JPH07509123A

JPH07509123A - オリゴ糖輸送体を有するｄｎａ配列，該輸送体を含有するプラスミド，細菌および植物，ならびに該輸送体を同定するための酵母株の製造および形質転換方法

Info

Publication number: JPH07509123A
Application number: JP6502044A
Authority: JP
Inventors: フロマー，　ヴォルフベルント; リースマイアー，　イェルク
Original assignee: ヘキスト　シェーリング　アグレヴォ　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング
Priority date: 1992-06-24
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1995-10-12
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: AU671135B2; DE4220759A1; EP0647273B1; HUT70472A; ATE248915T1; RU94046212A; US5608146A; DE69333180T2; US5981181A; CA2137346A1; ES2204903T3; RU2151802C1; AU4500393A; WO1994000574A1; HU220335B; HU9403767D0; IL106121A0; DE69333180D1; EP0647273A1; JP3565845B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】表題、オリゴ糖輸送体を有するＤＮＡ配列、該輸送体を含有するプラスミド、細菌および植物、ならびに該輸送体を同定するための酵母株の製造および形質転換方法一２°゛′− 発明の分野本発明は、植物ゲノム中への導入が形質転換植物中の貯蔵物質の生成および輸送を変更するオリゴ糖輸送体のコーティング領域を有するＤＮＡ配列、これらＤＮＡ配列を有するプラスミド、細菌および植物、本発明の植物オリゴ糖輸送体のＤＮＡ配列の同定を可能にする酵母株の製造および形質転換方法、ならびに本発明のＤＮＡ配列の使用に関する。

多数の植物、たとえばジャガイモ中の貯蔵エネルギーに対する最も重要な形質転換代謝生成物はスクロースである。他種における他のオリゴ糖もこの役割を果たすことができる。たとえば食用アザミ（ｊａｐａｎｅｓｅａｒｔｉｃｈｏｋｅｓ）においては、スタキオースである。

植物のエネルギー含量におけるオリゴ糖輸送の中心部分は、既に形質転換植物において示されており、該植物においてはインベルターゼの発現によりスクロースが単糖に分解され、その性質のかなりの変化を生じる（ヨーロッパ特許第４４２５９２号）。貯蔵物質の生成におけるスクロースの重要性のため、二糖の生合成または代謝の研究において多（の実験が実施された。ドイツ国特許第４２１３４４４号から、収穫された部分の貯蔵性の改善は、アポプラストのインベルターゼの発現により、エネルギー富有化合物の生成種のへテロトロピック部分への伝達が阻止される形質転換ジャガイモにおいて達成することができることは公知である。

多くの努力にも拘らず、貯蔵物質、たとえば植物におけるオリゴ糖の分配機構は明らかにされておらず、それに影響を及ぼすために、光合成を行なう葉において生成されたスクロースがどのようにして植物の篩部の輸送路に到達するかおよび貯蔵器官、たとえばジャガイモの塊茎または種子からどのようにして取込まれるかはまだ未知である。テンサイ（Ｂｅｔａ　ｕｎｌｇａｒｉｓ）の分離された葉組繊細胞の細胞膜に対して、該膜を通るスクロースの輸送は人工的なｐＨ勾配を設けることによって惹起することができかつ電気化学的電位を設けることによって激化することができることが証明された（　Ｌｅｍｏｉｎｅ　＆　Ｄｅｌｒｏｔ　（１９８９年）ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ　２４９　：　１２９〜１３３）− スクロースの膜通過はミカエルス・メンテン速度論に従い、該速度論におけるスクロース輸送のＫｍ値は約１ｍＭである（Ｓｌｏｎｅ　＆　Ｂｕｃｋｈｏｕｔ、　１９９１年、Ｐｌａｎｔａ　１８３　：　４８４〜５８９）。速度論のこの形は、輸送体タンパク質のかかわり合いを指示する。テンサイ、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびシクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ　ｐｅ−ｒｓｉｃｕｗ）に原形質膜に関する実験は、スクロースの輸送はプロトンの共輸送と関係があることを示した（Ｂ−ｕｃｋｈｏｕｔ、　１９８９年、Ｐｌａｎｔａ　１７８　：　３９３〜３９９　；　ｆｉｌｌｉａｍｓ等、１９９０年、Ｐｌａｎｔａｌ　８２　：　５４０〜５４５　；　Ｇｒｉａｎ等、１９９０年、Ｐｌａｎｔａｌ　８２　：　４８０〜４８５）。共輸送の化学量論は１：１である（Ｂｕｓｈ、１９９０年、Ｐｌａｎｔａ　Ｐｈｙｓｉｃｌ　９３　：　１５９０〜１５９６）。しかし、植物細胞のプラスモジウムを介するスクロース輸送の機構は提案されている（　Ｒｏｂ−ａｒｄｓ　＆　Ｌｕｃａｓ、　１９９０年、＾ｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔａ　Ｐｈ−ｙｓｉｃｌ　４１：３６９〜４１９）、細胞がスクロースを輸送路に分配させる活性輸送系の存在の認識にも拘らず、この種の性質を有するタンパク質はまだ知られていない。スクロースの存在および不在におけるテンサイの原形質膜のＮ−エチルマレインイミド染色において、ギヤレット（Ｇａ１ｉｅｔ）等（１９８９年、ＢｉｏｃｈｅｇＢｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　９７８　：　５６〜６４）は、大きさ４２ｋＤａのタンパク質はスクロースと相互作用しつるという情報を得た。この大きさ範囲の原形質膜タンパク質の両分に対する抗体は、原形質膜を通るスクロースの輸送を阻止することができる（　１Ｈｏｉｎｅ等、１９８９　年、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　９　７　８　：　６　５　〜７　１）。これとは異なり、膜を通るスクロースの輸送における６２ｋＤａタンパク質の関与に対する情報が、スクロース類似体、デスオキシアジドヒドロキシベンズアミドスクロースでの大豆タンパク質の光親和性標識によって得られた（　Ｒｉｐｐ等、１９８８年、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ１８８　：　１４３５〜１４４５）。スクロース輸送体のアミノ酸配列は知られていない。

