９ｍから（ｌＪられた２つのＲ５Ｉ配列（ＲＳＩおよびＲ５２と呼ぶ）を含む。Ｒ５１配列を含むＤＮＡの断片をｐＢＲ３２２にクローニングし、ｉ′７られるプラスミドをｐＧＰ２０と命名した。続いて、このプラスミドをＥｃｏＲＶ（Ｒ３Ｉ配列内で切断する）で消化した。このプラスミドを再連結した時、ハイブリッドＲ５２配列がコア配列により隣接されているＲ５２”と呼ばれるＲ５２のハイブリット型を含むｐＧＰ２０Ｒと呼ぶ新規プラスミドを生成した。続いて、Ｒ３２の５ｓｐｌ−３ｐｈｌ断片をＮｒｕｌおよび５ｐｈｌで消化された自殺プラスミドｐＪ〜１７０３．１にサブクローニングした。プラスミドｐＪＭ７０３．１はＭｉｌｌｅｒら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。ＵＳＡ　８１：３４７１）に記載されている。得られるプラスミドをｐＧＰ５２と呼ぶ。ｐＧＰ５２の構築を記載する図を図４に示す。ｐＧＰ５２を、ａｔｔＲｓ１配列を含むビブリオ・コレレ株に接合により導入する場合、それは染色体のａｔｔＲ３１配列とプラスミドに存在するａｔｔＲ５１配列との間の部位特異的組み換え事象によりビブリオ・コレラ染色体に組み込まれる。このような組み込み事象は、アンピンリンに対する耐性がｐＧＰ５２によりコードされているのでアンピシリン耐性を安定的に維持している（すなわち、選択されない）コロニーの数をδＰ１定することにより定量化できる。組み込みの確認はサザンブロソトハイプリダイゼーション実験において得られる。検査されるビブリオ・コレレ株が機能性ａｔｔＲ９１配列を有していれば、その場合組み込みは検査で観察される。株が機能性ａｔｔＲ５１配列を含んでいなければ、組み込みは起こらない。ｐＧＰ５２のレシピエンドとして働く種々のワクチン候補の能力を評価するために、下記の実験を行った。ひとつの培養につき、６株からの細胞１度１０７のルリアブロス５ｍｌ中でドナーＥ、ｃｏ　Ｉ　４４２５Ｍ１０λｐｔｒ　ｐＧＰ５２をレシピエンドのビブリオ・コレレ検査ワクチン株と混合した。混合物を３７ ℃で５時間インキュベートし、５時間の時点でそれを１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む新たなルリアブロスに入れて１　：　１００に希釈した。ストレプトマイシンの目的はＥ、ｃｏｌｉドナー株を殺すことにより、それを淘汰することである。従って、ストレプトマイシン耐性ビブリオ・コレレレシピエント株だけが増殖可能である。この培養物を細胞の成長速度が飽和に達するまでインキュベートシた。培養物を再び希釈し、各細胞がｐＧＰ５２のための、いかなる°陽性選択の非存在下でも合計２０回複製するまでさらにインキュベートした。続いて、生ａ能力のあるコロニー数を定量化するために、この培養物を希釈し、２つの別個の培地組成物に塗布した。これらの培地のうちひとつは、いかなる抗生物質も含まないルリアブロスである。これらのプレートに現れるコロニーの数は培養物中の総細胞数を示す。他の培地はアンビンリンを含むルリアブロスである。これらのプレートに現れるコロニーの数は接合の後起こる組み込み事象の数を示す。結果は、安定的組み込み事象／生存可能な細胞の総数、の比率として表わされ、下記の表１に示す。ペルー企　検出なしく＜　５　Ｘ　１０’）ペルー３　検出なしく＜　５　Ｘ　１０’）ペルー４　検出なしく＜　５　Ｘ　１０’）ペルー５　検出なしく＜　５　Ｘ　１０’）これらのデータに基づき、ａｔＬＲ５１配列の２つのコピーを含むペルー１株は、ａｔｔＲ３１配列を全く欠いている、検査された他の全ての株よりも少なくとも１０００ｆΔ高い開度でプラスミドｐＧＩ’５２をその染色体に組み込み可能なことが明らかである。ワクチン体の面清学的ＰＩ徴決定ワクチン株ペルー２、バング２、およびバー２をそれらの血ｌ青学的および定着特性に関してさらに特徴決定した。表２に示すデータは、新たに採収された細菌細胞をｄｉｒｃｏビブリオ・コレラ０１イナバまたはオガワタイピング血清を用いてスライド凝集により検査した場合、各誘導体はその予想された血清型（すなわち各変異体のそれぞれの親株の血清型）を保持していることを示している。この結果は、これらの珠が依然としてＬＰＳ抗原を発現することを示している。他の検査はこれらの変異株が運動性、原栄養性で、そして依然としてＴａｐ線毛を発現することを示している。従って、変異体は生ワクチン株として有用であるためにはそれらの能力に重要である多くの特性を発現する。ワクチン体およびコア欠失変異体の定着特性これらのワクチン体の定着特性を検査するために、変異株が後に続いてヒトの志願名において検査された場合（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ、Ｅｘｐｅｒ、Ｍｅｄ　よ互旦：１４８７−１４９２．１９８８）　、その定着特性と正確な相関関係があることが示されているＴａｙｌｏｒら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８４　二２８３３−２８３７．１９８７）に記載されているマウス腸内競合アッセイを用いた。アッセイは増殖および生存について競合できる変異株の能力を他の密接に関連している株または同遺伝子型株と比較することにより、変異株の定着性における相違をＡＦＩ定する。このアッセイにおいて、変異体および競合法を約１．１の比率で混合し、続いて、この混合物の約１００万の細胞を３−５０齢の乳児マウスＣＤ−１の胃に導入した。２４時間後、マウスを犠牲にし、腸を切開し、ホモジナイズし、両法を選択するストレプトマイシンを含む細菌学の培地に塗布した。続いて一晩のインキュベーンジン後増殖したコロニーを競合法から変異株を区別する別のマーカーについて検査する（すなわち、カナマイシンにχ・１する耐性または適切な放射性ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；表３の説明文参照）。表３に示すようにマウスの腸内における２４時間の増殖後、バング２およびバー２の両方は同遺伝子型の競合法の回収の方が変異株よりも約４−１３倍多い結果となる軽度の腸内定着因子（Ｈを示した。表３に示すのもコア欠＋ｆｉ変異株ペルー１、バング１およびバー１に係わる競合アッセイの結果である。タイプ２欠損株のバング２およびバー２のように、これらのコア欠損変異体はそれらの同遺伝子型の競合法と比較して定石性において欠損があった。コア欠失はＣＴＸ囚子（図１および３）のコアに対応する配列を取り除くので、これらのデータはＣＴＸ因子のコアが“腸内定着因子、すなわちＩＣＦ“をコードしていると示唆している。コレラ毒素そのものはＩＣＦではない。ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａ口ａｓ　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５ニア２３−７３１．１９８６）に記載されているようにｃｔｘ逍伝遺伝おける欠失およびカナマイシン耐性をコードする遺伝子の挿入のためにコレラ毒素産生に欠損のある５Ｍ４４と５Ｍ１１５株は、腸内競合アッセイにおいてそれらの各々の変異体（バング１、バング２およびバー１、バー２）より勝っている。従って、５Ｍ４４と５Ｍ１１５は、それらがコレラ毒素を産生しないとしてもＩＣＦを産生じ、一方変異体は産生じないことが明らかである。さらに、ＣＴＸコア領域はコアならびにタイプ２欠失両方において欠失されているＤＮＡだけてあり、両方の欠失を担持している変異体は定石性において同様に欠損があるので、ＣＩＦは図１に示すＣＴＸ因子のコア領域によりコードされると結論することもてきる。最近、ＺＯＴと呼ぶ新規心累がコア領域によりコードされることが見い出された（Ｂａｕｄｒｙら、１９９２、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、６０　：　４２８− ４３４）。我々はＺＯＴ遺伝子における変異がタイプ１またはタイプ２欠失変異体に観察される定石性欠損を生しないという：ｉ拠を持っている。従って、ＩＣＦはＺＯＴとは別個の、異なる特性として命名されている。タイプ１またはタイプ２欠損を担１．’ｊしている本出願に記載されたワクチン体はＩＣＦに欠損がある。月賦的に、ペルー２株は、その競合法Ｃ６７０９−５ｍと比較して腸内足首性に顕著な欠（ｌを示さなかった（表２）。しかしながら、マウスにおけるＣ６７０９−　Ｓ　ｍまたはペルー２株の総細胞量は、５Ｍ４４または５Ｍ１１５株よりも通常１０−１００イΔ少なく、ペルー株Ｃ６７０９−３ｍおよびその誘導体ペルー２が不明確な定心性欠損をすてに１ｑ持していることを示唆している。ＣＴＸ囚子のすべてまたは一部のコアの欠失はペルー１またはペルー２株の定着性においてさらに欠損を生じなかったので、Ｃ６７０９−Ｓ　ｍはＣＴＸコア領域に χ・ｊ応するＤＮＡ配列をｌ！ｉＦ！７しているにもかかわらず、ＩＣＦにおいてすでに部分的に欠損があると結論できる。ペルー２、バング２およびバー２株に存在するタイプ２変異により明確にされている全ＣＴＸ領域の欠失は、ＩＣＦの遺伝子がワクチン誘導体において再活性化せず機能的になることができないことを保証している。ＩＣＦ逍伝遺伝タイプ２欠失は軽度の定着欠損を明らかに生じる。そのようなことは、コレラワクチン開発において弱工化変異として有用である。なぜなら野生型ＩＣＥが望ましくない４性レベルの原因となるからである。変異株　親株本　血清型　欠失の型ペルー２　Ｃｅ２Ｏ２−８ｍ　イナバ　タイブー２バング２　Ｐ２７４５９−８曙　オガワ　タイブー２バー２　Ｅ７９４６−８ｗ　イナバ　タイプー２＊　法名の後の“Ｓｍ”の名称はストレプトマイシン耐性を意味することに注意。これは１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンに耐性のある自然発生的な選択株であり、リポソームタンパク質の遺伝子における自然発生的点突然変異の結果であった。この耐性マーカーはプラスミドまたはトランスポゾンと関連しておらず、その結果腸フローラに伝染性がない。全ての変異株は示した親株から得られるのて、全ての変異株はまたストレプトマイシン耐性である。