JPH07509135A - ゲオトリクム・カンジダの突然変異株により生成された酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 により生成される新規なリパーゼ、即ち、他の飽和および不飽和脂肪酸エステル 類、例えば、パルミトレイン酸エステル類およびステアリル酸エステル類より高 い率でオレイン酸エステル類を選択的に加水分解するＵＮリパーゼに関する。

２、本発明の背景 グリセリド切断は、飽和と不飽和脂肪酸または脂肪酸鎖長を区別しない高温蒸気 処理を使用して工業分野で典型的に行われる。緩やかな低エネルギー要求条件で の有効なグリセリド分解の触媒として酵素類、特に、リパーゼ類を使用すればそ れらの先行技術より多数の経済的な利点をもたらすであろう。低濃度のオレイン 酸を含む脂肪類または油類から高純度のオレイン酸を生成する選択的リパーゼを 使用すればそれらの先行技術より更に経済的な利点をもたらすであろう。

Ａ、リパーゼ、一般に リパーゼは、エステラーゼ類に属する一群の酵素類であり、グリセロエステルヒ ドロラーゼ類またはアンルグリセロールーアシルヒドロラーゼ類とも称する。

それらの酵素類は（グリセリドのようなエステル形態で存在する）脂肪および油 類を加水分解し、グリセロールおよび脂肪酸類の構成成分を生成する。それらの 酵素類は消化も触媒する。リパーゼ類はカビ類、細菌類、乳および乳製品および 動物組織（例えば、膵臓）を含む植物界および動物界に広く存在する。リパーゼ は影響を受け易い成分、例えば、ビタミンまたは不飽和脂肪酸類を破壊すること なく脂肪類を分解するために広く使用されている。（メルク・インデックス、第 ８６８頁）。

リパーゼ類は、一般に、位置特異性および脂肪酸特異性である２つの型の特異性 を有する。位置特異性（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）また は位置特異性（ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は、リパーゼ類がトリグリ セリド骨格上の特定の位置でエステル結合を分解することを可能にする。アスペ ルギルス・ニガーリパーゼ類はこの型の特異性を示す。ハタ他著、ジャーナル・ オブ・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、第８６巻、第６号、第 １８２１〜１８２７頁（１９８６年）参照。膵リパーゼおよびシュードモナス・ フラジリパーゼは１−位、３−位でトリグリセリド類を攻撃するらしい。アルフ ァード（＾１ｆｏｒｄ）他著、ジエイ・ニー・オー・シー・ニス（ＪＡＯＣ３） 　、第４２巻、第１０３８〜１０４０頁（１９６１年）参照。

総脂肪分解の理想的リパーゼは、以下の特性を有する＝１）広い基質特異性、２ ）顕著な干渉がない、３）高い特異活性、４）１００％の加水分鮮度。

脂肪酸特異性はエステル結合の全てを無差別に分解するリパーゼに見られる。

ある程度の脂肪酸特異性は数種のゲオトリクム・カンジダムリバーゼ中に発見さ れている。ハタ他著、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　）、第８６巻、第６号、第１８２１〜１８２７頁（１９８６年）参照 。それらのリパーゼは、ある鎖長の脂肪酸または二重結合の位置に一般的に特異 的である。オスチルベルブ他著、ジエイ・ニー・オー・シー・ニス（ＪＡＯＣ３ ）　、第６６巻、第９号（１９８９年）参照。

のサワークリームおよびチーズ上で成長することが判明している。ジエンセン（ Ｊｅｎｓｅｎ）著、リピッズ（Ｌｉｐｉｄｓ）　、第９巻、第１４９〜１５７頁 （１９７４年）参照。これは比較的選択性のあるリパーゼであることが周知のも のである。広範囲に亘る研究がゲオトリクム・カンジダムリパーゼにおいて行わ れているが、実際に選択性リパーゼを得ることに関してほとんど成功していない 。

ゲオトリクム・カンジダムリバーゼが短鎖脂肪酸類および飽和脂肪酸類よりオレ イン酸を含むトリグリセリド類への選択性を有するということは周知であるけれ ど、リパーゼが本発明の酵素である不飽和−特異性リパーゼを意味するＵＮリパ ーゼにより示されるオレイン酸選択性のレベルに達していないということを先行 技術の厳密な試験は示している。先行技術の以下の論議を参照のこと。

３．関連技術の詳細な説明 以下に上記の科学的な引例から抜粋されたゲオトリクム・カンジダムリバーゼの 簡潔な説明である。

ウィルコックス、ンエー・シー（Ｗｉｌｃｏｘ、Ｊ、Ｃ，）、ネルソン、ダブリ ュー・オー（Ｎｅｌｓｏｎ、　ｌ、　Ｏ，）およびウッド、ダブリュー・工（Ｗ ｏｏｄ、　１．＾、）著、ジャーナル・オン・ディリー・サイエンス（Ｊ、　Ｄ ａｉｒｙ　Ｓｃｉ、　）、第３８巻、第７７５号（１９５５年）。

ゲオトリクム・カンジダムリパーゼはオリーブ油を加水分解するが、バター脂を 加水分解しないので、このリパーゼはシス−９＝不飽和物に特異的であるという 最初の手掛かりをこの論文が含むということをジエンセン（１９７３年）が報告 している。１９５５年には種々の遊離脂肪酸類を特徴づける能力に限界があった ので、オレイン酸が大部分抽から遊離されているという結果を研究者が分析でき なかったということにジエンセンは注目している。