ところで、オリゴ糖輸送体のコーディング領域を有しかつヌクレオチド配列に含有されているその情報が植物ゲノムへの配列組込みによってＲＮＡの形成を許し、それにより、植物細胞中での新しいオリゴ糖輸送活性を惹起することができるかまたは固有のオリゴ糖輸送活性を発現することのできるＤＮＡ配列を記載する。オリゴ糖輸送体なる用語により、たとえばホウレンソウまたはジャガイモのような植物からのスクロース輸送体を表わす。

オリゴ糖輸送体のコーディング領域の同定は、酵母サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ−ｓｉａｅ）の特殊な突然変異体における発現により輸送体分子をコードする植物ＤＮＡ配列の分離を許す方法によって実施される。この方法には、輸送体分子のコーディング領域が植物遺伝子ライブラリーから分離すべき物質を取込むことのできない適当な酵母突然変異体を用意すべきである。酵母突然変異体におけるカリウム輸送欠失の相補性に関する方法は既に公知である（＾ｎｄｅｒｓｏｎ等、１９９２年、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ８９：３７３６〜３７４０）。この方法においては、植物ｍＲＮＡに対する酵母ｃＤＮＡ配列は、発現ベクターの使用により酵母突然変異体に発現される。

細胞中へ輸送すべき物質を取込むことのできるこれらの酵母は発現ベクター中の輸送体分子のコーディング領域を含有する。しかし、公知方法は、酵母が突然変異によって遮断することのできる固有のスクロース輸送を有しないので、スクロース輸送体のコーディング領域の同定には有用ではない。酵母は細胞外スクロースを切断して、細胞からヘキソース輸送体を介して取込むことのできる切断インベルターゼをコードする。

植物オリゴ糖輸送体を同定するのに役立つ酵母株の製造および形質転換のためには：ａ）　第一に、インベルターゼにより切断することのできない欠陥ｓｕｃ　２遺伝子を有する酵母株を相同的組換えにより製造し、次いでこれからｂ）　植物細胞からのスクロースシンターゼ活性遺伝子で形質転換することにより、かつＣ）　この株を植物ｃ　ＤＮＡライブラリーで酵母細胞の発現ベクターに形質転換することによって、植物オリゴ糖輸送体をコードするＤＮＡ配列を同定するこの方法から得られる、植物オリゴ糖輸送体同定のための酵母株は、たとえば酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡ−３ＵＳＹ　（ＤＳＭ７１０６）ｌｉ、びＹｓＨ２，６４−ＩＡ　（ＤＳＭ７１０５）Ｔある。

酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡ−３ＵＳＹを用い！＋！：、次の配列を有する植物スクロース輸送体のＤＮＡ配列が同定される。

