JPH07509139A - グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子配列およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グリコジルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子配列およびその用途 本発明は一般にフラボノイド経路の代謝酵素をコードする遺伝子配列に関し、詳 しくはフラボノイドグリコジル化酵素および例えば植物内での色素分子の産生を 操作する場合の該酵素の用途に関する。

本明細書で以後引用する刊行物の書誌的詳細事項は詳細な説明の項の最後に集め である。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列について本願で引用するＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯは上記書誌事項の後で定義する。

右前産業界では顕花植物類の新しい異なる品種を開発しようと懸命な努力がなさ れている。このような新規な品種を創製する有効な方法は花色を操作する方法で あるが、伝統的な育種方法が用いられており、花の商業品種の大部分について広 範囲の色を産生ずるのにある程度成功している。しカルこの方法は、特定の種の 遺伝子給源の制約によって制限されており、この理由のため、単一の種が着色品 種の全スペクトルをもっていることはまれである。例えば、バラ、キク、チュー リップ、ユリ、カーネーションおよびガーベラのような主な切花のブルーの品種 が開発されれば、切花を観賞植物の市場の両方に大きな機会が提供されるであろ う。

花色は主として、３種の色素すなわちフラボノイド類、カロチノイド類およびベ タレイン類に基づいている。これら３種の色素のうちフラボノイド類は最も普通 の色素であり、イエローからレッドおよびブルーまでの範囲の色に関与している 。花色に対して大きく寄与するフラボノイド分子は、シアニジン、デルフィニジ ン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジンおよびベラルゴニジンのグリコジル 化誘導体であるアントシアニン類であり、液胞内に局在している。

フラボノイド色素はフェニルプロパノイド経路の二次代謝物である。フラボノイ ド色素の生合成経路（“フラボノイド経路”）は十分に確立されており（Ｅｂｅ ｌおよびＨａｈｌｂｒｏｃｋ　１９８８年；　ＨａｈｌｂｒｏｃｋおよびＧｒｉ ｓｅｂａｃｈ　１９７９年；　ＷｉｅｒｉｎｇおよびＤｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ　１ ９８４年；　Ｓｃｈｒａｍら１９８４年；　５ｔａｆｆｏｒｄ　１９９０年）、 図ＩＡとＩＢに示す。３種の反応と酵素が、フェニルアラニンのｐ−フマロイル −ＣｏＡ（フラボノイド経路における第一主要基質の中の一つ）への変換に関与 している。上記３種の酵素は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ） 、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）および４−フマル酸：　ＣｏＡリガ ーゼ（４ＣＬ）である。フラボノイド経路で最初に行われるステップは、３分子 のマロニル−ＣｏＡ（アセチルＣｏＡと００１に対するアセチルＣｏＡカルボキ シラーゼ（ＡＣＣ）の作用で提供される）と１分子のｐ−フマロイル−ＣｏＡと の縮合反応である。この反応は酵素のカルコンシンターゼ（ＣＨ３）によって触 媒される。この反応の生成物である２′。

４．４’、６’−テトラヒドロキシカルコンは通常、酵素のカルコンフラボノン イソメラーゼ（ＣＨＩ）によって迅速に異性化されナリンゲニンを産生ずる。ナ リンゲニンは次いでフラボノール３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）によって中央 リングの３位がヒドロキシル化されてジヒドロケンフェロール（ＤＨＫ）を産生 ずる。

ジヒドロケンフェロールのＢリングは、３′位または３′位と５′位の両者がヒ ドロキシル化されてそれぞれジヒドロクエルセチン（Ｄ）ＩＱ）およびジヒドロ ミリセチン（ＤＩ（Ｍ）を産生ずる。Ｂリングのヒドロキシル化反応のパターン は花弁の色を決定するのに重要な役割を演じる。

またジヒドロフラボノール類（ＤＩＩＫ、　ＤＨＱおよびＤＨＭ）は、フラボノ ールシンターゼの作用をうけて、フラボノール類のケンフェロール、クエルセチ ンおよびミリセチンを産生ずる。これらのフラボノール類は無色であるが、アン トシアニン類とともにコビグメントとして作用し花色を増大する。

着色アントシアニン類を産生するに至るフラボノイド経路の次のステップはジヒ ドロフラボノール−４−レダクターゼ（ＤＦＲ）が関連しロイコアントシアニジ ン類を産生ずる。これらのフラボノイド分子は通常の生理的条件下では不安定で あるが、グリコジルトランスフェラーゼ類の作用によって３位がグリコジル化さ れるとアントシアニジン分子が安定化し、アントシアニン類が蓄積される。一般 にグリコジルトランスフェラーゼ類は、ｔｌＤＰ糖類から糖の部分を移動させ、 グリコジル化の位置に対して高い特異性を示し、受容体の基質に対しては比較的 低い特異性を示す（Ｓｅｉｔｚおよび旧ｎｄｅｒｅｒ　１９８８年）。

アントシアニジン分子の安定化に関与するグリコジルトランスフェラーゼ類とし てはＵＤＰグルコース：フラボノイド−３−グルコシルトランスフェラーゼ（３ ＧＴ）があるが、ＵＤＰＧがらグルコース部分をアンドシアニジン分子の３−０ −位に移動させてアンドシアニジン−３−グルコシドを産生ずる。またこれらの アントシアニン類は他のグリコジルトランスフェラーゼによってグリコジル化す ることができる。ＵＤＰラムノース：アントシアニジン−３−グルコシドラムノ ジルトランスフェラーゼ（３ＲＴ）は、ラムノース基を、アンドシアニン分子の ３−〇−結合グルコースに付加してアントシアニジン−３−ルチノシド類を産生 じ、さらにアシル化されると、ＵＤＰグルコース：アントシアニジン−３−（ｐ −フマロイル）−ルチノシドグルコシルトランスフエラーゼ（５ＧＴ）によって さらに修飾することがトランスフェラーゼがサイリーニ・ジオイカ（Ｓｉｌｅｎ ｅ　ｄｉｏｉｃａ）から精製されＣＫａｍｓｔｅｅｇら、１９７９年）、アンド シアニジン−３−グルコシド類とアントシアニジン−３，５−ジグルコシド類の 両者を基質として使用することが報告されている。アントシアニジン−３−ルチ ノシド類が次の植物中に存在することが報告されている。すなわちペチュニア属 （Ｐｅｔｕｎｉａ）の植物（Ｓｔａｆｆｏｒｄ　１９９０年；　Ｊｏｎｓｓｏｎ ら１９８２年；　ＭａｉｚｏｎｎｉｅｒおよびＭｏｅｓｓｎｅｒ　１９８０年） 、アンチライナム属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）の植物（Ｍａｒｔｉｎら１９９ １年）、シクラメン（ＭｉｙａＪｉｍａら１９９０年）、メトロシブロス属（Ｍ ｅｔｒｏｓｉｄｅｒｏｓ）の植物（Ａｎｄｅｒｓｅｎら１９８８年）、アルスト ロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）の植物（Ｓａｉｔ。

ら１９８８年）、ボテンティラ属（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ）の種の植物（Ｈａｒ ｂｏｒｎｅおよびＮａ５ｈ　１９８４年）、セントポーリア・イオナンタ（Ｓａ ｉｎｔｐａｕｌｉａｉｏｎａｎＬｈａ）（アフリカスミレ）　（Ｋｈｏｋｈａｒ ら１９８２年）、プロメリアシ工（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）　ＳＰＰの植物 （ＳａｉｔｏおよびＨａｒｂｏｒｎｅ　１９８３年）、ゼラニウム（ＡＳｅｎお よびＧｒｉｅｓｂａｃｈ　１９Ｂ３年）および多くの他の植物中に存在している 。しかし、アンドシアニジン−３−ルチノシド類がバラのなかに見出されたとい う報告は全くないが、アンドシアニジン−３−グルコシド類と３，５−ジグルコ シド類は報告されている（Ａｓｅｎ　１９８２年）。ラムノジルトランスフェラ ーゼｃＤＮＡが植物から単離されたという報告は今日まで全くない。

ペチュニアでは、υＤＰラムツール：アントシアニジン−３−グルコシドラムノ ジルトランスフェラーゼは染色体■１上のＲ【遺伝子座によって制御されている 。両方の対立遺伝子がホモ接合劣性状態で存在している場合、アンドシアニジン −３−グルコシド類が蓄積し、そしてアントシアニン分子を例えばさらにグリコ ジル化、アシル化およびメチル化するようなそれ以上の修飾は起こらない（Ｓｔ ａｆｆｏｒｄ１９９０年）。ラムノースをアントシアニジン−３−グルコシド類 に付加すると色に対してわずかにブルーイング効果があり（Ｗｉｅｒｉｎｇおよ びｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ　１９Ｂ４年）、アントシアニジン−３−ルチノシド類 をさらにグリコジル化、アシル化およびメチル化することによって修飾するとよ り大きなスペクトルの色が可能になる。

上記の修飾に加えて、ｐＨおよびフラボノール類とフラボン類のような他のフラ ボノイド類とのコピグメンテーションは花弁の色に作用する。フラボノール類と フラボン類もグリコジルトランスフェラーゼ類によってグリコジル化することが できる。各種フラボノール類の３−ルチノシド類は、クロッカス属（Ｃｒｏｃｕ ｓ）　ｓｐｐの植物（ＨａｒｂｏｒｎｅおよびＷｉｌｌｉａｍｓ　１９８４年） 、リリウム・コルダタム（Ｌｉｌｉｕｍ　ｃｏｒｄａｔｕｍ）　（Ｎａｋａｎｏ ら１９８９年）、ニースト？−グランディフロラム（Ｅｕｓｔｏ＋ｎａ　ｇｒａ ｎｄ！ｆｌｏｒｕｍ）　（Ａｓｅｎら１９８６年）、キュークルビタ・ペポ（Ｃ ｕｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ）　（Ｉｔｏｋａｗａら１９８１年）、カレンジュ ラ・オフィシナリス（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）　（Ｖｉ ｄａｌ−０１１ｉｖｉｅｒら１９８９年）、チューリパ・ゲスネリアーナ（Ｔｕ ｌｉｐａ　ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ）（Ｂｕｄｚｉａｎｏｗｓｋｉ　１９９１年） 、アルストロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）属の植物（Ｓａｉｔｏら１ ９８８年）、ローザ属（Ｒｏｓａ）　５ｐｐの植物（Ａｓｅｎ１９８２年）、ニ コチアナ属（Ｎｉｃｏｔｌａｎａ）　ｓｐｐの植物（Ｓｎｏｏｋら１９９２年） および多くの他の植物中に見出されている。３ＲＴまたは５ＧＴのような他のグ リコジルトランスフェラーゼ類の活性を制御する性能は、花弁の色を操作して、 単一の種がより広範囲のスペクトルの花色を発現できるようにする手段を提供す るであろう。このような制御は、自生の（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ）酵素の産生レ ベルを調節するかまたは非自生の酵素を導入することによって行うことができる 。

本願において“自生”酵素という用語を用いる場合、その酵素は特定の細胞にお いてもともと、あるいは自然の条件で発現している酵素である。“非自生”の酵 素は、細胞においてもともとはないが、例えば導入遺伝子によって植物細胞中に 遺伝物質を導入することによって発現される酵素である。“内因性”酵素は細胞 によって産生されるが、細胞において自生であるかまたは自生でなｔ、１細胞で ある。

本発明によって、フラボノイドグリコジルトランスフェラーゼ酵素のＵＤＰラム ノース：アントシアニジン−３−グルコシドラムノジルトランスフェラーゼ（以 後”３ＲＴ”と呼ぶ）をコードする遺伝子配列が同定され、クローン化され、次 いでその配列を使用して形質転換植物が製造された。これらの組換え配列は、デ ルフイニジンー３−グルコシドおよびシアニジン−３−グルコシドのようなアン トシアニジン−３−グルコシド類をさらにグリコジル化すること力（でき、その 結果花弁の色を操作する手段を提供する。

したがって本発明の一つの態様は、グリコジルトランスフェラーゼの特性を有す る植物フラボノイドグリコジル化酵素または前記グリコジルトランスフェラーゼ の機能的部分もしくは誘導体をコードするヌクレオチド配列、または該グリコジ ルトランスフェラーゼまたはその機能的部分もしくは誘導体をコードする配列に 相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子を提供するもので ある。

さらに詳しくは、本発明は、フラボノイド−５−グルコシルトランスフェラーゼ （５ＧＴ）およびアントシアニジン−３−グルコシドラムノジルトランスフェラ ーゼ（３ＲＴ）からなる群から選択される植物グリコジルトランスフェラーゼま たは前記グリコジルトランスフェラーゼの機能的部分もしくは誘導体をコードす るヌクレオチドの配列、または該グリコジルトランスフェラーゼまたはその機能 的部分もしくは誘導体をコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んで なる単離された核酸分子に関する。

本願では、本発明を、現在まで本願に開示した発明を実施するのに特に便利で有 用なフラボノイドグリコジル化酵素である３ＲＴをコードする遺伝子配列の同定 、クローン化および操作を行うことによって説明しかつ例示する。しかし、この ことは本発明には新規なフラボノイドグリコジル化酵素のすべてまたはその機能 的誘導体が含まれると解して行うものである。特に好ましいフラボノイドグリコ ジル化酵素は、例えばデルフィコジン−３−ルチノシドおよびシアニジン−３− ルチノシドのようなアシル化ルチノシド類をグリコジル化する酵素であるが、ロ イコアントシアニジン類をグリコジル化する酵素ではない。

便宜上および速く表記するために、本願における“フラボノイドグリコジル化酵 素”という用語には、アンドシアニン類、フラボノール類および／またはフラボ ン類のようなフラボノイド類に作用するラムノジルトランスフェラーゼ類が含ま れる。好ましいフラボノイドグリコジル化酵素は３ＲＴである。

したがって本発明の好ましい態様は、３ＲＴ　、または３ＲＴの機能的変異体、 誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体をコードするヌクレオチ ドの配列または上記のものをコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含 んでなる単離された核酸分子に関する。

“単離された核酸分子”という用語は、天然には存在しない状態の遺伝子配列を 意味する。一般にこの用語は、その天然の状態から単離されたこと、またはその 自然環境では必らずしも遭遇しない方式で生成することを意味する。さらに具体 的に述べると、この単離された核酸分子としては、生体外で形成もしくは維持さ れる核酸分子があり、ゲノムＤＮＡのフラグメント；組換えもしくは合成の分子 ；および本発明の遺伝子配列に融合されたかまたは作動可能に連結された非相同 核酸のような非相同核酸を結合した核酸が含まれる。また“単離された核酸分子 ”という用語には、３ＲＴまたは３ＲＴの機能的変異体、誘導体、一部分、フラ グメント相同体もしくは類似体を、そのプロモーターもしくは他のプロモーター に対して逆の方向にコードするゲノムＤＮＡもしくはゲノムｃＤＮＡまたはその 一部が含まれる。

さらに上記用語には、他の核酸配列に対して少なくとも部分的に精製した天然産 の配列が含まれる。本願で用いられる単離された核酸分子という用語は核酸単離 物（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　１ｓｏｌａｔｅ）と同じ意味をもっていると解 される。

“遺伝子配列”という用語は、本願ではその最も一般的な意味で用いられ、３Ｒ Ｔの分子を構成するアミノ酸の配列を、直接指定するかまたは塩基の相補的系列 によって指定するヌクレオチド塩基の連続系列を含んでいる。アミノ酸のこのよ うな配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：２に示すような全長の３ＲＴもしくはその 端を切り取った活性型、またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメン ト、相同体もしくは類似体を構成しているか、または該酵素のＮ末端、Ｃ末端ま たは内部のような特定の部分に相当する。

好ましい実施態様において本発明のヌクレオチドの配列は、５ＥＱＩＤ　ＮＯ： 　２に示すヌクレオチド配列またはその領域もしくは一部に実質的に一致してい る。

本発明のこの好ましい態様によれば、 （ｉ）３ＲＴをコードし、および （ｉｉ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２に示す配列に対して少なくとも５０％のヌ クレオチド配列類似性を有する、 ヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子が提供される。

さらに詳しくは、本発明は、 （ｉ　）　３ＲＴをコードし、および （ｉｉ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２に示す配列に対して少なくとも６５〜７５ ％のヌクレオチド配列類似性を有する、 ヌクレオチドの配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子に関する。

、好ましい類似性の百分率としては８０％、８５％、９０％、９２〜９５％。

９６〜９８％および９９〜１００％が含まれる。上記の類似性の百分率はＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：　２に示す配列と他の遺伝子配列とを全体にわたって比較する場 合を想定しているが、比較される分子の中に類似性が５０％より小さい特定の領 域があることは明らかである。この点について本発明は、 （ｉ）３ＲＴをコードし、および （ｉｉ）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２に示す配列の１つ以上の領域に対して少な くとも５０〜７５％のヌクレオチド配列類似性を有する、ヌクレオチドの配列を 含んでなる核酸分子として、および特にＤＮＡ分子として定義される。

別の実施態様では、本発明の核酸分子およびさらに詳しくはＤＮＡ分子は、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ二２に示す配列に実質的に類似しかつＳ［！Ｑ　ＩＤＮ０＝３に 示す配列に実質的に類似しているヌクレオチド配列を含んで構成されている。

また本願で目的とする核酸配列には、植物中での対応する遺伝子の発現を調節で きる遺伝子プローブまたは“アンチセンス”分子として有用なオリゴヌクレオチ ドも含まれる。また本願で用いられる“アンチセンス分子”という用語には、そ れのもしくは他のプロモーターに対して配向が逆になっている構造ゲノム遺伝子 もしくはｃＤＮＡ遺伝子またはその一部を含んでなる遺伝子構造体が含まれる。

本発明のこの態様によって、　ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　２に示すヌクレオチド配 列を有する分子の一部分もしくは領域に対して実質的な類似性もしくは相補性を 有する５〜５０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが提供される。こ の場合の“実質的な類似性もしくは相補性”という用語は、以下に定義するよう に、ストリンジエンシイ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）が低い条件下、あるいは好ま しくは中位の条件下、あるいは最も好ましくは高い条件下で７）イブリッドを形 成できる類似性を意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば３ＲＴの 遺伝子配列を各種の起源から選択する場合または形質転換植物中に導入された遺 伝子配列を監視するのに有用である。好ましいオリゴヌクレオチドは、３ＲＴの 保存遺伝子配列、または植物の属、植物の種および／または植物の系統または品 種内で保存される配列に関する。