バング２　５Ｍ４４ｂｏ、ｅ＋　ｏ、ｔａバー２　３Ｍ１１５°　０．９２　０．０７ベル−２Ｃ６７０９−９ｓ　Ｏ，７４０，ｆｉ５バング−５Ｍ４４ｂＯ，８５０，０５バーＩ　５Ｍ１１５°　０．６１　０．０４ペルーＩ　Ｃ６７０９−８ｉ　Ｏ，８９０，９４ａ　幼児マウス定着アッセイをＴａｙｌｏｒら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。い行った。株の比率を抗生物質に対する感受性の差異が、または追加された下記の脚注に記載されているように適切なプローブとのコロニーハイブリダイゼーショ／により決定した。ｂ　５Ｍ４４株はＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、よ６５＋７２３−７３１．１９８６）に記載されており、親株Ｐ２７４５９−５ｍのカナマイシン感受性誘導体である。５Ｍ４４においてカナマイシン耐性をコードする遺伝子をｃ　ｔ　ｘｉ３伝子座に挿入した。バング１およびバング２はＰ２７４５９−５ｍの誘導体なので、５Ｍ４４との競合はｃｔｘの喪失よりもむしろタイプ２の影響によるものであるとする定着性差異を測定する。バング１およびバング２株はカナマイシン感受性で３０μｇ／ｍｌのカナマイシンに対する耐性のコロニーを数えることにより、これらの競合アッセイにおいて５Ｍ４４から区別された。ｃ　５Ｍ１１５ｔＸＩ！ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ　Ｕ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、±６５ニア２３−７３１．１９８６）により記載され、親株Ｅ７９４６−３ｍのカナマイシン耐性ス導体である。５Ｍ１１５においてカナマイシン耐性をコードする遺伝子をｃｔｘ逍伝遺伝に挿入した。バー１およびバー２はＰ２７４５９−５ｍの誘メ、す体なのて、５Ｍ１１５との競合はｃｔｘの喪失よりむしろタイプ２欠１１の影響によるものであるとする定着性差異を測定する。バー１お　。よびバー２株はカナマイシン感受性であり３０μｇ／ｍｌカナマイシンに対する耐性のコロニーを数えることによりこれらの競合アッセイにおいてＳＭＩ　１５がら区別された。ｄ　Ｃ６７０９−５ｍ株はペルー１およびペルー２の親株である。ペルー２はタイプ２欠失を担ｔ！７Ｌ、一方ペルー】はコア欠失を担Ｆ′ｊする。これらの両欠失はＣｔｘ逍伝遺伝取り除き、その結果ペルー１およびペルー２はＧｏｌｄｂｅｒｇお１９８６）に記載されたＣＴ−１プローブで探査した場合、コロニーハイブリダイゼーションブロノトにおいて陰性であったが、Ｃ６７０９−３ｍ株は同じプローブを用いて陽性であった。従って、ペルー１およびペルー２両者は、ＣＴ−１プローブを用いるハイブリダイゼーションのコロニーを数えることにより、これらのｖＬ合アッセイにおいてＣ６７０９−３ｍから区別された。記載された変異株は、ワクチンの安全性および免疫原性を強化する役目を果たす、さらに別の変異を各株内につくることによりワクチン候補としてさらに改良できる。安全性に関して、第２の変異（変異はそのｒｅｃＡ遺伝子を不活性化するために設ニドされている）を上記の任意の株のｒｅｃＡ遺伝子に導入できる。従って、そのような二重変異株は組み換えにおいて欠損があり、自然環境においてビブリオ・コレレの野生型と組み換え不可能である。その結果、それらは野生型毒素遺伝子を獲得することおよびＣＴＸ因子を発現することは不可能である。その株にコレラｄｉｌＡ関連抗原（例えばコレラ毒素のＢサブユニット）、または他の異種抗１も（、例えばンガ様毒素の非毒性Ｂサブユニットまたは毒素原性Ｅ、ｃｏｌｔ株の種々のＣＦＡ抗原、シガ毒素、炭１ｎ毒素、シュードモナス内毒素Ａ１百口咳毒素、破傷風毒素；ヘルペスウィルス、風疹ウィルス、インフルエンザウィルス、おたふくかぜウィルス、麻疹ウィルス、ポリオウィルスからの抗原、ＨＩＶキャプシドからの抗原性断片、そしてマラリア、ニューモシスチス肺炎およびトキソプラズマ症を生じる真核生物寄生体からの免疫原性ポリペプチド（Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎら、１９８９．Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５７：１１２６；Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌら、１９９０．Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５８＋３５９４）を発現させるように、さらに別の変異を各法に導入することにより免疫原性も改善できる。従って、一連の変異された誘導体（株をより安全に、遺伝子的により安定で、さらに広範囲の免疫原性があるようにする、さらに別の特性を各々が組み込んでいる）も本発明において有用である。そのような誘導体の構築を下記に記載する。ｒｅｃＡ／ｃｔｘＢ対立遺伝子の構築コレラ４素Ｂサブユニツトはコレラ毒素中和抗体を誘発することができる非毒性で、非常に免疫原性のある／））了であることが知られている。さらに免疫原性のあるワクチン株を作成するために、新しいｃｔｘＢ遺伝子のコピーを上記のタイプ２欠失を含むワクチン株に導入した（なぜなら、タイプ２欠失はコレラ毒素Ｂサブユニットのコード配列全てを取り除くからである）。これは、下記の一連の段階で達成された。第一に、ｃｔｘＢ遺伝子のプロモーターなしコピーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて１Ｍ？Ｊｋした。ＰＣＲに関し、ｃｔｘＢ遺伝子の終了コドンがらすぐ下流に位置するａｔｔＲ３１部位を除去するようにｃｔｘＢコード配列が合成されｉｌｌるようにＦａのプライマーを設＝１した。このプライマーは下記の配列を（ｉした。５　’　−ＧＧＧＣＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣ−３゛　［配列番号５］。上流プライマーはＡ２サブユニットのカルボキン末端の最後の２４個のアミノ酸残基だけが反応の産物によりコードされ得るように設工１された。このプライマーは下記の配列を白した。５’−ＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣ；ＧＧＴＴＴＡＣＣＧ−３’　［配列番号６］。ＡサブユニットをコードするＤＮＡにおける、他の全てのヌクレオチドは反応から除外された。ｃｒｘＢ逍伝丁発現の翻訳共役を可能にするために、Ｃｔ　ＸＡ２のカルボキノ末端アミノ酸をコードするＤＮＡを最終産物に保持した。コレラ毒素に関連した毒素活性はＣｔ　ｘＡ１ポリペプチドから得られるので、Ａ１ポリペプチドをコードする全ての配列はＰＣＲ反応から除外された。Ｐ　ＣＲは上記のようにｃｔｘＢプライマーを用いペルー株Ｃ６Ｃ６７Ｏ９−５図５）からのビブリオ・コレレＤＮＡを用いて行われた。反応の産物である、０．６キロ塩２！対断片をプラスミドｐｃＲ１００にクローニングした。続いて、この断片を０６キロ塩基λ−ＪＳｐｅｌ−ＥｃｏＲＩ断片としてプラスミドから切り出し、２つの個々の受容体プラスミド、Ｘｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ消化のｐ　ＲＴ４１とＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ消化の１）ＶＣｌｏｏにクロー二／グした。得られるプラスミドｐＪＩｂ＋４１１およびｐ　Ｊ　Ｍ　１００１は、その時、各々かビブリオ・コレレのそれぞれｃｔｘプロモーター（ｃ　ｔ　ｘＰ）か、またはｈｔｐＧプロモーター（）１ｐｔＰ）の制御下てｃｔｘＢ逍伝子遺伝ピーをコードしている。続いてこれらのプラスミドを心素非産生株ビブリオ・コレレ０３９５−ＮＴ　（Ｍｅｋａ　１ａｎｏｓら、１９８３．Ｎａｔｕｒｅ　３０６：５５１および米国特許第４，９３５．３６４号）に導入し、０３９５−ＮＴ　ｐＪＭ４１１および０３９５−ＮＴｐ　Ｊ　Ｍ　１００１と呼ぶ２つの新規株を作成した。各法により産生されるコレラＢサブユニットの量をＧＭＩ　ＥＬＩＳＡ（エライザ）により測定した。ＬＢ培培養土岐液中０３９５−ＮＴ　ｐＪＭ４１１ｔ２は３０μｇ／ｍｌを産生じ、一方０３９５−ＮＴ　ｐＪＭｌｏｏｌは１００μｇ／ｍｌを産生じた。これらの結果は、ＰＣＲ産物がガングリオシドＧＭＩに結合可能な抗原性コレラＢサブユニットをコードする機能性ｃｔｘＢ遺伝子であり、従って、正常の野生型ビブリオ・コレレにより分泌されるものと類似であることを示している。次の段階において、プロモーター・ｃｔｘＢ構築物を指定するＤＮＡのＥｃ。Ｒ１−ＢａｍＨＩ断片を自殺ｒｅｃＡプラスミドｐＧＰ８４にサブクローニングした。このプラスミドはビブリオ・コレレのｒｅｃＡ逍伝子遺伝接するＤＮＡ１．：対応するビブリオ・コレレ染色体ＤＮＡ挿入断片（すなわち、ｒｅｃＡの内部欠失）を含んでいる。プラスミドｐＧＩ’８４は自殺プラスミドｐＪＭ７０３．１の誘導体（Ｍｉｌｌｅｒら、１９８８．Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７０：２５７５）であり、左側にＢｇｌｌｌ−Ｐｖｕｌｌ断片そして右側にＸｂａ　Ｉ −ＥｃｏＲＩ断片を含む、ビブリオ・コレレのｒｅｃＡ遺伝子のフランキング領域に対応する配列をコードしている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、１９８６．Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ。１．１６５ニア１５）。カナマイシン耐性をコードする１、３ｋｂ断片をこれら２つの断片間に配置する。プラスミドｐＧＰ８４は、ストレプトマイシンに対する感受性をコードするＮｒｕｌ−ＢａｍＨＩ断片も含む。この後者の断片はプラスミドｐＮ０１５２３から得られる（Ｄｅａｎ、１９８１．Ｇｅｎｅ　１５；９９）、ｐＧｐ８４をＸｂａｌて消化した時、１．３ｋｂ断片を取り出し、他のＸｂａｌ断片を、この欠失したｒｅｃＡ領域に挿入できる。