ホウレンソウからのスクロース輸送体（ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、１）：ＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣｋｃｃＣＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＴＡＴＴｒＣ入ＡＡＡＡＡ入ＡＣＡＴ　ＴＧＴＩ’入ＣＴＡＧＡ@６０ＡＡＴＣＩＴＡＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣ１０５Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ工ｌａ　ＬＹＳＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＡｓｎＡＡＧ　Ａ’ＩＴ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＣＡＣＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＣＣＣｋ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　１５０Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ａｌｌ　ＧＩＹ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｐｒｏ　！ｒｈｒ　ＴｈｒＣＣＣＣＣＣＧＡＧ　ＧＣＣＧＡＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣ’ Ｉ’ｒＡ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣＧＧＣＣＴＣＧＴＧ　ＧＣＴ　１９５Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｉ、ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ３０　コ５　４０ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＧＧ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＴＴＣＧＧＧ　ＴＧＧ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＣＣ２４０Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　５ｉｒＣＴＡ　ＣｒＧ　ＡＣＣＣＣＧ　ＴＡＣＧＴＣＣＡＡ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＧＧＣＡ’ＩＴ　ＣＣＣＣＡＣＡＣＴ　ＴＧＧ　２８５Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ＴｒｐＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧ　’Ｉ ’ｒＧ　ＴＧＣＧＧＣＣＣＡ　ＡＴＣＴＣＧ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＴＣココ０Ａｌａ　入１ａ　Ｔｙｒ　工１ａ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　工ｌａ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　工ｌａ　Ｖａ１ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＧＴＣＧＧＧ　ＴＡＣＴＡＴ　ＡＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＴＧＣＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＴＣ：１７５Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　’Ｉ’／ｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈａｇｃ）　９５　１００ＧＧＣＣＧＡ　Ｃ（、Ｔ　ＣＧＣＣＣＣＴｒＣＡＴＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＧＣＣ４２０Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ工ｌａ　Ａｌａλｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｖａｎ　ＡｌａＧＴＡ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＡ　ＡＴＣＧＧＡ　ＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴ　ＡＴＣＧＧＣＧＣＡ　ＧＣＧ　４６５Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ工１ａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ工ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ｋ１ａ１２０　１２５　ｌコ０ＴＣＧ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡＣＧＴＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＣＣＣＣＧＧ　ＧＣＣＡＴＣＧＣＧ　５１０Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｉ″Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　工１ａ　ＡｌａＧＴＧ　ＴｒＴ　ＧＴＧ　ＧＴＣＧＧＧ　ＴＴｒ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＴＣＧＡＣＧＴＧ　ＧＣＴ　ＡＡＣＡＡＣＡＣＣ５５５Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＴｈｒＣｒＧ　ＣＡＡ　ＧＧＣＣＣＡ　ＴＧＣＡＧＧ　ＧＣＧ　’ＩＴＧ　’ＩＴＡ　ＧＣＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＣＣＧＣＣＧＧＧ　６００Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　入ｒｑ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＧａｙＴＣＧ　ＣＡＡ　ＡＣＣＡＡＡ　ＡＣＣＣＧＧ　ＴＡＣＧＣｒ　ＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣ６４５ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈ１ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＴｒＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣＡＴＣＧＧＡ　ＧＧＧ　ＴＡＣＧＣＣＧＣＣＧＧＴ　ＴＣＡ　ＴＡＣＡＧ’Ｃ６９０Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　５ｉｒＣＧＣＣＴＣＴＡＣＡＣＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＣＣＣＴｌｆＴ　Ａｃｅ　ＡＡＡ　ＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣ７３５Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ２１０　：１５　２２０ＧＴＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＴ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＴＣＣＴにＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡ　７８０Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ｃ７ｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ工１ａ　Ｓｅｒ　工１ａ　Ｔｈｒ２２５　２コ０　２３５ＣＴＣＣＴＡ　ＡＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＡ　ＡＴＣＣＴＡ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＴＣＣＧＴＣＧＴＡ　ＭＡ　ＧＡＧ　８２５Ｌａｕ　Ｌａｕ工１ｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ工ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＣＧＴ　ＣＭ　ＡＴＣＡＣＡ　ＡＴＣＧＡＣＧＡＡ　ＡＴＣＣＭ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＭ　ＧＡＣＴＴＡ　ＭＡ　８７０Ａｒｇ　にｉｎ　工１ａ　Ｔｈｒ工ｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ工１ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ６５ＣＡＧＧＡ　ＭＣＭＴ　ＡＧＣＡＧＣＧＧＴ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＴＴＣＴＩ’ＣＧＧＡ　９１５Ａｓｎ　Ａｒｇ　ｘｓｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｇ１’Ｖ　Ｃ’ｆ５　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈｉ　ＧＩＹＣ入Ａ　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＧＧＣＧＣＴ　ＣＴＣＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　ＡＴＣ９６０Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　工１ｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　工１ｅＣＴＡ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＧＣＣＣＴＡ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣＧＣＡ　ＴＧＧ　ＴｒＴ　ＣＣＡ　ＴＴＣ１００５Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ工１ｅ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅコ００　３０５　３１０ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＧＭ　ＧＴＧ　ＴＡＣＧＧＴ　ＧＧＴ　１０５０Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＡＧＰ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＡＣＡ　ＧＴＣＧＧｋ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＡＣＧＡＣＣＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＣＧＧＴ　１０９５Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　ＧｌｙＧＣＣＴＴＡ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＡＣＴＣＣＧ’ｌＴ　ＧＴＣＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＴＴＡＴＧ　ＴＣＧ　１１４０Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍａｔ工ｌｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　５ｉｒ’Ｉ’ Ｃ’Ｇ　ＡＧＴ　ＡＴＴＧＡＡ　ＧＧＴ　ＴＴＧ　ＧＣｒ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＧＧＣＧＧＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　１１W５Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｘ１ｍ　Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ｌａｕ　Ａ１ａ　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇコロ０　３６５　コア。

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さらに、コーディング領域は、該領域を正確に転写することのできる転写終結シグナルを備えていなければならない。かかるエレメントも記載されている（Ｇ− ｉｅｌｅｎ等、１９８９年、ＥＭＢＯＪ８：２３〜２９）。転写出発領域は、宿主植物に対して天然および／または相同ならびに異種および／または異型の双方であってもよい。必要に応じ、終結領域は相互に交換可能である。転写出発および終結領域は合成により形成するかまたは天然に得ることができるか、または合成および天然ＤＮＡ成分の混合物から得ることができる。高級植物における異種遺伝子の導入のためには、Ｅ。

コリの複製シグナルおよび転写された細胞の選択が可能な遺伝標識を含有する多数のクローニングベクターが利用しうる。かかるベクターの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ’ｚリーズ、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　ンリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４等である。植物中へ所望の遺伝子を導入する方法に依存して、他のＤＮＡ配列も適当である。たとえば植物細胞を形質転換するためにＴ１−プラスミドまたはＲｉ−プラスミドを使用する場合には、導入される遺伝子に、フランキング領域として、Ｔｉ−およびＲｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右境界が付着されるが、しばしば右および左境界が付着される。

植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は集中的に研究され、ヨーロッパ特許第１２０５１６号、Ｈ−ｏｅｋａｍａ、　Ｉｎ：Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ；０ｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、＾ｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ、（１９８５年）、ｖ章：　Ｆｒａｌｅｙ等、　Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　ＰｌａｎｔＳｃｉ、、　４　：　１〜４６およびＡｎ等（１９８５年）ＥＭＢＯＪ、４：２７７〜２８７に十分に記載されている。一度、導入されたＤＮＡがゲノム中に組込まれると、一般に安定であり、もとの形質転換された細胞の子孫中にも残留する。通常、選択マーカーを含有し、これがカナマイシンＧ４１８、プレオマイシン、ハイグロマイノンまたはホスフィノトリシン等のような生物致死剤または抗生物質に対し形質転換された植物細胞中で耐性を惹起する。従って、使用される個々のマーカーは、導入されたＤＮＡを欠如する細胞から形質転換された細胞の選択が可能である。