アルファード（Ａｌｆｏｒｄ）およびピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）著、「リボリティ ック・アクティビイティ・オン・マイクロオルガニズムス・アット・ロー・アン ド・インターミゾイエイト・テンパラチャー。ｌｌｌ０アクテイビイテイ・オン ・ミクロバイアル・ライベイシイズ・アット・テンバラチャー・ビロー・０℃（ Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ＋＋ ＋ｓ　ａｔ　Ｌｏｗ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｅｍｐｅｒａｔ ｕｒｅ、　Ｉhｌ、＾ｅｔｉｖｉｔｙ ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｉｐａｓｅｓ　ａｔ　Ｔｅ＋ｏｐｅｒａｔｕｒｅ ｓ　ｂｅｌｏｗ　０℃）」、ジャーナル・オン・フード・サイエンス（Ｊ、　Ｆ ｏｏｄ　Ｓｃｉ、　）、第２６巻、第５１８〜５２４頁（１９６１年）。アルフ ォード（Ａｌｆｏｒｄ）は天然油中の不飽和脂肪酸に対するゲオトリクム・カン ジダムリバーゼの特異性における初の研究を報告している。アルフォード等は特 異性が低温で増大するということも証明している。アルフォードはこれは脂肪の 物理的な構造が変化するためであるという仮説を立てている。リパーゼは基質ト リグリセリドの７３％を遊離オレイン酸に加水分解する。

アルフォード（Ａｌｆｏｒｄ）およびスミス（Ｓａ＋１ｔｈ）、ｒプロダクショ ン・オン・ミクロバイアル・ライペイシイズ・フォー・ザ・スタディ−・オン・ トリグリセリド・ストラクチ＋　−（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉａｌ　Ｌｉｐａｓｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｇｌ凾 モ■ ｒｉｄｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）Ｊ、ジエイ・ニー・オー・シー・ニス（ＪＡＯ Ｃ５）　、第４２巻、第１０３８〜４０頁（１９６１年）は、ゲオトリクム・カ ンジダムからの選択性リパーゼを報告している。アルファード（Ａｌｆｏｒｄ） およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）はり焦土リクム・カンジダムリパーゼが第一に不飽 和脂肪酸結合を攻撃すると提示している。しかしながら、次の報告はこの観察を 否定している。フランツク（Ｆｒａｎｚｋｅ）等、以下の記載参照。

アルフォード、ジェイ（Ａｌｆｏｒｄ、　Ｊ　、　）、ピアス、ディー（Ｐｉｅ ｒｃｅ　Ｄ、　）およびエフ・スッグス（Ｆ、　Ｓｕｇｇｓ）著、ジャーナル・ オン・リピツド・リサーチ（Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５）、第５巻：第３９０頁 （１９６４年）。この基質は基質として合成トリグリセリド類に関してオレイン 酸に対するゲオトリクム・カンジダムリバーゼの特異性を確証した。特異性のレ ベルはヘンケル社の突然変異株によって開示されたものよりはるかに低い。

アルフォード、ジエイ（Ａｌｆｏｒｄ　Ｊ、）およびジエイ・スミス（Ｊ、　Ｓ 鳳１ｔｈ）著、ジエイ・ニー・オー・シー・ニス（ＪＡＯＣ３）　、第５２巻、 第１０３８頁（１９６５年）。この引例は、特定の媒介からのゲオトリクム・カ ンジダムの改良生成法を論議していて、飽和および不飽和脂肪酸に対するリパー ゼの選択性を検討しなかった。

フランツケ（Ｆｒａｎｚｋｅ）等著、「ツエントラルブラット・ツーエル・フフ ルマコテラビー・ウッド・ラポラトリウムダイアグノスティック（Ｚｅｎｔｒａ ｌｂｌａｔｔ　ＦｕｅｒＰｈａｒｍａｋｏｔｈｅｒｐｉｅ　Ｕｎｄ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｕｍｓｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）Ｊ　、第１１１巻、第１０２５〜１０ ３３頁（１９７２年）は、ゲオトリクム・カンジダムからの選択性リパーゼを開 示しているが、バターの加水分解は２４％のバルミチン酸の遊離ももたらした。

また、パーム油の加水分解は７０％以上の飽和脂肪を遊離した。クロール、ジェ イ（Ｋｒｏｌｌ　Ｊ、　）、、フランツケ、シー（Ｆｒａｎｚｋｅ　Ｃ，）、お よびゲンツ、ニス（ＧｅｎｚＳ、）著、ファルマチ−（Ｐｈａｒａ＋ａｚｉｅ） 、第２８巻、第２６３頁（１９７３年）（３２ｋＤ＾のＭ、Ｗ、を有するリパー ゼの分ｌｌｌ１）も参照のこと。

イワイ（Ｉｖａｉ）等著、「リピツド・リクワイアーメント・フォー・ザ・ライ ベイス・プロダクション・パイ・ゲオトリクム・カンジダム・リンク（Ｌｉｐｉ ｄ　Ｒｅｑｕｉｒｅｗｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｌｉｐａｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ　ｂｙ　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　Ｌｉｎｋ）Ｊ　、ア QＩノ力 ルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、）　、第３７巻、第４号、第９２９〜９３１頁（１９７３年）。著者は５３ 〜５５，０００ダルトンの見積り分子量を有するリパーゼの４４倍の分離を報告 している。リノく−ゼは酵素の生成培地中の脂質の存在を要求すること（脂質誘 発）によって特徴づけられている。研究はリパーゼの生成に集中していて、それ が受けた反応またはその選択性には触れていない。

ジエンセン、アール・ジー（Ｊｅｎｓｅｎ　Ｒ，Ｇ、　）著、「シンポジウム： ミクロノくイアル・リポリティック−ｚンザイムズ（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ｍｉ ｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）Ｊ、リピッド（Ｌｉｐ ｉｄ）　（１９７４年）。この引例はゲオトリクムから分離されるリパーゼの位 置特異性および脂肪酸特異性を特徴とする。ゲオトリクムの特定の株は失われて 、作用が繰り返されることを妨げている。

クロル（Ｋｒｏｌｌ）等著、「プレパレーンヨン・アンド・ブロノくティグ・オ ン・ディ・イモビリライズド・ライペイス・フォー・ゲオトリクム・カンジダム （Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉ ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｌｉｐａｓｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕ＋ｍ　ｃ≠ 獅р奄р浮香jＪ、 ジ・ナーラング（Ｄｉｅ　Ｎａｈｒｕｎｇ）、第２４巻、第２１５〜２２５頁（ １９８０年）。