サブクローニングを下記のように達成した。プロモーター・ｃｔｘＢ構築物を指定する、２つのＥｃ。Ｒ１−ＢａｍＨＩ断片それぞれをＸｂａｌリンカ−の付加により修飾した。それらを個々にＸｂａｌ消化ｐＧＰ８４に連結し、２つの新しいプラスミドｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２を作成（それぞれはｈｔｐＰ−ｃｔｘＢ横築物およびｃ　ｔ　ｘＰ−ｃ　ｔ　ｘＢＩＭ築物をそれぞれ指定しているＤＮＡを含んでいる）した（図６）。次に、プラスミドｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２をビブリオ・コレレ株ペルー２、バング２およびバー２に導入し、アンピシリン耐性のコロニーを選択した。これらのプラスミドはとブリオ・コレレ中で複製できないので、それらは相同的組み換えにより宿主細胞染色体に組み込み図６に示す構造物を作成する。両プラスミドはまたストレプトマイシン耐性（すなわち、ペルー２、バング２、およびバー２株）である株においてプラスミド組み込み事象に対して陽性の淘汰を可能にするストレプトマイシン感受性の遺伝子をコードしている。従って、染色体ＤＮＡに組み込まれたプラスミドを有する株を２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む培地で増殖した場合、アンビンリン感受性に復帰したコロニーを単離できる。続いて、ｃ＋ｘＢ＋Ｍ築物とともにｒｅｃＡ欠人変異人変異たままにするように組み込まれたプラスミドを、今取りはずされた株は、これら後者の株の間から選択された。これらの株は下記の特性を有しており容易に同定された。１、それらはアンビンリン感受性であった。２、それらはｒｅｃＡ−細胞の特徴的な表現型である、ＬＢ　１ｍｌに付きＯ７ｌ　ｍ　ｌのメチルメタンスルホネートの存在下で殺された。３、それらはＧＭＩ−ＥＬＩＳＡによりａｌ定されるコレラＢサブユニットを産生しｔ二。４、ｒｅｃＡおよびｃｔｘＢプローブを用いるサザンプロット分析により、それらがｃｔｘＢ構築物の存在および適切なｒｅｃＡ配列の欠失と一致しているＤＮＡ断片を含むことを確認した。下記の方法により単離された、上記の細菌株を下記に示す。株　遺伝Ｔ−型ベベル−ａｔＬＲ３Ｉ　欠失、　ｒｃｃＡ：：ｈｔｐＰ−ｃＬｘｌ’１．ｓｔｒペルー４　ａＬｔＲ３ｌ　欠失、　ｒｃｃＡ：　：ｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ、ｓｔｒバング３　ａＬｔＲ３１欠失、　ｒｃｃＡ：：ｌ＋ｔｐＰ−ｃｔｘＢ、ｓｔｒバー３　ａＬｔＲ３ｌ　欠失、　ｒｃｃＡ：：ｈＬｐＰ−Ｃ１ＸＢ、ＳＬｒバー４　ａＬｔＲ３ｌ　欠失、　ｒｃｃＡ：　：ｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ、５ｔｒｌａｃＺ −ｃｔｘＢ対立遺伝子の構築上記のワクチン４内に含まれるｒｅｃＡ変異は、株を相同的組み換え欠損にする。依然として相同的組み換えが可能なワクチン候補をつくるために、ｃｔｘＢ遺伝子を下記のようにビブリオ・コレラの１ａｃＺ遺伝子に挿入した。ビブリオ・コレラの１ａｃＺ遺伝子をコードするプラスミドｐＣＧ６９８は１ａｃＺコ一ド配列の中央にユニークＨｐａ１部位を含んでいる。プラスミドｐＣＧ６９８を下記のように構築した。ビブリオ・コレラのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は６己栽されｔ二（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、１９８３．Ｃｅ１ｌ　３５：２５３）ようにＥ７９４６株からの染色体ＤＮＡ断片のライブラリーからクローニン化された。それはβ−ガラクトンダーゼを発現することが見い出され、制限酵素マ・ソビングの後、１ａｃＺ遺伝子に２つのＨｐａ１部位（各々２．１ｋｂのＤＮＡにより分離された）を含む６ｋｂの挿入断ハを含むことが見い出された。このプラスミドをＨｐａｌで線状化しＸｂａｌリンカ−を末端に連結した。ｃｔｘＰ −ｃｔｘＢｔｇ築物を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断ｊ１を上記のようにｐＪＭ４１１から取り出し、末端をＸｂａｌリンカ−の付加により修飾し、断片を同様に修飾したｐＣＧ６９８に連結した。今てはｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ構築物を含む、得られたプラスミドｐＪＭ６８９１を１ａｃＺｉ１（ｉ子の中央に挿入した。このプラスミドをビブリオ・コレレ株ペルー２、バング２、およびバー２に導入し、各々得られた株をＸ−ｇａｌの存（ｉｌ下て増殖についてスクリーニングした。不活性化された１ａｃＺ遺伝子を含む白いコロニーを採取し精製した。宿主細胞染色体に組み込まれた１ａｃＺ：　：ｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ配列の組み込まれたコピーを含む株をアンピンリンの非存在下での増殖により細菌からｐＪＭ６８９１をキユアリングすることにより１また。適切な配列の存在はサザンブロ・ノド分析により確認され、これらの細菌がコレラ毒素Ｂサブユニットを産生ずる能力はＣＭＩ−ＥＬＩＳＡにより確認された。この方法に従ってｉｌ”Ｍされた細菌株を下記に示す。株　遺伝子型ペルー５　ａＬＬＲ３Ｉ　欠失、　１ａｃＺ：　：ｃＬｘＩ’−ｃｔｘＢ３．ｓｔｒバング５　ａＬｔＲ３ｌ　欠失、　１ａｃＺ：　：ｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ、ｓｔｒバー５　ａＬＬＲ３ｌ　欠失、　１ａｃＺ＋：ｃｔｘＰ−ｃｔｘＩｌ、ｓｔｒマウス定青定容関して、これら担体コレラワクチン候補のいくつかを特徴決定するために、下記に示した株をマウスに感染させた。ＴｃｐＡ欠失を含みヒトの志願者の腸に定るしない０３９５−Ｎｌの誘導体、ＴＣＰ’２株が対照としての役目をした。５匹のマウスを６株に用いた。感染２４時間後、腸上部を各マウスから取り出し、ホモジナイズし、単純なブレーティングアッセイを用いて存在するビブリオ・コレラの数をアッセイした。結果を下記の表に示す。本質的には、ＴＣＰ２て感染されたマウスの腸において細菌ＴＣｒ’２は検出されず、従って下記に示す値はバックグランドレヘル０より上でマウスの腸に定着した６株の細菌の数を示している。８１匹のマウスに付き回収されたコロニー形成単位（５匹のマウスの平均）ｂ　構築物ａｔｔＲ５１欠失＃２は図３に記載されたプラスミドｐＡＲ６２を用いて構築されたタイプ２欠失である。１Ｍ築物ｒｅｃＡ：　：ｈｔｐＧ−ｃｔｘＢはｒ　ｅ　ｃ　、Ａ遺伝子の欠失、および旦ブリオ・コレラのｈｔｐＧから得られる熱シヨツクプロモーターの制御下にあるコレラあ素Ｂサブユニット遺伝子の挿入である。横築物ｒｅｃＡ＋　；ｈｔｐＧ−ｃｔｘＢはｒｅｃＡ遺伝子の欠失とビブリオ・コレラの超４素産生性５６９８）末のｃｔ玉遺伝子から得られるコレラ毒素プロモーターの制御下にあるコレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子の挿入である。レラ訂素Ｂサブユニットから成るビブリオ・コレラの１ａｃＺ遺伝子中の挿入物である。結果は、ｒｅｃＡ：　＋ｈｔｐＰ−ｃｔｘＢ対立逍伝子の存在がペル遺伝導法の腸に定着する能力を減らす役目をする（例えば、ペルー３とペルー２を比較）ことを示唆している。しかしながら、バング誘導法の定着性に関するこの構築物の効果は顕がではなかった（バング３とバング２を比較）。一般に、ｃｔｘＢがその自己のプロモーターの制御下にある構築物の導入は、それが熱シヨツクプロモーターの制御下に置かれた構築物よりも定着性に及はす影響は少なかった。ペルー２、ペルー３およびバンク３株がそれらの定着特性において２８倍以上の範囲で異なることに注目すべきである。その定着特性において、さらに一層広く異なる、さらに別のワクチン候補を単離することは上記のプロトコールに従う技術内に十分大ることである。要約すると、ｃｔｘＢ遺伝了の発現が２つのビブリオ・コレラプロモーター（ｃｔｘＰおよびｈｔｐＰ）のどちらかの制御下に置かれる新規のｃｔｘＢ含白゛ビブリオ・コレレ株を作成するために遺伝子操作技術を用いることができる可能性をデータは示している。Ｊ’を作された遺伝子はビブリオ・コレラ染色体のターゲット遺伝子、例えばｒｅｃＡまたは１ａｃＺに組み換えられ、大量のコレラ毒素Ｂサブユニットを安定的に発現する株を作成する（例えば、ペルー３、ペルー４およびペルー５は）。ビブリオ・コレラの自然発生的軟寒天侵入欠損株の単離軟寒天侵入に欠損のあるビブリオ・コレラの変異体はワクチンの産生に存用である。これらの変異体を使用する合理性を下記に示す。腸の粘液層は、粘性があると考えられており、軟寒天の侵入に欠損のある変異体は、この粘液への侵入に欠陥がある。粘液を通る侵入に欠損があるが、これらの変異体は、痛い粘液のゲルにより被覆されていない、そしてＩｇＡ抗体産生に特異的な抗原試食細胞を含むバイアー班に抗原を依然として提示する。その結果、侵入欠損変異体は低い反応産生性をＨするが、抗原性が高いと予測されており、これらの特徴は、生ワクチンに望ましい。非運動性変異体は、軟寒天の侵入に欠損のある変異体のひとつの種類であるが、他の型の変異体も軟寒天侵入欠損表現型（すなわち、遁走表現型）を生じ、ワクチンに有用である。この論法の道筋を維持することにおいて、完全に非運動性変異体、すなわち、寒天を含まない培地で遁走できない変異体はａ用なワクチン候補である。そのような変異体を得るために、下記のように、軟寒天を用い、高い粘性の培地（０，２５％−０，４％寒天の軟寒天培地）に侵入する細菌の能力を評価する。高い治療上の価値を何する、ひとつのそのような軟寒天侵入欠損ワクチンはペルー１４である。ペルー１４は、軟寒天侵入欠損であり、そしてさらに、ペルー１４細胞の５０？。以上は、らせん状の外観を有し、正常の細胞の長さの５倍以上の細胞長さく野牛型の細胞長さ５ｎＭにχＩＬ２５ｎＭ）を有する線状である。ペルー１４は、下記に示すように（表７）、副作用がなく、被接８ｉ苦に定石する能力を依然として保持している３つの欠失ペルー株（ペルー３）（ｃｔｘＡ− 。