本発明の一つの態様では、そのオリゴヌクレオチドは３ＲＴの遺伝子配列の５′ または３′の末端に一致している。便宜上本願では、５′末端は、構造遺伝子の 出発コドンと遺伝子の中央部分との間の領域を実質的に形成すると考え、かつ３ ′末端は、遺伝子の中央部分と構造遺伝子の終止コドンとの間の領域を実質的に 形成すると考える。したがって、オリゴヌクレオチドまたはプローブは、５′末 端もしくは３′末端または５′末端と３′末端に共通の領域とハイブリッドを形 成できることは明らかである。これらのプローブはすべて本発明に含まれる。

一つの実施態様において、３ＲＴまたはその機能的変異体、誘導体、一部分、フ ラグメント、相同体もしくは類似体をコードする核酸配列は、例えばコサブレッ シゴン（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ）　（米国特許第５、０３４．３２３号） を用いることによって自生３ＲＴの活性を減少させるのに使用する。あるいは、 上記酵素またはその各種機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体 もしくは類似体をコードする核酸配列は、そのアンチセンス配向で用い（自生３ ＲＴの活性を減少させる。本発明をいずれか一つの理論に限定したくないが、ア ンチセンス３ＲＴ転写物またはそのフラグメントもしくは一部分（例えばオリゴ ヌクレオチド分子）は、該酵素に対して指定される天然産のｍＲＮＡのすべても しくは一部分と二重らせんを形成して、ｍＲＮＡの蓄積またはｍＲＮＡから活性 酵素への翻訳を妨害する。

他の変形では、リボザイム類を使用して標的の核酸配列を不活性化することがで きる。リポザイム類についてはＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ　１９８ ８年の文献に十分記載されている。この実施態様では、リポザイムは好ましくは ハイブリッド形成部分と触媒部分を含んでなり、そのハイブリッド形成部分は、 ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　２に示すのと実質的に同じヌクレオチド配列を有する 遺伝子由来のｍＲＮＡ転写物とハイブリッドを形成できる一つのおよび好ましく は二つのヌクレオチドアームをもっている。

本願において３ＲＴの活性を変更するということは、活性の通常の内因性もしく は既存のレベルの上下に３０％まで、好ましくは３０〜５０％、さらに好ましく は５０〜７５％、またはさらに一層好ましくは７５％以上増大もしくは減少させ ることを意味する。このような増大もしくは減少させることは３ＲＴの酵素活性 の“調節”と呼ばれる。一般に調節は３ＲＴ遺伝遺伝列配転写または翻訳のレベ ルについて行われる。活性のレベルはＲａｍＳｔｅｅｇら１９７９年の方法を用 いて検定することができる。

本発明の核酸はリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸でもよく、また一本鎖分子も しくは共有結合された閉環分子でもよい。核酸分子としてはｃＤＮＡが好ましい 。また本発明には本願に開示された遺伝子配列とハイブリッドを形成する他の核 酸分子も含まれる。

本発明の上記態様によって、 （ｉ　）　３ＲＴをコードし、および （ｉｉ）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２および／またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　３ に示すヌクレオチド配列またはその相補形と、低いストリンジエンシイ条件下で ハイブリッドを形成するヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子が 提供される。

ストリンジエンシイのレベルを定義するために、便宜上Ｍａｎｉａｔｉｌｉらの １９８２年の文献の３８７〜３８９頁および特にパラグラフ１１を引用する。な おこの文献は本願に援用するものである。本願では、低ストリンジエンシイを、 ４〜６ＸＳＳＣハ％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中３７〜４５℃で２〜３時間と定義する。

ハイブリッド形成に関与する核酸の起源および濃度によって、例えば、１〜４Ｘ ＳＳＣ１０，５〜１％（ｗ／　ｖ　）　ｓａｓ中４５℃以上で２〜３時間と本願 でみなされている中位のストリンジエンシイ条件、または０．１−ＩＸＳＳＣｌ ｏ、　１−１．ＯＳＤＳ中６０℃以上で１〜３時間と本願でみなされている高ス トリンジエンシイ条件のような別のストリンジエンシイ条件を用いてもよい。

最も好ましい実施態様として、本発明には、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２に示すヌ クレオチドを有する核酸分子；またはＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　２に示すヌクレ オチドもしくはアミノ酸の配列の少なくとも１個以上の領域に対して類似性が、 ヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列のレベルで少なくとも５０％、好ましくは 少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに一層好ましくは 少なくとも６５〜７０％およびさらにそれ以上好ましくは８５％より大きい分子 が含まれ、そしてその核酸は３ＲＴの活性を有する酵素をコードするかまたは３ ＲＴの活性を有する酵素をコードする配列に対して相補的である。しかし、ヌク レオチドもしくはアミノ酸の配列は、類似性が上記の百分率値より小さくしかも ａＲＴ様分子をコードすることがあることには注目すべきであり、このような分 子は、配列保存の領域をもっている場合、やはり本発明の範囲内にあるとみなす 。

本願において検討される核酸分子は、単独に配向して存在していてもよく、また はベクター分子および好ましくは発現ベクターと結合して存在していてもよい。

′ベクター分子”という用語は、最も広い意味で用いられ、核酸を植物細胞中に 移行し易くすることができおよび／または植物のゲノムに組込まれ易くすること ができる、核酸分子に対する中間の伝達体（Ｖｅｈｉｃｌｅ）が含まれる。中間 の伝達体は例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル・ボンバ ードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏＪｅｃｔ［Ｉｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ア グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ）による輸送、またはＤＮＡ もしくはＲＮＡのウィルスによる挿入の場合に用いるよう構成されている。本発 明に含まれる中間伝達体および／または核酸分子は植物のゲノム中に安定に組込 まれる必要があってもなくてもよい。またこのようなベクター分子は原核細胞中 で複製および／または発現することができる。

これらベクター分子またはその一部分は、植物ゲノム中に組込むことができるこ とが好ましい。その核酸分子はさらに、植物細胞内で核酸分子を発現させること ができるプロモーターの配列を含有している。この核酸分子とプロモーターも、 上記のようないくつかの手段によって細胞内に導入することができる。またこの ベクター分子には、３ＲＴのｍＲＮＡ転写物を切断できると先に定義したりボザ イムをコードする遺伝子配列が含まれるいる。

本発明の核酸またはその相補形は全長の酵素またはその誘導体をコードする。“ 誘導体”という用語は、天然産の酵素に対して単一もしくは複数のアミノ酸を置 換し、欠失させ、および／または付加したものでしかも３ＲＴ活性を保持してい るものを意味する。この点について本発明の核酸には、３ＲＴをコードする天然 産のヌクレオチド配列が含まれ、または前記天然産の配列に対し単一もしくは複 数のヌクレオチドを置換し、欠失させおよび／または付加したものが含まれる。

また本発明の核酸配列またはその相補形は、活性もしくは不活性であろうとも、 ３ＲＴの“一部分”をコードし、そしてこのような核酸分子は、オリゴヌクレオ チドのプローブ；また（よポＩＪメラーゼ連鎖反応もしくは各種の変異原生法、 または植物内で対応する遺伝子の発現を調節できるアンチセンス分子もしく　Ｇ ｔ　ＩＪボザイム分子の生成に用いプライマーとして有用である。

本発明の３ＲＴのアミノ酸挿入誘導体としては、アミノ末端および／またはカル ボキシル末端の融合体および単一もしくは複数のアミノ酸の配列内挿入体がある 。挿入アミノ配列変異体は、一つ以上のアミノ酸残基がタンパク質中の予め決め られた部位に導入された変異体であるが、得られる産物が適切に選別できるなら ばランダム挿入も行うことができる。欠失変異体は、配列から１個以上のアミノ 酸を除去されていることが特徴である。置換アミノ酸の変異体Ｃｔ配列中の少な くとも一つの残基が取り除かれ、その位置に異なる残基が挿入された変異体であ る。典型的な置換は表１にしたがって行われる。

３ＲＴがアミノ酸の置換によって誘導体化される場合、そのアミノ酸は一般に、 例えば疎水性、親水性、電気陰性度、かさだ力）の側鎖などのような類似の特性 を有する他のアミノ酸で置換される。アミノ酸の置換は一般に単一の残基につい て行われる。アミノ酸の挿入は一般に約１−１０個のアミノ酸残基のオーダーで 行われ、および欠失は約１〜２０個の残基の範囲で行われる。欠失もしくは挿入 は隣接するペアで行うことが好ましくすなわち２個の残基の欠失または２個の残 基の挿入が好ましい。

上記のアミノ酸変異体は、例えば固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ１ ９６４年）などのような当該技術分野で公知のペプチド合成法または組換えＤＮ Ａ操作法を用いて容易に作ることができる。公知のもしくは一部公知の配列を有 するＤＮＡの予め決められた部位に置換突然変異を起こさせる方法は公知であり 、例えばＭ１３突然変異変異性力（ある。置換、挿入または欠失の変異体として 発現する変異タンノくり質を製造するためＤＮＡ配列を操作する方法は、好都合 なことに、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら１９８９年に記載されている。

本発明の３ＲＴ酵素の組換えもしくは合成の変異体および誘導体の他の例には、 炭水化物類、脂質類および／またはタンノくり質類もしくはポリペプチド類のよ うな酵素に関連する分子の単一もしくは複数の置換、欠失および付加が含まれて いる。

また“類似体類”および“誘導体類”という用語には、３ＲＴの機能の化学的等 個物および上記のアミノ酸誘導体が含まれる。便宜上、本願では’３ＲＴ″とい う用語には、その機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体または 類似体が含まれる。

表１ アミノ酸の置換に用いる適切な残基 光の残基　代表的な置換基 Ａｌａ　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ｌｙｓ Ａｓｎ　Ｇｌｎ：　Ｈｉｓ ＾ｓｐ　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　５ｅｒ Ｇｌｎ　Ａｓｎ：　Ｇｌｕ Ｈｉｓ　Ａｓｎ：　Ｇ１ｎ １ｉｅ　Ｌｅｕ：　Ｖａｔ Ｌｅｕ　Ｉｌｅ：　Ｖａｔ Ｌｙｓ　Ａｒｇ：　Ｇｌｎ：　Ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ：　Ｉｌｅ：　Ｖａｌ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ：　Ｌｅｕ：　Ｔｙｒ Ｔｙｒ　Ｔｒｐ：　Ｐｈｅ Ｖａｌ　ｌｉｅ：　Ｌｅｕ：　Ｍｅｔ 本発明は、ペチュニアが今日まで最も便利で好ましい起源材料なのでペチュニア 由来の核酸配列を用いて例示する。しかし、当該技術分野の当業者は、類似の配 列を、他の植物またはある種の微生物のようないくつもの起源から単離すること ができることは直ちに分かるであろう。３ＲＴを直接もしくは間接的にコードす るこのような核酸配列はすべて、その起源のいがんにががゎらず本発明に含まれ る。ラムノジルトランスフェラーゼ類をコードする遺伝子の他の適切な起源の例 としては、限定されないが、サイリーニ・ジオイカ、アンチライナム属の植物、 シクラメン、アルストロメリア属の植物、メトロシブロス属の植物、ボテンティ ラ属の植物およびセントポーリア・イオナンタがある。

本発明によれば、３ＲＴをコードする核酸配列は、形質転換植物に導入されいず れかの方向に発現され、その結果適切な基質が植物細胞内で合成される場合はこ の基質をアンドシアニジン−３−ルチノシド類に最終的に変換するが、または代 謝物のこのような変換を内因性もしくは既存の３ＲＴの活性を減少させるかもし くはなくすことによって阻害する手段が提供される。これらのアントシアニン類 が産生されると、花弁の色が改変されて一部ブルーの色の産生に寄与する。植物 内での本発明の核酸配列の発現は、構成的、誘導的または発生的であり、かつ組 織特異的である。発現という用語は、最も広い意味で用いられ、ＲＮＡの産生ま たはＲＮＡとタンパク質の両者の産生が含まれている。またこの用語には核酸分 子の部分的発現も含まれる。

本発明の上記態様によって、適切な植物の細胞を、３ＲＴをコードするヌクレオ チドの配列を含んでなる核酸配列を用いて、最終的にこの核酸配列を発現するこ とができるようにする条件下で安定に形質転換し、形質転換植物を形質転換細胞 から再生させ次いで前記形質転換植物を、該核酸配列を発現できるようにするの に充分な期間と条件下で成長させることを含んでなる、３ＲＴを合成できる形質 転換顕花植物の製造方法が提供される。したがってその形質転換植物は、比較可 能な非形質転換植物内で発現される量に対して増大したレベルで非自生の３ＲＴ を産生ずることができる。

本発明の他の態様によって、３ＲＴの活性をコードするヌクレオチド配列または ３ＲＴ活性をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子 で、適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生さ せ、次いで必要な場合前記形質転換植物を、該核酸を発現できるようにするのに 充分な条件下で増殖させることを含んでなる、自生もしくは既存の３ＲＴ活性が 低下した形質転換植物の製造方法が提供される。

本発明のさらに他の態様によれば、適正に変更され植物細胞に導入されたＲ【遺 伝子またはその誘導体もしくは一部分から相同的組換えによって自生配列を修飾 してＲ【遺伝子を変更し、次いでその細胞から、遺伝子を修飾された植物を再生 させることを含んでなる、自生もしくは既存の３ＲＴ活性が低下した遺伝子修飾 植物の製造方法が提供される。

好ましい実施態様で、本発明は、本発明の核酸配列で適切な植物の細胞を安定に 形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで前記形質転換植物を 、該核酸配列が３ＲＴを発現できるようにするのに充分な期間と条件下で成長さ せることを含んでなる、変更された花序特性を示す形質転換顕花植物を製造する 方法が提供される。あるいは、前記方法は、本発明の核酸配列またはその相補的 配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生 させ、次いで前記形質転換植物をある期間、自生もしくは既存の３ＲＴの活性の レベルを変えるのに充分な条件下で増殖させることを含んでいてもよい。その変 更されるレベルは、比較可能な非形質転換植物の自生もしくは既存のレベルより 小さい方が好ましい。本発明を限定したくないならば、作用操作の原理は、自生 の３ＲＴの活性を低下させるには導入された核酸配列またはその相補的配列を発 現させる必要があるということである。しかし導入された遺伝子配列またはその 相補配列を発現させることは、所望の効果すなわち変化した花序特性を示す顕花 植物を得るために必要ではない。

関連する実施態様で、本発明は、適正に変更され植物細胞に導入されたＲｔ遺伝 子またはその誘導体もしくは一部分から、相同的組換えによって自生配列を修飾 してＲ【遺伝子を変更し、次いでその細胞から遺伝子を修飾された植物を再生さ せることを含んでなる、変更された花序物性を示す顕花植物の製造方法が提供さ れる。

この変更された花序には、受容個体の植物の遺伝子型および生理学的状態によっ て、異なる色相のブルーもしくはレッドの花または他の色の花の産生が含まれる 方が好ましい。

したがって、本発明には、３ＲＴもしくはその一部をコードする組換え遺伝子を 発現できる形質転換植物、または３ＲＴの調節を行う必要がある場合には任意に 転写することができるｍＲＮＡ分子のすべてもしくは一部に対して実質的に相補 的な核酸配列をもっている形質転換植物を製造する方法があって；適切な植物の 細胞を、３ＲＴをコードするヌクレオチド配列または３ＲＴをコードする配列に 相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子で、必要な場合、前 記単離された核酸分子を最終的に発現できるようにする条件下で安定に形質転換 させ、次いでその細胞から形質転換植物を再生させることを含んでなる方法が含 まれる。“適切な植物”という用語は、アンドシアニジン−３−グリコシド類を 産生ずることが可能でかつ所望の色を発生するのに必要な適正な生理学的特性を 有する植物を意味する。

当該技術分野の当業者は、例えば標的植物中に天然に存在する酵素の発現を増減 させて、異なる色相のブルーもしくはレッドのような異なる色相の色をもたらす ような本発明に適用可能な変形は直ちに分かるであろう。

したがって、本発明には、本発明の核酸配列のすべてもしくは一部を含有するす べての形質転換植物もしくはそのアンチセンス形および／またはその相同体もし くは関連する形態、および特に、変更された花序特性を示すそれら形質転換植物 が含まれる。これらの形質転換植物は、３ＲＴをコードするヌクレオチド配列ま たは３ＲＴをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる導入核酸 分子を含有している。一般にその核酸は、該植物のゲノムに安定に導入されるが 、また本発明には、その植物細胞内で複製することができるＤＮＡもしくはＲＮ Ａのウィルスのような自己複製核酸配列内に３ＲＴヌクレオチド配列を導入する ことも含まれる。また本発明にはこのような形質転換植物由来の種子も含まれる 。このような種子は、特に着色している場合、植物に対する専有の標識として有 用である。

本発明の他の態様は３ＲＴの組換え形に関する。この酵素の組換え形は、例えば より活性が大きい酵素を開発する研究に用いる材料源を提供し、着色化合物を製 造するのに用いる生体外の系を開発するのに有用である。

本発明のさらに他の態様は、植物内で３ＲＴを発現するかまたは自生３ＲＴ酵素 のダウンレギュレーションを行うことができる遺伝子構造体を製造する場合の本 願に記載した遺伝子配列の用途を提供するものである。

本発明のさらに別の態様は、３ＲＴをコードする遺伝子配列を染色体外にプラス ミド形で保有する原核生物または真核生物に関する。

一つの実施態様ではそのプラスミドはエシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏｌ＋）中のｐｃｃｐｓｏｅである。プラスミドｐｃｃｐａｏｅを保有 する微生物のエシエリキア・コリ菌株ＸＬＩ−ｂｌｕｅは、オーストラリア２０ ３７、ニューサウスウェールズ、ビンプル、スウアキン・ストリートｌに所在の ｔｈｅ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに１９９３年７月２９日付けで受託番号Ｎ９３／３２ １３９にて寄託された。

本発明を以下の図と実施例によってさらに説明するが本発明を限定するものでは ない。

図面中： 図１はフラボノイド色素の生合成経路の概略図である。上記経路の第一部分に関 与する酵素類は下記のとおりである。ＰＡＬ　＝フェニルアラニンアンモニアリ アーゼ、Ｃ４Ｈ＝ケイ皮酸４−ヒドキシラーゼ、　４ＣＬ　＝　４−フマル酸： 　ＣｏＡリガーゼ、ＣＨ３＝カルコンシンターゼ、ＣＨＩ＝カルコンフラバノン イソメラーゼ、Ｆ３Ｈ＝フラバノン３−ヒドロキシラーゼ、ＤＦＲ＝ジヒドロフ ラボノール−４−レダクターゼ（Ｂｌｅｄら１９８９年）；　３ＧＴ　＝ＵＤＰ −グルコース：フラボノイド−３−〇−グルコシルトランスフェラーゼ、　３Ｒ Ｔ　＝ＬＩＤＰラムノース：アントシアニジン−３−グルコシドラムノジルトラ ンスフェラーゼ、これはＲ【遺伝子座で制御される。上記経路の後の部分におけ る遺伝子座は次のとおりである。Ｇｆ＝アシル化反応を制御する遺伝子座；アシ ル化のステップに続いて５−０−グリコジル化が行われるが５−〇−グリコジル 化はＧｆ遺伝子座と関連がない（Ｊｏｎｓｓｏｎら１９８４年ｃ）；Ｍｔｌおよ びＭｔ２＝３’メチル化反応に関与する遺伝子座（Ｊｏｎｓｓｏｎら１９８４年 ｂ）：ＭｆｌおよびＭｆ２　＝　３　’と５′のメチル化反応に関与する遺伝子 座（Ｊｏｎｓｓｏｎら１９８４年ｂ）。