ゲオトリクム・カンジダム（未知の株）のリパーゼを分離しセルロースカラム上 に固定した。５８〜６６％の酵素活性が報告されており、脂肪酸特異性は変化し ないままであった。

キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）等著、ジャーナル・オン・アプライド・マイクロバイオ ロジー・バイオテクノロジー（Ｊ、＾ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌ、、第１７巻、第１０７頁（１９８３年）。

日本国特許第５９−９３，８８９号、「メソード・フォー・プロデューシング・ オレイック・アシッド（Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　０１ｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄ）Ｊ、（１９８４年）。

の多数の酵素のうちの数種によるトリグリセリド類の酵素加水分解の一般領域を 取り扱っている。この特許は酵素それ自体の特異性および活性よりも遊離酸の分 離を取り扱っている。

インタ（Ｉｓｈｉｄａ）等、「オレイック・アシッド・プロダクション・フォー ・オイルズ・アンド・フ７ツツ（Ｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 　ｆｏｒ　ｏｉｌｓ　ａｎｄ　ｆａｔｓ）Ｊ　、特開間第６０−２３７，９９７ 号公報（１９８４年５月出願）。食用油および脂（ま７０％より高い率でディオ トリクム・カンジダ（Ｄｉｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄａ）脂質加水分解酵 素で加水分解されると報告されている。加水分解されなかった部分１、つＬ）で 蒸気および水−油相分離を使用して分画し、オレイン酸を生成する。この要約書 は、通常の酵素系においてでさえ、オレイン酸の高度に精製された量を得ること は困難であるということを強調している。インタ等は十分な純度にするためｉ二 非酵素分離技術に頼らざるを得なかった。

ハタ（Ｉｌａｔａ）等著、「ロー・リゾルージョン・クリスタル・ストラフチャ ー・オン・ライペイス・フロム・ゲオトリクム・カンジダム（ＡＴＣＣ３４６１ ４）（Ｌｏｖ　Ｒｅ５ｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｒｙｓｔａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　 ｏｆ　Ｌｉｐａｓｅ　ｆｒｏＩＩＩＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄ奄р浮刀j Ｊ、 ジャーナル・オン・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＠、）　、第８６ 巻、第６号、第１８２１〜２７頁。この引例はゲオトリクム・カンジダムの異種 株からのリノく一ゼの構造だけを論じている。

ターオン（Ｔａｈｏｕｎ）著、ファー／ト・サイエンス・テクノロジー（Ｆａｔ 　Ｓｃｉ、Ｔｅｃｈ、）（１９８７年）。この引例で表された結果はゲオトリク ム・カンジダムリノく一ゼ生成においてトリパルミチンよりもトリオレインの加 水分解を２倍増大することを報告している。また、ターオンにより分離された「 菌糸」す／（−ゼも本発明のリパーゼとは異なる。この結論はターオン酵素が高 分子量即ち、７０ｋＤＡ（特異活性３２７）であることにより更に支持されてい る。

パンドーム（Ｖａｎｄａｍｍｅ）等、「クローニング・オン・ザ・ライペイス・ ジーン・オン・ゲオトリクム・カンジグム・イン・エシェリキア・コリ・アンド ・イースａｎｄ　ｙｅａｓｔ）Ｊ　、欧州特許第２４３，３３８号（１９８６年 ４月２５日出願）。

この要約書はゲオトリクム・カンジダム細胞外リパーゼのコードづけ遺伝子のク ローニングを主に論じている。要約書はそのようなリパーゼが「シス−９−二重 結合を有する脂肪酸に対して独特な特異性を発揮する」と述べているが、この情 報源を明らかにしていない。要約書はどのリパーゼが配列決定されているかにつ いても示していない。

欧州特許第８７−８７００５５．８号、「それらの発現のための特異リパーゼベ クターのＤＮＡ配列コードづけ、それらベクターによる形質転換された微生物お よびリパーゼの生成における微生物の使用」、ラボフィナ（Ｌａｂｏｆｉｎａ） 　（特許人）著、は約２９ｋＤＡの分子量を有するタンパク質を生成する配列を 開示しており、数年前から周知である低い選択性を多分示している。その特許は 広い請求の範囲を有しているけれど、その明細書に記載の選択性は支持されてい ない。

ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３４８帆ラブリシール社はヒマワリ油を加水分解するヒマ ワリ油の使用および高濃度オレイン酸生成物の分離を記載している。この報告さ れた要約書によれば、Ｕ、Ｓ、縮葉リパーゼ（ゲオトリクム・カンジダムではな い）を使用しての８８％〜９４％加水分解をヒマワリ種子油に対して使用した。

ヒマワリ種子油はトリグリセリド類中に高濃度にオレイン酸を有する油である。

ピアツァ（Ｐｉａｚｚａ）等著、「リボライシス・オン・オリーブ・オイル・ア ンド・タロー・イン・アン・エマルジファイアーーフリー・トウー−フェーズ・ システム・パイ・ザ・ライベイス・フロム・オート・シーズ（Ｌｉｐｏｌｙｓｉ ｓ　ｏｆ　０１ｉｖｅ　ａｎｄＴａｌｌｏｗ　ｉｎ　ａｎ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅ ｒ−Ｆｒｅｅ　Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ　５ｙｓｔｅ＋ａ　Ｂｙ　ｔｈｅ　Ｌｉｐａ ｓｅ　ｆｒ盾香@Ｏａｔ　５ｅｅ ｄｓ）Ｊ　、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｌｅｔｔｒｓ ）　、第１１巻、第７巻、第４８７〜４９２頁（１９８９年）。この引例はモノ 不飽和脂肪酸類の種子リパーゼ類特異性を開示している。