ａｔｊ−およびｒｅｃＡ−）の軟寒天侵入欠１ｄ誘導体として単離された。ペルー１４は、上記の理論に基づき単離されたが、この機能の理論は、ワクチンとしてペルー１４の効果を正確にかつ完全に説明できるかもしれないし、できないかもしれない。効果的なワクチンとしてペルー１４の有用性は、この理論の正確性に依存していない。表７＊志願者は、゛免疫７２時間後無痛の半固形便を有した。便は、ペルー１４について培養陰性であった。＋志願者は、免疫４８時間後２回の液状の便を有した。便は、ペルー１４について培養陽性であった。詳細には、ペル−１４軟寒天侵入欠損株を下記のように生成した。ペルー３をストレプトマイシンスルフェート１００μｇを含むＬＢツブロス中、３０”Ｃで一晩増殖した。培養物を約２０００ｃｆｕ／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌをストレプトマイシン１００μｇを含むＬＢプレートに塗布した。プレートを３０”Ｃで、 −晩インキユベートした後、約１０００コロニーをっま楊枝採取して軟寒天プレート（ＬＢブロス＋０．４５％バクト寒天）に入れ３０”Ｃて一晩インキユベートした。接種するっま楊枝を軟寒天プレートの表面に１−２ｍｍたけ挿入する。採取した１０００コロニーのうち、２５が非侵入のよってあった。非侵入単離体は、２ｍｍ径のコロニーとして現れるが、一方侵入単離体は寒天上および寒天内に５ｍｍ以上の径でｔｙ走した。これらのコロニーを再採取し、既知の非侵入コレラ株、非連動コレラ株、および最初のペルー３株とともに、もう一度軟寒天に入れた。２５のうちひとつのコロニーは寒天非侵入（Ｚ・Ｉ　！ＩＣ（と比較した場合）であった。ペルー１４　トＱｒ名された、このコロニーは、凝集血清で依然としてイナバ陽性であり、ＢサブユニットＥＬＩＳＡで検査した場合、ペルー３と同じレベルのＢサブユニット毒素を産生した。上記の方法をいかなるビブリオ・コレレ株の軟寒天侵入欠１ｆＪ変異体をＩｌｌ離することにも用いることができる。遺伝的欠損を有している変異体のような非復帰の侵入欠損変異体を上記の方法を用いて作成できる。ベンガル株社常に珍しい非０１強毒性株がインド亜大陸におけるコレラ流行の原因であると、最近発見された。初期の０１セログル一プ流行病の生存者は、この株に対して免疫学的に保護されていない。この株は、メリーランド州ロックビル市のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンＥｌｆ／　（ＡＴＣＣ）に寄託されている。ヘンガルは上記のように、例えば、１以上の下記の変異：ＣＬＸ−、ａｔｔ−、またはｒｅｃＡ−１または軟寒天欠ＩＩ表現型、ベンガル２（“ベンダ２“）およびベンガル３（“ベンダ３ ”）により他の株に弱、が化でき、ペルー２およびペルー３と遺伝了的に同等である。そのような弱毒化ベンガル株を上記の弱毒化ペルー株のひとつと組み合わせ２つまたは複数のコレラ株ワクチンを生成する。ペルー３およびペルー５のヒトでの検査ペルー３およびペルー５の効果のヒトでの研究を下記のように行った。血液試亨１を免疫前、そして免疫後７０．１４０．２１０および２８０目に志願者から取った。彼等の血流におけるビブリオ・コレラ抗体を測定し、レベルを表４に示す。ワクチン原型ペルー３およびペルー５の免疫原性をヒト志願者研究において評価した。志願者は、新たに採収したペルー３またはペルー５を１０％重炭酸ナトリウム１００ｍ１中の３つの異なる用量で摂取した。ペルー３およびペルー５も、抗毒素抗体（表５）を誘発することを示した。さらに、ペルー３およびペルー５は、野生型エルトールビブリオ・コレラ（表６、Ｎ１６９６１株）の攻撃から志願者を保護することを示した。我々は、ヒトでの研究においてペルー３が特に強力な免疫応答（表４および５）を刺激し、コレラからの保護を提供する（表６）と結論する。ペルー３またはペルー５での免疫後の殺ビブリオ菌力！１（１９９２年７月）熱活性化血清試料をマイクロタイターウェルで連続希釈し、対数期のビブリオ・コレラ（最終濃度５ｘｌＯ７）およびモルモ・ノドの補体（最終濃度１１％）を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、脳・心臓注入ブロスをプレートに加え、３７℃で２．７５時間インキュベートした。表の値は、とブリオ・コレラの抗体媒介死滅が５０％以上の時の逆数の力価を示す。ペルー３またはペルー５での免疫後のコレラ抗毒素力１ａｆ（１９９２年７月）血清試料を前処理ガングリオシド／コ毒素前素Ｂサブユニットを塗布した９６ウエルマイクロタイタープレートで連続希釈し、３７℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ヤギ抗ヒト抗体アルカリホスファターゼ接合体（１／１０００）を加え３７℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、２ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰを各ウェルに加え１５分インキュベートした。反応を０．１Ｍ　Ｋ２ＰＯ，で停止し、Ｏ，Ｄ、４０５ｎｍで読んだ。表の値は、逆数の力任および２日日と比較したピーク力価の増加を示す。表６トした志願者の結果（１９９２年１１月）被検者　以前の　最初の　症状　下痢　症状の１　ペルー３　対数期を６　なし　形成　１８−４８時間２　ペルー３＊　対数期を６　疲労　５３４ゴロゴロ音５　ペルー３　対数期を６　なし　３７　ペルー３　対数期を８　なし　２３　３６時間１１　ペルー５　対数期を６　なし　形成１２　ペルー３　対数期を８　なし　形成１４　ペルー５　対数期を６　なし　形成１５　ペルー５　対数期を６　なし　形成２２　対象　７　１００．７　１４４３　２４時間Ｆ、　ＨＡ、悪心ＬＯＡ、ゴロゴロ音痙学２３　対象　なし　７０９　２４時間２４　対ｉ　Ｔ　９９．Ｑｌ’、ＩＩＡ　９０４＋　４０時間倦怠感ゴロゴロ音急激な腹痛＊　定石巳なかったか、または予防接種後、血清変換が後に続いた。＋　２回の液状便は、緊急のために検量しなかった。異型抗原を発現するビブリオ・コレラワクチンの構築広範囲の種々の外来抗原または異種抗原（例えば、ビブリオ・コレラに通常発現されない抗原）を発現できるペルー２、バング２、バー２、ペルー１４ｔ２および関連株の誘導体の構築のために、上記の方法は全ての当業者に使用できる。そのような誘導体は、生ワクチンとして用いられた場合、それがコードしているビブリオ・コレラの抗原および外来抗原両名に対して強力な免疫応答を誘発すると丁想される。他の原形ビブリオ・コレラワクチンでの予防接種が全細胞抗原（例えば、ＬＰＳ）ならびにコレラ毒素Ｂサブユニット（Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９８８、Ｊ、Ｅｘｐ　Ｍｅｄ、１６８：１４８７−１４９２）のような個々のタンパク質に特異的である循環１ｇＧと局所１ｇＡ抗体の誘発を生じるので全身的免疫応答および局所的免疫応答の両方が誘発されるようである。ビブリオ・コレラにより発現される外来抗原は個々のコレラタンパク質の免疫応答に類似の免疫応答を誘発すると予想される。ビブリオ・コレラへの異種抗原の導入に有用な方法はｃｔｘＢ遺伝子のペルー３、ペルー４、ペルー１４、ペルー５、バング３、バー３およびバー４への再導入に関する上記の方法と同様である。実質的にどんな異種抗原もこれらの方法を用いてビブリオ・コレラに挿入てきる。新規プロモーター下にｃｔｘＢを含む株を構築するために用いられる同じプロトコールが実質的に全ての異種抗原またはバクテリア、ウィルスまたは寄生体のどれかにより通常コードされる抗原を発現できるペルー２、バング２およびバー２の誘導体の構築に用いることができる。従って、本発明に記載された方法はコレラに対してだけでなく他の病原体に対してもヒトを免疫化するために他の抗原をコードし発現するように操作でき、そしてヒトに投与できる多価ビブリオ・コレラワクチン“担体法′の生成を教示している。ビブリオ・コレレ／毒素原性　Ｅ、ｃｏｌｉワクチンコレラ毒素（ＣＴ）に対する抗体を誘発するビブリオ・コレラワクチンは熱不安定性Ｊ＝”　（ＬＴ）を産生する毒素原性Ｅ、ｃｏｌｉ　（ＥＴＥＣ）（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、１４９：８８４−８９３．１９８４）の株に対するヒト披接種者に交差保護を与えることを示している。しかしながら、被接Ｆｉ８は、依然として熱不安定性毒素（ＳＴ）産生ＥＴＥＣ株に弱い。ビブリオ・コレラの弱毒化法、ペルー３を定着因子抗原、ＣＦＡ／ＩＶ線毛の主要なサブユニットおよびＳＴの遺伝的トキソイドをコードする、ＥＴＥＣ由来外来遺伝子を有するワクチンベクターとして使用できる。そのようなワクチンベクターは、１）病原性Ｅ　Ｔ　Ｅ　Ｃ珠のヒト消化管上皮への結合を防止する抗綿毛抗体および１ｉ）ＳＴの下痢効果を無効にする抗ＳＴ抗体を誘導する。結果は単一用量の経口投与される生菌弱毒化ビブリオ・コレレベクター化ＥＴＥＣワクチンである。弱み化ビブリオ拳コレレベクター化ＥＴＥＣワクチンは下記の利点の１以上を何する。ｉ）それは長期保存のために凍結乾燥できる、ｉｆ）それはコールドチェーンを必要としない、１ｉｉ）それは経口投与される、ｉｖ）それは単一用量だけ必要とする、■）それは費用効果がある、そしてｖｉ）それは大部分のＥＴＥＣ株に対して保護する。腸管的病原体である、ビブリオ・コレラおよび毒素原性Ｅ、ｃｏｌｉ　（ＥＴＥＣ）に対して向けられた単一用量の生菌経口ワクチンはＥ、ｃｏｌｉからの抗原をコードする配列をビブリオ・コレレワクチン株へ遺伝子操作して入れることにより作成される。そのようなワクチン株の構築において、定る性およびＩｉ索産生の両方を中和することが望ましい。これは上記のようにビブリオ・コレラの弱毒化法、ペルー３を改変することにより達成できる。ペルー３株はＥＴＥＣ熱不安定性４ＸＢサブユニットとほぼ同じコレラ毒素Ｂサブユニットをすでに発現し、交？：：保護抗体を誘導する。