JPH07509223A - インターロイキン−１媒介疾患および腫瘍壊死因子媒介疾患の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−１媒介疾患および腫瘍壊死因子媒介疾患の治療方法 発明の背景 本発明は、一般的に疾患を予防する方法、および治療する方法、更に詳細には特 定の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）媒介疾患およびイノターロイキン−１（ＩＬ−１） 媒介疾患を予防する方法および治療する方法に関する。

炎症は、機械的な損傷、感染、または抗原刺激によって引き起こされる疾患のよ うな障害に対する生体の防御反応である。炎症反応は、炎症が自己抗原のような 不適切な刺激により誘導される場合に病理学的に発現され得、肥大して発現され 得、または障害因子の除去後もかなり持続する。これらの状況下で、炎症は慢性 的に発現され得る。敗血症性シヲノクのような急性炎症性疾患ならびに慢性関節 リュウマチおよび炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患の媒介は、ＩＬ−１およ び丁ＮＦの前炎症性活性に関連付けられてきた。

ＴＮＦおよびＩＬ−１は天然に見出される化合物であり、しばしばサイトカイン といわれる。サイトカインは細胞外タンパク質であり、細胞、特にサイトカイン の合成および放出の即時型領域にあるそれらの細胞のふるまいを改変する。

最も有効な炎症性サイトカインの１つはまだ発見されておらず、多くの疾患およ び医学的な症状におけるキーメディエ−ターであると考えられるサイトカインは ＩＬ−１である。ＩＬ−１はマクロファージ／単球系の細胞により作られるが単 一ではなく、２つの形、ＩＬ−１アルフア（ＩＬ−１α）およびＩＬ−１ベータ （ＩＬ−１β）、で生成され得る。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、単球およびマクロファージを含む多くの細胞型によ り生成される１種のサイトカインである。少なくとも２つのＴＮＦ、特にＴＮＦ アルファ（ＴＮＦα）およびＴＮＦベータ（ＴＮＦβまたはリンホトキンン）が 以前に記載されてきた。これらの公知のＴＮＦは、炎症応答に含まれる多くの異 なる標的細胞において重要な生理学的効果を有する。そのタンパク質は、フィブ ロブラストおよび滑膜細胞の両方に潜在性コラゲナーゼおよｙブロスタグランン ンＥ２の分泌を引き起こし、骨細胞に骨吸収の刺激を引き起こす。これらのタン パク質は好中球への上皮細胞の表面粘着特性を増加する。それらはまた、上皮細 胞に凝集活性の分泌およびそれらの凝塊溶解能の低下を引き起こす。さらにそれ らは、リポタンパク質リパーゼ酵素の発現を阻害することで脂肪細胞の活性を脂 質の貯蔵がら向けなおす。

ＴＮＦは肝細胞に「急性期反応物質」として知られる１種のタンパク質の合成を 引き起こし、それは発熱物質として視床下部で作用する。これらの活性を通して 、ＴＮＦは感染および障害のような種々の兆候に対して生体反応で重要な役割を 果たす。

例えば、Ｐ、　Ｊ、　５ｅｌｂｙら、Ｌａｎｃｅｔ、１９８８年２月２７日、４ ８３ベージ；Ｈ，Ｆ、　５Ｌａｒｎｅｓ、　Ｊｒ、ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ、　、　８２巻、１３２１ページ（１９８８）　：　Ａ、０１ｉｆｆら 、二、５０巻、５５５ページ（１９８７）　；およびＡ、ｉｆａａｇｅら、い法 旦１１．１９８７年２月１４日、３５５ページの記事を参照。

ＩＬ−１およびＴＮＦの両方の活性はヒトの炎症性疾患において採取した血清お よび池の体液中に検出される。実験系では、短時間の障害性の刺激後、ＩＬ−１ およびＴＮＦの循環への放出のキネティクスはよく特徴付けられたパターンに従 う。細菌の生成物、リボ多糖（ＬＰＳ）をヒトにポーラス投与すると、ＴＮＦお よびＩＬ−１が合成および放出され、投与後それぞれ２時間および６時間で順に ピークを迎える。ＩＬ−１およびＴＮＦの細胞材料は異なる。ＴＮＦは主として 単球によってのみ合成され、ＩＬ−１は、実質的に全ての有核細胞型により生成 され得る。しがし炎症反応の初期段階において、おそら＜　ＩＬ−１の生成に含 まれる細胞は、上皮細胞、内皮細胞および単球／マクロファージ系の細胞である 。