図２は花弁のｃＤＮＡライブラリー＃ｌを調製するのに用いられるベクターｐｃ ＧＮ１７０３中のｃＤＮＡ挿入断片の線図である。

図３はプラスミドｐｃＧＰ８０６の線図である。ａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡ挿入断 片は箱わくで示す。その５′末端から約１００　ｂｐ内方の位置に内部ＰｓｔＩ 部位がある。

図４はＶＲ（Ｖ／Ｒ）Ｆ２植物のＲＦＬＰ分析で得た代表的なオートラジオグラ フである。ＥｃｏＲＩで消化したゲノムＤＮＡをａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡのクロ ーンでプローブした。ａＥｌｏ、　９プローブを用いて得られたＲＦＬＰのデジ グネーション（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）は、ｄｆｒ−Ｃプローブを用いて得ら れたＲＦＬＰのデジグネーションに一部分一致した。Ｖ　：　Ｖ２３様ＲＦＬＰ 　、　Ｒ：　Ｒ５１様ＲＦＬＰ　、　Ｈ：ヘテロ接合（ＶＲ）　ＲＦＬＰ０図５ は各種のピー・ハイブリダ（Ｐ、　ｈｙｂｒｉｄａ）系由来の花弁のへり（ｌｉ ｍｂ）の中のａ［＋１０．９ｃＤＮＡがコードするｍＲＮＡのＲＮＡブＯット分 析の結果を示す図である。Ａ、＊ｔｐ標識化ａＥ１０．９プローブとピー・）１ イブリダ系由来の全ＲＮＡ　２０μｇとのハイブリッド形成。ペチュニア系の遺 伝子型は実施例１に示す。長時間露出したところ、二つのハンドがＲ５１系に検 出された。Ｂ、ｌｆＰ標識化ａＥ１０．９プローブと、Ｒｔ遺伝子座にトランス ポゾンを有するピンク色のＴｒ３８の花弁のへりから単離した全ＲＮＡ　２０μ ｇとのハイブリッド形成Ｃｒｔ”　）　、ならびに上記プローブと、Ｒｔ対立遺 伝子のうちの一方からトランスポゾンを切取ったおおむね深紅色のＴ「３８の花 弁のへりから単離した全ＲＮＡ　２０μｇとのハイブリッド形成（胆）。

図６はバイナリ−プラスミドｐｃｃｐｓｔｏの線図である。図に示すように、ｐ ｃＧＰ８０６由来のｃＤＮＡ挿入断片を、発現ベクターｐＣＧＰ２９３のＭａｃ プロモーターの後にセンスオリエンテーションでクローン化した。

図７はバイナリ−プラスミドｐｃＧＰ８１１の線図である。図に示すように、ｐ ｃＧＰ８０６由来のｃＤＮＡ挿入断片を、発現ベクターｐＣＧＰ２９３のＭａｃ プロモーターの後にアンチセンスオリエンテーションでクローン化した。

図８はＰＡＬ、　ＣＨ５，ＣＨＩ、　ＤＦＲおよび３ＲＴに対する転写物の発現 プロフィルを示すＲＮＡプロット分析の結果を示す。２ｔｐ標識化プローブと、 実施例１に記載した五つの発育段階のピー・ノーイブリダｃｖ　０ＧＢ（１〜５ ）由来の花弁から単離した全ＲＮＡ　２０μｇとのハイブリツド形成。

図９はＰＡＬ、　ＣＨ３，Ｃ旧、　ＤＦＲおよび３ＲＴに対する転写物の発現プ ロフィルを示すＲＮＡプロット分析結果を示す。ｓｔｐ標識化プローブと、２％ （Ｗ／Ｖ）グルコース中でインキュベートした後、０〜７日間ハイライトに暴露 した６週齢実生由来のＯＧＢの葉の組織から単離した全ＲＮＡ　２０μｇとのハ イブリッド形成。

図１ＯはＯＧＢ植物の各種の部分の３ＲＴ　ｍＲＮＡのＲＮＡプロット分析の結 果である。各レーンには全ＲＮＡの試料２０μｇが含有されている。花の部分は すべて、発育段階がほぼ３の花から得た。栄養器官は６週齢実生から得た。茎／ 根の試料は茎と根の結合部であり、根（Ｔ、　Ｃ，）の試料は組織培養を行った 小植物から採取した。

図１１は段階３のペチュニアの花弁のつぼみの中に３ＲＴＲＮＡが局在している のをｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で示した図である。プラスミドｐｃＧＰ ８０６に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ベクター中に 入っているａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡクローンを入れた。プラスミドｐｃｃｐａｏ ａをＥｃｏＲＩによって線状にしてアンチセンスＲＮＡ転写物をＴ７プライマー を用いて合成し次いでＸｈｏ　Ｉで線状にし、Ｔ３プライマーを用いてセンス転 写物を得た。センスＲＮＡプローブは非特異的ハイブリッド形成の対照として使 用した。ＡはセンスａＥ１０．９転写物とハイブリッドを形成した対照のスライ ドを示す。略語は次のことを意味する。Ｕ＝上表皮細胞層；ｖ＝維管束；ｍ＝葉 肉細胞および１＝下表皮細胞層。ＢはアンチセンスａＥ１０．９転写物とハイブ リッドを形成した花弁の断面を示す。スケールパーは５０μｍを示す。

本明細書を通じて使用されるアミノ酸の略語を以下の表に示す。

アミノ酸　３文字　１文字 Ｌ−アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ Ｌ−アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ｌ−グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ 本願に示すヌクレオチドとアミノ酸の配列に割当てたＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯをまと めて以下に示す。

配列　ＩＤ　ＳＥＱ　ＮＯ オリゴ＃　ｌ　１０　ＳＥＱ　Ｎｏ　：　１オリゴ＃　２　１Ｄ　ＳＥＱ　ＮＯ ：　６オリゴ＃　３　１０　ＳＥＱ　Ｎｏ　：　７オリゴ＃　４　１Ｄ　ＳＥＱ 　Ｎｏ　：　４オリゴ＃　５　１Ｄ　ＳＥＱ　ＮＯ：　５ａＥｌｏ、９　１０　 ＳＥＱ　Ｎｏ　：　２ａＥ１０．１２　１０　ＳＥＱ　Ｎｏ　：　３実施例１− 植物材料 使用したペチュニア・バイブリカの品種を表２に示す。

表２ 植物は、光の強さが１０．０００ルツクスで日長が１４時間および温度が２２〜 ２６℃で特別の成長室内で成長させた。ＯＧＳの花を以下に定義した発育段階で 収穫した。

段階ｌ：無着色の閉じたつぼみ（長さ：＜２５ｍｍ）。

段階２：着色した閉じたつぼみ（長さ：２５〜３５ｍｍ）。

段階３：花冠が現われた暗紫色のつぼみ（長さ：　＞３５＋ｎｍ）。

段階４：開やく前の暗紫色の開いた花（長さ：　＞５０ｍｍ）。

段階５：すべてのやくが開いて完全に開いた花。

他の品種の花は開やくする前に、色素の蓄積が最大の段階で収穫した。

実施例２−細菌菌株 使用したエシェリキア・コリの菌株は次のとおりである。

ＤＨ５ａ　５ｕｐＥ４４．Δ（ＩａｃＺＹＡ−ＡｒｇＦ）υ１６９．（φ８０１ ａｃＺΔＭ１５）、　ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ａｒｋつ、　ｒｅＣ＾１．　ｅｎ ｄＡＩ、　ｇｙｒＡ９８．　ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡＩ、　ｄｅｏＲ。

（Ｈａｎａｈａｎ、　１９８３年およびＢＲＬ、　１９８６年）。

ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　５ｕｐＢ４４．ｈｓｄＲ１７Ｃｒｋ−、ＩＩＩｋつ、　ｒｅ ｃＡｌ、　ｅｎｄＡＩ、　ｇｙｒＡ９６．　ｔｈｉ−１ｒｅｌＡＩ、　Ｉａｃ” 、　［Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、　Ｉａｃｌ”　ＩａｃＺΔＭ１５．　ＴｎｌＯ（ｔｅ ｔ”）］（Ｂｕｌｌｏｃｋら、１９８７年）。

ＰＬＫ−Ｆ　ｒｅｃＡ、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ”）、ｍｃｒＡ−、ｍｃｒ Ｂ−、Ｉａｃ’、５ｕａＥ４４゜ｇａｌＫ２．　ｇａｌＴ２２．１ｅｔＢｌ、　 ［Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、　Ｉａｃｌ”・１ａｃＺΔＭ１５．ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”） ］　（ストラタジェン社）ディスアームされた（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバク テリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｌｌｌｅｆａ ｃｉｅｎｓ）菌株として使用されたのはＡＧＬＯ（Ｌａｚｏら１９９１年）であ る。

クローニングベクターのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅはス トラタジエン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手した。

イー・コリの形質転換 イー・コリの菌株の形質転換は１ｎｏｕｅら１９９０年の方法にしたがって行っ た。

実施例３−一般的な方法 オリゴヌクレオチド類の合成 オリゴヌクレオチド類はＡｐｐｌｉｅｄ　８ｉｏｓｙｓｔｅ＋ｎｓ　ＰＣＲ−Ｍ ａｔｅ　ＤＮＡ合成器を利用し、メーカーの推奨する方法を用いて合成した。合 成したオリゴヌクレオチド類は５’−３’： オリゴ＃　Ｉ　ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１ オリゴ＃　２　ＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　６ オリゴ＃　３　ＣＴＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＡＣＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７オリ ゴ＃　４　ＣＣＣＡＣＴＧＴＡＡＴＧＴＡＧＣＡＧＴＡＴＴ　ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎ Ｏ：　４オリゴ＃　５　ＣＣＡＴＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡ　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ　：　５であった。

Ｉｍｐで標識を付けたｃＤＮ＾ＤＮＡプローブ２０ｔｔｇの全ＲＮＡを２００℃ で２分間インキュベートし次いで氷上でさらに２分間冷却した。そのＲＮＡを、 ２０μｇ／ｍｌオリゴーｄＴ、　５０ｍＭトリス−）ＩＣＩ　１）ｌ（８゜０． ７５ｎＭ　ＫＣＩ、　３０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．５　ｍ ｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ、　２００　、［ＺＭ　ｄＡＴＰ、　２００／ＩＺ Ｍ　ｄＧＴＰ、２００　ａＭ　ｄＴＴＰ、　２．５μＭ　ｄＣＴＰ、１００μＣ ｉ　Ｃａ　−”Ｐ）　−ｄＣＴＰ　（Ｂｒｅｓａｔｅｃ社、　３０００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）　、４０単位のＲＮアシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および６０００年位の モロニーマウス白血病ウイスル逆転写酵素（ＢＲＬ社）を含有する反応混合物に 添加し３７℃で１時間インキュベートした。ＥＤＴＡとＮａＯＨをそれぞれ最終 濃度５０ｍＭおよび０．２Ｍまで添加し、その混合物を７０’Ｃで２０分間イン キュベートした。得られた混合物に、ＭＣＩを０．２Ｍの濃度まで添加して中和 した。取り込まれなかった〔α−”Ｐ）　−ｄＣＴＰを、セファデックスＧ　− ５０（Ｆｉｎｅ）のカラムのクロマトグラフィーで除去した。

ＤＮＡプローブのｚｔｐによる標識化 ＤＮＡフラグメント（５０〜１００　ｎｇ）を、オリゴラベリングキット（Ｂｒ ｅｓａｔｅｃ社）を利用して５０μＣｉの（α、ｊｌｐ）−ｄＣＴＰを用い、放 射能の標識を付けた。取り込まれなかった〔α−″”Ｐ）　−ｄＣＴＰを、セフ ァデックスＧ　−５０（Ｆｉｎｅ）カラムのクロマトグラフィーで除去した。

実施例４ ｃＤＮＡライブラリー＃１の構築 ＴｕｒｐｅｎとＧｒｉｆｆｉｔｈ　（１９８６年）の方法を用いて、ビーＮハイ ブリダｃｖ　ＯＧＢの段階３〜４の花の花弁組織から全ＲＮＡを単離した。ポリ （Ａ）　”　ＲＮＡを、３サイクルのオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィ ーによって上記全ＲＮＡから選択した（ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ　１９７２年 ）。

五つの発育段階のピー・ハイブリダｃｖ　ＯＧＢから調製したｍＲＮＡ　５μｇ を用へ２Ｍ体−プライマー法（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら１９８４年）を利用しｐｃ ＧＮ１７０３中にｃＤＮＡライブラリーを構築した（図２）。プラスミドｐｃＧ Ｎ１７０３はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　１Ｊ１３−　（ストラタジェン社）に基 づいたプラスミドベクターであり、Ｃａｌｇｅｎｅ　Ｉｎｃ社（米国、カリフォ ルニア州）が構築した。ポリリンカ一部位は、ｃＤＮＡｔｌｌｔ人断片の両端に ＰｓｔＩ、ＸｈａＩおよび５ｉｎａ　Ｉの部位が隣接するように変更した。Ｔ３ プライマーおよびｌａｃプロモーターを含有する旧ｎＤｎＩ／　ＰｖｕＩＩフラ グメントは除去した。

上記のライブラリーを、ＬＢ　（ＳａｍｂｒＯＯｋら１９８９年）＋アンピシリ ン（１００μｇ／ｍＬ）プレート上に高密度でプレートし、３７℃で１６時間イ ンキュベートした。次いでコロニーをかきとり、ＬＢブロス＋１５％（ｖ　／　 ｖ　）グリセリン中に懸濁させて一７０℃で貯蔵した。上記増幅されたライブラ リーの２万個のコロニーを、２０００コロニー／プレートの密度でＬＢ＋アンピ シリン（１００ｕ　ｇ／ｍＬ）のプレート上にプレートシ、３２℃で１６時間イ ンキュベートした。４０’Ｃで１時間インキュベートした後、Ｃｏ１ｏｎｙ／Ｐ ｌａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ　（登録商標、ＤｕＰｏｎ　を社）にコロニーリフト を２回とって、メーカーが推奨するとおりに処理した。

ｃＤＮＡライブラリー＃ｌのディファレンシャル・スクリーニング（ｄｉｆｆｅ ｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）分画選別法を用いて、ＯＧＢの花弁（段 階３〜４）中で発現されるがＲ５１の花弁（段階３〜４）中には少ないかまたは 存在しない遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを単離した。

２００００個のコロニーを、２０００個／１５ｃｍプレートで選別した。ハイブ リットを形成させる前に、フィルターを、５０＋ｎＭ　）リス−〇ＣＩ　ｐＨ８ ，０゜Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％（ｗ／ｖ）サルコ シンの溶液（前洗浄液）で、４２℃で３０分間前洗浄を行った。次いでそのフィ ルターを２ＸＳＳＣ，１％（ｗ／　ｖ　）　Ｓ０５中ですすいだ。−組のコロニ ーリフトのプレハイブリダイゼーション（４２℃、１時間）次いでハイブリッド 形成（４２℃、　１６時間）を、５０％（Ｖ／Ｖ）脱イオンホルムアミド、ｌ　 Ｍ　ＮａＣ１，１％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ　、　１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラ ン（ハイブリッド形成溶液）中で行った。ハイブリッド形成段階の前に、分解サ ケ精子（ｄｅｇｒａｄｅｄ　Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ）　ＤＮＡ　（１００ｔ ｔ　ｇ／ｍＬ）およびポリＵ（２０μｇ／ｍＬ）をＳｌｐ標識付けｃＤＮＡプロ ーブ（３Ｘ１０＠ｃｐｍ／ｎＬ）とともに添加した。フィルターを、２ＸＳＳＣ ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で６５℃にて６０分間洗浄し、次いで０．２ＸＳＳＣ ，１％（ｗ／ｖ）ＳＯ３によって６５℃で３０分間洗浄し、増感スクリーン付き Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲフィルムに一７０℃で１６時間暴露した。

上記の分画スクリーンから１９６個のｃＤＮＡクローンを単離し、並べた列（ｏ ｒｄｅｒｅｄ　ａｒｒａｙｓ）に配置した。次にこれらの列を、ＯＧＢの花弁（ 段階３〜４）、ＯＧＢの花弁（段階５）および０ＧＢ（葉）から抽出した全ＲＮ Ａから製造されたｃＤＮＡプローブでプローブした。１９６個のｃＤＮＡクロー ンの中の７８個が、ＯＧＢの花弁（段階５）とＯＧＢの葉に比べて、ＯＧＢの花 弁（段階３〜４）中に優先的に発現された。これらのクローンを、同胞分析（ｓ ｉｂｌｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ）　、ＲＮＡブＯ−／ト分析および配列分析を 行うために選別した。

実施例５−同胞分析 ｃＤＮＡ挿入断片の単離と精製 上記７８個のｃＤＮＡクローンのどれが同胞であるかを決定するため、−回の選 択で得た標識化ｃＤＮＡ挿入断片を並べた列とハイブリッドを形成させた。ｃＤ ＮＡ挿入断片は、適切な制限エンドヌクレアーゼで制限し次いでＴＡＢ泳動緩衝 液中の低融点アガロースゲルで電気泳動させることによって、プラスミドベクタ ーから単離した。次に正しいＤＮＡフラグメントを切り取り、フェノール：クロ ロホルムニイソアミルアルコール（５０：４９：１）で３回抽出し次にエーテル で２回抽出し次いでエタノールで沈澱させて精製した。得られたＤＮＡのペレッ トを最後にＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，５） に再懸濁させ、その一部を、ＥｃｏＲＩで制限した５ＰＰ−Ｉ　ＤＮＡＣＢｒｅ ｓａｔｅｃ社）の既知量の横のアガロースゲル上に電気泳動させて濃度を推定し た。