植物宿主細胞中へＤＮＡを導入するためには、アグロバクテリウム菌を用いる形質転換のほかに、多数の他の技術が利用しつる。これらの技術は、プロトプラスト、ＤＮＡのマイクロ注入およびエレクトロポレーション、ならびにパリスティック法（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　＋ｎｅｔ−ｈｏｄｓ）およびウィルス感染を包含する。形質転換された植物材料から植物全体を、選択のための抗生物質または生物致死剤を含有する適当な培地中で再生することができる。次に、得られた植物は、導入されたＤＮＡの存在を調べることができる。注入およびエレクトロポレーションにおいてプラスミドに対して特殊な要求は加えられない。たとえばｐＵＣ誘導体のような簡単なプラスミドを使用することができる。しかし、かかる形質転換された細胞から植物全体を再生する場合には、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。形質転換された細胞は植物中で普通に成長する（ｌｌｃＣｏｒｍｉｃｋ等（１９８６年）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　５　：８１〜８４参照）。これらの植物は普通に成長しかつ同じかまたは異なる形質転換遺伝子を有する植物と交雑することができる。得られるハイブリッド個体は相応する表現型特性を有する。

本発明のＤＮＡ配列はプラスミドに導入することもでき、これにより原核細胞における発現のためにかじ取エレメントと結合することもできる。さらに、細菌からの原核マクロース輸送体の翻訳可能なＲＮＡの形成は、原核生物および真核生物の膜構造における著しい相違にも拘らず、意外にもスクロースを取込みうる原核生物を生じる。これにより、比較的廉価な基質スクロース上で成長しつる工業的に重要な株の生産が可能となる（例５参照）。たとえば細菌アルカリゲネスユートロフス（＾ｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）中でのポリヒドロキシ酪酸の製造が記載されている（　５ｔｅｉｎｂｕｅｃ−ｈｅｌ　＆　５ｃｈｕｂｅｒｔ、　１９８９年、Ａｒｃｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌ　５３：１０１〜１０４）。しかし、細菌単独では使用される基質選択が非常に制限される。そゆ故、なかんずくアルカリゲネスユーロフス中でのスクロース輸送体の遺伝子の発現は、極めて重要である。

本発明のＤＮＡ配列は、原核または真核系中でのＤＮＡ配列の組換えによる配列変更または突然変異誘発を許すプラスミド中へ導入することもできる。こうして、スクロース輸送体の特異性を変更することができる。

標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９年、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：＾　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒ　ＰｒｅｓｓＳＮ　Ｙ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）を使用することにより、塩基交換を実施することができるか、または天然または合成配列を加えることができる。ＤＮＡフラグメントを互いに結合するためには、該フラグメントに対しアダプターまたはリンカ−を導入することができる。さらに、適当な制限切断部位の形成または過剰のＤＮＡまたは制限切断部位を除去する操作を実施することができる。たとえばトランジションおよびトランスバージョンのような挿入、欠失または置換を実施すべき場合には、生体内突然変異誘発、プライマー修復または連結反応を使用することができる。合成方法には、一般に配列分析、制限分析および他の生化学的分子生物学的分析方法を使用することができる。各操作後、使用したＤＮＡ配列を切断し、他のＤＮＡ配列と結合することができる。

各プラスミド配列は、同じかまたは異なるプラスミド中へクローニングすることができる。

本発明のＤＮＡ配列およびプラスミドの誘導体または部分は、原核および真核細胞の形質転換のために使用することもできる。さらに、本発明のＤＮＡ配列は、スクロースまたは他のオリゴ糖輸送体分子をコードする種々の種の植物のゲノムにおける類似配列を分離する標準方法によって使用することができる。これらの配列を用いると、植物細胞を形質転換するための、形質転換した植物中での輸送法を変更する構築を形成することができる。

関連したＤＮＡ配列を特定するためには、まず、植物型の遺伝子中の含量または植物型における遺伝子の発現に代表的な遺伝子ライブラリーを製造しなければならない。前者はゲノムライブラリーであり、後者はｃＤＮＡライブラリーである。これから、関連する配列を、プローブとして本発明のＤＮＡ配列を使用して分離することができる。いったん関連する遺伝子を確認し、分離すれば、配列の決定およびこの配列からコードされたタンパク質の性質の分析が可能である。

本発明の基礎を形成する実施例を理解するため、これらの試験のために必要で自体公知のすべての方法を列挙するクローニングのためには、λファージＺＡＰＩＩならびにベクターｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋ　（５ｈｏｒｔ等、１９８８年、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６　：　７５８３〜７６００）が使用された。

酵母の形質転換のためにはベクターＹ　Ｉ　ｐｌａｃｌ　２８およびＹ　Ｅ　ｐｌａｃｌ　１２　（Ｇｉｅｔｚ　＆　Ｓｕｇｉｎｏ、１９８８年、Ｇｅｎｅ７４　：　５２７〜５３４）が使用された。

植物形質転換のためには、２成分ベクターｐＢｉｎＡ　Ｒ（Ｈｏｅｆｇｅｎ　＆　ｆｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、　１９９０年、Ｐｌａｎｔ　５ｃｉ６６：２２１〜２３０）中の遺伝子構築がクローニンｐＢｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋベクターならびにｐＢｉｎＡ　Ｒ構築のためには、Ｅ、コリ菌株Ｘ　Ｌ　１　ｂｌｕｅ　（ＢｕｌＬｏｃｋ等、１９８７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　５．３７６〜３７８）が使用された。

本発明の酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡ−ｓｕｓｙ製造のため出発味としては、株ＹＳＨ２゜６４−ＩＡ　（Ｇｏｚａｌｂｏ　＆■ｏｈｓａｎｎ、　１９９０年、Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔｌ　７　ニア７〜７９）が使用された。

ジャガイモ植物中のプラスミドの形質転換は、アグロバクテリウム゛ンメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔ−ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＬＢＡ４４０４　（Ｂｅｖａｎ（１９８４年）　１ｌｕｃｌ　＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｌ　２　：　８７１１〜８７２０）を使用して実施された。