ＩＬ−１およびＴＮＦの合成は、通常、細菌生成物、レクチン、免疫複合体、お よび組織障害を生じる種々の有害刺激により刺激される。ＩＬ−１およびＴＮＦ は次の前炎症活性を共有する：（１）好中球の血管内皮への粘着の増加、（２） 好中球および単球におけるレスピラトリーバーストの活性化、（３）軟骨マトリ ックスおよび骨の吸収の刺激、（４）多くの細胞型がらのプロスタグランジンの 放出および多くの細胞型の増加の刺激、および（５）発熱、悪液質、食欲不振お よび急性期タンパク質の刺激。

共通の炎症特性に加えて、（１）ＩＬ−１およびＴＮＦを同じ炎症刺激に応答さ せて合成することおよび（２）ＴＮＦ自身カ月Ｌ−１の放出を誘導することがし 察され、それは２つのサイトカイン系の間に密接な関係か存在することを示す。

実際、ＩＬ−１とＴＮＦとの組合せ刺激のｔ目乗効果が、多（の炎症の実験系に おいて観察された。相乗効果は組合せた２つの薬剤の効果がそれらの個々の効果 の総和より大きい場合に起こると定義される。例えば、最大下（ｓｕｂｍａｘｉ ｍｕｍ）投与量のＩＬ−１およびＴＮＦをウサギ腺関節に注射すると結果、多形 核好中球の蓄積の面で著名な相乗が得られた（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｂ、、　Ｃ しｎ、Ｅｘ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７５＋３０６−３１０（１９８９））。さら に、個々には半致死量の投与量でのＩＬ−１およびＴＮＦのマウスへの組合せ投 与は、１００％のマウスに致死の敗血症性ンコ、り様症状の相乗的な誘導を引き 起こす（Ｅｖｅｒａｅｒｄｔ。

Ｂ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、１６３：３ ７８（１９８９）＋Ｗａａｇｅら、Ｌ」」二ヱリー１６７：１９８７−１９９２ （１９８８））。従って、疾病状態における場合、ＩＬ−１およびＴＮＦの両方 は相乗的な相互作用を介して十分な病理学的応答を引き出すのに必要とされ、従 ってＩＬ−１インヒビターまたはＴＮＦインヒビターのいずれかの投与は炎症応 答を最大限に阻害するのに十分であると考えられた。

＆胛旦！互 本発明に関する驚くべき不測の結果の発見は、ＩＬ−１媒介疾患およびＴＮＦ媒 介疾患の治療におけるいくつかの場合に、相加的たけてはなく相乗的にも作用す るＩＬ−１インヒビターおよびＴＮＦイノヒビターの能力である。従って、本発 明は投与の必要な被験体に治療効果のある量のＩＬ−１インヒビターおよびＴＮ Ｆインヒビターの組合せを投与することによる、ＩＬ−１媒介疾患およびＴＮＦ 媒介疾患の予防および治療の方法に関する。さらに詳細には、本発明はＩＬ−１ およびＴＮＦの両方に媒介される特定の疾患および医学的な症状（多くは炎症性 疾患として特徴付けられ得る）の治療の方法に関する。本発明の方法に従って治 療され得る適用には、敗血症性ショック、関節炎、炎症性腸疾患、成人呼吸促進 症候群、肺繊維症、虚血性障害、および再潅流障害（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　 １ｎｊｕｒｙ）がある。

本発明で用いられ得るＴＮＦインヒビターは天然に見出されるタンパク質および 天然に見出されるタンパク質の切断型である。治療される被験体において不測の 副作用を生じる危険が比較的低いため、天然に見出されるタンパク質は有用であ る。

