JPH07509058A - ｄｓＤＮＡ抗体の化学発光アッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｄｓＤＮＡ抗体の化学発光アッセイ法 本発明は生化学的アッセイ法に関する。より詳しくは二重鎖核酸に対する抗体を アッセイする法に関する。

生物の細胞の核の必須部分であり二重鎖構造をとるデオキシリボ核酸の重合ｍ（ ｄｓＤＮＡ）は、通常免疫システムを刺激して抗体を形成させることがない。し かし少なくとも全身性紅班性狼瘉という疾患は、ｄｓＤＮＡに対して抗体ができ る免疫系の異常が明かな特徴であり、この異常は致命的な結果をもたらす、ｄｓ ＤＮＡに対する抗体は専ら全身性紅班性狼瘉でのみ形成されるので、そのような 抗体に対するアッセイはこの病気の診断や予後の判断に用いられる臨床試験の１ つである。

従来抗ｄｓＤＮＡ抗体の測定は放射性イムノアッセイを用いるのが普通であり、 その際抗体−抗原複合体は放射性物質で標識され生成物の放射活性が光化学的に 、あるいはガイガーカウンターなどを用いて測定される。この様なアッセイで用 いられる放射性物質は危険性が高く、その半減期が短い場合は頻繁な検量線作成 が必要になる。別の方法として、固相上の抗原に結合した抗体に特異的な分子に リンクした酵素（例えばリン酸ペルオキシダーゼ）を用いる酵素結合イムノアブ ソーベントアッセイを用いることもできる０発色性基質を加え、リガンドの酵素 部分の存在下で着色物質を生成させる。

この方法は安定性はあるがラジオイムノアッセイに比べるとはるかに感度が低い 。また具合の悪いことにリューマチ因子がヒトＩｇＧのＦ　ｃ部分と反応するの で、このアッセイをひどく妨害する可能性がある。

既知のクリヂジア（Ｃｒ１ｔｈｊｄｉａｌアツセイは真のｄｓＤＮＡの為のアッ セイであるが、せいぜいよくても半定量的であり、この病気の活性を追跡するこ とはできない。

本発明の主要な目的は抗ｄｓＤＮＡ抗体をアッセイする法を提供することであり 、このアッセイ法は非常に感度が高いが安定で、分析者の健康を損なうおそれの あるものは使用しない１本発明の別の目的は、直線的な定量性があり、臨床医学 において特に有用性があるようなアッセイ法を提供することにある。またこの病 気の活性に関連したＩｇＧ抗体のみを測定するアッセイ法を提供するものである 。一般に、本発明のこれら及びその他の目的は、二重鎖ＩｇＧ抗体を捕捉するシ ステムを組み込み、従ってその抗体のみを測定することができるアッセイ法によ り実現させる。このアッセイ法はヒト血清サンプル中のＩｇＧの抗ｄｓＤＮＡ部 分を、固相に固定したＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧのＦ　（ａｂ’　）２フラグメン トを用いて捕捉し、次いで捕捉されたＴｇＧを合成ｄｓＤＮＡとインキュベート するものである。ここでこの合成ｄｓＤＮＡ　は合成りＮＡの量に比例してシグ ナルを発する分子で標識されているのでｄｓＤＮＡにたいする抗体の量を定量す る事ができる。更に詳しくいうと、本発明の好ましい実施態様は、ヤギ抗ヒトＩ ｇＧ抗体のような、抗ヒトＩｇＧ抗体のＦ　（ａｂ’　）フラグメントを不活性 な基質即ちイムノアブソーベント上に固定することを含むものである０本発明で はＦ（ａｂ’　）２を使用して、ＴｇＧのＦｃ部分と反応する傾向のあるリュー マチ因子によるアッセイの妨害を回避するものである。被覆した基質と、　Ｉｇ Ｇ中に抗ｄｓＤＮＡＩｇＧが存在すると考えられる人間の患者の血清を希釈した ものを、患者１ｇＧの一定割合が動物の抗ＴｇＧ抗体と反応して結合するのに十 分な条件と時間、接触させる０合成二重鎖ＤＮＡは例えばジゴキシゲニン（ｄｉ ｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）で標識する。これはジゴキシゲニンを使用すると一本鎖や 変性部分を持たないｄｓＤＮＡ−抗体が生じるからである。ジゴキシゲニンは血 清中に存在するであろう抗ＤＮＡ抗体に結合するのに十分な時間と条件下で再度 添加される。標識ｄｓＤＮＡが同相イムノアブソーベントに結合する程度はアル カリホスファターゼとカップリングした抗ジゴキシゲニン抗体を加えて測定する 。存在するアルカリホスファターゼの量は更に化学発光基質を加え、アルカリホ スファターゼと基質の反応で生じたルミネッセンスをルミノメータ−で測定する ことによりめられる。化学発光をタッグまたは標識として用いると、優れた定量 的測定を行うのに十分な感度が得られる。得られた化学発光のレベルは、抗ｄｓ ＤＮＡ抗体の標準量との同様な反応により得られる標準レベルと比較し、Ｕ　／ 　ｍ　Ｌとして表される。