３、アグロバクテリウム　ツメファシェンスの形質転アグロバクテリウム属菌中でのＤＮＡの伝達は、ヘフゲン（Ｈｏｅｆｇｅｎ）およびウイルミツツ７−　（ｆｉｌｌｍｉ−ｔｚｅｒ）　（１９８８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｌ　６　：　９７８８）の方法による直接形質転換によって実施された。形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドＤＮＡは、バーンポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリイ（Ｄｏｌｙ）　（（１９７９年）　Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５７　：　１５１３〜１５２３）の方法により分離され、適当な制限切断後、ゲル電気泳動によって分析された。

４、植物形質転換無菌ジャガイモ栽培の、スカルペル（５ｃａｌｐｅｌ）で傷をつけた小さい葉を、アグロバクテリウム　ツメファシェンス３０〜５０μｌを含有する、スクロース２％を有するＭＳ培地ＩＱｍｌに入れ、夜とおし、選択下培養成長させた。３〜５分の穏和な振とうの後、葉を、グルコース１．６％、ゼアチンリボース２ｍ＋／ｌ。

ナフチル酢酸０．０２ｍ５／ｌ、ジベレリン酸０．０２諷ｔ／１．クラホラン（Ｃ１ａｆｏｒａｎ）　５００　ｓｒ／　ｌ、カナマイシン５０菖＋／１およびバクトアガール０．８％のＭＳ培地上に塗布した。２５℃、３００ルツクスで１週間の保温後、培地中のクラホラン濃度は半分に減少した。

」−μ 次のプラスミドおよび酵母株は、１９９２年６月１２日にドイツ国ブラウンシュワイグ在ドイツ微生物収蔵所（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（ＤＳＭ）に寄託された（寄託番号）ニブラスミド　ｐ　５Ｋ−３２１（ＤＳＭ７１１５）酵母株　ＹＳＨ２，６４−ＩＡ−８ＵＳＹ（ＤＳＭ７１０６）酵母株　ＹＳＨ２，６４−ＩＡ−ＩＮＶ（ＤＳＭ７１０５）酵母細胞中でのスクロース取込みのタイムパターン“ｐｍｏｌ／ｓｒ細胞“＝酵母細胞の含湿重量ｍｌに対する、１４Ｃ標識スクロースの量ｐｍｏｌであり：　 “１１２”＝出発味（輸送体なし）を表わし、”＋グルコース”＝ｌＱｍＭグルコースの培地中での細胞の前保温を表わし：　“−グルコース”＝細胞の前保温なしを表わし：″２　、５　ｔｔ　Ｉ−！　ＣＣＣＰ”＝濃度２．５μＭの阻害剤力ルポニルンアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）との共保温を表わし：“５００μＭＰＣＭＢＳ”＝濃度５００μＭの阻害剤ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸（ＰＣＭＢＳ）との共保温を表わし；″１０μＭアンチマイシン”＝１度１０μＭの阻害剤アンチマイノンとの共保温を表わす。

図　２プラスミドｐＭＡ５−ＩＮＶのクローニング。ｐＳＥＹＣ３０６−１からの大きさ２　、４　ｋｂの口１ｎｄＩＩＩフラグメントのｐＭＡ５−１０中への挿入を示す。

図　３プラスミドｐＢｉｎＡＲ−３２１を示す。

図中：ＣａＭＶ３５ｓプロモーター：カリフラワーモザイクウィルスの３５　ｓ　ＲＮＡの遺伝子のプロモーターＡ：ホウレンソウ中のスクロース輸送体のコーディング領域、読取り方向に配向ＯＣＳ　：アグロバクテリウムツメファシエンスからのオクトピンシンターゼのターミネータ−３＋＊ａＩ　、ＮｏｔＩ　、Ｂａｍ［ＩＩ　：制限酵素の切断位置図　４　。

プラスミドｐＢｉｎＡ　Ｒ−Ｐ　６２−　ａｎｔｉを示す。

図　中　：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター：カリフラワーモザイクウィルスの遺伝子のプロモーターＯＣＳ　：アグロバクテリウムツメファシエンスからのオクトピンシンターゼのターミネータ−３ａ＋ａＩ　、ＮｏｔＩ　、ＢａｍＨＩ　、　ＸｂａＩ　：制限酵素の切断位置図　５　・葉中）種々ノ炭水化物のＢｉｎＡ　Ｒ−Ｐ　６２−ａｎｔｉ形質転換体の含量図　中　：ｆｒｕ：フルクトースＳＵＣニスクロースｓｔａ　：デンプンｃｏｎｔｒｏｌ　：形質転換されてない出発物質ｓｐ　−５〜ｓｐ−４３：個々の数字を有する形質転換体図　６　：ＢｉｎＡ　Ｒ−Ｐ　６２−ａｎｔｉ形質転換体のペチオール（ｐｅｔｉｏｌｅｓ）からの炭水化物の流出Ｗｔ：野生型ｓｐ　−５ないしｓｐ−４３：個々の数字を有する形質転換体次側は、酵母株の製造、同定ならびに植物スクロース輸送体の機能および用途を記載する。

■−ユ酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡ−８ＵＳＹおよびＹＳＨ２，６４−ＩＡ−ＩＮＶの調製酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡは特性ｓｕｅ　−２−１ｍａｌ。