本発明の他の実施態様において、天然タンパク質の配列とは少数のアミノ酸残基 のみが異なるＴＮＦインヒビターの変異タンパク質もまたＴＮＦインヒビターと いう。

ＴＮＦインヒビターは、ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性フラグメントであ り得る。本発明において有用なＴＮＦインヒビターは、ヒトＴＮＦ結合タンパク 質（ＴＮＦｂｐ）、特に例えば３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターおよび４０ｋＤ ａ　ＴＮＦインヒビターを包含する、ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性フラ グメントを包含する。４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは、全長の４０ｋＤａ　 ＴＮＦインヒビター、または切断型の４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５１お よび４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５３であり得る。例えばポリエチレング リコール（ＰＥＧ）または他のあらゆる反復ポリマーの付加により修飾されて、 その循環半減期が増加および／または免疫原性が減少したタンパク質もまた有用 である。ＴＮＦに対するレセプターアンタゴニストとして作用する丁ＮＦインヒ ビターもまた本発明の範囲に含まれる。

ＴＮＦインヒビターの生成はヒト尿からの単離のような天然に得られる材料から の抽出により達成され得るが、ＴＮＦインヒビター生成の好ましい方法は組換え ＤＮＡ技術による。組換えＤＮＡ技術は、比較的大量のＴＮＦインヒビターを高 純度で生成し得るので幾分好ましい。

さらにＴＮＦインヒビターは、３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの選択されたア ミノ酸が７ステインで置換される３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの変異タンパ ク質を包含する。そのような変異タンパク質はＴＮＦインヒビターとして使用さ れ得るか、またはそれらをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させてＴＮ ＦインヒビターＰＥＧ化合物を形成し得る。この化合物は、１分子あたり１つま たは２つのＴＮＦインヒビターを含む。好ましい実施態様では、ＴＮＦインヒビ ターは変異３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターと二官能性ＰＥＧ前駆体との間の反 応で形成された二価の種である。好ましい変異タンパク質はＣｌＯ３３０ｋＤａ 　ＴＮＦインヒビターであり、３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの１０５位の残 基がシスティン残基に置換する。

本発明で有用なＩＬ−１インヒビターはタンノくり質でり、さらに詳細には天然 に見出されるタン／ｆり質である。天然に見出されるタンパク質は、治療される 被験体において不測の副作用を生じる危険が比較的低いため特に有用である。

有用なりラスのインターロイキン−１インヒビターは、天然インターロイキン− ルセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）として作用するヒトタンパク質であ る。好ましくは、本発明の実施において好ましいＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａ α、ＩＬ−１ｒａβ、ＩＬ−１ｒａｘ、またはこれらのＩＬ−１ｒａのＮ−末端 メチオニン誘導体からなる群より選択される。例えば、ポリエチレングリコール （ＰＥＧ）または他の反復ポリマーの付加により修飾されて、それらの循環半減 期が増加および／またはそれらの免疫原性が減少したタンパク質もまた好ましい 。

ＩＬ−１ｒａの生成は、培養ヒト単球の調製培地からの単離によるように、天然 に得られる材料からの抽出により達成され得るが、ＩＬ−１ｒａ生成の好ましい 方法は組換えＤＮＡ技術による。組換えＤＮＡ技術は、比較的大量のＩＬ−１ｒ ａを高純度で生成し得るので幾分好ましい。

本発明はまた、治療法に用いる薬学的に受容可能なキャリア中に、Ｉし一１イン ヒビター（特に組換えヒトＩＬ−１ｒａ）およびＴＮＦインヒビターを含む薬物 組成物に関する。

図面の簡単な説明 図１は、ＬＰＳ誘導性再活性化後７２時間の関節の直径における最大増加を示す （＊＝片側（ｕｎｐａｉｒｅｄ）　を検定による以下の間の有意な差異、ＴＮＦ ｂｐ＋　ＩＬ−１ｒａ対溶媒（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ｐ（０，０２５；ＴＮＦｂｐ ＋ＩＬ−１ｒａ対ＴＮＦｂｐ、　ｐ＜０．０２５　；およびＴＮＦｂｐ＋ＩＬ− １ｒａ対ＩＬ−１ｒａ、　ｐ＜０．０１０）。