株を改変しＥＴＥＣの綿毛抗原、およびコレラ毒素ＡサブユニットとＥＴＥＣ熱安定性毒素の変異型のオリゴマー化ドメインから成るキメラタンパク質を発現する。この様にして、ビブリオ・コレラとＥ、ｃｏｌｉ両石へ両名疫の誘発を達成できる。ビブリオ・コレレ／ＥＴＥＣワクチン株の生成は微生物学および分子生物学における通゛畠の技術を用いて達成される。動物に定着し免疫応答を誘発する株の能力は確立されたウサギの腸内感染モデルで分析できる。綿毛抗原のクローニングおよび発現ＥＴＥＣのヒトの腸内上皮への定石能力は定着因子抗原（ＣＦＡ）および推定の定着因子（Ｐ　ＣＦ）として知られている血清学的に異なる綿毛により介在されている。ＣＦＡ／４線毛は、仝ＥＴＥＣ臨床単離体の約１／４−１／３に同定される主要な定石因子である。群（ＣＳ　６）の原型の一員の主要なサブユニットをコードする遺伝子か他によりクローン化され配列決定されている。高コピー数のプラスミドに担持されるクローン化Ｃ３６遺伝子を電気形質転換によりペルー３に導入し、５０μｇ／ｍｌのアンピンリンを含むルリア・バータニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス中で舟外して維持した。Ｃ３６配列を含む、ペルー３の全細胞溶菌液をタンパク質抗原発現について変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動そして抗Ｃ３６ボリクローナルウサギ血清を用いるイムツブはノドにより分析した。イムノプロットを抗つサギＩｇＧアルカリホスファターゼ接合体およびＢＣ１１’を用いて展開した。ＣＳ６遺伝了の発現は１７キロダルトンタンパク質の産生として検出された。従って、ｃｓ６抗原はワクチンの製剤化のためにペルー３中で発現できる。しカルながら、ワクチン株候補を生成するために、抗生物質選択の非存在下で表定的にＣ８６逍伝子を維持させ、それをビブリオ・コレラにより活発に転写されるプロモーターから発現させるようにすることが望ましい。その目的のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてプラスミドに担持されるＣ３６遺伝子をＲ５“（的に増幅腰ビブリオ・コレラの染色体への組み込みを可能にするアンピンリン耐性でストレプトマイシン感受性の“自殺”ベクターへの後に続（クローニングのためにその末端にユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を作成する。詳細には、コレラ毒素プロモーターの制御下にＣ５６遺伝子を配置するように、５Ｐａｃ１部位と隣接するＰＣＲ牛成Ｃ３６ＤＮＡおよび３”Ｎｏｔ１部位を、ＰａｃｌおよびＮｏｔｌて消化されたｐＪＭ６８９１−ＤＮＡと連結する。複製のためにｐ　Ｊ　Ｍ　６８９１に必要なｐｉとして知られている特異的なトランス作用タンパク質を提（ＪｔするＥ、ｃｏｌｉ　５Ｍ１０ｐｉｒ株に電気形質転換により連結４ｊ、合物を導入する。しかしながら、ｐＪＭ６８９１およびその誘導体をビブリオ・コレラ（ｐｉタンパク質を欠いている）に導入する場合、５０μｇ／ｍｌのアンピンリンに対する耐性の選択はプラスミドが染色体に組み込まれることを必要とする。組み込みの部位は、ビブリオ・コレラ染色体の配列に同一で、を目間的組み換えか起こるのを可能にするＣ３６に隣接するビブリオ・コレラの１ａｃＺＤＮＡ配列の存在により決定される。得られた子孫はアンビンリン耐性でプラスミドの組み込まれたコピーと１ａｃＺ逍伝子の繰返しＤＮＡ配列により囲まれたＣ８６配列を有している。繰返しは分離してベクター配列（アンピンリン耐性決定基を含む）を除去し、Ｃ３６遺伝子を毒素プロモーターの制御下に残すことができる。これは、ペルー３に天然のストレプトマイシン耐性幻立遺伝子を選択し、プラスミドにより導入されたストレプトマイシン感受性対立遺伝子を淘汰する、２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下で株を培養することにより行われる。ストレプトマイシンの存在下で一晩増殖した後、培養物を単一コロニーに関して１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天に塗布し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する感受性を採点した。予想された組み込みと切断事象が起こったかどうか決定するためにストレプトマイシン感受性でかつアンビンリン耐性の単離体を染色体ＤＮＡのサザンブロソトにより分析する。これらの単離体をイムノプロット法を用いて抗原産生レベルを分析する。Ｃ８６線毛抗原の産生は、コレラ毒素プロモーターの転写に影響を与えることが知られている種々の増殖条件下で評価する。Ｃ３６発現のレベルに関して培地のｐＨ（６，５対８．０）、温度（３０℃対３７℃）、ＮａＣ１濃度（５０−５００ｍＭ）およびアミノ酸濃度（０−２５ｍＭ）の影響をｉｌｌ定する。続いて、安全性および免疫原性を証明するためにワクチン株候補ペルー３／Ｃ５６をウサギモデルに用いる。ＣＦＡ抗原を産生ずるＥＴＥＣのヒト臨床単離体は、通常、実験動物に病原性がないので、安全性および免疫原性を証明するためにＥ、ｃｏｌｉ株ＲＤＥＣ−１のＡＦ／Ｒ１線毛抗原を発現する他のペルー３ｙ。導体を構築する。この抗原は消化管上皮への吸若に介在し、ウサギに下痢疾患を生じる。プラスミドｐｗｌに担持されるＡ　Ｆ／Ｒ１をコードする遺伝子をＰＣＨにより増幅し、ｐＪＭ６８９１にクローン化し、Ｃ５６と同じような方法で染色体に組み込む。ＡＦ／Ｒ１の発現レベルをイムノプロットにより評価する。これはヒトのワクチン候補を生成しないが、それは改変ペルー３株により修飾された異種抗原の発現および異種生物による攻撃からの保護の誘導を示すモデルとしての役目を果たす。高コピー数のプラスミドに担持される、クローン化ＡＦ／Ｒ１遺伝子も電気形質転換によりペルー３に導入され５０μ／ｍｌのアンピシリンを含むルリア・バーダニブロス中での培養により維持された。ＡＦ／Ｒ１配列を含むペルー３の全細胞溶菌物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および抗ＡＦ／Ｒ１ポリクローナルウサギ血清を用いるイムノプロットによりタンパク質抗原の発現に関して分析した。イムノプロットを抗つサギＩｇＧアルカリホスファターゼ接合体およびＢＣＩＰを用いて展開した。ＡＦ／Ｒ１遺伝子の発現は約１８キロダルトンタンパク質の産＋ｌ−とじて検出された。従って、ＡＦ／Ｒ１抗原はワクチンの製剤のためにペルー３中で発現できる。！］［の方１１を用いて、リボ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）およびプラスミド由来侵入性タンパク質のようなンゲラの保護的抗原を発現するワクチン株を作成し、シゲラ・ソンネイのような感染性ンゲラ種により生じる感染性下痢に対して保護する。ンゲラ・ソンネイにおいて、ひとつの血清型のＬＰＳだけがあり、この細菌に＆、ｌする保護において、それは主要な抗原決定バである。Ｅ、Ｃｏ１１へのＬＰＳオペロンをコードするプラスミドクローンの導入はＬＰＳの発現を生じ、抗シゲラソンネイＬＰＳ抗体により凝集される能力をＥ、ｃｏｌｉに付与するのに充分である。ペルー３欠失変異昧に導入された同じプラスミドは、それを凝集可能にする。オペロンのさらに別の分析は、ｐＢＲ３２２にサブクローン化された、このプラスミドの１２キロ塩基のＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１断片が依然として凝集表現型を付与することを示した。続いて、この断片を上記のようにビブリオ・コレラ染色体の１ａｃＺ遺伝子に導入する。５Ｔ−ＣＴＡ２セ合体の構築および安全性ＥＴＥＣは定着および２つの別々の毒素の産生により下痢を生じる。熱不安定性毒素（ＬＴ）は配列、構造、および生物活性においてコレラ毒素（ＣＴ）とほぼ同しである。従って、ペル−３誘導体によるＣＴの産生は内毒素を中和できる抗体を誘発するのに充分である。しかしながら、ＣＴての免疫処置は多くの臨床単離体（そのうちのいくつかはＬＴを産生じない）により産生される非常に小さなポリペプチド（１９のアミノ酸）であるＥＴＥＣ熱不安定性毒！（ＳＴ）からの保護を（・ｆ’ｊＬない。従って、この毒素に対する抗体を誘発するためにコレラ／ＥＴＥＣワクチン候補における重要な要素は、ペルー３にＳＴ配列を封入することである。ｉＳ素活性の全く無い［ＳＴオキソイド（ＳＴｏｘｏｉｄｓ）］多くの明確に特徴決定されたＳＴの誘導体か作成されている。これらの誘導体は、通常、毒素の断１１またはタンパク質の３つのジスルフィド結合を形成しているシスティン残基における置換変異体である。残基５および１０においてシスティンからアラニンへの変異を有する完全な成熟ポリペプチドからなるＳＴオキソイドを構築し毒素活性を最小にするかまたは除去する。このＳＴオキソイドをコードする遺伝子は全てＤＮＡ自動合成装置で生成された相補オリゴヌクレオチドから作成される。合成遺伝子は後に続くプラスミドベクターへのサブクローニングのためにユニーク制限エンドヌクレアーゼによって隣接される。ＳＴのサイズ（１９のアミノ酸）は、それを本質的に不十分な免疫原にしている。完全なＳＴまたはさらに小さなペプチド断片も他の大きなタンパク質（担体）と化学的または遺伝子的に結合すれば、ＳＴはより良好な免疫原になり中和抗体を活発する。使用される主要な担体はＬＴまたはＣＴのＢサブユニットであった。コレラ毒素Ａ２サブユニツト（Ａ断片がＢサブユニットペンタマーとオリゴマー化するのを可能にする酵素性サブユニットのドメイン）と融合した外来タンパク質がペンタマーと結合し、完全毒素状の複合体を形成するので、これらのキメラ複合体はｉ）ビブリオ・コレラにより分泌される、１１）ガングリオシドレセプターに結合できる、１ｉｉ）免疫反応性である。ＳＴオキソイドをコードする合成遺伝子はインフレームでＣＴ　Ａ２をコードする遺伝子の５′末端に融合されＳＴオキソイド・Ａ２キメラを形成する。遺伝子融合構築物を上記のようにペル−３染色体に組み込める。