、１ｅｕ２、ｔｒｐ　ｌを有する（　Ｇｏｚａｌｂｏ　＆　■ｏｈｍａｎｒ＋、　１９９０年、Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔｌ　７　：　７７〜７９）　ｏこの株中にスクロース切断酵素活性を導入するために、酵母からのアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子のプロモーターに融合するように、ジャガイモからのスクロースシンターゼのコーディング領域を含有する組込みプラスミドＹＩｐｌａｃ１２８Ａ２−ＳＵＳＹで形質転換した。プラスミドＹ　Ｉｐｌａｃｌ　２８Ａ２−３ＵＳＹは次のように製造した。プラスミドＹ　Ｉ　ｐｌａｃｌ　２８　（Ｇｉｅｔｚ　＆Ｓｕｇｉｎｏ、１９８８年、Ｇｅｎｅ７４　：　５２７〜５３４）をＰｓｔ　ＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、分解および／または突出する１本鎖中へ充填およびポリリンカーの領域中での連結反応によって短かくした。残存Ｓｐａ　Ｉ切断位置において、７２８ｐｂカセツトを、プラスミドｐＶＴ　１０２　Ｕ　（Ｖｅｒｎｅｔ等、１９８７年、Ｇｅｎｅ５２　：　２２５〜２３３）からのアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターを用いて挿入した。こうして、Ｙ　Ｉ　ｐｌａｃ１２８Ａ２が得られた。スクロースシンターゼのコーディング領域は、オリゴヌクレオチドＵＳＹＩ（ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣ＾＾ＴＧＧＣＴＧ＾＾ＣＧＴＴＴＴＴＧＡＣＴＣＧＴＧ）およびＳＵＳＹ２（ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣ＾＾ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴ）とのポリメラーゼ連結反応によってジャガイモからのスクロースシンターゼのλクローンに増幅した（　５ａｌａｎｏｕｂａｔ　＆　Ｂｅ１ｌｉａｒｄ、　１９８７年、Ｇｅｎｅ６０　：　４７〜５６）。生成物から、コーディング領域をＢａ■ｔｌＩフラグメントとして製造し、カセットのポリリンカーのＢａｍＨＩ切断部位に挿入した。酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡは、こうして製造したプラスミドＹＩｐｌａＣ１２８Ａ２−３ＵＳＹで形質転換した。このプラスミドは２μ領域を有しないので、酵母中で自律複製することはできない。それ故、かかる形質転換細胞だけが、ロイシン栄養要求性を獲得し、プラスミドＤＮＡを少な（とも部分的に染色体的に組込む。

ロインン独立栄養生物コロニーを、スクロースシンターゼ遺伝子の発現のために分析した。このために５寓ｌ液体培養の細胞をガラス七を加え激しく振とうすることにより分解し、次いで遠心分離した後、上澄みからの全タンパク質を、酵素活性測定のために加えた。

発現されたスクロースシンターゼの活性は２５ｍＵ／ｍｇタンパク質を有する。

類似に、インベルターゼ活性を酵母株ＹＳＨ２，６４−ＩＡ中へ導入し、この中でプラスミドＹ　Ｉ　ｐｌａｃ１２８Ａ１−ＩＮＶの助けにより、サイドシルの切断不能のインベルターゼの遺伝子を酵母ゲノム中に染色体的に組込んだ。ＹＩｐｌａｃ１２８Ａ１−ＩＮＶは、スクロースシンターゼのコーディング領域の代りに、遺伝子産物の輸出のためのシグナル配列を欠如するインベルターゼ遺伝子を含有する。プラスミドの前駆体はプラスミドＹ　Ｉ　ｐｌａｃｌ　２８　Ａ　１であり、このものはＹＩｐｌｃｌ　２８　Ａ　２とはアルコールデヒドゲナーゼ遺伝体のプロモーターを有するカセット中のポリリンカーの配向が異なる。このプラスミドのカセットは、プラスミドｐＶＴ　１００　Ｕ　（Ｖｅｒｎｅｔ等、１９８７年、Ｇｅｎｅ５２・２２５〜２３３）から誘導される。このインベルターゼのコーディング領域は、ｓｕｅ　２遺伝子のＤＮＡにおいて、オリゴヌクレオチドＩＮＶ３（ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣ＾＾＾ＣＧＡ＾＾ＣＴＡＧＣＧＡＴＡＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＡ）（ＧＡＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴ＾＾ＣＣＴＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＣＣＣＴＴＡＣＴＴＧＧ＾＾）とのポリメラーゼ連鎖反応によって得られた。コーディング領域は、ＰｓｔＩおよびＸｂａ　Ｉを使用して線形化ベクターＹ　Ｉｐｌｃｌ　２　Ｓ　Ａ　１ｄｅｎ中へ結合した。酵母細胞中に発現したインベルターゼ活性の酵素活性の試験は、酵素細胞からの全タンパク質１１あたり５１３ｉＵの酵素活性を生じた。

成長するホウレンソウおよびジャガイモ植物の葉組織からのポリアデニル化ＲＮＡから、λファージＺＡＰ■ライブラリー中のｃＤＮＡのライブラリーを製造した。５０００００　ＰｆｕからＤＮＡファージを製造し、塩化セシウムサルコンルグラジェントを使用して精製した。酵素ＮｏｔＩでＤＮＡファージを切断した後、１％アガロースゲル上で上下１　、５　ｋｂｐの大きさ範囲からの挿入体を製造し、発現ベクターＹＥｐＬｃｌ１２ＡＩＮＥのＮｏｔＩ切断部位に結合した。該ベクターは、ベクターＹ　Ｅ　ｐｌｃｌ　１２　（Ｇｏｚａｌｂｏ　＆　ＩＴｏｈｍｚｎｎ、　１９９０年、Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｔｌ　７　：　７７〜７９）の誘導体であリ、それを用いて、例１に記載したように、ポリリンカーをアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターと交換した。カセットのポリリンカーは、再び酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａ　Ｉで切断することにより除去し、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を導入する２本鎖オリゴヌクレオチドにより置換した（配列：　ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧ＾＾ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣ＾）。

Ｅ、コリ中での形質転換により、下方１　、５　ｋｂｐの大きさ範囲に対し約９００００クローンおよび上方１．５ｋｂｐの大きさ範囲に対し約４００００クローンが得られた。これらから、プラスミドＤＮＡを製造した。２ｔｔｔＤＮＡを、酵母株Ｙ　Ｓ　Ｈ２，６４−Ｉ　Ａｓｕｃ−，５ｕｓｙ中で１４回形質転換した。形質転換細胞をグルコース２％を含有する媒地上で成長させ、それぞれ５〜１０．０００を寒天平板液体培地で洗浄し、スクロース含有培地上に塗布した。