発明の詳細な説明 上記のように、本発明はＩＬ−１媒介疾患およびＴＮＦ媒介疾も（こ冒された被 験体においてその疾患を予防および治療する方法に関する。この方法は、治療効 果のある量のＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターをＴＮＦ媒介疾患 またはＩＬ−１媒介疾患（こ冒された被験体に投与することを包含する。理論に 限定されないが、ＴＮＦ　ｔｊよびＩＬ−１の間に存在することが知られて０る 相互関係は、全てではなくともほとんどのＴＮＦ媒介疾叡はまたＩＬ−１媒介疾 患でもあることが見出され、逆もまた真であることを示唆する。

上記のように、ＴＮＦインヒビターがＴＮＦ媒介疾患を予防または治療するのに うまく用いられ得ること、および、ＩＬ−１インヒビクーがＩＬ−１媒介疾患を 予防または治療するの（こうまく用いられ得ることが知られている。本発明者ら により発見された驚くべき不測の結果は、ＩＬ−１媒介疾患およびＴＮＦ媒介疾 患の治療において相乗的に作用するＩＬ−１インヒビターおよびＴＮＦイノヒビ ターの能力である。本明細書中の「相乗約６こ」（マ、インヒビターの組合せ投 与により示された利益が組合せの成分の個別の投与の結果得られた効果の総和よ り犬き０状況を０うのに用いる。

本発明はヒトの疾患の予防および治療の方法（＝関する力（、カイダンスが一般 的な病理学的用途（こ提供されるため、獣医学的な用途もまた本発明の範囲に含 まれる。

自然発生的な疾患または実験的な疾患が体内の疾患または兆候の焦点付近の体液 または組織中のＴＮＦの上昇レベルと関連付けられる場合、疾患または医学的な 症状はｒ　ＴＮＦ媒介疾患」であると考えられる。ＴＮＦ媒介疾患はまた次の２ 条件により認められ潟る：（１）疾患と関連した病理学的所見が、ＴＮＦの投与 により動物で実験的に似せ得る；および（２）疾患の実験動物モテルにおいて誘 導される病因がＴＮＦの作用を阻害する薬剤での治療により阻害または廃止され 得る。多くのＴＮＦ媒介疾患はこれらの３条件の内２つを満足し、そして池は３ つ全ての条件を満足する。ＴＮＦ媒介疾患の限定されないリストは、成人呼吸促 進症候群、肺繊維症、関節炎、炎症性腸疾患、および敗血症性／ＩＩ／りを含む 。

自然発生的または実験的である、疾患または医学的な症状が体液または組織中の ＩＬ−１の上昇レベルと関連付けられる場合、あるいは、体内から得られた細胞 または組織が培養中のＩＬ−１の上昇レベルを生じる場合、疾患または医学的な 症状は「イノターロイキン−１媒介疾患」であると考えられる。多くの場合、そ のようなインターロイキン−１媒介疾患はまた、次の２条件により認識される： （１）疾患または医学的な症状と関連する病理学的所見が、ＩＬ−１の投与によ り動物で実験的に似せ得る；および（２）疾患または医学的な症状の実験動物モ デルにおいて誘導される病因が、ＩＬ−１の作用を阻害する薬剤での治療により 阻害または廃止され得る。はとんどの「インク−ロイキン−１媒介疾甲」では３ つの条件の内少なくとも２つが適合し、そして多（の「インターロイキン−ｌ媒 介疾患」では３つ全ての条件が適合する。インターロイキン−ｌが媒介する疾患 または医学的な症状のリストは、関節炎、炎症性腸疾患、敗血症性ノーミック、 虚血性障害、再潅流障害骨粗髪症、喘息、イン／ニリン糖尿病、骨髄性白血病お よび他の白血病、乾１、および悪液質／食欲不振を含むが、それに限定されない 。