ＣＴ　Ｂサブユニットとともに発現させた場合、このタンパク質はＳＴとＣ７両方の生物活性を全く欠く完全毒素状の複合体を形成しガングリオシドレセプターに結合できる。ＳＴオキソイド・Ａ２キメラタンパク質を発現する株は、置換変異が抗原的に関係するタンパク質を生じるかどうかを決定するために抗ＳＴ抗血清を用いてイムノプロットにより分析できる。ＳＴオキソイドも幼児マウスアッセイにおいて毒性を比較できる。幼児マウスアッセイを下記のように行う。２−３日齢のマウスに、これらのコレラワクチン株（または対照として精製されたＳＴ）から得られたタンパク質抽出物を胃内部に注射し、注射３〜４時間時間性犠牲、消化管と体の重量比率の増加を検査した。最小の毒性を示すＳＴオキソイド・Ａ２キメラ候捕は、続いてつサギにおける免疫原性について分析される。ペルー３／ＡＦ／Ｒ１の安全性、免疫原性および効能ＡＦ／Ｒ１を発現するペルー３の最初の検査をウサギで行う。細菌をニュージ一ランドホワイトラビットに用量２×１０．２×１０．２ｘ１０６．２ｘ１０８で経口投与する。便の試料を採集し１００μｇ／ｍ＋のストレプトマイシンを有するＬＢ寒天プレートで培養し細菌の定ご性および放出を数える。血液をワクチンの投与前、ならびに投与後７０．１４０．２１日、そして２８日５に取る。血清を調製し、マイクロタイタープレートに結合した精製されたＡＦ／Ｒ１を用いて酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＡＦ／Ｒ１タンパク質に特異的な抗体の存在、およびＲＤＥＣ−１細菌を凝集する能力を分析する。ペル−３／ＡＦ／Ｒ１株を受け取る動物を続いてＲＤＥＣ−１の病原株で攻撃する。攻撃用２２　Ｘ　１０６生物を免疫化したウサギおよび免疫化していないウサギに経口投与し、便の試料を下痢（直腸部分を汚すゆるい水分のある便と、檻の底のゆるい便とに定義）について観察する。下痢は、非免疫動物には通常３− ４０以内に発生する。定着性をアッセイするために、直腸スワブ試料をラクトースマノコンキー寒天プレートで培養し、ラクトース陽性コロニーをスライド凝集検査において抗ＲＤＥＣ−１抗体との陽性反応について採点する。保護は４０後下痢および細菌定行の阻害の両方で定義される。ペルー３／ＣＳ　６およびペルー３／ＳＴオキソイドの安全性および免疫原性Ｃ５６およびＳＴオキソイド・Ａ２を発現するペルー３株の最初の検査を上記のように行う。血清を調製し精製したＣ３６かまたはマイクロタイタープレートに結合したガングリオシドを用いて酵素結合抗体免疫吸１（ＥＬＩＳＡ）によりＣ３６またはＳＴオキソイド・Ａ２キメラタンパク質に特異的な抗体の存在を分析する。抗Ｃ３６血Ｆｔは補体を固定てき、Ｃ５６産生Ｅ、ｃｏｌｉを溶菌できる抗体の存在についても分析できる。このアッセイにおいて、Ｃ８６を担持する細菌を血清およびモルモットの補体と混合し、ＬＢブロスを加え、細菌をＬＢ寒天に塗布する。殺菌作用は回収される生存数における減少を生じる。最後に幼児マウス毒性アッセイにおいて抗ＳＴオキソイド・Ａ２血清をＳＴ活性を中和できる抗体について検査する。上記の方法と類似のアプローチを用いてヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）の抗原を発現するビブリオ・コレレワクチン株を構築する。熱シヨツクタンパク１ｈｔｐのプロモーターおよびコレラＣＴ−Ｂ遺伝子を含む細菌転写ユニットを含むコレラシャトルプラスミドを構築した。転写ユニットはコレラのｒｅｃＡ遺伝子座から得られたＤＮＡ配列に隣接されているので、その結果、コレラゲノムのｒｅｃＡ遺伝子座とプラスミドの両方に存在するＤＮＡ配列間の相同的組み換えによりＣＴ−Ｂ遺伝子とそのプロモーターがコレラの染色体に組み込まれる。シャトルブラスミドは選択マーカーとしてアンピシリン耐性をコードする遺伝子およびストレプトマイシン感受性をコードする遺伝子も含んでいる。ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質はＨＩＶ抗原がＣＴ−Ａポリペプチドのシグナル配列により先行され、ＣＴ−Ａ２ドメインによりあとに続かれる“サンドイッチ゛融合クンバク質の形態で細菌により分泌される組み換えビブリオ・コレラホロトキソイドの一部として発現される。ＣＴ−Ａおよびその上流非翻訳領域のシグナル配列は細菌におけるＨＩＶ−１抗原の発現および分泌のために必要になる。ＨＩＶ−１抗原に融合されたＣＴ−Ａ２ドメインは組み換えコレラホロトキソイドを形成するためにＣＴ−Ｂタンパク質と組み立てられる融合タンパク質に必要になる。上記のプラスミドはシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列およびＣＴ −Ａ遺伝子のシグナル配列を含むＰＣＲ断片、およびＨＩＶ−１抗原の挿入のためのユニーク制限エンドヌクレアーゼＰｍｅ　１部位がそのＰａｃ１部位に挿入されるように改変できる。プラスミドはＣＴ−Ａ２ドメインおよびＣＴ−Ｂ遺伝子の両方を含む第二のＰＣＲ断片がＣＴ−Ｂ遺伝子を置換するようにさらに改変できる。ＤＮＡ挿入物の方向性およびＰＣＲ断片の連接点はＤＮＡ配列決定により確認できる。この研究で用いられるＨＩＶ−１抗原は主要な中和ドメイン（ＰＮＤ）を含むＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の一部である。以前の研究はＰＮＤから得られる一部の合成ペプチドは動物に中和抗体を誘発すると示している。ＰＮＡを含んでいるがシグナル配列および初めの１２０のアミノ酸のないＨＩＶ−ＬＡＩエンベロープ遺伝子から得られるＤＮＡ断片を、ＣＴ−Ａ２ドメインとＣＴ−Ｂ遺伝子の両方を含む、上記のプラスミドのＰｍｅ１部位にクローニングする。ＨＩＶ抗原およびＣＴ−ＡシグナルペプチドおよびＣＴ−Ａ２ドメインのインフレーム融合は、ＤＮＡ配列決定により確認できる。ＨＩＶ”−１抗原を担持する遺伝子的に弱み化されたコレラ株を（構築するために、ペルー２を親株に用いた。ＨＩＶ配列を含むプラスミドを交配によりペルー２株に導入する。ｃｔｘおよびｒｅｃＡ遺伝子座の欠失を含み、ＨＩＶ−１抗原の非市性組み換え融合タンパク質を発現するビブリオ・コレラの組み換え株を作成し、ペルー１０１と命名した。サザンプロット分析を用いてペルー１０１がＨＩＶ−１抗原のＤＮＡを含むことを確認し、ウェスタンプロット分析を用いて組み換え細菌によるＨＩＶ−Ａ２融合タンパク質の発現を示す。抗ＣＴ−Ｂと抗ＨＩＶ抗体両方を用いるＥＬＩＳＡは、組み換えコレラホロトキソイドが細菌により分泌されているかどうかを検査できる。経口ＨＩＶ−１予防ワクチンとしてビブリオ・コレレ組み換え体ペルー１０１の免疫原性を検査するために、成人雌アカゲザル［マカカ・マラソタ（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）１６匹それぞれに重炭酸水３０ｍ１中に新たに：Ａ製した生菌２Ｘ１０６ＣＦＵを与える。同し年齢と性別群のさらに別の動物２匹に対照として同し用量のペルー２を与える。予防接種の２日後、動物の便の試料を分析し、ＬＢストレプトマイシンプレートでのコロニー形成単位を測定することにより腸内のビブリオ・コレラの増殖を検出する。ＨＩＶ−１およびＣＴ−Ｂに特異的な、ＩｇＡとＩｇＧを含む、膣、直腸、唾液および血清の抗体を予防接種後２週間毎に検査する。投入ＨＩＶ−１抗原に特異的な宿主動物のＴ細胞増殖およびＣＴＬ応答も検査する。予防Ｉ！一種した動物の最初の免疫応答のレベルによるが、精製されたＨＩＶ−１抗原の経口による、または筋向および静脈注射による１回または数回の追加免疫を必要とする。ペルー１０１が動物を刺激して抗ＨＩＶ抗体または細胞性ＨＩＶ−１特異的免疫応答を生成できる場合、ＨＩＶ−１ワクチンとしてペルー１０１の効能を膣内注入による生きた５ＨＩＶ−ＬＡＩ保存菌で動物を攻撃することにより検査する。２匹のペルー２動物（ペルー２株を受けたサル）および６匹のペルー１０１動物のうち２匹（ペルー１０１を受けたサル）を２ＸＶＩ−ＡＩＤＳｏで攻撃する。他のペルー１０１動物のうち２匹は１０ｘＶＩ−ＡＩＤＳｏを受け、残りのペルー１０１サルは最大の５０ｘＶＩ−ＡＩＤ５ｏ用量を受ける。感染後抹消血試料を２週間毎に採取し、培ｉＨ’ＢＭｃ中にウィルス抗原を検出することにより動物が感染されたかどうか決定する。ワクチンが同種のＨＩＶ＝１エンベロープ遺伝子を担ｔ、′ｆする５ＨＩＶによる攻撃に対して動物に予防効果を何する場合、異型のＨＩＶ−１エンベロープを含む５ＨＩＶ−Ｅｌｆを用いて動物をｐ工攻撃する。生ワクチン株の用途ビブリオ・コレラ変異株ペルー１、ペルー２、バング１、バング２、バー１、バー２、ベンツｌル２、ベンガル３、ペルー１４および上記の別の変異体は生ワクチンとして用いられた場合、コレラおよび他の関連毒素産生疾患に対して免疫学的保護の供給源として有用である。他のそのような疾患は、コレラＢサブユニットと免疫学的交差中和可能な毒素を産生する毒素原性Ｅ、ｃａｌｆおよび他の細菌により誘発される疾患を含むがこれらに限定されない。実験動物またはヒトの腸に接種した場合、ビブリオ・コレラの変異体はオガワおよびイナバ０ＩＬＰＳ抗原、鞭毛抗原、Ｔｃｐ線毛の抗原性ドメインおよび外膜タンパク質を含むがこれらに限定されない、これらの株により合成される全ての細菌成分に対して強力な免疫応答を刺激し誘発する。他の原型コレラワクチンを用いた公表された研究に基づき、これら細菌成分に対して向けられた抗体のＩｇＡとＩｇＧクラスの両方が接種された動物またはヒトにおいて合成され、ビブリオ・コレラの病原性の味での後に続く攻撃に対して動物またはヒトを保護する役目を果たす。世只これらワクチンの適切な用量および投与の決定は基本的にはＨｅｒｒｉｎｇｔＯｎら（１９８８，Ｊ、Ｅｘｐｅｒ、Ｍｅｄ、よ旦旦：　１４８７−１４９２）に記載されているように行う。一般的に、そのような用量は用量当たり１０”１０９の生存している細菌であるが、これらに限定されない。ワクチン株の増殖ワクチンとして用いられる細菌は標章的ビブリオ・コレラ実験培地で増殖できる。細胞を採収し、続いて生存性を保存する製剤中に冷凍乾燥する（例えば、５ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ＋　２および８桔て１０％重皿のグリセロールを含む滅菌スキムミルクまたは食塩水）。