急速に成長しえたこれらのクローンをさらに分析した。ベクターＹ　Ｅｐｌａｃｌ　１２　Ａ　ＩＮＥ中への形質転換体Ｓ２１またはＰ６２の挿入（ＹＥｐｌａｃｌ１２ＡＩＮＥ−Ｓ２１）を配列決定した。配列は上記に記載されている。

酵母形質転換体ＹＥｐｌａｃｌ１２ＡＩＮＥ−３２１（例２において得られたものに一致）を、液体培地中で、培養が対数期に達するまで成長させた。培地を遠心分離した後、細胞を、グルコース含有培地中で５分間前保温し、次いで１４Ｃ標識スクロース含有培地中に入れた。標識スクロースの取込み量をチリ口（Ｃ１ｒｉｌｌ。

）（１９８９年、１ｌｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌｌ　７４　：　６１７〜６２２）により記載された方法により測定した。グルコースとの前保温なしの標識スクロースの取込み量を、阻害剤カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）　、ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸（ＰＣＭＢＳ）およびアンチシアニンと同時保温したものと比較した。時間パターンは図１に示されている。阻害剤によるスクロース取込み量の減少計算値は表Ｉに示されている。標識スクロースの競合体として種々の糖を用いる比較実験（それから輸送体の特異性を読取ることができる）は表■に示されている。

類似の測定を、酵母株ＹＥｐｌａｃｌ　１２ＡＩＮＥ−Ｐ６２を用いて実施した。

スクロースを取込み代謝しうるためには、単糖の酵素切断活性を有する細菌細胞が必要である。かかる活性を導入するために、細菌をプラスミドｐＭＡ５−ＩＮＶにより形質転換し、インベルターゼ活性を調べた。プラスミドｐＭＡ５−ＩＮＶは次のように製造した。プラスミドｐ　Ｍ　Ａ　５−１０　（５ｔａｎｓｓｅｎｓ等、１９８９年、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５１７　：　４４４１〜４４５４）を、ポリリンカーのＢｉｎｄｌ［［切断部位で線形化した。プラスミドｐ　Ｓ　ＥＹＣ３０６１（Ｔａｕｓｓｉｇ　＆　Ｃａｒｌｓｏｎ、１９８３、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｌ　１　：　１９４３〜１９５４）の２　、４　ｋｂ　）Ｉｉｎｄｌ［［フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位中へクローニングした。プラスミドの相応するカットアウトは表Ｈに示されている。プラスミドｐＭＡ５−ＩＮＶで形質転換した細菌細胞中のインベルターゼの酵素活性を、ゲル電気泳動活性試験において公知方法で測定した。細菌細胞中での植物ｃＤＮＡの発現による官能スクロース輸送体形成の可能性を、プラスミドｐＳＫ−３２１でのＥ、コリの形質転換によって調べた。該プラスミドは例３に記載されている。

ｐＳＫ−３２１での細菌細胞の形質転換後、スクロース取込み量の試験を実施した。

ホウレンソウおよび／またはジャガイモからのスクロース輸送体のｃＤＮＡを挿入体として、含有するベクターＹＥｐｌａｃｌ　１２Ａ　Ｉ　ＮＥ−３２１およびＹＥｐ−１ａｃｌ　１２ＡＩＮＥ−Ｐ６２　（例２および例３参照）から、該挿入体をＮｏｔｌ切断後に分離し、プラスミドｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　−Ｓ　ＫのＮｏｔ切断部位に結合した（ｐｓＫ−８２１および／またはｐＳＫ−Ｐ６２）。ｐｓＫ−３２１に対しては、挿入をＳａｃ　Ｉ　／　Ｘｂａ　Ｉフラグメントとして行ない、突出する１本鎖ＤＮＡ中に充填した後、あらかじめ酵素Ｓｅａ　ＩおよびＸｂａ　Ｉで切断したｐＢｉｎＡＲ（Ｈｏｅｆｇｅｎ　＆　Ｙｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、１　９　９　０　年、　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉ６６　：　２２１〜２３０）中に“センス（５ｅｎｓｅ）　”配向でクローニングした。得られるプラスミドｐＢｉｎＡ　Ｒ−３２１（図３参照）は、スクロース輸送体を過剰発現（ｏｖｅｒ　−ｅｘｐｒｅｓｓ）するため、植物の形質転換のために挿入することができる。ｐＳＫ−Ｐ６２に対しては、挿入体を１．７ｋｂ　ＮｏｔＩフラグメントとして分離し、２成分ベクターｐＢｉｎＡ　ＲのＳｍａ　Ｉ切断部位中へ “アンチセンス”配向でクローニングした（図４参照）。このプラスミドは、スクロース輸送体発現の“アンチセンス”阻止を目指す植物の形質転換のために適当である。

次いで、形質転換アゲロバクチリアを、タバコおよびジャガイモの葉セグメントの感染のために使用した独立に得られた形質転換体（この中に組換えられていないもとのキメラタンパク質の存在がサザンブロッティング分析により証明された）を、スクロース、ヘキソースおよびデンプン含量における変化をそれぞれ調べた。

ｐＢｉｎＡ　Ｒ−Ｐ　６２−　ａｎｔｉからのＴ−ＤＮＡを含有する形質転換体は葉におけるデンプン、ヘキソースおよびスクロースの著しく増加した濃度を示した（図５参照）。植物から採取した葉柄からの炭水化物の流出は水性媒体中では著しく減少する（図６参照）。これらのデータから、光合成活性器官からの光間化体の輸送路のスクロース輸送体の有意性は明瞭に認められる。