天然に見出されるインヒビタータンパク質は、それにより治療される彼験体にお いて不測の、そして望ましくない病理学的副作用を生じる危険が比較的低いため 幾分好ましい。

明細書および請求の範囲の目的のために、そのタンパク質または実質的に等しい タンパク質が、健常なヒトに通常存在することが見出され得る場合に、タンパク 質は「天然に見出される」であると考えられる。「天然に見出される」タンパク 質は特に、健常なヒト中ではグリコ／ル化された型で存在するタンパク質の非グ リコジル化型に加え、健常なヒトに存在することが分かったタンパク質の、その ようなタンパク質のカルボキシル末端で部分的に切断される形態を包含する。

「天然に見出される」タンパク質は、組換えＤＮＡ法および普通にそれらを生成 する細胞からの単離により得られ得る。「天然に見出される」はまた、Ｉ：、ｃ ｏｌｉの発現の結果のようにＮ末端メチオニン基を含むタンパク質も包含する。

明細書および請求の範囲にわたって用いられる［実質的に同じ」は、非常に高度 のアミノ酸残基ホモロジーを有すること、および、同等の生物学的活性を有する ことを意味すると定義される（一般的にＭ、　Ｄａｙｈｏｆｆ、狂１ａｓ刀コニ 虹虱り士団徨肚ｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　５巻、１２４ページ、（１ ９７２）　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆ ｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，、本明細書中に参照と して特に援用した）を参照）。

本発明で有用なＴＮＦインヒビターは、ＴＮＦの結合タンパク質としてインビボ で存在する天然に見出されるタンパク質であり、ヨーロッパ出願第９０１１３６ ７３．９号の［腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビターおよびそれを得る方法」、 １９９０年７月１７日出願、に記載され、この開示内容は本明細書に参考として 援用されている。

２つの異なる型の好ましいＴＮＦインヒビターがあり、それぞれヨーロッパ出願 第９０１１３６７３．９号で開示および記載されている。これらのうち第一の型 は、３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターであり、ヒトＵ９３７細胞により調整され た培地およびヒト尿から同定され、単離されている。３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒ ビターは、５ＤＳ−ＰＡＧＥでおよそ３０ｋＤａであり、トリス緩衝液（ｐＨ７ ，５＞中の約８０ミリモルのＮａＣ１でＤＥＡＥ　ＣＬ６Ｂカラムから溶出され る。　３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは、ＴＮＦαの活性を阻害し、ＴＮＦβ の活性にはほとんど影響しないことが示された。天然に見出されるタンパク質は グリコリル化されている。非グリコジル化３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターもま たＴＮＦ阻害活性を示す。

ＴＮＦインヒビターの第二の型は、　４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターであり、 これもまた、少なくともヒトυ９３７細胞により調整された培地およびヒト尿か ら同定され、単離されている。全長の４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは糖タン パク質であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥでおよそ４０ｋＤａてあり、トリス緩衝液（ｐ Ｈ７，５）中の約１００ミリモルのＮａＣ１でＤＥＡＥカラムから溶出される。

この４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターはＴＮＦαおよびＴＮＦβの両方の活性を 阻害することが示されている。非グリコリル化タンパク質はＴＮＦ阻害活性を示 す。

４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの３つの型が、Ｅ、ｃｏｌｉ、中の発現により 組換え生成された。これらの型のそれぞれは、全長４０ｋＤａ　ＴＮＦイノヒビ ター、４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５１、および４０ｋＤａ　ＴＮＦイノ ヒビターΔ５３と呼ばれ（ヒトＵ９３７細胞により調整された培地およびヒト尿 より単離されたグリコ／ル化全長４０ｋＤａ　ＴＮＦイノヒビターとともに、グ リコリル化型および非グリコジル化型で、その全ては本明細書中ではひとまとめ にして４０ｋＤａ　ＴＮＦイノヒビターと呼ばれる）、これらはヨーロッパ出願 第９０１１３６７３．９号に記載される。Δ５１タンパク質は、天然タンパク質 の切断型であり、成熟タンパク質のカルボキシル末端で５１個のアミノ酸残基か 切り離されている。Δ５３タンパク貫は、成熟タンパク質の切断型であり、天然 タンパク質のカルポキ／ル末端で５３個のアミノ酸残基が切り離されている。