陽性のｃＤＮＡクローンをプレートからとり出しＬＢ＋アンピシリン（１００μ ｇ／ｍＬ）ブロス中に入れ３７℃で１６時間インキュベートした。

この−夜培養物の一部（２００μＬ）を、マイクロタイタートレイ中に入れて並 べた列を作った。これらのｃＤＮＡクローンを選別するため、これらの列を、Ｌ Ｂ＋アンピシリン（１００μｇ／＋ｎＬ）プレートの上に置いたＣｏ１ｏｎｙ／ Ｐｌａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎフイルター（Ｄｕｐｏｎ　を社）上にレプリカをと った。その細菌を２８℃で１６時間増殖させ、次いで３７℃で２時間インキュベ ートした。これらのフィルターを取出し、１０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳの溶液上に２ 分間浮かせて処理し次いで１枚のプロッティング紙の上で風乾した。そのＤＮＡ を、オートクレーブ法（ＡｌｌｄａｙおよびＪｏｎｅｓ　１９Ｂ７年）を利用し てフィルター上で固定した（　ｂａｋｅ）。ハイブリッドを形成する前に、これ らフィルターを前洗浄溶液中で４２℃にて３０分間洗浄し次に２ＸＳＳＣ，１％ （ｗ／ｖ）ＳＤＳ中ですすいだ。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリッ ド形成のステップは先に説明したのと同様にして行った。

１３個のｃＤＮＡクローンが高ストリンジエンシイ条件下でｃＤＮＡクローン（ ａＥｌｏ）とクロスハイブリッド形成を行った。最も長いｃＤＮＡ挿入断片（０ ，９Ｋｂ）を有するクローンをｐｃＧＰ７１１と命名し、最も短い挿入断片（０ ，５Ｋｂ）を有するクローンをｐｃＧＰ７１２と命名した。

実施例６−長い方のｃＤＮＡクローンの単離ｃＤＮＡライブラリー＃ｌから単離 したａ［！１ｏｃＤＮＡクローンは長さが０．９にｂに過ぎなかった。全長のｃ ＤＮＡを単離するため、ｃＤＮＡライブラリー＃２由来の１６．０ＯＯｐｆｕを 、ｐｃＧＰ７１１由来のｃＤＮＡ挿入断片で選別した。

ｃＤＮＡライブラリー＃２の構築 ２μｇのポリ（Ａ）″ＲＮＡを、ＩＸ　５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　（登録商標） 反応緩衝液、１０ｍＭジチオトレイトール、５００　ｕＭ　ｄＡＴＰ、　５００ μＭ　ｄＧＴＰ。

５００　ｕＭ　ｄＴＴＰ、　５００μＭ　Ｓ−メチル−ｄＣＴＰ、　０．７５μ ｇオリゴヌクレオチド＃　Ｉ　Ｃ３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１）および２　μ］　 ５ｕｐｅｒｓｃｒｊｐｔ　（登録商標）逆転写酵素（ＢＲＬ社）を含有する２０ μｌの容積の混合物中で逆転写させた。その反応混合物を３７℃で５０分間次い で４４℃で１ｏ分間インキュベートシ、次に氷上に置いた。

第二ストランドの反応混合物（１４０μＬ）を上記第一ストランドの反応混合物 に添加した。その第二ストランドの反応混合物は、２１ｍＭ）リス−ＨＣ１１０ ４ｍＭ　ＫＣｌ、　５．３＋ｎＭ　ＭｇＣＩｔ、１７１　ｔｔＭ　β−ＮＡＤ、 １１．４ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ，、２１４ｕＭ　ｄＡＴＰ、　６４２μＭ　ｄ ＣＴＰ、　２１４μＭ　ｄＧＴＰ、　２１４ｕ　Ｍ　ｄＴＴＰ、　４　ｍＭ　Ｄ ＴＴ、１０μｃｉ”Ｐ　−ｄＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍＭｏ１ｅ）、１５単位 イー・コリＤＮＡ　リアーゼ、４０単位イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ社）および０．８単位ＲＮアーゼＨで構成されている。その最 終混合物を１６℃で１５０分間インキュベートした。平滑断端の二本鎖ｃＤＮＡ を作るために、ｌＯ単位のＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを添加し、次いで反応を１ ６℃でさらに１５分間続けた。反応を停止させ、次にｃＤＮＡをフェノール／ク ロロホルムで抽出し次にクロロホルムで抽出し次いでエタノールで沈澱させて精 製した。

ＥｃｏＲＴアダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を上記ｃＤＮＡに連結し次いでメー カーが推奨する条件を用いてキナーゼで処理した。その酵素を加熱によって（７ ０℃、２０分間）変性させ、モして１）ＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出 しエタノールで沈澱させることによって精製した。

そのｃＤＮＡを、メーカーが推奨する条件を用い、１００μＬの反応容積中で５ ０単位のＸｈｏ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）で消化した。酵素を加熱して 失活させ（７０℃、２０分間）次にその混合物を、ＳＴＥＴＲ緩衝液ａｍｂｒｏ ｏｋら１９８９年）中で予め平衡化させておいた５４００スパンカラム（Ｓｐｕ ｎｃｏｌｕｍｎ）　（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ社）を通過させた。生成した溶出 液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。４℃で３０ 分間、微量遠心分離器にかけた後、得られたｃＤＮＡベレットを７０％（Ｖ／ｖ ）エタノールですすぎ、風乾し、１０μｌのＴＲ緩衝液（１１１１Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ　（ｐＨ７，５）、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。

上記ｃＤＮＡ混合物の一部の２．５μｌを、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ ７，０）。

１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、　１０ｍＭジチオトレイトール、１　ｍＭ　ＡＴＰおよ び２単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼからなる反応緩衝液５μｌ中にて、λＺＡＰ　ｎ　 ＥｃｏＲＩ　／ＸｈｏＩ／ＣＩＡＰで処理したベクター（ストラタジェン社）ｌ μｇと連結させた。この反応は４℃で４日間行った。

室温で２時間インキュベートした後、その連結反応混合物を、Ｐａｃｋａｇｅｎ ｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてパッケージした。組換え体の総数はＩ 　Ｘ１０＠ｐｆｕであった。

ＰＬＫ−Ｆ細胞をトランスフェクトした後、上記のパッケージしたｃＤＮＡを、 ５０．０００ｐｆｕ／１５ｃｍ直径プレートの量でプレートした。そのプレート を３７℃で８時間インキュベートし、次いでファージを、１００ｍＭ　ＮａＣ１ ，８ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋、　５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０，０，０１ ％ゼラチン〔ファージ貯蔵緩衝液ＣＰＳＢ））中に溶出させた。クロロホルムを 添加し、そのファージを増幅ライブラリーとして４℃で貯蔵した。

プラスミドの単離 ヘルパーファージＲ４０８（ストラタジエン社）を用い、メーカーが示す方法を 利用して、増幅されたλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリー＃２からペチュニアｃＤ ＮＡ挿入断片を含有するｐＢＩｕｅｓｅｒｉｐｔファージミド類（ｐｈａｇｅｍ ｉｄｓ）を切り出した。イー・コリＸＬＩ−Ｂｌｕｅを上記ファージミド混合物 でトランスフェクトし、次いでそのコロニーを１００μｇ／ｍＬのアンピシリン を含有するＬ８プレート上にプレートした（ＳａＩｌｌｂｒｏｏｋら１９８９年 ）。単コロニー（Ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｌｏｎｙ）を、ＬＢブロス（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら１９８９年）＋アンピシリン（１００ｕ　ｇ／ｍＬ）中で増殖させ次いで アルカリ溶菌法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年）を用いてプラスミドを単離す ることによって、ｃＤＮＡ挿入断片について分析した。ｃＤＮＡ挿入断片が存在 することが測定されたとき、アルカリ溶菌法を用い、５０ｍＬの一夜培養物から 、一層多量のプラスミドＤＮＡが製造された。

プラスミドＤＮＡは、ＣｓＣｌ勾配液上にバンドを形成させることによってさら に精製した（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。

ｃＤＮＡライブラリー＃２の選別 ハイブリッド形成を行う前に、二つのプラークリフトを前洗浄溶液中で４２℃に て３０分間洗浄し、０．４Ｍ水酸化ナトリウム中、４２℃で３０分間ストリップ し、０．２Ｍトリス−１１Ｃ１，ｐＨ８，０，０，ｌＸ５ＳＣ，０，ＩＮ（ｗ／ ｖ）ＳＤＳの溶液中、４２℃で３０分間洗浄し、最後に２ＸＳＳＣ，１，０％（ ｗ／ｖ）ＳＤＳ中ですすいだ。プレハイブリダイゼーションを４２℃で１時間行 い、そのハイブリッド形成溶液に１ｆｆｉｐで標識を付けたプローブ（ｌ　ｘ　 １０’　ｃｐｍ／ｍＬ）を添加し、次いでハイブリッド形成を４２℃でさらに１ ６時間続けた。次にそのフィルターを２ＸＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、６ ５℃で２×３０分間洗浄し続いて０．２ＸＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、６ ５℃で３０分間洗浄し、次に増感スクリーン付きＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルムに 一７０℃で１６時間暴露した。

１３個のハイブリッド形成りローンのうちの１個（ｐｃＧＰ８０６と命名）は１ ．７ＫｂのｃＤＮＡ挿入断片（ａＥｌｏ、　９）を含有していたのでその後の分 析を行うために選択した（図３）。上記１３個のハイブリッド形成りローンのう ちの別の１個（ｐｃＧＰ８２０と命名）がわずかに長いｃＤＮＡ挿入断片（ａｔ ！１０．１２）を含有していることがその後に分かった。

実施例？−ＤＮＡ配列の分析 ＤＮＡの配列決定は、特に、５ｅｑｕｅｎａｓｅ酵素（ＵＳＢ、バージｇン２． １）を用い、Ｓａｎｇｅｒら１９７７年の方法で行った。ａＥｌｏ、　９の完全 配列は、５ｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて決定し た（ＳＥＱ　Ｉｌｌ　ＮＯ：２　）　、　ｐｃＧＰ８２０　ｃＤＮＡクローン（ ａＥｌＯ，１２）の一部分の配列をＳＥＱ　１ＯＮＯ；３に示す。

Ｇｅｎｅｂａｎｋ　５ＷｉＳＳ−ＰＲＯＴ　ａｎｄ　ＩＩ！ＭＯＬのデータベー スに対する相同性のサーチを、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのプログラムを用 いて行った（ＰｅａｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ　１９８８年）。

ａＥｌｏ、　９の完全配列をＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２に示す。この配列は、４ ６９個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする最初のメチオニンから始ま る。１４０７個の塩基の読み取り枠を含有していた。この読み取り枠は最初のメ チオニンから上流に続いているが、このことは、ｐｃＧＰ８２０由来のｃＤＮＡ 挿入断片（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３　）の５′末端の一部の配列が、別の同相 のメチオニン（ｉｎ−ｐｈａｓｅ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）がａＥｌｏ、　９の 最初のメチオニンから上流の４個目のアミノ酸として存在していることを示して いることから分かる。ａＥｌｏ、　９がコードするアミノ酸配列は、トウモロコ シＢＺＩ　ＵＤＰグルコース：フラボノール−３−〇−グルコシルトランスフェ ラーゼ（Ｆｕｒｔｅｋら１９８８年：　Ｒａ１ＳｔＯｎら１９８８年）およびホ ルジューム・プルガーゼの３ＧＴ（）ｌｏｒｄｅｕｍ　ｖｕ１ｇａｒｅ３ＧＴ） （Ｗｉｓｅら１９９０年）（表３Ａと３８）の両者に対して類似性を示した。

最も類似性が高い（３６％）領域は、ａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡ配列のアミノ酸２ ５２〜３９６の１３０個のアミノ酸にわたっている。またこの領域の後部の１／ ２のアミノ酸３３５〜３８７（５２個のアミノ酸にわたっている）は、非植物の 起源の他のグリコジルトランスフェラーゼ類、すなわちヒト由来（Ｒｉｔｔｅｒ ら１９９１年）、マウス由来（ＫｉｉＩＩｕｒａおよびＯｗｅｎｓ　１９８７年 ）およびラット由来（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ　１９８６年）のグルクロノジルトラ ンスフェラーゼ類、ならびにオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａ ｐｈａ　ｃａｌｉｆｎｒｎｉｃａ）の核多角体病ウィルス由来のエフジステロイ ドグルコシルトランスフェラーゼ（０°Ｒｅ１ｌｌｙおよびＭｉｌｌｅｒ１９８ ９年、　１９９０年）に対して相同性（約３２％）を示した。植物、ヒトおよび ウィルスの起源由来のグリコジルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を５２個の アミノ酸のスパンにわたって比較した結果を表４に示す。配列のアラインメント （ａｌ　ｉｇｎｍｅｎｔ）はＣ１ｕｓｔａｌのプログラム（ｌ（Ｉｇｇｉｎｓお よび５ｈａｒｐ　１９８８年）を用いて実施した。

表３八　ａＨｌｏ、９の１〜３１３の推定アミノ酸配列と他の植物のグリコジル トランスフェラーゼ類のと比較。エイチ・プルガーレ（ＧＴ−オオムギ）由来の ３ＧＴおよびゼット・メイズ（Ｚ、ｍａｙｓ）（Ｂｚｌ−トウモロコシ）由来の ３ＧＴに対してａＥｌｏ、　９の推定アミノ酸配列が相同である領域。保存アミ ノ酸は太字で記載しその配列の下に星印をっけて示し、同類置換部はその配列の 下にドツト印をつけて示す。

表３Ｂ　ａＥｌｏ、９の３１４〜４６９の推定アミノ酸配列と他の植物のグリコ ジルトランスフェラーゼ類との比較。エイチ・プルガーレ（ＧＴ−オオムギ）由 来の３ＧＴおよびゼット・メイズ（Ｂｚｌ−トウモロコシ）由来の３ＧＴに対し てａＥ！１０．９の推定アミノ酸配列が相同性である領域。

保存アミノ酸は太字で記載しその配列の下に星印をつけて示し、同類置換部はそ の配列の下にドツト印をつけて示す。

表４　表３に記載の植物のグルコシルトランスフェラーゼ類、ウィルスのエフジ ステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ−ＥＣＤ）およびヒトのグルク ロノジルトランスフェラーゼ（ＧＴ−ヒト）を含む各種のグリコジルトランスフ ェラーゼと比較して類似性を示すａＥｌｏ、　９のアミノ酸配列の領域。

実施例８−ＲＦＬＰ分析 ゲノムＤＮＡの単離 ＤＮＡを、特にＤｅｌ　１ａｐｏｒｔａら１９８３年に記載されているのと同様 にして葉の組織から単離した。そのＤＮＡの標品を、ＣｓＣ１浮遊密度遠心分離 法（Ｓａ＋ｎｂｒｏｏｋら１９８９年）によってさらに精製した。

サザーンプロット ゲノムＤＮＡ（１０膜ｇ　＞を６０単位のＥｃｏＲＩで１６時間消化し、ＴＡＢ （４０ｍＭトリス−アセテート、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ）のランニング緩衝液中０ ．７％（Ｗ／ｖ）アガロースゲルによって電気泳動させた。そのＤＮＡを変性溶 液（１，５Ｍ　ＮａＣ１１０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）中で１−１．５時間変性させ、 ０．５Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）／１．５　Ｍ　ＮａＣｌ中で２〜３時 間中和し、次いでＨｙｂｏｎｄ　Ｎ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）フィルター（２０ ＸＳＳＣ）に移した。

ＤＦＲ−Ｃプローブの単離 鋳型としてＶ２３ゲノムＤＮＡを用い、かつ公表されたｄｆｒ−Ｃ配列（Ｇｅｒ ａｔｅｓら１９９０年）から得た二つのオリゴヌクレオチドブライマー：Ｒ４（ ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　４）およびＲ５Ｃ３ＥＱ　１０　ＮＯ：　５）を用いる ＰＣＨによってｄｆｒ−Ｃ遺伝子のフラグメントを増幅した。得られた１７０　 ｂｐのＰＣＲ生成物をゲルで精製し次いでＮＡ−４５膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１社）上に単離した。ＰＣＲ生成物を溶出した後、その生 成物を、Ｈｏ１ｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ　１９９１年の文献に記載されている ｄｄＴのテイルをつけたｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐＬ　Ｍ１３−ベクター（ストラタ ジエン社）に連結し配列を決定して、クローン化されたフラグメントが公表され た配列に一致することを確認した。

ＲＦＬＰ分析 ａＥｌｏ、　９でプローブしたＶ２３とＲ５１のゲノムＤＮＡのサザーンプロッ トに、高ストリンジエンシイ条件下、両者の系に一つのハイブリッド形成バンド が出現した。ＲＦＬＰ分析法を用いて、ａＥｌＯ，９ｃＤＮＡに相当する遺伝子 の公知の遺伝子座に対する連鎖について試験した。

Ｖ２３ＸＲ５１Ｆ２集団から単離されたＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡを分析した ところ、ｄｆｒ−Ｃ連結されたａＥｌｏ、９プローブに対するＲＦＬＰが見出さ れた。

ｄｆｒ−Ｃは染色体Ｖｌの分子マーカーでありＲｔに連鎖している（Ｂｅｌｄら １９８９年）　、　３４ｆ７）Ｖ２３ＸＲ５１Ｆ２植物のうちノ２６ニツイテａ Ｅ１０．９とｄｆｒ−ＣのＲＦＬＰの共分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ） があった。これは８．１％の組換え頻度を表し、この頻度は、Ｒｔとｄｆｒ−Ｃ の間の報告されている組換え頻度１３％（Ｃｏｒｎｕら１９９０年）に近い。

実施例９−ノーザン分析 液体窒素中に凍結しておいた組織から全ＲＮＡを単離し、乳鉢と乳棒を用いてす りつぶして微粉末にした。４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、５０ｍＭ　 トリス−ＨＣｌ　（ｐ）１８．０）、　２０＋ｎＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％（Ｖ ／　ｖ　）　５ａｒｋｏｓｙｌからなる抽出緩衝液を上記組織に添加し、その混 合物を、ポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を最高速度で用いて１分間ホモジナイ ズした。得られた懸濁液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）が 濾過し、次いでＪＡ２０ロータを用い１０．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に 付した。上澄み液を集め、０．２　ｇ　／ｍＬ　ＣＣ５Ｃ１（／　ｖ　）にした 。次いで、３８ｍＬＱｕｉｃｋ−ｓｅａｌ遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ社）中に 入れた５、７　Ｍ　ＣｓＣｌ、　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）のクッシ ョン１０ｍＬの上に試料を重層し次にＴｉ−７０ロータを用い、４２．　ＯＯＯ ｒｐｍで２３℃にて１２〜１６時間遠心分離を行った。

得られたペレットをＴＥ／ＳＯ５（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、 　Ｉ　ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ。

０．１％（ｗ／　ｖ　）　ＳＤＳ　）中に再懸濁し、次いで１０ｍＭ　ＥＤＴＡ 　（ｐＨ７，５）中に飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ ール（２５：２４：１）で抽出した。エタノールで沈澱させた後、ＲＮＡのベレ ットをＴＥ／ＳＤＳ中に再懸濁させた。