俳ひワクチンの役Ｊｊは２つのエンベロープまたはバイアル、すなわちひとつは凍結乾燥したワクチン株または株の組み合わせを含み、もうひとつは水および胃酸を中和するために充分なｍ炭酸ナトリウムかまたは代わりの緩衝液を含む（約２グラム）、内容物の組み合わせを必要とする。次に、ワクチンは被接種者により飲み込まれる。または、凍結乾燥したワクチンを耐酸性“腸溶被覆′で被覆される錠剤に組み込まれる。ワクチンのそのような形態は、数日から数週間の間隔をおいて１以上（３まで）の用量を被接種者に投与される。“追加免疫°ワクチンとして使用される場合、ワクチンは同しように数日から数週間の間隔をおいて１以上（３まて）の用量を以前予防接種を受けた固体に投与される。２以上の株を投与されている場合、それらは共に、または７−２８日間をおいて個々の用量で提供される。改良された死菌経口コレラワクチン改良された死菌経口コレラワクチンの調製は上記の株から行われる。現在入手できる実験コレラワクチンは精製されたコレラ毒素Ｂサブユニットと混合したホルマリンおよび熱死滅したビブリオ・コレレ約１ｏ１１から成る（Ｂｌａｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５５：１１１６．１９８７）ｏこのワクチンの細菌成分の調製に用いられる４つの株は被接Ｆ！ｉ者に投与される前に完全に不活性化されなければならない活性コレラ毒素を産生ずる。上記の新規株は下記のそれぞれの理由によりＢｌａｃｋら（上記）のワクチンと比較して著しく改良されているワクチンを提供する。（１）ペルー２、バング２、およびバー２に由来し、そしてこれらを含む株がコレラ毒素の非毒性Ｂサブユニットだけ産生じ毒性のＡサブユニットは産生じないので、これらの株の培養は被接種者への投与前に温和な不活性化のみ必要とし、従ってホルマリンまたは熱のようなさらに過酷な変性処理を避けている。温和な処理の利点は抗原がより大きな度合いのそれらの天然の外形を保持し、その結果、それらにはさらに免疫原性がある。細菌のタンパク質を化学的に不活性化するのを避ける不活性化の温和な方法は、生物のマイクロ波処理、他の放射線源での処理または温和な有機溶媒かまたは界面活性剤を含み、または細胞を音波処理またはフレンチプレスの使用のような機械的方法により溶菌させる。（２）ペルー３、バング３およびバー３１２において、ｃｔｘＢ遺伝子はｈｔｐプロモーターの制御下に置かれている。その結果、これらの株はＬＢのような標準的実験培地において多量のコレラ毒素Ｂサブユニット（培養の１０μｇ／ｍ１以上）を合成する。これは多量のコレラＢサブユニットの精製を容易にし、従って、これらの株は緊縮増殖条件下で少量のＢサブユニットだけしが産生じない他の株に対して著しい利点を提供する。（３）既存の死菌コレラワクチンの調製において、別々の細菌株を用いて全細胞抗原として用いられる株からＢ毒素サブユニットを産生ずる。従って、Ｂサブユニットの調製中、生化学的方法を用いて毒性Ａサブユニットから離してＢサブユニットを精製する必要がある。そのような精製は少量のＡサブユニットがＢサブユニットの調製に混入する危険を生じる。上記の株を用いることにより、Ｂサブユニット調製物を得るために用いられる同じ培養物から全細胞抗原調製物を生成することが可能である。第一に、Ｂサブユニットの精製は、現在は、不必要である。なぜなら株はＡサブユニットを産生しないので、その結果、ワクチンの産生に必要な時間二とかなりの費用を減らす。第二に、調製においてＡサブユニットの、いかなる混入も仔する危険がない。なぜなら、細菌は、このサブユニットの遺伝Ｔを全くコードしないので、従って、それを産生できないからである。その結果、全細胞調製物を被接種者に最小の危険性を有するワクチンとして用いることができる。（４）本発明のいくつかの細菌株はエルトール生物型のビブリオ・コレラの誘導体であり、さらに詳細には、ペルー２、ペルー３およびペルー４の場合、それらはラテンアメリカで実際に現在流行の原因微生物である１１ｔｑ体（Ｃ６７０９ −５ｍ）の誘導体である。この特定の親株に特（Ｔの抗原があれば、上記のワクチン誘導体はラテンアメリカおよび恐らく世界の他の地域において、エルトール疾患に対して、通常、より良好な保護を提０（する。改良された経口死菌コレラワクチンの調製改良された経口死菌コレラワクチンは下記のように１調製できる。好ましくはオがワ血清型（例えば、バー３）からイナバ血清型（例えば、ペルー３、ペルー１４またはバング３）までから選択される最小２つの４およびベンガル血清型（例えば、ベンガル２またはベンガル３）を別個の培養で増殖する。当業者は、３７℃で細胞増殖を最大にするために条件、培地等の、’Ｅ製の仕方を知っている。例えば、ＣＹＥ　（Ｍｅｋａ　１ａｎｏｓら、１９７７、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、１６　：　７８９）またはグルコース、すなわちＡＧＭ４（ｖａｎ　ｄｅ　Ｗａｌｌｅら、１９９０．Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３３：３８９）を含む最小培地のような培地中で高いレベルの通気下で増殖した培養物を用いる。細菌の増殖が飽和に達した時、全細胞を遠心により培地から回収し、一方上清フラクション内に含まれるタンパク質（Ｂサブユニットを含む）は超遠心によりまたは沈殿により得られる。細胞はＢｌａｃｋらの方法（Ｉｎｆｅｃｔ。Ｉｍｍｕｎ、５５：１１１６．１９８７）を用いて、または温和な方法（例えば、マイクロ波処理、アルファー、ベータ、またはガンマ線を用いる照射）エタノールまたはアセトンのようなｒｆ機溶媒での処理により不活性化でき、または細胞を界面活性剤での処理により、または例えば音波処理またはフレンチプレスの使用による機械的方法により溶菌する。続いて不活性化した細胞を細菌のタンパク質（Ｂサブユニットを含む）を含む、濾過し濃縮した上滑と混合し、混合物を経口投与に適切な医薬的に許容できる溶液（例えば滅菌した食塩水また２％重炭酸ナトリウム）に懸濁する。俳ユワクチンは被接８ｉ？５が２グラムの重炭酸ナトリウムを飲み込んだ数分後に被接種名により飲み込まれる経口食塩水として被接種者に投与される。または、調製物は凍結乾燥され、錠剤に加圧され、続いて、被接Ｆ！者への投与前に耐酸性 “腸溶被覆°て被覆される。錠剤は、また、腸内の粘液性組織による調製物の摂取を促進するためにポリマーを用いてマイクロカプセルに入れることができる。里ｐ。ワクチンの単一用量は約１ａｌｌの細胞および約１００−５０００μｇのコレラＢサブユニットを含む。被接種者は約２週間以上間をおいて投与される別々の約２以上の用量のワクチンを必要とすることが予想される。爽匹特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下でビブリオ−ｍ１１株Ｃ６７０９−３ｍＳＰ２Ｃ６７Ｏ９−３，Ｅ７９４６−５ｍ。ベンガル２、ベンガル３、ＭＯＩＯｌおよびペルー１４の寄託を米国メリーランド州ロックビル市のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に行い、寄託物はＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ５５３３１（Ｃ６７０９−５ｍ）、ＡＴＣＣ５５３３３（Ｐ２７４５９−３ｍ）　、ＡＴＣＣ５５３Ｂ２　（Ｅ７９４６−５ｍ）　、ＡＴＣＣ５５４３６（０１３９、ベンガル２）　、ＡＴＣＣ５５４３７（０１３９、ベンガル３）およびＡＴＣＣ５５４３８（０１３９、ＭＯ１０）を与えられた。ペルー１４は１９９３年６月３０日にＡＴＣＣに寄託された。出願人の譲受人、バーバード・カレッジの学長および特別研究員は、特許が許可された場合、ＡＴＣＣが寄託物の永続性を可能にし公ノ（にょる寄託物への利用の準備をする受託機関であることを申し立てている。そのように寄託された物質の公共の入手に関する全ての制約は特許の許可後、完全に取り除かれる。物質は、特許出願の系属中、３７　Ｃ，Ｆ、　Ｒ，１，１４および３５　Ｕ、Ｓ、Ｃ，９１２２下で特許商標庁長官により物質に対して権利があると決定された者に入手可能になる。寄託された物質は、寄託物質の試料の分譲のための最も直近の要請微少なくとも５年間、そしてどんな事情があろうとも、寄託の日付後生なくとも３０年間、または特許の施行期間のいずれか長い方の期間、寄託物質を生存させ汚染させないように保／ｆするために必要なあらゆる配慮を払って維持する。出願人の譲受人は、要請された場合、寄託物の状況により受託機関が試料を分譲できない場合、寄託物を交換するその義務を承諾する。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：Ｍｅｋａｌａｎｏｓ、Ｊｏｈｎ　Ｊ。（ｉ　ｉ）発明の名称：コレラワクチンとしての欠失変異体（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数、６Ｈｖ）住所：（Ａ）受信人　Ｆｉｓｈ　＆　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｂ）通り＋２２５　Ｆｒａｎｋｌｉｎ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）都市：Ｂｏｓｔｏｎ（Ｄ）州＋Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｅ）国：Ｕ、　Ｓ、　Ａ。（Ｆ）ＺＩＰコード：０２１１０−２８０４（■）コンピュータ及びＯ８の名前及び型・（Ａ）ディスク、３．５インチ　ディスク、１．４４Ｍｂ（Ｂ）８１器：　ＩＢＭ　ＰＣ／２　モデル５０Ｚ又は５５ＳＸ（Ｃ）Ｏ５八ｌ５−ＤＯ８（バージョン５．０）（Ｄ）ソフト、ワードパーフェクト（バージョン５．１）（ｖ　ｉ）本出願データ：（Ａ）出願番号・（Ｂ）出願［］；（Ｃ）分類。（ｖ　ｉ　ｉ）先願データ：（Ａ）出願番号。