これにより、結合した標識合成二重鎖ＤＮＡの測定量に、予めめられた標識され た合成二重鋼ＤＮＡの量と動物抗ヒトＩｇＧ抗体の量との間の定量的関係をあて はめて、血清中のヒトＩｇＧの量をめることができる。

純粋な二重鎖ＤＮＡ分子がこの抗ｄｓＤＮＡアッセイで用いるために供給される 。後で詳しく説明するように、Ｍ１３ファージの一本鎖ＤＭＡ分子からのＤＮＡ 合成はランダムプライマーで開始し、シークエナーゼ存在下でｄＡＴＰ、ｄＧＴ Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びジゴキシゲニンで標識されたデオキシウリジン三 リン酸とともに行なう。

個々人の抗体の全部が、標準抗体標品と同じようなｄｓＤＮＡに対する親和性や 親和力をしめずわけではなく、この標準試料と個々の患者の試料の親和力の差の ため用量−反応曲線が直線でなくなる。

この非直線性のため、試料を２倍希釈した場合、Ｕ／ｍＬは希釈しないサンプル の結果の半分にはならない。しかし−人の患者の試料はある希釈度においては再 現性があり、首尾一貫している。このため、標準１５０Ｕ以上の１１　／　ｍ　 ＋、の試料はすべて、再分析の際には希釈をできるだけ少なくし、患者によって は結果を軽詩的に比較できるよう常に一定の希釈で分析する。抗ｄｓＤＮＡアッ セイに使用する純粋な二重鎖ＤＮＡ分子を作成するには分子生物学の手法を用イ ル、通常Ｄ　Ｎ　Ａは一本鎖ＤＭＡ分子　３７ｙ−ジ環状分子（０，２μｇ／μ ［１、Ｕ　Ｓ　Ｂ　＃　７０７０４　）から合成される。ＤＮＡ合成はランダム プライマーで開始し、シークエナーゼとしてＤＮＡポリメラーゼ（ｔＪｓＢ＃７ ０７７７５）存在下でｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴｒ’、ｄＴＴＰ、及びジゴキ シゲニンで標識されたデオキシウリジン三リン酸（ｄｕＴＰｌ　（ベーリンガー マンハイム＃１０９３０８８）とともに行なう、ジゴキシゲニンは植物のジギタ リスに天体に存在する既知のステロイドである。この操作に用いるピペットチッ プはすべてオートクレーブし、必ず手袋をはめて取り扱う。

１）　Ｎ　Ａ　ｌｌｉ識・合成操作の例は次のようである。パーキンエルマー反 応デユープ中に、３０ｕＬのＭ１３配列決定用前方プライマー（２４Ｍｅｒ）　 ＩＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　＃１２２４）　２０μＭと５倍濃 度のシークエナーゼバッファ−１２０μＩ；　（Ｕ　Ｓ　Ｂ　＃　７０７６５　 ）を加えて混合し、ＭＩ３ＤＮＡにアニールさせる。アニールしたＭ］　３ＤＮ Ａ５μＬと一本＃ＩＤＮＡＭ＋３環状ファージ分子（０２μｇ／ｌＪ１．）ＩＱ μ＋−、を反応チューブにいれて混合し、５秒足らず遠心したのち、パーキンエ ルマーＤＮＡサーマルサイクラ−擺にセットする。混合物は機械中で２分かけて ６５℃まで加熱しこの温度で５分間保ち、１５分かけて４℃までゆっくりと冷却 した。冷めてからデユープを機械から取り出し、直ちに氷上におく、プライマー をアニールさせている間に、それぞれｌＯμＭのアデニン保存溶液。