４０＋ｎＭモルホリノプロパンスルホン酸（ｐ）１７．０）、５　ｍＭ酢酸ナト リウム、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）を含有する泳動緩衝液を用い 、２．２Ｍホルムアルデヒド／１．２％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルによって、Ｒ ＮＡの試料の電気泳動を行った。そのＲＮＡをメーカーが説明しているのと同様 にしてＨｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移し、次いで■ｐ で標識を付けたｃＤＮＡフラグメント（１０”　ｃｐｍ／μｇ、２　ＸＩＯ＠ｃ ｐｓ／＋Ｌ）でプローブした。プレハイブリダイゼーション（４２℃で１時間） およびハイブリッド形成（４２℃で１６時間）を、５０％（Ｖ　／　Ｖ　）ホル ムアミド、ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，１％（ｗ／ｖ）　ＳＯ３，１０％（ｗ／ｖ）デキ ストラン硫酸中で行った。分解サケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）を、１２ｐ 標識化プローブとともに添加してハイブリッド形成ステップを行った。

フィルターを、２ＸＳＳＣ，１％（Ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で６５℃にて１〜２時間洗 浄し、次に０．２ＸＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で６５℃にて０．５〜１時 間洗浄した。フィルターを、増感スクリーン付きのＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルム に一７０℃で１６時間暴露させた。

突然変異体内での発現 ａＥｌｏ、　９プローブとハイブリッドを形成するｍＲＮＡの蓄積に対する三つ の遺伝子座（Ｒｔ、　ＡｎｌおよびＡｎ２）の影響を試験した（図５Ａ）。さき に述べたように、Ｒ【はアントシアニジン−３−グルコシドのラムノシル化反応 を制御するが、ＡｎｔとＡｎ２は、アンドシアニンの生合成に関与するいくつも の構造遺伝子の活性を制御する調節遺伝子である（Ｇｅｒａｔｓら１９８４年） 　、　ＲＬ／Ｒｔ、　Ａｎｔ／Ａｎｔ、　Ａｎ２／Ａｎ２の系の花弁組織（Ｄａ 、　Ｓｄ５．５ｋｒ４．　ＲｌＢおよびＲ５１）中に、約２．４Ｋｂおよび１． ５Ｋｂの二つの＋ｏＲＮＡがａＥｌｏ、　９プローブによって検出されたが、こ れに対して、ＯＧＢおよび他のＲｔ／Ｒｔ、　Ａｎｌ／Ａｎｔ、　Ａｎ２／Ａｎ ２　（Ｔｂ　ｌ〜３およびｖ２３）系では約１．７ＫｂのｍＲＮＡが一つだけ検 出された。またＲ５１．　Ｖ２３およびＯＧＢの系も短いａＥｌｏ、　９ｃＤＮ Ａ同胞クローン（ｓｉｂｌｉｎｇ　ｃｌｏｎｅ）でプローブした（データは示し ていない）　、　ａＥｌｏ、９配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２）のヌクレオチ ド７３６で始まるｐｃＧＰ７１２の０．５ＫｂのｃＤＮＡ挿入断片が、Ｒ５１系 内の２．４にｂの転写物だけを検出した。ａＥｌｏ、　９配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ ０：２）のヌクレオチド１２１７で始まるｐｃＧＰ７１１の０．９ＫｂのｃＤＮ Ａ挿入断片がＲ５１系内の２．４Ｋｂの１．５Ｋｂの転写物の両方を検出した。

０．５Ｋｂと０．９ＫｂのｃＤＮＡクローンの両者がＶ２３とＯＧＢ系中に野生 型転写物を検出した。Ａｎｌ／ＡｎｌまたはＡｎ２／＾ｎ２の系（Ｂａ２０．　 Ｄｌａ５１．　Ｐｌａ３およびＴｌｈｌ）中には、ａＥｌｏ、　９プローブとハ イブリッドを形成するｍＲＮＡの発現は全く検出できなかった。

ペチュニア系Ｔ「３８のＲｔ遺伝子座はトランスポゾンの存在によって不安定に なる（Ｃｏｒｎｕ　１９７７年）。トランスポゾンが花の発育の早い段階におい て切り出されると復帰突然変異体の深紅色花弁が生成する。Ｔｒ３８のピンク色 花弁から単離した全ＲＮＡ（ｒｔ”　’）およびＴ「３８の復帰突然変異体の深 紅色花弁から単離した全ＲＮＡ（Ｒｔ）を、ａｌ！１０．９プローブとハイブリ ッドを形成するｍＲＮＡの発現について試験したく図５Ｂ）。

ａ［！１０．９プローブによって、ｒｔ’花弁組織中に２．ＯＫｂのＲＮＡ種を 、および復帰突然変異体の組織中に１．７Ｋｂの転写物が検出された。

実施例１〇−構築物の製造 ｐＣＧＰ２９３の構築 発現バイナリ−ベクターｐＣＧＰ２９３をＴｉバイナリ−ベクターｐｃＧＮ１５ ５９（Ｍｅ　Ｂｒ１ｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ　１９９０年）から誘導し た。プラスミドｐＣＧＮ１５５９をＫｐｎ　Ｔで消化し、次いで突出している３ ′末端を、標準のプロトコールにしたがって７４ＤＮＡポリメラーゼで除去した （Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年）。このベクターをさらにＸｂａ　Ｉで消化し 、次いで生成した５′突出部を、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメント を用いて修復した。次にこのベクターを再結合してｐＣＧＰ６７を得た。Ｍａｃ プロモーター、ｍａｓターミネータ−および各種のクローニング部位を含有する １、　９７ＫｂのＰｓｔＩフラグメント（Ｃｏｍａｉ　ら１９９０年）をｐｃＧ Ｐ４０から単離し、ｐＣＧＰ６７のＰｓｔ１部位中に挿入してｐＣＧＰ２９３を 得た。

ｐＣＧＮ７３３４か呟ＢａｍＨＩ　−Ｓａｃ　Ｉフラグメントと１てＧＵＳ遺伝 子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら１９８７年）を除去し、そのフラグメントの代わりに 、マルチクローニング部位を含有している、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ１３− 由来のＢａｍＨＩ　−５ａｃＩフラグメントを挿入した。Ｃａｌｇｅｎｅ　Ｉｎ ｃ、　（米国、カリフォルニア州）から入手したプラスミドｐＣＧＮ７３３４は 、Ｍａｃ−ＧＵＳ−ｍａｓ遺伝子融合体を含有するフラグメントをｐＣＧＮ７３ ２９のＸｈｏ　１部位に挿入することによって構築されたものである（　Ｃｏｍ ａ　ｒ　ら１９９０年）。

ｐｃＧＰ８１０の構築 ｐｃＧＰ８０６由来のｃＤＮＡ挿入断片を、ｐＣＧＰ２９３のＭａｃプロモータ ー（Ｃｏｍａ　ｉ　ら１９９０年）の後にセンス配向でクローン化することによ って、プラスミドｐｃＧＰ８１０を構築した。プラスミドｐｃＧＰ８０ＢをＢａ ｍＨＩとＫｐｎ　Ｉで制限酵素消化してｃＤＮＡ挿入断片を分離した。そのｃＤ ＮＡフラグメントを低融点アガロースゲル上に単離し、次いでｐＣＧＰ２９３バ イナリ−ベクターのＢａｍＨＩ　／　Ｋｐｎ　ｒ末端に連結した。この連結は、 Ａｍｅｒｓｈａｍ社１社の連結用キットを利用し、ｐＣＧＰ２９３バイナリ−ベ クター４００　ｎｇおよび１．７ＫｂのａＥＩｏ、　９ｃＤＮＡフラグメント８ ５ｎｇを用いて実施した。ｐｃｃｐａｌＯ内に挿入断片が正しく挿入されたこと は、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したＤＮＡを、ＰｓｔＩによる制限 で分析することによって確認した。

ｐｃＧＰ８１１の構築 ｐｃＧＰ８０６由来のｃＤＮＡ挿入断片を、ｐＣＧＰ２９３のＭａｃプロモータ ー（Ｃｏｉｌａｉ　ら１９９０年）の後にアンチセンス配向でクローン化するこ とによって、ブ与スミドｐｃＧＰ８１１（図７）を構築した。プラスミドｐＣＧ Ｐ８０６をまずＡｐａ　Ｉで制限した。突出している３′末端を、Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ（フレノウフラグメント）で削り取った。次にそのプラスミドをＸｂａ　Ｉ で制限してｃＤＮＡ挿入断片を含有するフラグメントを単離した。

ＸｂａＩ５’突出末端を、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラグメント）を用い て修復した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年）。そのｃＤＮＡフラグメントを低 融点のアガロースゲル上に単離し次いでｐＣＧＰ２９３バイナリ−ベクターの平 滑にしたＸｂａＩ／　Ｂａ＋ｎＩ［［末端に連結した。この連結はＡｍｅｒｓｈ ａｍ社の連結用キットを利用し、ｐＣＧＰ２９３バイナリ−ベクター４００　ｎ ｇおよび１．７ＫｂのａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡフラグメント８５ｎｇを用いて実 施した。挿入断片がｐｃＧＰ８１１中に正しく挿入されたことは、ゲンタマイシ ン耐性形質転換体から単離したＤＮＡのＰｓｔＩによる制限分析で確認した。

実施例１１−エイ・ツメファシェンスの形質転換プラスミドｐｃＧＰ８１０と１ ）ＣＧＰ８１１（図６と７）を次のようにしてアグロバクテリウム・ツメファシ ェンス菌株ＡＧＬＯ中に導入した。すなわち５０ｍＬのＭＧ／　Ｌ　（Ｇａｒｆ 　１ｎｋｅｌおよびＮｅ５ｔｅｒ　１９８０年）培地に接種し振盪しながら２８ ℃で１６時間増殖させることによって調製したコンピテントへ〇ＬＯ細胞１００ μｌに上記の各プラスミドＤＮＡ　５μｇを添加して導入した。その細胞をペレ ット化し、８５％（ｖ／　ｖ）　１００　ｍＭＣａＣｌｇ／１５％　ｖ／ｖグリ セリン（０，５ｍ、Ｌ）中に再懸濁させた。得、られたＤＮＡ−アグロバクテリ ウム混合物を液体窒素中で２分間インキュベートして凍結し次いで３７℃で５分 間インキュベートして融解させた。そしてＤＮＡ／細菌の混合物を氷上にさらに １０分分間−た。その細胞をＭＧ／Ｌ培地１＋ｎＬと混合し、振盪しながら２８ ℃で１６時間インキュベートした。ｐｃＧＰ８１１またはｐｃＧＰ８１０を保有 するエイ・ツメファシェンスの細胞を、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含 有するＭＧ／　Ｌ寒天プレート上で選択した。ｐｃＧＰ８１１またはｐｃＧＰ８ １０が存在することは、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離されたＤＮＡの サザーン分析を行うことによって確認した。

実施例１２−ペチュニアの形質転換 植物の材料 ピー・ハイブリダｃｖ　ＶＲの成熟植物由来の葉の組織を１．２５％（Ｗ／ｖ） 次亜塩素酸ナトリウム中で２分間滅菌し次いで滅菌水中で３回すすいだ。その葉 の組織を２５＋ｎがの四角形に切断し、０．０５ｏｇ／　Ｌのカイネチンおよび １．０　ｍｇ／　Ｌの２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を補充し たＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ　１９６２年）上で２４時間 前培養を行った。

アグロバクテリウムとペチュニアの組織との共存培養バイナリ−ベクターのｐｃ ＧＰ８１１またはｐｃＧＰ８１０（図６および１０）を含有するエイ・ツメファ シェンスの菌株ＡＧＬＯ（Ｌａｚｏら１９９１年）を、１００　Ｈ／　Ｌのゲン タマイシンを含有するＩＪＧ／Ｌ　（ＧａｒｆｉｎｋｅｌおよびＮｅ５ｔｅｒ　 １９８０年）寒天プレート上に４℃で保持した。１％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ−ペ プトン、０．５％（ｗ／　ｖ　）　Ｂａｃｔｏ−酵母エキスおよび１％（ｗ／　 ｖ　）　ＮａＣ１を含有する液体培地中で単コロニーを一夜増殖させた。翌日、 Ｂ、ビタミン類（ＧａｌｌＩｂｏｒｇら１９６８年）および３％（ｗ／Ｖ）スク ロースを含有する液体ＭＳ培地（ＢＰＭ）で希釈することによって、最終濃度５ Ｘ１０”細胞／＋＋＋Ｌにした。上記のＡＧＬＯ／ｐＣＧＰ８１１またはＡＧＬ Ｏ／１）ＣＧＰ８１０を含有するＢＰＭに葉のディスクを２分間浸漬した。

その葉のディスクをプロットして乾燥し、次に４日間共生培養培地上に置いた。

その共生培養培地は、０．０５ｍ１／　Ｌカイネチンおよび１．０ｍｇ／Ｌ　２ ．　４−Ｄを補充したＳｌｌ培地（５ｃｈｅｎｋおよび旧１ｄｅｂｒａｎｄｔ。

１９７２年）で構成され、その培地の上にはタバコの細胞の懸濁液のフィーダ一 層がひろげられ、そしてその懸濁液の上にフィルター紙を置いた。

形質転換ペチュニア植物の回収 共生培養を行った後、葉のディスクを、３％（ｗ／ｖ）スクロース、α−ベンジ ルアミノプリン（ＢＡＰ）　（ＶＲの葉のディスクには１ｍｇ／ＬまたはＳＤの 葉のディスクには４．０　ｌｌ１ｇ／　Ｌ）　、０．１　ｍｇ／　Ｌ　α−ナフ タレン酢酸（ＮＡＡ）、カナマイシン（ＶＲの葉のディスクには３００ｍｇ／Ｌ またはＳＤの葉のディスクには１００　ｍｇ／　Ｌ）　、３５０　ｍｇ／　Ｌセ ホタキシムおよび０．３％（ｗ／　ｖ　）　Ｇｅ１ｒｉｔｅ　Ｇｅ１ｔａｎ　Ｇ ｕｍ　（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌ１社）を補充したＭＳ培地（選択培地）に移 した。新生中の外植片を、４週間後に新しい選択培地に移した。カナマイシンに よる選択に対して生残った不定茎を単離し、根を誘発させるため、１００　ｍｇ ／　Ｌカナマイシンおよびｚｏｏｍｇ／Ｌセホタキシムを含有するＢＰＭに移し た。

全培養物を２３±２℃にて１６時間の日長条件下に維持した（６０μｍｏｌ。

ｍ−２，ｓ−１クールホワイト蛍光灯）。根の長さが２〜３ｃｍになったとき、 そのペチュニアの形質転換小植物を、オートクレーブ処理を行ったＤｅｂｃｏ　 ５１４１０１２鉢植え混合物（ｐｏｔｔｉｎｇ　ｍ１ｘ）を入れた８ｃｍのチュ ーブに移した。４週間後、植物を、同じ鉢植え混合物を用いて１５ｃｍポットに 改植し、２３℃にて１４時間日長の条件下に維持した（３００　μｍｏ１．ｍ　 −２，ｓ　−１ハロゲン化水銀灯）。

実施例１３−形質転換植物表現型の分析ＳＤ中のｐｃＧＰ８１０ ｐｃｃｐａｔｏプラスミドによって形質転換したＳＤ植物で得た各種の花弁と花 粉の色の表現型を表５に示す。形質転換植物の＃　２１２９と＃２１２８の両者 は、対照のＳＤに類似しているが花弁と花粉の色が変化した花を産生じた。プラ スミドｐｃＧＰ８１０をＳＤペチュニア植物中に導入したときに花粉の色の変化 が観察されたことは予想外の結果であった。

そのコードをｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　５ｏｃｉｅｔ ｙ’ｓ　Ｃｏ１ｏｕｒ　Ｃｈａｒｔからとった。そのコードは、観察された色の 表現型を示す別の手段を与える。しかし与えられた数字は、感知された色に対す る一つの指標にすぎないと考えるべきであり、そして得ることができる可會託な 色を限定するとみなすべきではない。

表５ ＲＨ３ＣＣ＝Ｒｏｙａｌ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｃｏ １ｏｕｒ　ＣｈａｒｔＶＲ中ｔｖ　ｐＣＧＰ８１１ 下記の表６は、ｐｃＧＰ８１１プラスミドで形質転換したＶＲ植物で得た各種の 色の表現型を示す。そのコードはやはり、ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ）１ｏｒｔｉｃｕ ｌｔｕｒａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ’ｓ　Ｃｏ１ｏｕｒ　Ｃｈａｒｔからとったが、 上記のように、そのコードは感知された色の一つの指標に過ぎないと考えるべき でありそして得ることができる可能な色を限定するとみなすべきではない。

表６ ＲＨ３ＣＣ＝Ｒｏｙａｌ　Ｉ（ｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｃ ｏ１ｏｕｒ　Ｃｈａｒｔ実施例１４−色素の抽出 アントシアニジン類 ＋（ＰＬＣまたはＴＬＣによる分析を行う前に、花弁抽出液中に存在するアンド シアニジンの分子を酸で加水分解してそのアンドシアニジンのコアからグリコジ ル部分を除去した。アントシアニジンの色素類のＢリングに対するヒドロキシル 化のパターンを、アンドシアニジンのコア分子をＨＰＬＣまたはＴＬＣで分析す ることによって決定した。

花弁のへりを２Ｍ塩酸１ｍＬとともに１００℃にて３０分間インキュベートする ことによって、花の色素を抽出し加水分解した。その加水分解されたアントシア ニン類を２００μＬのイソアミルアルコールで抽出した。この混合物を減圧乾燥 し、少容積２０μＬのイソアミルアルコール中に再懸濁させた。ＳＤの花弁、や （および花柱のｐｃＧＰ８１０の抽出液の一部の５μＬをＴＬＣプレート上にス ポットした。ＶＲの花弁のｐｃＧＰ８１１の抽出液の一部の５μＬを取り出し減 圧乾燥し、２００μＬの５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．５％（ｖ／ ｖ）ＴＦＡ中に再懸濁させた。

アントシアニン類 花弁のへり、花柱またはや（にｌ＋ｎＬのメタノール／１％（Ｖ　／　Ｖ　）Ｈ ＣＩを加え、暗所にて４℃で１６時間インキュベートすることによって、形質転 換ペチュニアの花の加水分解されていなしＸ色素抽出液を調製した。抽出液を取 り出し減圧乾燥した。得られた色素を１００μＬのメタノール／１％（ｖ／ｖ） ＨＣＩ中に再懸濁させた。ＶＲの花弁中のｐｃｃｐｓｔｉの抽出液およびＳＤの 花弁中のｐｃｃｐｓｔｏの抽出液の一部分をＴＬＣプレート上にスポットした。