天然に見出される４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター（グリコリル化）および非グ リコ／ル化インヒビター（天然全長（口ａｔｉｖｅ　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ） 、Δ１５およびΔ５３）は実質的に同じＴＮＦ阻害活性を有する。

３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターおよび４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの両方 をコードする遺伝子の核酸配列およびこれらのタンパク質のアミノ酸配列は、ヨ ーロッパ出願第９０１１３６７３．９号に示されている。本発明は、上記のよう に、ＴＮＦインヒビターの非グリコジル化型および天然に見出されるタンパク質 の特定の切断型を含む。さらなる実施態様では、ＴＮＦインヒビターは、下記の ように１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の反復ポリマー部 分の結合により修飾される。

ＴＮＦインヒビターを生成する方法もまたヨーロッパ出願９０１１３６７３．９ 号に開示される。１つの開示された方法は、ヒト尿およびヒトＵ９３７細胞によ り調整された培地のような種々の材料からインヒビターを単離することも包含す る。第二の開示された方法は、インヒビターをコードする遺伝子を単離し、適切 なベクターおよび細胞型に遺伝子をクローニングし、そして遺伝子を発現させて インヒビターを生成することを包含する。後者の方法は、一般的に典型的な組換 えＤＮＡ方法であり、本発明の好ましい方法である。組換えＤＮＡ方法は、より 高い純度で比較的多量を得ることができるため幾分好ましい。

好ましくは、上記のＴＮＦインヒビターは、上記の方法により「実質的に純粋な 」型で生成される。「実質的に純粋な」により、イノヒビターは、非修飾型にお いて、比較的高い比活性を有することを意味する。しかし、ＴＮＦインヒビター の誘導体は異なる比活性を有し得ることが理解されるべきである。

さらに、ＴＮＦインヒビターは、ＴＮＦレポータ一部位についてＴＮＦと競合し 得る化合物を包含する。そのような化合物はレセブタ−アンタゴニストを包含す る。他のＴＮＦインヒビターは、インビボでＴＮＦの合成または細胞外放出を妨 害する化合物およびタンパク質を包含する。そのような化合物は、ＴＮＦ遺伝子 の転写または翻訳あるいはＴＮＦプレタンパク質のプロセッシングに影響する因 子を包含する。

本発明の特に好ましいＩＬ−１ｒａは天然に見出されるタンパク質であり、イン ターロイキン−１の制御因子としてインビボで存在する。これはＨａｎｎｕｍら により米国特許第５，０７５．２２２号、「インターロイキン−１インヒビター 」にすでに記載されている。この米国特許は、本明細書では°２２２特許という が、参考として本明細書中に特に援用する。

３つの好ましいＩＬ−１ｒａ型は、それぞれは同じＤＮＡコード配列由来である が、°２２２特許に開示および記載される。これらのうち第一の型の比−１ｒａ αは、およそ４８の等電点を有する、５ＤＳ−ＰＡＧＥで２２−２３ｋＤａの分 子であり、トリス緩衝液（ｐＨ７，６）中の５２ｍＭのＮａＣ１あたりでＭｏｎ ｏＱ　ＦＰＬＣカラムから溶出される。第二の型のＩＬ−１ｒａβは、２２−２ ３ｋＤａのタンパク質（ｐ、ｌ＝４．８）であり、ＭｏｎｏＱカラムから６ｈＭ のＮａＣ１で溶出される。第三の型のＩＬ−１ｒａＸは、２０ｋＤａのタンパク 質であり、ＭｏｎｏＱカラムから４８０１ＭのＮａＣ１で溶出される。これらの インターロイキン−１インヒビターの３つ全てが、類似の機能活性および免疫活 性を有する。