グアニン保存溶液、シトシン保存溶液を５．５０μＬずつ、および１０μＭのチ ミジン保存溶液を３．５７５μＬ、１４℃Ｍのジゴキシゲニン標ｊｌｌ　ｄ　ｕ 　Ｔ　Ｐ保存溶液を１９．２５０ｕＬ、０．１Ｍジチオスレイトール（ＵＳＢ＃ ７０７２６）２７．５０μし、蒸留水１５．６７５μＬを加えて全量８２．５０ μＬとし標識カクテル混合液を作成した。

空の反応デユープに、５６μＬの酵素希釈用バッファーを入れ、そこに、保存指 定場所であるフリーザーからとりだしたシークエナーゼ酵素を８μＬ加えた。こ の混合液の５５μＬを標識カクテル混合液に加えた。こうして調製した標識カク テル／シークエナーゼ溶液の５　ｕ　Ｉ−を、水冷しであるプライマーがアニー ルしたＭ１３ＤＮＡの入ったチューブに加えてよく混合し、ごく短く遠心した。

このチューブを３７℃の水浴中の「フロータ−」に置き、４５分間インキュベー トしたのち、取り出して氷の上に置き、直ちに２μＬの０．５ＭＥＤＴＡを加え て反応を停止させた。標識反応用のＪｏｎｇ−３μｇＤＮＡとジゴキシゲニン標 識デオキシウリジン三リン酸のキットは、操作手順書とともにベーリンガーマン ハイム（インディアナ州、インディアナポリス）から市販されている。

通常のアガロースゲル電気泳動と改良サザンプロット法を用いて、できたＤＮＡ の分子量とジゴキシゲニン標識の効率が正確であるかどうかをヂエツクするのが 好ましい。以前に作成したロフトにＤＮＡ１１度を合わせるため及び純度を確認 するためにＵＶ分光を用いることも好ましい。

本発明には、抗ヒトＩｇＧ抗体に適した固相担体の作成も包含される。まず５． ７８９ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ。

１、ｏｕｉｓ、　Ｍｏ、、Ｔ−１５０３）、０．３３４６ｇトリスｌｅｔ　（Ｓ ｉｇｍａ、　Ｔ−３２５３）を計量して、ｐＨ９，５の０．０５Ｍトリスバッフ ァーを作成する。

これを１．ＯＬの目盛り付きシリンダーにいれ、蒸留水で１．ＯＬにしたのち、 ｐＨが９．５であることを確認した。このバッファーを４℃に保存すると約３カ 月は安定である。好ましくはアッセイを行う前日に捕捉用抗体の２．５ｕＧ／ｍ ｌ溶液を作成するが、これは好ましくはヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的、Ｊａｃ ｋｓｏｎ＃１０９−００６−００８．１．１ｍｇ／ｍＬの形で市販）のような動 物抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’　）２抗ヒトＩｇＧ保存溶液（１，１ｍｇ／ｍＬ） ２５ｕＬをＩｌｍＬの０．０５Ｍトリスコーティングバッファーに加えて作成す る（１　：　５００希釈）、タイターチック８ヂヤンネルビベツトを用い、この 抗ＴｇＧ／コーティングバッファーを１００μＬずつ９６穴黒色マイクロフルオ ル・マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。プレートをプラスチックの プレートシーラーで覆い、室温で６時間インキュベートした。

本発明のアッセイを行うためのハイブリダイゼーション手順はＧｅｎｉｕｓＴＭ 、非放射性ＤＮＡ標識及び検出キットと題された文書（ベーリンガーマンハイム 発行、　１９８８年９月）に記載されており、ここに引用して組み込むものとす る。

詳しく述べると、ブロック用バッファーは２５ｍＬの０．０５Ｍトリスバッファ ーに２５０　ｍ　ｇのウシ血清アルブミンを加え、穏やかに攪拌してウシ血清ア ルブミンをバッファー中に完全に溶解して作成する。マイクロタイタープレート からコーティング溶液を流しにはじき飛ばして除き、プレートを逆さにしてウェ ルの上面をベーパータオルで押さえて水を吸い取り、各ウェルを完全に乾かす、 ついで各ウェルにブロッキングバッファーを２００μＬずつ加え、プレートをプ ラスチックシーラーで覆って４℃で一晩インキユベートする。