ラザール、ジー（Ｌａｚａｒ　Ｇ、　）およびエイリッヒ、エル・ディー（Ｅｉ ｒｉｃｈ　Ｌ、　Ｄ、　）、「ハイドロライシス・オン・タロー、オリーブ・オ イル・アンド・ココナツツ・オイル・パイ・エクストラセルラー、イントラセル ラー・アンド・メンブラン−ポンド・マイクロバイアル・ライペイスーカタライ ド・リピツド・ハイドロライシス（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔａｌｌｏｗ 、　ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ　ａｎｄ　ｃｏｃｏｎｕｔ　ｏｉｌ　ｂｙ　ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌ浮撃≠秩A　１ ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ｍｅ＋＋ｂｒａｎｅ−ｂｏｎｄ　＋ｍ１ｃ ｒｏｂｉａｌ　１ｉｐａｓｅ−１ｉｐａｓｅ−ｃａｔａｌｙ嘯■п@１ｉｐｉｄ 　ｈ ｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）　（会議録）　Ｊ　、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｈｏｐｐ ｅ　５ｅｙｌｅｒ　（１９８９年）、第３７０巻、第９号、第９８５頁（ヘンケ ル社）。

「ゲオトリクム・カンジダム・・・の細胞外、細胞内および細胞膜領域のリパー ゼ（ＥＣ−３，１，１，３）を含むフラクションの基質選択性を、基質として獣 脂、オリーブ油、パーム油を用いて評価した。トリグリセライドを部分的に酵素 加水分解した後、脂肪酸の比率を測定し、全化学的加水分解と比較した。・・・ ゲオトリクム・カンジダムから得られた全てのリパーゼはオレイン酸とリルイン 酸に非常に強い選択性を示した。従って、特定の微生物からの異なるリパーゼ画 分は非常に異なる基質特異性を有し、ある程度は、基質特異性は加水分解される トリグリセリドに依存している。

ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）等著、エンザイム・アンド・ミクロバイアル・ テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　）　（１９ ８９年）、第１１巻、第９０〜９５頁。

この引例は普通株ゲオトリクム・カンジダムからの数種の酵素を特徴とする。グ オトリクム・カンジダムによる酵素油誘導生成は、酵素の生成のために使用され たが、ヘンケル社の新しい酵素生成法とは異なる。結局、この引例は「細胞外」 リパーゼに関しているだけであり、パルミチン酸とオレイン酸の選択性を試験し ていない。

バリラルジョン（Ｂｉｌｌａｒｇｅｏｎ）等著、「エバルエーション・オン・ス トレインズ・オン・ゲオトリクム・カンジダム・フォー・ライペイス・アクティ ビティ・アンド・ファッティ・アラシド・スペンフィシティ（Ｅｖａｌｕａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ 　ｆｏｒ　１ｉｐａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　 ５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）i　、アプ ライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（＾ｐｐ、　１ｌ ｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｃｈ、　、　）、第３０巻、第９２〜９６頁（１９８９年）。この引 例は３種のグオトリクム・カンジダム株、即ち、ＡＴＣＣ３４６１４、ＮＲＲＬ 　Ｙ−５５２およびＮＲＲＬ　Ｙ−５５３を試験している。対照として市販の２ 種の粗製リパーゼを使用して、研究者はヘンケル社により使用された株、ＮＲＲ Ｌ　Ｙ−５２２またはＡＴＣＣ３４６１４からのリパーゼとの差異を観察しなか った。研究者はＮＲＲＬ　Ｙ−５５３における加水分解の優先的特異性を観察し た。

研究者は純粋なオレイン酸とパルミチン酸の酵素反応速度を使用し、特異性定数 の比を比較した。Ｙ−５３３の速度はＹ−５５２から生成されたそれらより著し く高く、後者はパルミチン酸よりもオレイン酸の方をほんの１．５倍またはそれ 以下選好しただけであった。この引例はヘンケル社の研究者によりＹ−５２２か ら得られた突然変異株の非常に有望な結果から離れていることを教示している。

ベエイルラジョンは「ゲオトリクム・カンジダムリパーゼの特異性は株によって 非常に異なると述べている。ベエイラルジョンは１０〜１５：１の相対速度は「 不飽和脂肪酸の分離に工業的に有効」であろうとも述べている。

ヒルズ（Ｈｉｌｌｓ）著、［エンザイマティック・フラクショネーション・オン ・イブニング・ブリムロウズ・オイル・パイ・レイプ・ライペイス；エンリッチ メント・オン・ガンマー−リルニック・アラシド（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｆｒａ ｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｖｅｎｉｎｇ　Ｐｒｉｍｏｒｅ　Ｏｉｌ　ｂｙ 　Ｒａｐｅ　Ｌｉｐａｓｅ：　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇａｍ＋＋＋ａ− Ｌｉｎｏｌｅｎ奄メ@Ａｃ１ｄ）Ｊ　、 バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｒｓ） 、第２巻、第９号、第６２９〜６３２頁（１９８９年）。なたねリパーゼはＧＬ Ａ　（ガンマー−リルイン酸）の３５倍の速度でブタノールとオレイン酸のエス テル化生成を触媒する。

ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）等、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第１２巻、第１２１〜１２６頁、（１ ９９０年）は、オレイン酸のメチルエステル類に対してパルミチン酸メチルエス テルにおける速度より１０倍高い加水分解速度を引き出した。しかしながら、天 然または合成トリグリセリド類における速度は報告されなかった。

米国特許第４，７１９．１７８号および同第４．８６１．７１６号は特定の型の 長鎖脂肪酸エステルの加水分解に関するゲオトリクム・カンジダムの使用を開示 している：米国特許第４，６８３，９８７号は２−ハロプロピオン酸のエステル 化におけるゲオトリクム・カンジダムからのリパーゼの使用を開示している。