アンドシアニジン類のＨＰＬＣによる分析２００μＬの５０％（ｖ　／　ｖ　） アセトニトリルおよび０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中のＶＲ花弁のｐｃＧＰ８１１ 由来のアントシアニジンの一部分５μＬを、次のような勾配条件を用いる勾配溶 離による、ＨＰＬＣで分析した。

すなわちＴＦＡ　：　Ｈｇ０（５：　９９５）からなる溶媒Ａおよびアセトニト リル：ＴＦＡ　：　Ｈ，０（５００：　５　：　４９５）からなる溶媒Ｂを用い 、５０％Ｂから６０％Ｂまで１０分間、次いで６０％Ｂで１０分間、最後に６０ ％Ｂから１００％Ｂまで５分間の勾配で分析した。Ａｓａｈｌ　Ｐａｃ　０ＤＰ −５０カートｌルソジカラム（２５０＋ｎａ＋Ｘ４．６　ｍｍ　ＩＤ）を用いて 、逆層クロマトグラフィーによる分離を行った。流量は１ｍＬ／ｗｉｎで温度は ４０℃であった。アントシアニジン化合物類の検出は、Ｓｈｉｍａｚｕ　ＳＰＤ −Ｍ６Ａ三次元検出器を用いて４００〜６５０　ｎｍで行った。

アンドシアニジンのピークは、公知の標準を参照して、デルフイニジン、シアニ ジンおよびマルビジンについて同定された。

アントシアニジン類のＴＬＣによる分析酸で加水分解した色素の抽出液を、Ｆｏ ｒｅｓｔａｌ溶媒系（ｌ（ＯＡＣ：水：）ＨＣＩ　＝３０　：　１０　：　３　 ）　（Ｍａｒｋｈａｍ　１９８２年）中で試験した。

アントシアニン類のｌ＋ＰＬｃによる分析ＳＤペチュニア、およびＶＲのアンチ センスａＥ１０．９形質転換体の加水分解されていない花弁の抽出液のデルフィ ニジンー３−グルコシドのピークは、デルフィニジンー３−グルコシドの標品を 参照してＨＰＬＣで同定した。次にデルフィニジンー３−グルコシド画分を、最 初にｌＯ％Ｄから６０％Ｄまで４０分分間−て６０％Ｄで４０分間の勾配溶離条 件を用いてＨＰＬＣによって２回精製した。画分を３９〜４６分の時点で収集し た。再精製条件は２０％Ｄから４０％Ｄまでも４０分分間−て４０％Ｄで３０分 間であった。画分の収集は３８〜４５分の時点で行った（溶媒Ｃは水であり、溶 媒りは５０％（Ｖ　／　Ｖ　）アセトニトリル、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡであ った）。精製した両分を質量分析に付して化合物がデルフィニジンー３−グルコ シドとして同定されたことを確認した。

アントシアニン類のＴＬＣによる分析 加水分解していない色素抽出液の一部を、ＴＬＣ用のプラスチックでコートした セルロースプレート（ＭＥＲＣＫ社）上にスポットし、２種の別個の溶媒系すな わち１５％ＨＯＡｃおよびＲＡＷ（ブタン−１−オール：　ＨＯＡｃ　：水＝４ 　：　２　：　５）中で試験した。

実施例１５−ｒｔ変異体（ＳＤ中ｐｃＧＰ８１０）の補足性ハイブリッドペチュ ニア系ＳＤはＲ【遺伝子に対してホモ接合劣性である。このハイブリッドペチュ ニア系ＳＤはデルフィニジンー３−グルコシド色素を蓄積するピンク色の花を産 生する。ａＥｌｏ、９ｃＤＮＡのセンスバージョンを構成Ｍａｃプロモーターの 後にクローン化してＳＤ中に導入した。四つの個々の形質転換体のうちの二つが 濃色に着色した花を産生じた。これらの花の酸が加水分解した抽出物を薄層クロ マトグラフィー（ＴＬＣ）で分析した結果、マルビジンが花弁中に産生される主 な色素であることが明らかになった。ＳＤはＧｆ、　ＭｔおよびＭｆに対して優 性であるから、Ｒｔの突然変異はこの系がマルビジンを産生ずるのを防止する唯 一の障害である（図ＩＢ参照）。したがってこの色素が形質転換された花の中に 産生じたことは、ａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡがＲ１の突然変異を補足し３ＲＴをコ ードできるということを示す強力な証拠を提供した。

実施例１６−３ＲＴの活性のアンチセンス抑圧（ＶＲ中（７）ｐｃＧＰ８１１） ａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡを構成Ｍａｃプロモーターの後にアンチセンス配向でク ローン化し次いでパープル色の花が咲（ＶＲペチュニアノ１イブ１ルソド系内に 導入した。１２個の個々の形質転換体のうちの７個が変化した花色を示した。こ れらの花は、はとんどの場合、均一な色相のピンクであったが、２個は花が斑入 りパープルとレッドのセクターが含まれていた。加水分解しなかった花弁の抽出 物をＨＰＬＣとＴＬＣで分析したところ、デルフィシジン−３−グルコシドが、 一層うずく着色した形質転換化の主な色素であることが分かった。マルビジンの 産生はかなり減少したが、試験されたすべての形質転換植物中で抑制されたわけ ではなく、ヘチュニジンの産生は増加した（表７）。以下の表７は、ＨＰＬＣで 分析したところ、ｐｃＧＰ８１１で形質転換された形質転換ＶＲペチュニア植物 の花のいくつかの中にアンドシアニジン類が存在していることを示している。

表７ Ａ／Ｓ　＝アンチセンス ＲＴ　＝保持時間 ％比率＝検出されたアントシアニン類の％ＶＲ植物中でのａＥｌＯ，９ｃＤＮＡ のアンチセンス発現によってマルビジンの産生が妨害され、デルフィニジンー３ −グルコシド類が蓄積した。

この結果は、アンドシアニジン−３−グルコシド類のラムノシル化が５−〇−グ ルコシル化、アシル化およびメチル化より早（おこるのでＲｔ遺伝子座が３ＲＴ をコードしているという論点を裏付けている（図１）。興味深いことに、すべて の場合にベチュニジンとマルビジンの色素がいくらか産生されたので、これら形 質転換植物はどれも、すでに特性が決定されているＲ１変異体に正確に匹敵する 色素プロフィルをもっていなかった。Ｒ【遺伝子の活性の阻害が不完全であった と推定される。しかし花色と、花弁抽出物中に存在するマルビジン色素の百分率 との間には相関関係があった。うすい色に着色した花は、マルビジンの含有量が 濃色に着色した花より低かった。また形質転換された花はＶＲの対照と比べて高 レベルのペチュニジン色素を含有していた。従来の突然変異の研究では、形成さ れるいずれのベチュニジン色素も、Ｍｆｌ、　Ｍｆ２の遺伝子で制御されるメチ ルトラレスフェラーゼ類によってマルビジン色素に変換されたのであろうと予想 されていた（Ｗｉｅｒｉｎｇおよびｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ　１９８４年）。しか しＪｏｎｓｓｏｎらの１９８４年のおよびｂの文献には、ペチュニジンに対して 、形成されるマルビジンの量は、基質〔デルフィニジン（３−ｐ−フマロイル） ルチノシドー５−クルコシド〕の濃度によって変化し、かつ基質の濃度が高いと マルビジンの生成が阻害されると報告されている。これらの結果についての可能 な説明の一つは、高レベルのデルフィニジンー３−グルコシド類はＭｆｌとＭｌ ２の遺伝子座によって制御されるメチル化反応に何らかの作用をするということ である。あるいは、効率的な５′メチル化反応を行うには、ペチュニジン基質の 濃度が最小であることが必要であるのもしれない。

実施例１７−Ｒ１の時間的および空間的発現Ｒ【遺伝子の発現プロフィルをＲＮ Ａプロット法とｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法によって試験した。すでに特 性が決定されたフラボノイド生合成遺伝子の単離 （ａ）　ＣＨＩ　ｃＤＮＡライブラリー＃ｌおよび２種のオリゴヌクレオチドす なわちヌクレオチド６〜２０を変換した＃　２　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　：　６ ）および公表されているｃｈｉ−Ａ　ｃＤＮＡ配列（ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎら１９ ８８年）のヌクレオチド７１１〜７２５１．：相補的な＃　３　（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：　７）から、１゜ｎｇを用いＰＣＲによってｃｈｉ−Ａ（ｖａｎ　Ｔｕ ｎｅｎら１９８８年）のｃＤＮＡクローンを合成した。得られたＰＣＲ産物をキ ナーゼで処理し、次いでｐＢＩｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍｌ：Ｔ　（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ社）のＳｍａ　ｒ部位に連結し配列を決定して、クローン化されたフラグ メントが公表された配列に一致していることを確認した。

（ｂ　）　ＤＦＲ−Ａ　ｄｒｒ−Ａに対応するｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡライ ブラリー＃ｌのディフェレンシャルスクリーン（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　５ ｃｒｅｅｎ）から単離し、次いで配列分析を行い公表されている配列と比較する ことによって同定した（Ｂｅｌｄら、１９８９年）。

（ｃ）ＰＡＬ （ｉ）ｃＤＮＡライブラリー＃３の構築全ＲＮＡを段階１〜３のビー・ハイブリ ダｃｙ　ＯＧＢから単離した。ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロー スクロマトグラフィーによって精製した。Ｌａ１）ｅＹｒｅおよびＡｍａｌｒｉ ｅ（１９８５年）の方法の改変法を用い、２．５μｇのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡ から二本鎖ｃＤＮＡを合成した。リンカ−による連結を行う前に二本鎖ｃＤＮＡ のＳｌヌクレアーゼ処理は行わなかった。ＥｃｏＲＩ−アダプター（Ｐｒｏｍｅ ｇａ社）を上記二本鎖ｃＤＮＡに連結し、リガーゼを熱で失活させ（７０℃で２ ０分間）、次にそのアダプターをキナーゼで処理して脱リン酸化されたベクター ＤＮＡに連結した。連結されていないアダプターと小さなｃＤＮＡ分子をセファ デックス５２００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）スパンカラムクロマトグラフィー によって除去した。ｃＤＮＡの１／４を、ＥｃｏＲＩで切断した脱リン酸化Ｉ　 ＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ｌμｇと連結した。パッケージングを行った 後、そのライブラリーは、イー・コリＢＢ４をトランスフェクトし次にＸ−ｇａ ｌを含有するＮＺＹ培地上にプレートすることによって滴定した。

そのライブラリーは２３．０００個の組換え体を含有していた。

（ｉｉ）ｃＤＮＡライブラリー＃３のスクリーニングｃＤＮＡライブラリー＃３ をジャガイモ由来のＰＡＬ　ｃＤＮＡフラグメント（ドイツ、ケルン所在のＭａ ｘ　Ｐｌａｎｃｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのＩｍｒｅ　Ｒ，Ｓｏｍｓｓｉｃｈ博士 からの寄贈品）で選別した。プレハイブリダイゼーション（４２℃、１時間）お よびハイブリッド形成（４２℃、　１６時間）を２０％（Ｖ／　ｖ　）ホルムア ミド、６ＸＳＳＣおよび１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で行った。

低ストリンジエンシイ−洗浄条件は、２ＸＳＳＣ１０，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中 、ＩＬｍテ２　ｘ　５　分子ｔＪ洗浄し次イテ２Ｘｓｓｃ１０．Ｉ　Ｎ　（ｗ／ 　ｖ）　ＳＤＳ中４２℃で２×３０分間洗浄する条件であった。ペチュニアＰＡ Ｌ　ｃＤＮＡクローンの同定は、配列解析およびファセオリス・ブルガリス（Ｐ ｈａｓｅｏｌｉｓｖｕｌｇａｒｉｓ）由来の公表された配列（Ｂｄｗａｒｄｓら １９８５年）との比較によって確認した。

（ｄ　）　ＣＨＳ　ｃＤＮＡのクローンｐｇＰ３２　（Ｒｅｌｆら１９８５年） 由来の８Ｋｂのペチュニアｃｈｓ−Ａゲノムフラグメントを用いてｃＤＮＡライ ブラリー＃ｌを選別した。先に述べた標準のハイブリッド形成条件を用いて、全 長のペチュニアｃｈｓ−Ａ　ｃＤＮＡクローンを単離した。その同定は、配列分 析と公表された配列（Ｋｏｅｓら１９８６年）との比較によって確認された。

葉の中でのデルフイニジン合成のグルコース／ノ＼イライトによる誘発 葉をピー・ハイブリダｃｖ　ＯＧＢから収穫し、滅菌水中で切断して１Ｃ１ｌ１ ２の断片にした。これらの葉の断片を２％（Ｗ／Ｖ）グルコース溶液上に浮かし 、２４．０００ルツクスの光の強さの光に９６時間暴露した。

時間的発現 （ａ）発育中の調節 上記実施例１で定義された発育の段階の異なる段階にある花から収穫したピー・ ハイブリダｃｖ　ＯＧＢの花弁由来の全ＲＮＡを、フラボノイドの生合成経路に 関与している各種の遺伝子の発現について試験した。

ａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡクローンに対応する遺伝子は、花冠の成熟中の発育中に 調節され一般に花の発育の段階１〜２のあたりでピークになることが見出された （図８）。この発育のプロフィルはフラボノイドの生合成に関する他の遺伝子の 発現に類似していたが、ＣＨＳ、　ＣＨＩ。

ＤＦＲおよびＰＡＬの発現は一般に花の発育の段階２〜３のあたりでピークにな った（図８）。

（ｂ）葉の組織内のアントシアニン経路の誘発フラボノイド色素の生合成経路の 遺伝子類は、通常、葉の組織では発現されない。しかしデルフィニジン色素の合 成は、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース溶液中、ハイライト内でインキュベートするこ とによってＯＧＢの葉の中に誘発された。これらの条件下で、ａＥｌＯ０９ｃＤ ＮＡクローンに対応する遺伝子がＯＧＢの葉の組織の中に検出された。伝令ＲＮ Ａの最大の誘発は９６時間後に起こることが分かった。いくつかの他の色素の生 合成遺伝子の発現も誘発された（図９）。

（Ｃ）異なる器官における発現 ビー・ハイブリダＣｙ　ＯＧＢの各種器官由来の全ＲＮＡを、ａＥｌｏ、　９ク ローンに対応する遺伝子の発現について試験した。メツセージが花弁と柱頭に検 出されたが、柱頭ではそのレベルは非常に低かった。それ故３ＲＴ　ｍＲＮＡの 発現は、花弁と花の特定部分の両者において発育中に調節されているようである 。

空間的発現−ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成（ａ）植物組織の調製 花弁を２〜３＋ｎｍの断片に切断し、やくと柱頭の全体とともに、４％（ｖ　／ 　ｖ　）パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と５　Ｉ ｒ１Ｍ　ＭｇＣ１ｔ　ｐＨ７，４中で約１６〜２４時間固定した（Ｌａｗｒｅｎ ｃｅおよびＳｉｎｇｅｒ　１９８５年；　Ｓｉｎｇｅｒら１９８６年）。次に組 織を段階的なエタノールのシリーズによって脱水し次いでパラブラスト（ｐａｒ ａｐｌａｓｔ）中に包埋した（ＢｅｒｌｙｎおよびＭｉｋｓｃｈｅ　１９７６年 ）。厚みが１０μｍの横断面片を切り取りサブベッドスライド上に載置した（ス ライドは予め２％　３−アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液で５ 分間処理し、蒸留水中で洗浄し、次いで風乾したものを用いた）。

（ｂ）ＲＮＡプローブの調製 ストランド特異的ＲＮＡプローブを、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ反応キット（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ社）を用いて調製した。

（ｃ）ハイブリッド形成 載置された断片とともにスライドを、キシレン中で脱パラフイン処理を行い次い でＭａｒｔｉｎｅａｕおよびＴａｙｌｏｒ　（１９８６年）の文献に記載されて いるようにして段階的エタノールのシリーズを通過させて脱水した。次いでこれ らの断片をＰＢＳおよび５　＋ｏＭ　ＭｇＣ１を中で約３０分間処理し続いて０ ．１Ｍグリシン、０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５中で１０分間処理した 。

各スライドに対して、１．２　ＸＩＯ’　ｃｐｍのＲＮＡプローブ、５０μｇの イー・コリｔＲＮＡ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉａ＋社）および ２５μｇの分解ニシン精子（ｄｅｇｒａｄｅｄ　ｈｅｒｒｉｎｇ　ｓｐｅｒｍ） 　（Ｓｉｇｍａ社）を凍結乾燥し、９０℃に予め加熱した２５μＬの脱イオンホ ルムアミド（ＢＤＨ）中に再懸濁させた。２ｘハイブリッド形形成台物の２５μ Ｌを添加して、最終濃度を、２ＸＳＳＣ，０，２％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ、　１０ ％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、７５ｍＭ　ＤＴＴ、１単位／μＬのＲＮエイシ ンリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および５０％（ｖ／ｖ） ホルムアミドにした。

４０μＬの液滴を断片の上に置いてカバーグラスをのせた。ハイブリッド形成は 、加湿チャンバー内にて３７℃で１６時間行った。

洗浄を、５０％（ｖ　／　ｖ　）ホルムアミド、２ＸＳＳＣ，２０＋ｏＭ　ＤＴ Ｔ中で、室温にて５分間行ってカバーグラスを外し、続いて１０μｇ／ｍｌｌ？ ＮアーゼＡ、　５００ｍＭ　ＮａＣｌ、　ＩＯ＋ｎＭ）リス−ＨＣｌ、　ｐ）１ ８．０．２０ａ＋Ｍ　ＤＴＴ中、次いで２ＸＳＳＣ，２０＋ｎＭ　ＤＴＴ中、次 にｌＸ５ｓｃ、　２０ｍＭ　ＤＴＴ中で４２℃にて３０分間行った。最後の洗浄 を、ｌＸ５ｓｃ、　２０ｍＭ　ＤＴＴ中で室温にて３０分間行った。次にこれら のスライドを、ＭａｒｔｉｎｅａｕおよびＴａｙｌｏｒ　（１９８６年）の文献 に記載されているように段階的なエタノールのシリーズで脱水した。それらスラ イドを風乾し次いでＦｕｊｉ　ＲＸフィルムに一７０℃で１６時間暴露し、核ト ラックエマルジョンに対する暴露時間を測定した（ＣＯｇｈｌａｎら１９８５年 ）。次にスライドを、４５℃にて、ＫｏｄａｋＮＴＢ−２液体核トラックエマル ジョン（蒸留水を用いてｌ：１の比率で希釈）でコートし、垂直に立て、てドレ インさせ、次にシリカゲルの結晶（６〜１８メツシユ）　（ＢＤ）ｌ）による耐 光性ボックス中に入れ、４℃にて５日間貯蔵した。スライドをＭａｒｔｉｎｅａ ｕおよびＴａｙｌｏｒ（１９８６年）の文献に記載されているようにデベロップ した。スライドを流水中で１５分間洗浄し、段階的エタノールのシリーズで脱水 し、次いでキシ１２２９５％エタノール（１：　１）およびキシレンを通過させ た。次にスライドをＥｕｃｋｉｔｔ　（０，Ｋｉｎｄｌｅｒ）で永久的にマウン トした。