本発明のアッセイを行う準備として洗浄及び希釈用バッファーの新鮮溶液をつぎ のように作成する。

０．０１Ｍリン酸バッファー（以後ＰＢＳ）ＸＩＯ（十倍濃度）は以下のように 計量して作成する。

８　５、０　ｇ　Ｎ　ａ　Ｃ１（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−９６２５）１１、５ｇ　Ｎａ ２ＨＰＯ４（ＢａｋｅｒＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、 　Ｎ、Ｊ、３８２８−５．　無水）２、０　ｇ　Ｋ　ＣＩ　（Ｓｉｇｍａ、Ｐ− ４５０４）２．０ｇ　にＨ２Ｐ　０４　（Ｓｉｇｍａ、　Ｐ−５３７９）１、　 ０ｇ　Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ　（Ｓｉｌ）ａ、　Ｐ−５３７９）上記を目盛りつ きシリンダーにいれ、蒸留水で１．ＯＬにし、溶液を混合する。このリン酸バッ ファー（ＰＢＳ）の保存溶液はｐＨ６８でなければならない。ＰＢＳ／ＴＷＥＥ Ｎバッファー（０゜０１Ｍ　ＰＢＳｌｏ、０５％ポリエチレンーソルビタンモノ ラウレート）（以後Ｔｗｅｅｎという）は、ＰＢＳＸＩＯ保存液１０保存液１燕 ０ Ｐ−１３７９）を加え、泡をたてないように穏やかに混合する。

ＰＨ５ｆｃ浄用バツフアーは４　５　ｍ　ｌ−のｌ０ＸＰＢＳ溶液と４５０ｍ　 ＋−の蒸留水を混合して作成する。

試料希釈用バッフｙ−（０．ＯＩＭＰＢＳｌｏ．０５％Ｔｗｅ　ｅｎｌｏ．０２ ％ウシ血清アルブミン（以後ＢＳＡ））は、５、ＯｍＬのＸ　Ｉ　０ＰＢＳを４ 　５　ｍ　ｌ−の蒸留水と混合し、５０μＬのＴｗｅｅｎと１０ｍｇのＢ　Ｓ　 Ａ　（Ｓｉｇｍａ．＾−２＋３５）を加える。

標準試料と対照は、ＤＮＡ抗体の濃度が高いことが分かっている患者から採取し た保存血清サンプルから以下のようにして調製する。

「高濃度」標準試料は、標準試料即ち保存血清の適当μＬ量を希釈用バッファー と混合して希釈し、標定したＩｇＧｆｉ度が８２５ｍｇ／　ｍ　＋、となるよう に調製する。

「中濃度」標準試料は「高濃度Ｊ標準試料からその値の６０％となるように調製 したものであるが、６００μＬのｒ高濃度」標準試料を４００ｕｌ−の希釈用バ ッファーと混合して調製する。

標準状Ｆｌｉ３よび対照はすべて、それぞれの血清１　０　ｕ　Ｉ−に４９０μ Ｉ４の希釈用バッファー（ＢＳＡ）を加えて試験管中に作成する。

前回最高濃度標準試料よりも値が高かった患者については以下のような２欅類の 希釈を行なう．即ち１つは正常のＬｉｔ血清と患者の血清５０ｕ＋−ずつの混合 、もう１種は１５０μ■−の正常Ｌｉｔ血清と５　０　１ｔ　１．の患者血清の 混合である．それぞれの希釈１０４ｔＬに４９０μＬの希釈用バッファーを加え て１．５０の希釈液を作る。

同様に．１：５０希釈液をアッセイをおこなう各患者のサンプルについて作成す る。

すでに述べたようにして調製した装置プレートをプレート洗浄機にかけ、ブロッ キングバッファーを吸引してのぞく．吸引の終わったプレートはＰ　Ｂ　Ｓ　／ 　Ｔ　Ｗ　ｅ　ｅ　ｎバ・ノファーで計６回洗浄する。プレートを洗浄機から取 り出し、ベーパータオルで水気を吸い取り、ウェルから完全にバッファーを除く ．標準試料、対照、患者サンプルをそれぞれのウェルに１００μＬずつ入れ２連 のブランクウェルにはサンプル希釈用バッファーを１００μＬ加える．プレート はプラスチックプレートシーラーで覆い、加湿ヂエンバー内で３７℃。

１時間半インキュベートする．インキュベーション時間の終わる直前に，２４μ Ｌの保存ＤＮＡ溶液に１　２ｍＬの希釈用バッファーを加太で（０．１ＡＬＬ／ ｍＬ）、ｄｓＤＮＡ−ジゴキシゲニン溶液を１：５００に希釈したものを作成す る。インキュベーション時間が終わったとき、希釈された試料溶液を吸引して除 き、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーで洗浄する．プレートの水気を吸 い取り、軽くたたいて完全に乾かす。