米国特許第４，２７５，０８１号はグリセリド位置における脂肪酸ラジカルのラ ンダム化におけるゲオトリクム・カンジダムの使用を教示し、米国特許第４，２ ７５．０１１号はグリセリドの生成におけるゲオトリクム・カンジダムの使用を 開示している。

よびこの生物により生成された細胞外オレイン酸−選択性リパーゼである新規な 酵素ＵＮリパーゼに関する。本発明はその範囲内に突然変異株の新規な生成方法 も含む。

本発明の新規な株の生成方法は以下を含む：ａ）普通培地、例えば、普通寒天中 でゲオトリクム・カンジダムＮＲＲＬ　Ｙ５２２を培養する、 ｂ）突然変異を誘発するのに十分な時間培養株を紫外線にさらす、Ｃ）生じた突 然変異体を普通ブイヨン中で撹拌しながらインキュベートする、ｄ）懸濁物を凍 結する、 ｅ）懸濁物を解凍する、および ｆ）ａ）からｅ）まで工程を繰り返して、所望の微生物を得る。

普通ブイヨンは動物源または植物源（ペプトン）から適当に部分的に加水分解さ れたタンパク質、例えば、トリブチカーゼペプトン、バクトペプトン（ｂａｃｔ ｏｐｅｐｔｏｎｅ）　、大豆ペプトン、カザミノ酸、ＮＺ−アミンまたは水中の カゼインの約１重量％から約１０重量％の混合物を含む。水中の５％のトリブチ カーゼペプトンは典型的に使用される普通ブイヨンである。

本発明のＵＮリパーゼは、ａ）低温（２３〜４５℃）を要求するおよびｂ）中性 ｐＨ（６，０〜８．０）という利点を有して脂肪類および油類から高純度のオレ イン酸を得、モノ−、ジーおよびトリグリセリド類を有するオレイン酸とリルン 酸の生成物を得ることに特に有効である。更に、触媒をバッチまたは連続操作の いずれかで循環するのに適するように固定化し得る。オレイン酸選択性リパーゼ は飽和脂肪酸類と不飽和脂肪酸類の混合物からオレイン酸および他の不飽和脂肪 酸の選択的エステル化に使用され得る。ＵＮリパーゼは飽和エステル類と不飽和 エステル類の混合物からオレイン酸のエステルの選択性エステル交換反応にも使 用され得る。

および本発明の株の対応する突然変異株および変異体ならびにトリグリセリド類 および他のエステルからの不飽和脂肪酸加水分解の高選択性により特徴づけられ る株により生成された新規なリパーゼに関する。本発明は本発明の株の突然変異 誘発および生成の選択方法を本発明の範囲に含む。本発明は本発明のリパーゼを 使用して脂肪と油からオレイン酸および他の不飽和脂肪酸類の選択性加水分解の 方法も含む。

本発明のリパーゼ生成物をＵＮリパーゼと表す。

−リアにあるＵＳＤＡカルチャー・コレクションから得た。特に、株ＮＲＲＬＹ −５５２（ＡＴＣＣ＃７４１６９）を選択した。

培養培地　典型的に、ゲオトリクム・カンジダムＮＲＲＬ　Ｙ−５５２の突然変 異株を普通寒天中で３〜４日間培養平板で株を培養し、単細胞分節胞子を得るた めに無菌水で培養平板をすすぎ、突然変異株を生成するために培養平板を予め決 めた時間紫外線にさらし、５％バタトペブトンを含むブイヨン中に突然変異株を 入れ、８℃で２４時間振盪して懸濁物を得、懸濁物を一５℃で凍結し、懸濁物を 解凍し、懸濁物から突然変異株を培養し、そして以上の工程を繰り返して生成す る。

上記のヘンケル社内番号９−２−３−９で知られている新規な突然変異株はＡＴ ＣＣ寄託番号７４１７０で示す。所望のＵＮリパーゼを以下のように培養細胞か ら収集する： １、酵素調製 酵素を遠心分離器を用いて、例えばベックマン社製ＧＳＡローター中で５００Ｑ ｒｐｍｓで１０分間運転して収集した。本発明の無細胞生成法を加水分解、エス テル化およびエステル交換反応の特性を決定するのに使用した。

２、基質調製 基質をイソオクタン（２，２，４−トリメチルペンタン）中で約０．８　ｇ／２ Ｑｍｌ溶媒で調製した。リパーゼの活性の測定の検定法はウオン、ディー・ワイ （Ｋ冒ｏｎ、　Ｄ、　Ｙ、　）およびり−、ジエイ・ニス（Ｒｈｅｅ　Ｊ、　Ｓ 、　）著、ジャーナル・オン・アメリカン・オイル・ケミスツ・ソサイティ（Ｊ 、　Ａｌ１ｅｒ、Ｏｉｌ　Ｃｈｅ膳Ｓｏｃ、）、第６３巻、第８９〜９２頁（１ ９８６年）に記載されたものである。ひとつの応用方法は撹拌しない条件下で一 時間複数の検定を行い、撹拌速度を再現する困難さを避けることである。

ＵＮリパーゼは分子量約３５．０００〜７０．０００ダルトン、ｐＨ５，０〜９ ゜５、最適なｐＨ７，５〜８５および温度範囲０〜４０℃、Ｔ、、、＝３２℃を 有する。２５ｍＭ濃度のカルシウムイオンにより阻害されるが、２５ｍＭ濃度の マグネシウムイオンにより活性化される。

ＵＮリパーゼの選択性 １、ＵＮリパーゼによる純粋なトリグリセリド類の加水分解カプリル酸（Ｃ８） 、カプロン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４Ｌバル ミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、アラキドン酸（Ｃ２０）、パル ミトレイン酸（Ｃ１６：　１）　、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびリルイン酸 （１８：２）の純粋なトリグリセリドを上記の基質調製の欄と同様に調製し、３ ７℃で１時間水の存在下でＵＮリパーゼと反応した。トリオレイン：トリパルミ トレイン：トリオレインの加水分解率１００　：　６５　：　８２であり、加水 分解はトリオレインで最大に行われた。飽和脂肪酸トリグリセリドのうち、トリ パルミチンだけがＵＮリパーゼに反応性を示した。トリオレイン対トリバルミチ ンの加水分解の比は約３３＝１であった。