（Ｂ）出願「ｌ：（ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）代理人等の情報：（Ａ）名前°Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｊｌｔｏｎ　Ｗ。（Ｂ）登録番号：２９．０６６（Ｃ）処理番号：　００７４２１００７００１（１ｖ）通信情報。（Ａ）電話：　（６１７）５４２−５０７０（Ｂ）電話ファックス：　（６１７）５４２−８９０６（Ｃ）テレックス：２００１５４（２）配列番号＝１（ｉ）配列の特徴＝（Ａ）配列の長さ：１７（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二ｌ！！鎖状（ｘｌ）配列：ＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴ　１７（２）配列番号＝２（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５２（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｘ　ｉ）配列。Ｔ＾＾＾ＣＣＴＡＧＡ　ＣＡＣ＾＾＾＾ＴＧＴ　ＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧ　ＣＡＴＴＡＴＧＴＡＴ　ＧＴＴＡＴＣＴＴ＾＾　＾Ｔ　５２（２）配列番号：３（ｉ）配列の特徴。（Ａ）配列の長さ＝４８ＣＢ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数　一本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｉ）配列。ＴＡ＾＾ＣＣＴＡＧＡ　ＧＡＣ八＾へ＾ＴＧＴ　ＴＣＣＴＡＧＴＧＣＧ　ＣＡＴＴＡＴＧ：ＴＧＧ　ＣＧＣＧＧＣＡＴ　４Ｂ（２）配列番号　４（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　５０ＣＢ）配タリの型　核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配タリ　・＾へ＾ＣＣＣＴＡＧＡ　ＴＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＡＧＴＧＣＧＣＡ　ＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴ　ＴＡＴＧＴＴ＾＾＾Ｔ　５０（２）配列番号　５（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　３２（Ｂ）配タリの型　核酸（Ｃ）鎖の数　一本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｉ）配列：ＧＧＧＣＴＡＡＡＧＴ　ＴＡ＾＾ＡＧＡＣ＾＾ＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧ　ＧＣ３２（２）配列番号：６（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２６（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：ＧＧＧＴＡＧ＾＾ＣＴ　ＧＡＡＡＣＧＧＧＧＴ　ＴＴＡＣＣＧ　２６ｒｅｃＡ　ｈｔｐＰ−一◆ｃｔｘＢ　ｒｅｃＡＦＩＧ、　５ビブリオ・コレレｒｅｃＡ　ｈｔｐＰ　−一→へなり　ｒｅＣＡ　ｒｅｃＡ　ｃｔｘｐ　−一◆ｃｔｘｆ３　ｒｅＣＡフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２０Ｃ１２Ｒ１：６３）（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡＣ１２Ｒ１：６３）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ。ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＮ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡＩＣ１２Ｒ１：６３）（７２）発明者　ピッティー　デビットアメリカ合衆国　マサチューセッツ州　ボストン　ネポンセット　コート　１０（７２）発明者　キリーン　ケビンアメリカ合衆国　マサチューセッツ州　ミルトン　プルツク　ロード　１１１２（７２）発明者　ルー　イッヒエンアメリカ合衆国　マサチューセッツ州　ウェルスレー　サウス　ウッドサイド　アベニュー　１５

Claims

【特許請求の範囲】

１．株が機能性ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠く遺伝子操作された欠失変異体であり、前記変異体がいかなる機能性ａｔｔＲＳ１配列もさらに欠いている、ビブリオ・コレレの毒素非産生性の遺伝学的に安定な変異株。
２．機能性ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠き、そしていかなる機能性ａｔｔＲＳ１直列もさらに欠いている、ビブリオ・コレレの遺伝学的に安定な変異株を作成する方法において、そのｃｔｘＡおよびａｔｔＲＳ１配列において変異されているビブリオ・コレレＤＮＡの断片を含むプラスミドを野生型ビブリオ・コレレに導入し、前記ＤＮＡが前記ビブリオ・コレレ内で野生型ビブリオ・コレレＤＮＡと組み換えでき前記変異株の生成を生じることから成る、ビブリオ・コレレの遺伝学的に安定な変異株を作成する方法。
３．前記株がエルトール血清グループに属する親株から得られる、請求項１記載のビブリオ・コレレ株。
４．前記株がイナバまたはオガワ血清型に属する親株から得られる、請求項３記載のビブリオ・コレレ株。
５．前記株がベルー２、バンダ２、またはバー２である、請求項４記載のビブリオ・コレレ株。
６．前記株が非０１血清グループから得られる、請求項１記載のビブリオ・コレレ株。
７．前記株がＣＴＸコア配列を欠き、全ての前記ａｔｔＲＳ１配列を完全に欠失している、請求項１記載のビブリオ・コレレ株。
８．前記株が機能性ｒｅｃＡ遺伝子をさらに欠いている、請求項１記載のビブリオ・コレレ株。
９．前記株がコレラ毒素のＢサブユニットをさらコードする、請求項１、７、または８記載のビブリオ・コレレ株。
１０．前記株が異種抗原をさらコードする、請求項１、７、または８記載のビブリオ・コレレ株。
１１．前記異種抗原がシガ様毒素またはシゲラリポ多糖抗原またはＥ．ｃｏｌｉ線毛抗原またはＨＩＶ抗原である、請求項１０記載のビブリオ・コレレ株。
１２．前記異種抗原をコードするＤＮＡ配列がビブリオ・コレレのＩａｃＺ遺伝子に挿入されている、請求項１０記載のビブリオ・コレレ株。
１３．前記株がベルー３、ベルー４、バンダ３、バー３またはバー４である、請求項９記載のビブリオ・コレレ株。
１４．前記ビブリオ・コレレ株がベルー２、バンダ２、またはバー２である、請求項２記載の方法。
１５．前記変異株がＣＴＸコア配列および全てのａｔｔＲＳ１配列を欠いている、請求項２記載の方法。
１６．前記変異株が機能性ｒｅｃＡ遺伝子をさらに欠いている、請求項２記載の方法。
１７．前記変異株が異種抗原をさらにコードする、請求項２記載の方法。
１８．前記方法が抗原をコードするＤＮＡの断片を前記変異株のＩａｃＺ遺伝子に導入することをさらに含む、請求項２記載の方法。
１９．前記変異株がベルー５、バング５、またはバー５である、請求項１８記載の方法。
２０．生理的に許容される担体に懸濁された少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株からなる死菌経口コレラワクチンにおいて、各株が機能性ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠き、そして前記株の少なくとも２つが異なる血清型であり、前記ビブリオ・コレレが非生存性であり、前記ワクチンが前記ビブリオ・コレレ株の前記血清型の少なくともひとつにより過剰生産されるコレラ毒素Ｂサブユニットをさらに含んでいる、死菌経口コレラワクチン。
２１．前記血清型のひとつがオガワ血清型であり、他の前記血清型がイナバ血清型である、請求項２０記載のワクチン。
２２．前記ワクチンがバー３およびベルー３かまたはバンダ３のどちらか一方、またはベルー３およびバンダ３の両方を含む、請求項２１記載のワクチン。
２３．前記株が機能性ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠いている遺伝子操作された欠失変異体であり、前記株が軟寒天侵入欠損変異体である、ビブリオ・コレレの毒素非産生性の遺伝学的に安定な変異株。
２４．前記株のひとつがベルーから得られ他がベンガルから得られる、請求項２３記載のビブリオ・コレレの少なくとも２つの異なる株を含むワクチン。
２５．前記株の各々がｃｔｘ−、ａｔｔ−、およびｒｅｃＡ−である、請求項２４記載のワクチン。
２６．前記株がａｔｔ−である、請求項２３記載のワクチン。
２７．死菌ビブリオ・コレレワクチンを生成する方法において、株が殺されている請求項２０記載の少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株を提供し、前記の段された株に前記株の少なくともひとつにより産生されるコレラ毒素Ｂサブユニットを加え、そこにおいて前記コレラ毒素Ｂサブユニットが前記株を増殖した培地から得られ、そして生理的に許容される担体に前記の殺された株および前記毒素Ｂサブユニットを懸濁する、段階から成る、死菌ビブリオ・コレレワクチンを生成する方法。
２８．生理的に許容される担体中の請求項１記載の株を含むワクチン。
２９．前記株がベルー１４である、請求項４記載のビブリオ・コレレ株。
３０．前記株がベンガル血清グループである、請求項６記載のビブリオ・コレレ株。
３１．前記株がベンガル２またはベンガル３である、請求項６記載のビブリオ・コレレ株。
３２．前記株の細胞の少なくとも２５％が定常増殖期の条件下で１５ｎＭもしくはそれ以上の線状構造を形成できる、請求項２３記載のビブリオ・コレレ株。