チャンネルピペットを用いてｄｓＤＮＡ−ジゴキシゲニンの希釈液を１００μ■ ，ずつプレートの各ウェルに加え、プレートをプラスチックブレートシーラーで 覆い、加湿チェンバー内で３７℃、１時間半インキュベートする．インキュベー ション時間が終わったとき、希釈ｄｓＤＮＡージゴキシゲニン溶液を吸引して除 き、プレートをＰ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎバッファーで洗浄する．プ レートの水気を吸い取り、軽くたたいて完全に乾かす．インキュベーション時間 の終わる直前に、保存ｄｓＤＮＡージゴキシゲニン溶液をＩ：５００に希釈した ものを作成し、１００μｍ、ずつ各ウェルに加える．再度ブレートをプラスデッ クプレートシーラーで覆い、加湿チェンバー内で３７℃、１時間半インキュベー トする。インキュベーション時間が終わったとき、希釈ｄｓＤＮＡージゴキシゲ ニン溶液を吸引して除き、プレートをＰ　Ｂ　Ｓ　／　’ｒ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎバ ッファーで洗浄してからＰＢ５／ＴｗｅｅｎバッファーをＴｗｅｅｎを含まない ＰＢＳに置換する。洗浄ラインからＰ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎバッフ ァーを確実に除いてから、プレートをＴｗｅｅｎを含まないＰＢＳで洗浄し、プ レートの水気を吸い取り、軽くたたいて完全に乾かす、３回目のインキュベーシ ョン時間の間に、Ｌｕｍ１ｐｈｏｓ　５３０のような化学発光アルカリホスファ ターゼ基質を少なくとも１２ｍＬ冷蔵庫から取り出し、室温に戻す、′ｆの１Ｏ ＯｕＬをインキュベートを終わって乾燥した各ウェルに加える。ジゴキシゲニン で標識したプローブの検出は、抗ジゴキシゲニンーアルカリホスファターゼのよ うな抗体−酵素複合体で行うのが好ましい。この複合体は既知の酵素連関色反応 で可視化できるが、本発明においては化学発光検出で行うのが好ましい。この目 的には、ハイブリダイズしたプローブと結合した抗体複合体がついた担体を、Ｌ ｕｍ１−Ｐｈｏｓ”５３０として溶液の形でベーリンガーマンハイムから市販さ れている１、２−ジオキセテンのような既知のアルカリホスファターゼの発光基 質と反応させる６反応プロトコールはＬｕｍ１−Ｐｈｏｓ”５３０という題のＬ 　ｕ　ｍ　ｉ　ｇ　ｅ　ｎ社（ベーリンガーマンハイム社の１部門）がら入手で きる刊行物に記載の方法に従って行うことができる。化学発光を検出するには、 イーストマンコダック社（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）から入手 できるＡｍｅｒｌｉｔｅＴＭ化字発光検出器のようなルミノメータ−を使用する のが望ましい。

化学発光基質を加えたのも直ちにプレートをルミノメータ−中にセットし、機械 の使用説明書の指示に従って運転して各ウェルを読み取る。プレートはそのまま 機械中に放置し、４５分のインキュベーション期間が終わったところで再度機械 にウェルを読ませ、２回目のデータをとる。　「中濃度」と「高濃度」標準試料 の一回目と２回目の読み取り値を比較して、その差が各サンプルにつき５ユニッ ト以内でなければならない０機械が標準、対照、患者試料の全部について曲線当 てはめ統計値と１組の反復ウェルごとに平均値を出してくれることが好ましい、 正常個人は１５Ｕ／ｍＬのｄｓＤＮＡ抗体値となるであろう。

Ａｍｅｒ　ｌ　ｉ　ｔｅ検出器での測定は以下の基準を満すようにおこなう。

（１）曲線合致因子が＜１０．０、ライトインデックスが〉１Ｏ００、ルミノメ ータ−による標準曲線における各点の相違％が〈５゜０であること、 （２）対照については、１群の試料測定の前後に行った「中濃度」「高濃度」対 照がそれぞれ５ユニット以内であること：反復ウェルのＣＶが１０％以下である こと、 （３）患者のサンプルについては、反復ウェルのＣｖが１０％以下であること： 最高濃度標準試料以上の値は続いて再測定を行い、その値が標準曲線内にあるよ うにすること。