２、ＵＮリパーゼによる普通のアシルトリグリセリド類の加水分解硬い固形の獣 脂、肝脂、パーム核油または落花生油の各々２０グラムをＵＮリパーゼ含有突然 変異株９−２の無細胞発酵ブイヨンの５％（容量対容量）で処理した。約２０Ｏ ｒｐｍで機械撹拌しつつ、３０℃で２２時間反応を行った。硬（Ａ固形の獣脂を 加水分解し、オレイン酸８７％と他の不飽和脂肪酸１３％から成る遊離脂肪酸を 生じた。肝脂をＵＮリパーゼにより加水分解し、９９％不飽和脂肪酸である遊離 脂肪酸を得た。トリグリセリド類中に約１７重量％の不飽和脂肪酸を含むパーム 核油をＵＮリパーゼにより加水分解し、９７％不飽和脂肪酸である遊離脂肪酸を 得た。約８０重量％のオレイン酸とリルイン酸を含む落花生油を、ＵＮリパーゼ により加水分解し、１００％不飽和脂肪酸である遊離脂肪酸を得た。

３、ＯＮリパーゼによる単エステル類の加水分解率エステル類をＵＮリパーゼに さらし、ＵＮリパーゼ選択性の範囲および程度を測定した。評価されたエステル はプロピオン酸、カプリル酸、ノナン酸、カプロン酸、パルミチン酸およびオレ イン酸のメチルエステルであった。エステル類をイソオクタン中で約５ＱｍＭｉ ！度で調製し、３７℃で４時間ＵＮリノく−ゼにさらした。オレイン酸のメチル エステルだけはＵＮリパーゼにより触媒されたときかなりの加水分解を示した。

プロピオン酸、カプリル酸、カプロン酸およびノナン酸のメチルエステルはＵＮ リパーゼにより加水分解されなかった。メチル、（ルミテートの約２％は反応し たが、メチルオレエートは６７％を加水分解した。

４、ＵＮリパーゼによるエステル化およびエステル交換反応リパーゼの濃縮され た水性調合剤を使用して、ＵＮリノく−ゼのエステル合成特性を試験した。それ らの調合剤は脂肪酸５０〜２００ｍｇ、濃縮ブイヨン領５ｍ１、水０．５ｍｌ　 （緩衝液）およびアルコール１００〜３００μｍを含有した。

反応を２７．３０または３７℃いずれかで１６〜２４時間おこなった。エーテル ２．０ｍｌを加えて反応を止めた。

脂肪酸およびエステルをエーテル中に抽出し、薄層クロマトグラフィーにより評 価した。種々のアルコールによるオレイン酸のエステル化を表１に示す。結果は オレイン酸エステルは１級および２級アルコール類（環状アルコール類でさえ） により合成されたが、試験された１種の３級アルコールはリノ々−ゼの存在下オ レイン酸と反応しなかった。

表１ オレイン酸エステル化のアルコール選択性２−オクタツール　＋十＋十 シクロヘキサノール　＋＋ ｔ−ブタノール　−− エステル化反応中のリパーゼの脂肪酸選択性も上記の方法で評価し、結果を薄層 クロマトグラフィー、ＧＣ，ＨＰＬＣおよびＩＲにより分析した。結果を表２に 示す。

表２ リパーゼエステル化の脂肪酸選択性 阻肱醇　幾何配置　エステル オレイン酸　ンス、９．１０　＋＋＋＋エライジン酸　トランス、９．１０　− ペトロセリン酸　シス、６．７　− バクセン酸　シス、１１．１２　− ウンデセン酸　１０．１１　− パルミトレイン酸　シス、９．１０　＋十十十リノール酸　シス、９，１０；１ ２，１３　＋十十十すルン酸　シス、９．１０；１２．１３；　＋＋＋＋１５、 １６ γリルン酸　ノス、６．７；９，１０；　−それらのデータから得ることができ る結論はリパーゼが二重結合の位置だけでな（立体配置でも厳密に選択性を有す るということである。選択性は厳密にモノ不飽和脂肪酸中のラス９，１〇二重結 合であると思われる。多不飽和エステル類においても、シス９，１０結合は必要 であるが、しかしながら、γリルン酸の反応性の欠乏はシス９．１〇二重結合に 加えて、カルボニル炭素と９，１〇二重結合との間の二重結合を許容しないこと を示す。１０−ウンデセン酸である１個の炭素原子を隔てた二重結合は活性部位 のケミストリーを崩壊する。

実際に、１０−ウンデセン酸はオレイン酸のエステル化の阻害剤として作用する とういうことは、酵素と二重結合の間に相互作用が生じ、阻害を引き起こすこと を示唆している。

まとめると、上記で要約された反応性は活性部位のモデルを提示している。反応 性（エステル化）は二重結合と酵素上のある部位の間の相互作用を必要とする。

この相互作用が適所で脂肪酸基質を固定し、酵素の触媒部位に反応性カルボニル 炭素を位置づけるというひとつの説明が可能である。脂肪酸混合物のエステル化 を圧力−分解牛脂起源とする典型的脂肪酸混合物（以後ＰＴＡと称する）を使用 して評価した。ＰＦＡの試料を内部標準としてペンタドデカン酸でスパイクした 。

生じた生成物をＨＰＬＣ（逆相Ｃ−１８カラム）またはＧＣ（ＦＦＡＰ細管カラ ム）のいずれかにより分析した。オレイン酸、パルミトレイン酸およびリノール 酸のエステルだけを検出した。ＰＦＡ中のリルン酸濃度が低すぎたので、エステ ルの生成を測定できなかった。ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸およ びペンタデカン酸（内部標準）はエステル化しなかった。従って、脂肪酸類の複 合混合物を選択性リパーゼで処理でき、シス９．１〇二重結合を含む脂肪酸エス テルだけを得ることができる。