輸送体の活性阻止は炭水化物の輸送路を制限するので、これはたとえばプラスミドｐＢｉｎＡＲ−Ｓ２１を用いる過剰発現の場合における貯蔵器官への光間化物の輸送低下から生じる。さらに、ｐＢｉｎＡ　Ｒ−８２１からのＴ−ＤＮＡが組込まれているタバコ植物は減少した頂芽優性を示す、つまり該植物はブシー成長（ｂｕｓｈｙ　ｇｒ−ｏｗｔｈ）を示す。かかる表現型変化は、たとえばトマト植物において非常に望ましい。それ故、本発明のＤＮＡ配列（Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ、１）を有するプラスミドｐＢｉｎＡＲ−３２１はブシー成長のような重要な育種改善の目的で植物を変更するのに適当である。

表　Ｉ阻害剤　スクロース輸送体＊（％）Ｃｏｎｔｒｏｌ　１０００．５μＭ　ＣＣＣＰ　６５２．５μＭ　ＣＣＣＰ　２１２５μＭ　ＰＣＭＢ５　７３１００ＭＭ　ＰＣＭＢ５　２１２５μＭ　２．４−ＤＮＰ　６１１００μ麗２．４−ＤＮＰ　９１ｍ１ｌヒ酸ナトリウム　３４１０μＭ　ａｎｔｉＢｃｉｎ＾　５９１ｍ　ｃＡＭＰ　１０２ｃｃｃｐ＝カルポニルンアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾンＰＣＩＢＳ＝　ｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸２．４−ＤＮＰ＝２．　４−ジニトロフェノール本＝Ｙ　Ｅｐｌａｓ　１１２　ＡＩＮＥ−３２１に関して（対照）表　■ 競合体　スクロース輸送本（％）対　照　１００２ｍＭ　スクロース　２８２１１Ｍ　マルトース　５８１Ｑ＋ａＭ　マルトース　３７２ｍＭ　フェニルグルコシド　７２ａＭ　フロリジン　１６２ｔｌｌ　ラクトース　９１１０ｍＭ　パラチノース　１０２１Ｏ口滅　トレハロース　１０３本＝ＹＥｐｌａｃｌ１２ＡＩＮＥ−８２１に関して（対照）、、、−一、、Ｎ、　ＰＣＴ／ＥＰ　９３１０１６０４ＰＣＴ／ＥＰ　９３１０１６０４フロントページの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：０１）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．オリゴ糖輪送体のコーディング領域を有するＤＮＡ配列において、ヌクレオチド配列に含まれている情報が、植物ゲノム中への配列組込みにより、ＲＮＡの形成を可能にし、かっこのＲＮＡで新しい植物細胞中への新しいオリゴ糖輸送活性を導入することができるかまたは内在性オリゴ糖輸送体活性を発現することができ、これにより貯蔵物質の形成および輸送が変化することを特徴とするオリゴ糖輸送体を有するＤＮＡ配列。
２．下記のヌクレオチドド配列（Ｓｅｑ−ＩＤ　Ｎｏ．１）：【配列があります】を有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。
３．次のヌクレオチド配列（Ｓｅｑ−ＩＤＮｏ．２）【配列があります】を有することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。
４．請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とするプラスミド。
５．プラスミドｐＳＫ−Ｓ２１（ＤＳＭ７１１５）。
６．原核細胞および真核細胞の形質転換のために、請求項３から５までのいずれか１項記載のプラスミドまたはその誘導体または部分の使用。
７．請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ配列を有する植物。
８．請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ配列を有する細菌。
９．スクロースを取込むことのできる細菌の製造のために請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ配列の使用。
１０．輸送体の変化した特異性を有するプラスミドの製造のために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のＤＮＡ配列の使用。
１１．植物ゲノムから類似の配列を分離するために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のＤＮＡ配列の使用。
１２．細胞中のスクロース輸送体の合成を可能にする、翻訳可能ｍ−ＲＮＡの発現のために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のＤＮＡ配列の使用。
１３．細胞中の内在性スクロース輸送体を妨げる翻訳不可能ｍ−ＲＮＡの発現のために、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体の使用。
１４．原核細胞中での発現のために、かじ取エレメントと組合せて、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ糖輸送体のＤＮＡ配列の使用。
１５．植物オリゴ糖輸送体を同定するのに役立つ酵母株の製造および形質転換方法において、ａ）最初に■インベルターゼにより切断することので■■■欠陥ＳＵＣ２遺伝子を有する酵母株を■■同組換えにより製造し、次にこれからｂ）植物細胞からのスクロースシンターゼ活性のための遺伝子で形質転換することにより、細胞内スクロースを切断しうる酵母株を抽出し、かっｃ）この菌株を、酵母細胞の発現ベクター中の植物ｃＤＮＡライブラリーで形質転換することにより、植物オリゴ糖輸送体をコードするＤＮＡ配列を同定することを特徴とする醇母株の調製および形質転換方法。
１６．請求項１５記載の方法により得られる、植物オリゴ糖輸送体同定のための酵母株。
１７．酵母株２．６４−１Ａ−ＳＵＳＹ（ＤＳＭ７１０６）。
１８．酵母株ＹＳＨ２．６４−１Ａ−ＩＮＶ（ＤＳＭ７１０５）。
１９．植物オリゴ糖輸送体同定のために、請求項１６から１８までに記載の酵母株の使用。
２０．スクロース輸送体の過剰発現のため植物の形質転換のために、実施例５により製造された、プラスミドｐＢｉｎＡＲ−Ｓ２１の使用。
２１．スクロース輸送体の発現の“アンチセンス”阻止のため植物の形質転換のために、実施例５により製造された、プラスミドｐＢｉｎＡＲ−Ｐ６２−ａｎｔｉの使用。
２２．重要な育種特性を改善する目的で植物を変性するために、ＤＮＡ配列ＳｅｑＩＤ　Ｎｏ．１を含有するプラスミドｐＢｉｎＡＲ−Ｓ２１の使用。