正常血清で希釈した患者サンプルについては値を以下のように計算する。

ｌ：２容量希釈： ｔＪ　／　ｍ　Ｌで表した値＝ＡＸ　（Ｂ＋Ｃ）／ＢここでＡ＝標準曲線から読 んだＵ　／　ｍ　Ｌ、Ｂ＝患者血清中のＩｇＧレベル Ｃ＝正常対照血清中のＩｇＧレベル １：４容量希釈： Ｕ　／　ｍ　Ｌで表した値＝Ａｘ　（Ｂ＋３Ｃ）／Ｂ最高濃度の標準試料以上の 患者試料はすべて、次回の測定は更に希釈して行う。最高濃度標準以上の値は、 ｄｓＤＮＡに対する抗体産生を特徴とする病的状態、恐らくは全身性紅班性狼癒 、の特徴であることは理解されよう、この様な病気は進行するので、アッセイ値 が正常のｄｓＤＮＡ抗体Ｕ　／　ｍ　Ｌを越えて増加していく程度は病気の活性 度を示すことが示唆される。

本発明の範囲を外れることなく、上記の方法に一定の変更を加えることができる ので、上記の記載あるい添付の図面に含まれるすべての事項は説明のためであっ てそれに限定するものではない。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．液状のヒト血清標本中のヒト二重鎖ＤＮＡに対する抗体をアッセイする方法 であって、該方法は以下の工程：該標本と固相イムノアブソーペントとの第一の インキュベーション混合物を作成し、ここで該イムノアブソーペント上にはＦｃ 特異的Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを含む動物の抗ヒトＩｇＧ抗体が固定されて いる： 第一の混合物を該標本中のヒトＩｇＧ中のＦｃが該動物抗１ｇＧ抗体中のＦ（ａ ｂ′）２フラグメントと結合するのに必要な条件と時間でインキューべートする ： 実質的に一本鎖あるいは変性した成分を有さない二重鎖ＤＮＡ抗体を形成するた めに、血清中に存在する可能性のあるどのような抗ＤＮＡ抗体も該イムノアブソ ーペントに結合するのに必要な時間と条件下で上記第一の混合物とジゴキシゲニ ン標識合成二重鎖ＤＮＡの第２のインキュベーション混合物を作成する；該イム ノアブソーペントに結合したジゴキシゲニン標識合成二重鎖ＤＮＡの量を検出し ： 検出された結合標識合成二重鎖ＤＮＡの量を、予め求められた標識二重鎖ＤＮＡ の量と動物抗ヒトＩｇＧ抗体との間の定量的間係と関連づけて該標本中のヒトＩ ｇＧの量を決定する；からなる。
2. ２．ヒト血清標本中のヒト二重鎮ＤＮＡに対する抗体をアッセイする方法であっ て、該方法は以下の工程：固相に固定化したＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ ′）２フラグメントを用い該ヒド血清標本中のＩｇＧの抗ｄｓＤＮＡＩｇＧ部分 を、その分子のＦｃ部分で捕捉し： 捕捉されたＩｇＧを、合成ｄｓＤＮＡの量に比例したシグナルを引き出すことが できる部分で標識された合成ｄｓＤＮＡとインキュベートし： 該シグナルを引き出し； 引き出されたシグナルにしたがってｄｓＤＮＡに対する抗体の量を定量する： からなる。
3. ３．請求項２に規定した方法であって、捕捉されたＩｇＧはアルカリホスファタ ーゼで標識された合成ｄｓＤＮＡとインキュベートし、引き出されるシグナルは 該合成ｄｓＤＮＡを標識しているアルカリホスファターゼの量に比例している方 法。
4. ４．インキュベートの工程を含む請求項３に規定した方法であって、該工程が 該抗体に化学発光する基質を添加し、かつ該基質と該ホスファターゼとの反応か ら生じる発光をすべて測定する、ことからなる方法。
5. ５．請求項２に規定する方法であって、該捕捉のステップが以下のように行われ る： 不活性な担体の上に動物抗ヒトＩｇＧ抗体を被覆し：患者１ｇＧの一部が該動物 抗１ｇＧ抗体と反応して結合するように被覆された担体を該血清の希釈液と接触 さて；合成二重鎖ＤＮＡをジゴキシゲニンで標識し、標識されたＤＮＡを該血清 に加えて血清中に存在する可能性のある抗ＤＮＡ抗体と結合させる； 方法。
6. ６．インキュベートの工程を含む請求項５に記載の方法であって、該工程が 化学発光基質を該抗ジゴキシゲニン抗体に加える；該基質と該ホスファターゼと の反応から生じる発光をすべて測定する、ことからなる方法。
7. ７．請求項５に規定される方法であって、該発光の測定値をすでに求めた標準レ ベルと比較する工程をさらに含む方法。