５、ＵＮリパーゼの精製 以下の一連の工程を適用して遠心分離により細胞塊を除去した後にＵＮリパーゼ を発酵ブイヨンから精製したコ Ａ、非タンパク質材料の無細胞ブイヨンを清澄化するためのバイオクリル（Ｂｉ ｏｃｒｙｌ）　Ｂ　ＰＡ−１０００カチオン交換クロマトグラフイー：Ｂ、エタ ノール沈澱、ついで遠心分離によるＵＮリパーゼの濃縮：Ｃ，エタノール沈澱の 再度懸濁、ついでオクチル−セファロース上での疎水性相互作用クロマトグラフ ィー： Ｄ、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　３０限外濾過ユニツトを使用した限 外濾過によるリパーゼの最終濃度でのＱ−セファロース上でのクロマトグラフィ ー。

単一のタンパク質バンドを電気泳動法で確認した。等電点電気泳動分析法は、ｐ ■範囲４．０〜４．６に２種の主なアイソザイムおよび２種の主要でないアイソ ザイムを示した。クロマトフオーカシングによりオレイン酸への最高度の選択性 を示した主なアイソザイム（ｐ　Ｉ−４，５）を分離した。酵素（ＵＮリパーゼ ）がエンドグリコシダーゼＨに感受性であるグリコジル化の部位を有する約６５ ゜０００ＫＤａの分子量を有する。

本発明の実施を詳細に説明するために、以下の実施例を含む。

実施例１ 株ＮＲＲＬ　Ｙ−５５２を３〜４日間日間基天上で成育した。単細胞分節胞子類 をついで無菌蒸留水で平板の表面から濯いだ。ついで、その細胞を（非常によい 結果の突然変異誘発を示す）９０％殺菌するのに必要である紫外線にさらす時間 を決定するために使用した。これを紫外線を装備した生体安全性（ｂｉｏｓａｆ ｅｔｙ）フード（Ｎｕａｉｒｅ社製）内で行った。分節胞子の懸濁物５ｍｌを無 菌ペトリ皿に入れ、ついで様々な時間紫外線にさらした。９０秒の曝露で９０％ 以上の殺菌効果を示すことが測定された。このように生成された突然変異株をバ クトーペプトンブイヨン（５％）５０ｍｌに加え、８℃で２４時間（これは生存 株の回復時間として与えられる。）振盪器上においた。紫外線照射懸濁物をつい で無菌の５０ｍ１試験管に入れ、−５℃で凍結した。紫外線照射された生存株の うち、９９，９％以上は凍結されることにより死滅した。（生存のための仮説は 不飽和脂肪酸中で細胞膜が最も厚いものが凍結条件の生存に対して有利であろう ということである。）これらの少数の生存株はついでトリオレインまたはトリパ ルミチンを基質として使用して標準リパーゼ検定法（上記の検定法）によりリパ ーゼ生成および脂肪酸特異性に関してスクリーニングされた。１種の突然変異株 ９−２はオレイン酸とバルミチン酸の純粋なトリグリセリド類を試験したとき、 オレイン酸対パルミチン酸の特異性が２５：１より優れているという結果が得ら れた。

９−２による初期研究は、修飾された標準ブイヨン中での生物体の成育をもたら したけれど（ツジオカ等、１９７３年）、ＵＮリパーゼ酵素の生成を改良するた めに研究は開始された。培地中に脂肪または油を有するとゲオトリクム株により 他のリパーゼの生成を誘発することが私たちの初期の研究で判明した。従って、 脂肪または油を培地から除去した。ついで、バタトペブトンの改良に努めた。大 豆ペプトン、トルブチカーゼ（登録商標）（ＢＢＬ社製）ペプトン、カザミノ酸 、ＮＺアミン（登録商標）（ンエルフィード・プロダクト社製）およびカゼイン を含めて、一連のペプトンまたは他のペプトンまたは他の有機窒素源を試験した 。

５％でトリブチカーゼ（登録商標）ペプトンは最高レベルのＵＮリパーゼの生成 をもたらしたということが判明した。糖および糖アルコールの添加は、ＵＮリパ ーゼに影響を与えない場合（例えば、マンニトールおよびマルトース）もあり、 もしくは、ＵＮリパーゼの生成を確実に阻害する場合（例えば、フルクトース、 グルコースおよびスクロース）もあるということが次に重要な発見であった。次 に塩成分を標準媒体で試験した。０．０５％（重量／容量）のＭｇＳＯ４と０． １％（重量／容量）のＫＨｔＰ０４両方の添加は酵素の生成に有益であることを 示した。培地中のこれら２種の塩の含有は、標準検定法を使用して検定した時、 二倍の加水分解活性を与えた。０．５％へＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４の濃度を増加しても それ以上の増加は見られなかった。培地へのカルシウム添加（０，１〜０．５２ ）はリパーゼ生成を増大しないことが判明した。従って、ＵＮリパーゼ酵素は、 ｐＨを調整しなイテ、５％トリブチカーセヘブトン、０．１％ＭｇＳＯ４，０， ５％ＫＨｚＰＯｔを含む培地中で定型の手順で生成できる。この培地５０ｍ１を ５００ｍ１じゃま板フラスコ（ベルコ社製）中に入れ、ついで２５〜３０℃で２ ５Ｏｒｐｍで振盪した。

ＵＮリパーゼ酵素を生成し、突然変異株９−２中で最適化した。次の目的は高生 成能を有する突然変異株を発見することであった。従って、突然変異株９−２の 突然変異は上記のように行ったが、選択プロトコールを変更した。この場合に、 ８℃での回復時間後、突然変異株懸濁物を５０ｍ１無菌試験官に入れ、−５５℃ で凍結した。ついで凍結期間を解凍期間（約４時間）により中断し、更に一５５ ℃で凍結した。突然変異株をリパーゼ活性および特異性についてスクリーニング した。９−２−３−９である１種の突然変異株は凍結と解凍を３サイクル繰り返 し３週間の凍結サイクルを生存した。突然変異株９−２−３−９を普通培地で成 育したとき、そのコロニー形態学は、その親（９−２）とは明らかに異なった。