スライドをＮ１ｋｏｎ写真用顕微鏡で調べた。対照のスライドは、バックランド の指標として、センス転写物とハイブリッドを形成させたスライドである。写真 は）［ｏｄａｋ　ＥｋｔａＣｈｒＯｍｅ　１６０Ｔフイルムを用いて撮影した。

Ｒ【転写物の空間的発現をｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法によって調べた。

花弁の断片については、ａＥＩＱ、　９ｃＤＮＡが表皮細胞に優先的に結合した が葉肉細胞とのハイブリッド形成は制限されていることが検出された（図１１） 。このことは、アントシアニン色素が特に花弁の表皮層に局在して蓄積している ことと一致している。花柱とやくの断片についての予備的なｉｎ　５ｉｔｕハイ ブリツド形成試験でも、これらの器官内にＲ１転写物が検出された。

アンドシアニン経路に関与するｃＤＮＡクローンを単離するプログラムの一環と して、ディフエレンシャル・スクリーニングによるアプローチを利用し、ＯＧＢ の段階３〜４の花の花弁（へりとチューブ）およびＲ５１の花弁（チューブ）か ら調製したｃＤＮＡプローブによって、ＯＧＢの花弁のｃＤＮＡライブラリーを スクリーニングした。ペチュニア系Ｒ５１は、アントシアニンの生合成に関与し ていることが知られているいくつかの遺伝子座が変異した変異体であり、そして ヘリが減少し大部分がチューブで構成されている花が生成するようになるブライ ンド突然変異性（ｂｌｉｎｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）をもっている。二つのクラス のｃＤＮＡクローンがこのディフェレンシャルスクリーンによって検出される。

すなわちチューブの組織に比べて花弁のへりに優先的に発現されるものおよび特 異的な突然変異によって発現が減少しているものである。ｃＤＮＡクローンａＥ ｌｏ、　９は先に配列を決定したグリコジルトランスフェラーゼに対して配列類 似性を示した。ＲＦＬＰとＲＮＡのプロット分析によって、このｃＤＮＡが、Ｒ ５１においてホモ接合劣性であるｌ？を遺伝子座に一致するという強力な証拠が 得られた。このことはＲ【の突然変異とａＥＩＯ，９ｃＤＮＡの間の補足性によ って証明された。さらにａＥｌｏ、　９ｃＤＮＡクローンのアンチセンス発現は アンドシアニジン−３−グルコシド類のラムノシル化反応を阻害した。

しかし当該技術分野の当業者は、本願に記載した発明は、具体的に述べたちの以 外に変形および改変を行うことができることが分かるであろう。そして本発明に はこのような変形および改変のすべてが含まれると解すべきである。また本発明 には、本明細書で個々にまたは総合的に参照しまたは示したすべてのステップ、 特徴、組成物および化合物のすべて、ならびに前記ステップまたは特徴のいずれ かの二つ以上の組合わせのすべてが含まれる。

引用文献 Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　ｏ、　ｃ、　、　ｌＪｃＫｎｉｇｈｔ、　’ｒ、　ｏ、 　ａｎｄ　Ｗｉ　Ｉｌｉａｍｓ、　Ｂ、　Ｇ、　、　Ｇｅｎ■@３１　ニア９− ８９゜ １９８４゜ Ａ１１ｄａｙ、Ｍ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ、Ｍ、Ｄ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５（２４）：１０５９２゜１９８７゜ Ａｎｄｅｒｓｅｎ、　０．　Ｍ、　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　５ｙｓｔ、　Ｅｃ ｏｌ、　１６（６）　：５３５−５４０．１９８８゜Ａｓｅｎ、　Ｓ、　、　Ｊ 、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ｈｏｒｒｉｃ、　Ｓｃｉ、　１０７（５）　ニア４４− ７５０．１９８２゜Ａｓｅｎ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ、　Ｒ，、 Ｊ、　Ａｍ、　Ｓａｃ、　Ｈｏｒｒｉｃ、　Ｓｃｉ、　１０８（５）　：８４５ |８５０゜ １９８３゜ Ａｓｅｎ、　Ｓ、　、　Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ、　Ｒ，Ｊ、　、　Ｎｏｒｒｉｓ、 　Ｋ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ、　Ｂ、　Ａ、　B Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５（１１）　：２５０９−２５１４．１９ ８６゜Ａｖｉｖ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６９：１４０８．１９７２K Ｂｅ１ｄ、　Ｍ、　、　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｃ，、Ｈｕｉｔｓ、　Ｈ，、５ｔｕｉ ｔ　Ｊｅ、　Ａ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　ＧA　Ｍ、　。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１３：４９１−５０２．１ ９８９゜Ｂｅｒｌｙｎ、　Ｇ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｍｉｋｓｃｈｅ、　Ｊ、　Ｐ、 　、　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　ｍ１ｃｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄｃｙｔｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｉｏｗａ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｗｅｓ、 　Ｉｏｗａ、　１９７６゜Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、ＢＲＬ　ｐＵＣｈｏｓｔ：Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ”ｃｏｍｐｅ ｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ、　Ｄｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、　Ｆｏｃｕｓ 、　８（２）　：９．１９８６゜Ｂｕｄｚｉａｎｏｗｓｋｉ、　Ｊ、　、　Ｐｈ ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０（５）　：１６７９−１６８２．１９９１゜Ｂ ｕｌｌｏｃｋ、　Ｗ、　０．　、　Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ、　Ｊ、　Ｍ、　ａｎｄ 　５ｈｏｒｔ、　Ｊ、　Ｍ、　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ浮■刀@５：３７６゜ １９８７゜ Ｃｏｇｈｌａｎ、　Ｊ、　Ｐ、　、　Ａｌｄｒｅｄ、　Ｐ、　、　Ｈａｒａｉａ ｍｂｉｄ　ｉｓ、　Ｊ、　、　Ｎ１ａｌ　ｌ、　Ｈ，Ｄ、　A　Ｐｅｎｓｃｈｏ ｗ。

Ｊ、Ｄ、ａｎｄ　Ｔｒｅｇｅａｒ、Ｇ、Ｗ、、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４９：１−２８．１９８５゜Ｃｏｍａｉ、Ｌ、、Ｍｏｒａ ｎ、Ｐ、ａｎｄ　Ｍａｓｌｙａｒ、Ｄ、、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　１５：３７３−３８１．１９９０゜ Ｃｏｒｎｕ、　Ａ、　、　Ｍｕｔａｔ　ｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４２：２ ３５−２４８．１９７７゜Ｃｏｒｎｕ、Ａ、、Ｆａｒｃｙ、Ｅ、、Ｍａｉｚｏｎ ｎｉｅｒ、Ｄ、、Ｈａｒｉｎｇ、Ｍ、、Ｖｅｅｒｍａｎ、Ｗ、ａｎｄ　Ｇｅｒａ ｒｓ。

Ａ、Ｇ、Ｍ、、　ｌｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｐｓ−Ｌｏｃｕｓ　Ｍａｐｓ　ｏ ｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｇｅｎｏｍｅｓ、５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ、５ｔｅｐｈｅｎ 　Ｊ、０’Ｂｒ１ｅｎ（ｅｄ、）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＵＳＡ、１９９０゜ Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｗｏｏｄ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｉｃｋ、 　Ｊ、　Ｂ、　、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　qｅｐ、　１　：１ ９− ２１．１９８３゜ Ｄｏｏｄｅｍａｎ、　Ｍ、　、　Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｓｅ ｈｒａｍ、　Ａ、Ｖｌ、　、　Ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、　ＰA　ａｎｄ　Ｂ　１ ａｎｃｈ　ｉ。

Ｆ、　、　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　６７：３５７−３６６、 １９８４゜［！ｂｅ１．　Ｊ、ａｎｄ　Ｈａｈｉｂｒｏｃｋ、に、、　ｌｎ：Ｔ ｈｅ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒモ■ Ｓｉｎｃｅ　１９８０．　）ｌａｒｂｏｕｒｎｅ、Ｊ、Ｂ、（ｅｄ、）、　Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＵＳＡB ６４１−６７９．１９８８゜ Ｅｄｗａｒｄｓ、に、、Ｃｒａｍｅｒ、Ｃ，Ｌ、、ＢｏｌｗｅｌＩ、Ｇ、Ｐ、、 Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、、５ｃｈｕｃｈ、Ｗ　ａｎｄＬａｍｂ、　Ｃ，Ｊ、　、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：６７３１−６ ７３５．１９８５゜Ｆｕｒｔｅｋ、　Ｄ、　、　５ｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ、　 Ｊ、　Ｗ、　、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｎｅ１ｓｏｎ、　Ｏ，Ｅ A　、　Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、ｌｌ：４７３−４８１．１９８８゜Ｇａｍｂｏｒｇ、　Ｏ， Ｌ、　、帽ｌ　１ｅｒ、　Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　ＯＪｉ＋ｏａ、　Ｋ、　、　Ｅｘ ｐ、　Ｃｅｌ　Ｉ　Ｒｅｓ、　５０F１５１−１５８゜ １９６８゜ Ｇａｒｆ　１ｎｋｅｌ、　Ｄ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｎｅｓ　ｔｅｒ、　Ｅ、　Ｗ、 　、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１４４　ニア３２−７４３．１９W０゜ Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｆａｒｃｙ、　Ｅ、　、　Ｗａｌｌｒ ｏｔｈ、　Ｍ、　、　Ｇｒｏｏｔ、　Ｓ、　Ｐ、　Ｃ，ａｎп@Ｓｃｈｒａｍ、 　Ａ。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０６：５０１−５０８．１９８４゜Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、 　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｈｉｕｔｓ、　Ｈ，、Ｖｒｉｊｌａｎ、ｄｔ、　Ｅ、　、　 Ｍａｒａｎａ、　Ｃ，、５ｏｕｅｒ、@Ｅ、　ａｎｄ Ｂｅｌｄ、Ｍ、、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２：１１２１−１１２８．１ ９９０゜Ｇｅｒａ　Ｌｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、　、　ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、　 Ｐ、　、　Ｄｏｏｄｅｍａｎ、　Ｍ、　、　Ａ１．　Ｂ、　ａｎｄ　rｃｈｒａ ｍ、　Ａ、　Ｗ、　。

Ｐｌａｎｔａ　１５５：３６４−３６８．１９８２゜Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、　Ｋ 、　ａｎｄ　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、　Ｈ，、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ 　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３０＋１０T− １３０．１９７９゜ Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６：５５７． １９８３゜１（ａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｎａ５ｈ、　Ｒ，Ｊ、 　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｙｓｔ、　Ｅｃｏｌ、１２（３）　：３１T−３１ ８゜ １９８４゜ Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｗｉ　Ｉｌｉａｍｓ、　Ｃ，Ａ、　 Ｚ　Ｎａｔｕｒｊｏｒｓｃｈ　３９（１−２）　：１８−２R゜ １９８４゜ Ｈａｓｅｌｏｆ　ｆ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ、　Ｌ、　Ｎａｔｕｒｅ 　３３４：５８６−５９１．１９８８゜Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｄ、　Ｇ、　ａｎｄ 　５ｈａｒｐ、　Ｐ、　Ｍ、　、　Ｇｅｎｅ　７３　：２３７−２４４．１９８ ８゜Ｈｏ１ｔｏｎ、　Ｔ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｇｒａｈａ＋ｎ、　Ｍ、　Ｗ、　、 　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９：１１T６．１９９１ ゜ １ｎｏｕｅ、　Ｈ，、Ｎｏ　ｊｉｍａ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ， 、Ｇｅｎｅ　９６　：２３−２８．１９９０゜Ｉｔｏｋａｗａ、Ｈ，、５ｈｉｄ ａ、Ｙ、、１ｋｕｔａ、ａ、、Ｉｎａｔｏｍｉ、Ｈ，ａｎｄ　Ｉｋｅｇａｍｉ、 Ｓ、。

Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０（１０）：２４２１−２４２２．１９８１ ゜Ｊｅｆ　ｆｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｋａｖａｎａｇｈ、　Ｔ、　Ａ、　 ａｎｄ　Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、　Ｗ、　、　ＥＭＢＯＪ、　６（P３）　：３９０ １ −３９０７．１９８７゜ Ｊｏｎｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｖ、　、　Ａａｒｓｍａｎ、　Ｍ、　Ｅ、　Ｇ 、　、　Ｓｃｈｒａｍ、　Ａ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｂｅｎｎ１獅求A　Ｇ、　Ｊ、 　Ｈ，。

Ｐｈｖｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１（１０）　：２４５７−２４６０．１９８ ２゜Ｊｏｎｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｖ、　、　Ａａｒｓｍａｎ、　Ｍ、　Ｆ！ 、　Ｇ、　、　ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｓｃｈ窒≠香A　Ａ、 　Ｗ、　。

Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　６８：４５９−４６６、１９８４ａ 。

Ｊｏｎｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｖ、　、　Ａａｒｓｍａｎ、　Ｍ、　Ｅ、　Ｇ 、　、　Ｐｏｕｌ　ｔｏｎ、　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｓｃｈ窒≠香A　Ａ、　Ｗ 。

Ｐｌａｎｔａ　１６０：１７４−１７９．１９８４ｂ。

Ｊｏｎｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｖ、　、　Ａａｒｓｍａｎ、　Ｍ、　Ｅ、　Ｇ 、　、　ｖａｎ　Ｄｉｅｐｅｎ、　Ｐ、　、　Ｓｍｉ　ｔ、@Ｎ、　ａｎｄ　Ｓ ｃｈｒａｍ。

Ａ、　’Ｉ１．　、　Ｐｌａｎｔａ　１６０：３４１−３４７．１９８４ｃ。

Ｋａｍｓｔｅｅｇ、　Ｊ、　、　ｖａｎ　Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ、　Ｊ、　ａｎｄ 　ｖａｎ　Ｎｉｇｔｅｖｅｃｈｔ、　Ｇ、　、　Ｚ　Ｎａｔ浮窒■盾窒唐モ■ ３５ｃ：２４９−２５７．１９７９゜ ＫｉＩＤｕｒａ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｏｗｅｎｓ、　１．　Ｓ、　、　Ｅｕｒ　Ｊ 　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ　１６８：５１５−５２１．１９８７゜Ｊｏｓｈｉ、　Ｃ， Ｐ、　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５：９６２７− ９６４０．１９８７゜Ｋｈｏｋｈａｒ、　Ｊ、　Ａ、　、　Ｈｕａ＋ｐｈｒｅｙ ｓ、　Ｊ、　Ｍ、　、　５ｈｏｒｔ、　Ｋ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｇｒｏｕｔ、　Ｂ、 　v、　Ｗ、　。

Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ　１７（５）：８１０−８１１．１９８２゜Ｋｏｅｓ、 　Ｒ，Ｅ、　、５ｐｅｌｔ、Ｃ，Ｅ、　、　Ｒｅ１ｆ、Ｈ，Ｊ、　、　ｖａｎ　 ｄｅｎ　［！１ｚｅｎ、　Ｐ、　Ｊ、Ｍ、　、　uｅｌｔｋａｍｐ。

Ｅ、　ａｎｄ　Ｍｏｌ、　Ｊ、　Ｎ、　Ｍ、　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、　１４（１３）　：５２２９−５２３９．１９８６゜Ｌａｐｅｙｒｅ、　 Ｂ、　ａｎｄ　Ａｍａｌｒ比、　Ｆ、　、　Ｇｅｎｅ’　３７：２１５−２２０ ．１９８５゜Ｌａｗｒｅｎｃｅ、Ｊ、Ｂ、ａｎｄ　Ｓｉｎｇｅｒ、Ｒ，Ｈ，、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１３（５）：１７７７−１７９ ９．１９８５゜ Ｌａｚｏ、　Ｇ、　Ｒ，、Ｐａ５ｃａｌ、　Ａ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｌｕｄｗｉｇ 、　Ｒ，Ａ、　Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：９６３|９６７゜ １９９１゜ Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ、　Ｐ、　１．、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２６１：６１１ ９−６１２５．１９８６゜Ｍａｉｚｏｎｎ　ｉｅｒ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｍｏｅｓ ｓｎｅｒ、　Ａ、　、　Ｇｅｎｅｔ　ｉｃａ　５２（２）　：１４３−１４８． １９８O゜ Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　Ｔ、　、　Ｆｒｉ　ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、　ａｎｄ　 Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ奄獅■FＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ。

１９８２゜ Ｍａｒｋｈａｍ、に、Ｒ，、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ 　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏ ｎ、１９８２゜Ｍａｒｔｉｎ、Ｃ，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ、Ａ、、Ｍａｃｋａｙ、Ｓ 、、Ｂａｒｔｌｅｔｔ＋　Ｊ、ａｎｄ　Ｖｒｉ　ｊｌａｎｄｔ、Ｅ、。

Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１（１）：３７−４９．１９９１゜Ｍａ ｒｔ　１ｎｅａｕ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｗ、　Ｃ，、Ｐｌａｎｔ 　Ｐｈｙｓｉｏｌ　８２：６１３−６１８．１９８６゜ＭｃＢｒｉｄｅ、に、Ｅ 、ａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｔｅｌｔ、に、Ｒ，、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４：２６９−２７６　１９９０゜ Ｍｉｙａ　ｊｉｍａ、　１．　、　Ｄｏｉ、　１．　ａｎｄ　Ｋａｇｅ、　Ｔ、 　、　Ｓｃｉ、　Ｂｕｌ　Ｉ、　Ｆａｃ、　Ａｇｒｉｃ、　jｙｕｓｈｕ　Ｕｎ ｉｖ。