コロニーの型は９−２より非常に実体がなかった。最も特有な性質は、この突然 変異株が培養中で成育するとき９−２より少ししか細胞塊をつくらないけれど、 はるかに高い酵素活性を表した。

実施例２ 突然変異株９−２を上記の培地中で成育した。５０ｍ１を５００ｍ１じゃま板フ ラスコ（ベルコ社製）に加えて、３０℃で維持された振盪器に入れ、２５０ｒｐ ｍｓで振盪した。生成は約３０分で最大限度に達し、ついで僅かに減少し、低い ままであった。酵素を一連の加水分解試験のために３０時間のところで採取した 。酵素の収集はブイヨンをベックマンＧＳＡローター中で５０００ｒｐｍｓで１ ０分間の遠心分離にかけた。ついで無細胞ブイヨンを傾斜法により、細胞ペレッ トから分離した。いくつかの場合には、高い活性懸濁物をブイヨンを７０％硫酸 アンモニウムで沈殿することにより生成した。

実施例３ ＵＮリパーゼの選択性脂肪分離の実施態様を表すために、１０ポンドの食用豚腸 を温度を３０℃に温度を調整された反応容器に入れ、３００〜５００ｒｐｍで撹 拌した。突然変異株９−２の培養からの無細胞発酵ブイヨンまたは２倍濃縮無細 胞ブイヨンを加え、加水分解を開始した。ブイヨンは反応に必要な水を提供した 。加水分解の進行を反応混合物のアリコートの酸価（ＡＯＣ３法Ｔｅ１ａ−６４ ）を測定することにより定期的に監視した。反応の終点で遊離脂肪酸の組成は９ ９％が不飽和脂肪酸であった。オレイン酸：パルミトレイン酸：リルン酸の比は ７８：３：１８であった。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　Ｆｌ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、 ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ 、ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ。

ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　ベスパー、ステイーブン・ジェイアメリカ合衆国４５４２９オ ハイオ、ケタ−リング、サウス・ペルハム・ドライブ　１８０番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＴＣＣ寄託番号７４１７０であるゲオトリクム・カンジダム株および対応 する変異株およびこの株の変異体。
2. ２．以下の工程を含む請求項１に記載のゲオトリクム・カンジダム株の生成方法 ：ａ）普通培地中でゲオトリクム・カンジダムＮＲＲＬＹ５５２（ＡＴＣＣ７４ １６９）を培養すること； ｂ）培養された株を突然変異を誘発するに十分な時間紫外線にさらすこと；ｃ） 生じた突然変異株を普通ブイヨン中で撹拌しながらインキュベートすること；ｄ ）懸濁物を凍結すること； ｅ）懸濁物を解凍すること； ｆ）ａ）からｅ）の工程を繰り返すこと。
3. ３．普通ブイヨンが水中約１％から約１０％濃度の部分的に加水分解されたタン パク質類の混合物またはカゼインを含む請求項２に記載の方法。
4. ４．普通ブイヨンが約５％の水中トリプチカーゼペプトンである請求項３に記載 の方法。
5. ５．工程ｃ）でのインキュベーション時間が約５〜４０℃で約４０時間である請 求項２に記載の方法。
6. ６．インキュベーションが約３０℃である請求項５に記載の方法。
7. ７．懸濁物が少なくとも約−５℃で凍結する請求項２に記載の方法。
8. ８．懸濁物が約−５℃から約一５５℃に凍結する請求項７に記載の方法。
9. ９．請求項２の方法で生成されたゲオトリクム・カンジダムの突然変異株。
10. １０．オレオイル鎖を有するトリグリセリドと接触するとき、リパーゼは２０： １以上の比により他の鎖よりオレオイル鎖を加水分解することを特徴とするリパ ーゼ含量を有する請求項９に記載の株。
11. １１．培養培地に油または脂肪を添加することにより誘発されないことを特徴と する、不飽和一特異性リパーゼを有する請求項９に記載の株。
12. １２．普通ブイヨン中で株を培養し、ついでブイヨンから細胞を分離し、無細胞 上清を得る工程を含む請求項９に記載の株から不飽和一特異性リパーゼを生成す る方法。
13. １３．以下の特徴を有するリパーゼを有する請求項９に記載の株；分子量約３５ ，０００〜約７０，０００ドルトン、温度０〜４０℃および等電点４．０〜４． ６。
14. １４．上記のリパーゼがｐＨ活性５．０〜９．５である請求項１３に記載の株。
15. １５．上記のリパーゼが最適ｐＨ活性７．５〜８．５である請求項１３に記載の 株。
16. １６．上記のリパーゼが９位に二重結合を含み、上記の二重結合がシス立体配置 を有する脂肪酸に対して選択性を有する請求項１３に記載の株。
17. １７．上記のリパーゼがカルボニル炭素から最初の不飽和位置としてシス−９二 重結合を有する多不飽和脂肪酸に対して選択性を有する請求項１３に記載の株。
18. １８．上記のリパーゼが第１級および第２級アルコールに選択性を有する請求項 １３に記載の株。
19. １９．請求項９記載の株の懸濁物から生成された無細胞上清をオレオイルを含む トリグリセリドと処理する工程を含む、オレオイル含有トリグリセリド類の選択 性加水分解法。
20. ２０．シス−９二重結合を有するカルボン酸および第１級または第２級アルコー ルを含む脂肪酸の混合物で請求項９記載の株の懸濁物から生成される無細胞上清 の工程から成るシス−９二重結合を含むカルボン酸を処理する選択性エステル化 の方法。