４５（１−２）：８３−９０．１９９０゜Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、　Ｔ、　ａｎｄ 　Ｓｋｏｏｇ、　Ｆｌ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ　１５ニア３−９７．１９ ６２゜Ｎａｋａｎｏ、　Ｋ、　、　ＮｉＮ１５ｈｉｚａ、　Ｋ、　、　Ｔａｋｅ ｍｏｔｏ、　Ｉ。Ｍｕｒａｋａｍｉ、　Ｋ、　、　Ｔａｋａｉｓｈ堰A　Ｙ、　 ａｎｄ Ｔｏｍｉｍａｔｓｕ、　Ｔ、　、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ　ｔｒｙ　２８（１ ）　：３０１−３０３．１９８９゜０’　Ｒｅｉ　ｌ　Ｉｙ、　Ｄ、　Ｒ，ａｎ ｄ　Ｍｉ　Ｉ　Ｉｅｒ、　Ｌ、　Ｋ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４　：１１１０ −１１１２．１X８９゜ ０°Ｒｅｉ　Ｉ　Ｉｙ、　Ｄ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｍｉ　ｌ１ｅｒ、　Ｌ、　Ｋ、　 、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６４：１３２１−１３２８．１９９０K Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５F２４４４− ２４４８．１９８８゜ Ｒａ１ｓｔｏｎ、　Ｅ、　Ｊ、　、　Ｅｎｇｌ　ｉｓｈ、　Ｊ、　Ｊ、　ａｎｄ 　Ｄｏｏｎｅｒ、　Ｈ，Ｋ、　、　Ｇｅｎｅｔ　ｉｃｓ　１P９　：１８５− １９７．１９８８゜ Ｒｅｉ　ｆ、　Ｈ，Ｊ、　、　Ｎ１ｅｓｂａｃｈ、　Ｕ、　、　Ｄｅｕｍｌ　ｉ ｎｇ、　Ｂ、　ａｎｄ　５ａｅｄｌｅｒ、　Ｈ，、Ｍｏ１．@Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ ｔ。

１９９：２０８−２１５．１９８５゜ Ｒｉｊｔｅｒ、Ｊ、に、、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄ　Ｏｗｅｎｓ　１ ．Ｓ、、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６６：１０４３−１０４７．１９９１゜ Ｓａｉ　ｔｏ、　Ｎ　ａｎｄ　Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、Ｂ、　、　Ｐｈｙｔｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２（８）　：１７３５−１７４０．P９８３゜ Ｓａｉ　ｔｏ、　Ｎ、　、　Ｙｏｋｏ　ｉ、　Ｍ、　、　Ｏｇａｗａ、　Ｍ、　 、　Ｋａ＋ｎｉ　Ｊｏ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｈｏｎｄａ、　ＴA　、　Ｐｈｙｔｏ ｃｈｅｍｉｓ　ｔｒｙ２７（５）　：１３９９−１４０２．１９８８゜Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ、　Ｊ、　、　Ｆｒｉ　ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａ ｔｉｓ、　Ｔ、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ獅奄獅■FＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＵＳＡ、 １９８９゜ Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ 、　Ａ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ堰AＵＳＡ　７４： ５４６３−５４６７．１９７７゜ ５ｃｈｅｎｋ、　Ｒ，Ｕ、　ａｎｄ　Ｈｉ　Ｉｄｅｒｂｒａｎｄｔ、　Ａ、　Ｃ ，、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂａｔ、　５０　：１９９−２０４．P９７２゜ Ｓｃｈｒａｍ、　Ａ、　Ｗ、　、　Ｊｏｎｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｖ、　ａｎ ｄ　Ｂｅｎｎ　ｉｎｋ、　Ｇ、　Ｊ、　Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅ高奄唐狽窒凵@ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉ ｄａ、夏ｎ：Ｐｅｔｕｎｉａ　５ｉｎｋ、に、Ｃ。

（ｅｄ）、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌ　ｉｎ、　Ｇｅｒｍ ａｎｙ、　ｐｐ　６８−７５．１９８４゜５ｅｉｔｚ、Ｈ，Ｕ、ａｎｄ　Ｈｉｎ ｄｅｒｅｒ、Ｗ、、Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ、　Ｉｎ：Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　ａｎｄＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ ｓ、Ｃｏｎ５ｔａｂｅｌ、Ｆ、ａｎｄ　Ｖａｓｉｌ、　１．Ｋ。

（ｅｄｓ、　）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ ＳＡ、　５：４９−７６、１９８８゜Ｓｉｎｇｅｒ、　Ｒ，Ｈ，、Ｌａｗｒｅｎ Ｃｅ＋　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｖｉｌｌｎａｖｅ、　Ｃ，、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ　４（３j　： ２３０−２５０．１９８６゜ ５ｔａｆｆｏｒｄ、Ｈ，Ａ、、Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｃ ＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。

Ｆｌｏｒｉｄａ、　ＵＳＡ、　１９９０゜５ｎｏｏｋ、　Ｍ、　Ｅ、　、　Ｃｈ ｏｒｔｙｋ、　０．　Ｔ、　、　５ｉｓｓｏｎ、　Ｖ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｃｏ５ ｔｅｌｌｏ、　Ｃ，ＥA　。

Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１（５）：１６３９−１６４７．１９９２゜ Ｔｕｒｐｅｎ、　Ｔ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｇｒｉｆ　ｆ　ｉ　ｔｈ、　Ｏ，Ｍｌ、　 ＢｉｏＴｅｃｈｎｊｑｕｅｓ　４：１１−１５．１９８６゜ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ 、Ａ、　Ｊ、　、　Ｋｏｅｓ、　Ｒ，Ｅ、　、　５ｐｅｌ　ｔ、　ｃ、　Ｅ、　 ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、　Ａ、　ＲC、５ｔｕｉｔｊｅ。

Ａ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｍｏ１．　Ｊ、　Ｎ、　Ｍ、　、　ＥＭＢＯＪ、　、　７（ ５）　：１２５７−１２６３．１９８８゜Ｖｉｄａｌ−０１１１ｖｉｅｒ、　Ｅ 、　、　Ｅｌｉａｓ、　Ｒ，、Ｆａｕｒｅ、　Ｆ、　、　ＢａｂａｄＪａｍｉａ ｎ、　Ａ、　、　Ｃｒ■唐垂奄氏B Ｆ、　、　Ｂａ１ａｎｓａｒｄ、　Ｇ、　ａｎｄ　［１ｏｕｄｏｎ、　Ｇ、　、 　Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　５５（１）　ニア３−７４D１９８９゜ Ｗａｌｌｒｏｔｈ、　Ｍ、　、　Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｒｏ ｇｅｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、　、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、　≠獅п@Ｈｏｒｓｃ ｈ。

Ｒ，Ｂ、　、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２：６−１５．１９８ ６゜Ｗｉｅｒｉｎｇ、Ｈ，ａｎｄ　Ｄｅ　Ｖ１ａａ＋ｉｎｇ、Ｐ、、　Ｉｎｈｅ ｒｉｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｏｉｓｔｒｙ　ｏｆＰｉｇ＋ａｅｎＬ ｓ、　Ｉｎ：Ｐｅｔｕｎｌａ　５ｉｎｋ、　Ｋ、　Ｃ，（ｅｄ、　）、　Ｓｐｒ ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌ　奄氏B Ｇｅｒｍａｎｙ、　ｐｐ４９−６５．１９８４゜Ｗｉｓｅ、　Ｒ，Ｐ、　、　Ｒ ｏｈｄｅ、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｓａｌａｍｉｎｉ、　Ｆ、　、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、　１４　：Q７７−２７９゜ １９９０゜ Ｙａｄａｙ、Ｓ、Ｐ、ａｎｄ　Ｂｒｅｗ、に、、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６ ６：６９８−７０３．１９９１゜配列の一覧表 （１）一般情報： （ｉ）出願人（米国以外）　：　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＦＬＯＷＥＲＤ ＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＳ　ＰＴＶ、ＬＴＤ。

出願人（米国のみ）　：ＢＲＵＧＬＩＥＲＡ、Ｆｉｌｉｐｐａ；ＨＯＬＴＯＮ、 Ｔｉｍｏｔｂｙ　Ａｌｂｅｒｔ（ｉｉ）発明の名称：グリコシルトランスフェラ ーゼ酵素をコードする遺伝子配列およびその用途 （ｉｉ）配列の数ニア （ｉｖ　）通信の宛先： （Ａ）受信者：　ＤＡＶＩＥＳ　Ｃ０ＬＬＩＳＯＮ　ＣＡＶＥ（Ｂ）ストリート ：リトル・コリンズ・ストリート１（Ｃ）市：メルボルン （Ｄ）州：ビクトリア （Ｅ）国：オーストラリア （Ｆ）　ＺＩＰ　：　３０００ （ｖ）コンピュータが読取り可能なフオーム：（Ａ）媒体の種類：フロッピー・ ディスク（Ｂ）　コンピュータ：　ＩＢＭ　Ｐｃ　ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ） オペレイティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウェ ア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ。

Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５ （ｖｉ　）本出願のデータ： （Ａ）出願番号二オーストラリア国際特許願（Ｂ）出願臼：　１９９３年７月３ ０日（Ｃ）分類： 、’−ＴＴ　ＴＴＧ　；、ｘＴ　ＧＣＡ　入ＡＧ　ＣＴｔｌｌ；　ＧＴＧ　Ａに Ｔ　ｃｓＴ　にＡＴ　ＡＩＮＩ；　ＣＡＡ　ＧＣＴ　Ｇａｃ@ＣｒＣ−ＧＡに　 ユ２００ ；ＩＴＴ　ＡＡＴ　ＡＧＣλＧＣＣＡＴ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　Ｇｆ７　ＴＡＴ　’ ｒＴｒ　ＣＯＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＡＴｆ’　ＡＡf　’、２４Ｂ Ｓ入Ａ　ＧＣＴ　Ｃ；ＴＣ；　にＡＡ　ＡＡＣ；　ＧＴｃ　入ＴＧ　ＣＴＣにＡ Ｔ　Ｃ；ＴＴ　ｃ入へ　ＡＡＧ　（Ａｃ　ＧＣＡ　ＧｃＴ　■`Ａ　二２９６ ４５０　シ５５　４６０ −？’ＣＣＣＴ　ＡＡＧ　ＣＴＣＴ：Ｃ入ＣＴ　ＡＣＡ　ＴＡＣＣ入ＡＴＣＧＡ 　＄ＣＣＭ；Ｃ入ＴＦ：ＴＧ入ＴＧＣ１４４３Ａ＾）ＯＬ入＾−Ａ−＾λ−Ｊ１ ζ入ＡＡＡ−へＡ＾ンＪ１−人＾−Ａ〜へｍ入へ−Ｊ―−人入鼻ＪＪＪ、’＝７ ３８（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　３に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝８９個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０ （ｉｘ　）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：３０．．８９ （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　３　：（２）　ＳＥＱ　１０　 ＮＯ：　４に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｄ）分子の種類二オリゴヌクレオチド（ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４　：ＣＣＣＡＣＴＧＴＡＡ　Ｔ ＧＴＡＧＣＡＧＴＡ　ＴＴ　２２（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５に関する情 報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＝２２個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＩ）　Ｎｏ　：　５　：ＣＣＡＡＴＣＣＧＴＣ ＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴ　ＣＡ　２２（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　６に関する 情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１６個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の種ｇＩ：オリゴヌクレオチド（ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｘｊ）配列の記載：ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　６　：ＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡ ＡＧＴＧ　１６（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７に関する情報：（ｉ）配列の 特徴： （Ａ）長さ：１５個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｘｉ）配列の記載：Ｓ２Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ　：　７　：ＣＴＡＧＡＣＴＣＣＡ　 ＡＴＣＡＣ１５ＦＩＧＵＲＥＩＡ ＦＩＧＵＲＥ３ シＣ ト ロ ＦＩＧＵＲＥ６ ＦＩＧＵＲＥ７ ＦＩＧＵＲＥ　９ 厘 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成７年　１月３０日

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．グリコシルトランスフェラーゼの性質を有する植物フラボノイドグリコシル 化酵素、又はその機能的部分もしくは誘導体をコードするヌクレオチドの配列、 またはその配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子 。
2. ２．前記グリコシルトランスフェラーゼがフラボノイド−５−グルコシルトラン スフェラーゼ（５ＧＴ）及びアントシアニジン−３−グルコシドラムノシルトラ ンスフェラーゼ（３ＲＴ）から成る群から選ばれる、請求の範囲１記載の単離さ れた核酸分子。
3. ３．前記グリコシルトランスフェラーゼが３ＲＴである請求の範囲２記載の単離 された核酸分子。
4. ４．植物が、ペチュニア・ハイブリダ、サイリーニ・ジオシア、アンチライナム 属の植物、シクラメン、アルストロメリア属の植物、メトロシデロス属の植物、 ポテンティラ属の植物およびセントポーリア属の植物からなる群から選択される 請求の範囲１記載の単離された核酸分子。
5. ５．植物がペチュニア・ハイブリダである請求の範囲４記載の単離された核酸分 子。
6. ６．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示す配列と実質的に同じ配列またはＳＥＱＩＤＮＯ： ２に示す配列のすべてもしくは一部に対して少なくとも５０％の類似性を有する 配列を含んでなるヌクレオチド配列または相補的ヌクレオチド配列を有する請求 の範囲５記載の単離された核酸分子。
7. ７．（ｉ）３ＲＴをコードし、および （ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示す配列に対して少なくとも５０〜７５％のヌク レオチド配列類似性を有する、ヌクレオチドの配列を含んでなる単離されたＤＮ Ａ分子。
8. ８．前記ＤＮＡ分子が、ＳＥＯＩＤＮＯ：３に示すヌクレオチド配列に実質的に 類似しているヌクレオチド配列を含んでなることをさらに特徴とする請求の範囲 ８記載の単離されたＤＮＡ分子。
9. ９．（ｉ）植物起源の３ＲＴをコードし、および（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に 示すヌクレオチド配列またはその相補的ストランドと、低ストリンジェンシイ条 件下でハイブリッドを形成する、単離された核酸分子。
10. １０．前記核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示す配列に実質的に類似している ヌクレオチド配列を含んでなることをさらに特徴とする請求の範囲９記載の単離 された核酸分子。
11. １１．３ＲＴがペチュニア起源の３ＲＴである請求の範囲６〜１０のいずれか一 つに記載の単離された核酸分子。
12. １２．請求の範囲７〜１０のいずれか一つに記載の核酸分子を含んでなるベクタ ー。
13. １３．核酸分子が、作動可能に、プロモーターに連結されている請求の範囲１２ 記載のベクター。
14. １４．真核細胞内で複製および発現を行うことができる請求の範囲１３記載のベ クター。
15. １５．原核細胞内で複製および発現を行うことができる請求の範囲１３記載のベ クター。
16. １６．ＳＥＱＩＤＮＯ：２および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：３に示すヌクレオチ ド配列の一部またはその相補形と、低ストリンジェンシイ条件で、ハイブリッド を形成することができるオリゴヌクレオチドプローブ。
17. １７．グリコシルトランスフェラーゼまたはその機能的部分もしくは誘導体の特 徴を有する自生でないフラボノイドグリコシル化酵素を発現することができる形 質転換植物。
18. １８．発現を調節することができる請求の範囲１７記載の形質転換植物。
19. １９．発現が発育中に調節される請求の範囲１８記載の形質転換植物。
20. ２０．グリコシルトランスフェラーゼが５ＧＴおよび３ＲＴからなる群がら選択 される請求の範囲１７記載の形質転換植物。
21. ２１．グリコシルトランスフェラーゼが３ＲＴである請求の範囲１７記載の形質 転換植物。
22. ２２．グリコシルトランスフェラーゼが、ペチュニア・ハイブリダ、サイリーヌ ・ジオイカ、アンチライナム属の植物、シクラメン、アルストロメリア属の植物 、メトロシデロス属の植物、ポテンティラ属の植物およびセントポーリア属の植 物が起源のグリコシルトランスフェラーゼである請求の範囲１７記載の形質転換 植物。
23. ２３．グリコシルトランスフェラーゼがペチュニア・ハイブリダが起源のグリコ シルトランスフェラーゼである請求の範囲２２記載の形質転換植物。
24. ２４．グリコシルトランスフェラーゼが、３ＲＴであり、そしてＳＥＱＩＤＮＯ ：２に示す配列を有しているかまたは該配列のすべてもしくは一部に対して少な くとも５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる請求の範囲２３記載の 形質転換植物。
25. ２５．前記植物がペチュニア、バラ、カーネーション、キク、ガーベラ、タバコ 、トルコギキョウ、ユリ、アヤメおよびテンジクアオイからなる群から選択され る請求の範囲１７記載の形質転換植物。
26. ２６．ペチュニア、バラ、カーネーション、キク、ガーベラ、タバコ、トルコギ キョウ、ユリ、アヤメおよびテンジクアオイからなる群から選択され、自生でな い３ＲＴの調節された発現を行うことができる形質転換植物であって；前記３Ｒ Ｔが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すヌクレオチドの配列のすべてもしくは一部を含 んでなる核酸分子と低ストリンジェンシイ条件下でハイブリッドを形成できるＤ ＮＡストランドを含んでなるＤＮＡ分子でコードされている形質転換植物。
27. ２７．適切な植物の細胞に、請求の範囲６〜１０のいずれか一つに記載の核酸分 子を導入し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで該核酸配列がグリコ シルトランスフェラーゼを発現できるようにするのに充分な期間および条件下で 前記形質転換植物を成長させることを含んでなる、変化した花序特性を示すこと ができる形質転換顕花植物の製造方法。
28. ２８．形質転換植物がペチュニア、パラ、カーネーション、キク、ガーベラ、タ バコ、トルコギキョウ、ユリ、アヤメおよびテンジクアオイからなる群から選択 される請求の範囲２７記載の方法。
29. ２９．導入される核酸がＤＮＡであり、かつＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すのと実質 的に同じヌクレオチド配列またはその機能的部分もしくは誘導体を有するペチュ ニア・ハイブリダ由来の３ＲＴをコードする請求の範囲２８記載の方法。
30. ３０．ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示す配列に対して実質的な類 似性を有していることをさらに特徴とする請求の範囲２９記載の方法。
31. ３１．グリコシルトランスフェラーゼの特性を有する自生のフラボノイドグリコ シル化酵素を保有する植物の細胞に、前記の自生フラボノイドグリコシル化酵素 の共抑制を誘発する条件下で、請求の範囲６〜１０のいずれか一つに記載の核酸 を導入することを含んでなる、変化した花序特性を示すことができる形質転換顕 花植物の製造方法。
32. ３２．形質転換植物が、ペチュニア、バラ、カーネーション、キク、ガーベラ、 タバコ、トルコギキョウ、ユリ、アヤメおよびテンジクアオイからなる群から選 択される請求の範囲３１記載の方法。
33. ３３．導入される核酸がＤＮＡであり、かつＳＥＱＩＤＮＯ：２および／または ＳＥＩＤＮＯ：３に示すのと実質的に同じヌクレオチド配列またはその機能的部 分もしくは誘導体を有するペチュニア・ハイブリダ由来の３ＲＴをコードする請 求の範囲２８記載の方法。