本発明はまた、修飾ＩＬ−１ｒａも包含する。１つの実施態様では、ＩＬ−１ｒ ａは、下記のように、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の 反復ポリマー部分の結合により修飾される。

池の実施態様では、ＩＬ−１ｒａは、Ｅ、ｃｏｌｉでの発現の結果としてのＮ− 末端メチオニン基を含む。

これらのＩＬ−１インヒビター、特にＩＬ−１ｒａ、を生成する方法もまた、° ２２２特許に開示される。１つの開示された方法は、ヒト単球（天然に生成され る）からインヒビターを単離することを包含する。第二の開示された方法は、イ ンヒビターをコードする遺伝子を単離し、適切なベクターおよび細胞型に遺伝子 をクローニングし、遺伝子を発現させてインヒビターを生成し、そしてイノヒビ ターを採取することを包含する。後者の方法は、一般に典型的な組換えＤＮＡ方 法であり、本発明の好ましい方法である。組換えＤＮＡ方法は、より高い純度で 比較的多量を得ることができるため幾分好ましい。

さらに、インターロイキン−１インヒビターは、ＩＬ−１への細胞性レセプター の活性化を特異的に妨害し得る化合物を含む。そのような化合物は、可溶性レセ プターおよびモノクローナル抗体のようなＩＬ−１結合タンパク質を包含する。

そのような化合物はまた、レセプターアンタゴニストおよびレセプターに対する モノクローナル抗体を包含する。

ＩＬ−１ｒａの第二のクラスは、インビボでの合成および／またはＩＬ−１の細 胞外放出を妨害する化合物およびタンパク質を包含する。そのような化合物は、 ＩＬ−１遺伝子の転写またはＩＬ−１プレタンパク質のプロセッシングに影響す る因子を包含する。

特定の条件下で、ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１誘導性ＩＬ−１生成を妨害する。

好ましくは、上記のＩＬ−１ｒａは、上記の方法により「実質的に純粋な」型で 生成される。「実質的に純粋な」により、インヒビターは、非修飾型において、 比較的高い比活性、好ましくは約１５０．　ｏｏｏ−ｓｏｏ、　ｏｏｏレセプタ ー単位／ｆｆ１ｇの範囲、を有することを意味する。この範囲は、ｔｌａｎｎｕ ｍら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：３３６−３４０（１９９０）、および、Ｅｉｓｅ ｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：３４１−３４６（１９９０）で定義され 、両方とも本明細書に参考として特に援用される。しかし、ＩＬ−１ｒａインヒ ビターの誘導体は異なる比活性を有し得ることが理解されるべきである。

修ｖ５ＴＮＦおよびＩＬ−１インヒビターもまた、本発明の範囲に含まれる。修 飾インヒビターは、例えば、そのシスティン残基が天然に見出されるインヒビタ ーのアミノ酸配列の１つ以上の部位でアミノ酸に置換されるようなイノヒビター の変異タンパク質を包含する。次いで、そのような変異タンパク質、は機能化ポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニットまたは他のスルフヒドリル含有ポリエ ーテルと部位特異的に反応させ、ＴＮＦインヒヒターＰＥＧ種またはＩＬ−１イ ンヒビタ−ＰＥＧ種を生成し得る５ＰＣＴ公開公報番号ｗｏ　９２／１６２２１ （参考として本明細書に援用する）は、多くの修飾したＴＮＦインヒビタ一種お よびＩＬ−１インヒヒタ一種ならびにそのようなＰＥＧ修飾インヒビターを生成 する方法を開示する。３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの１０５位でアスパラギ ンがシスティンと置換されている３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター変異タンパク 質（本明細書中ではｒｃ１０５変異タンパク質」または−ｃｔｏｓｒと呼ぶ）は 、特に有用である。さらに１つの実施態様では、変異タンパク質は二官能性ＰＥ Ｇユニットと反応し得、二価の「唖鈴」種を形成する。ここで２つのサイトカイ ン種は、一本鎖のＰＥＧ鎖を介して結合し、例えば２つのＣｌＯ３変異タンパク 質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、特に約２０．０００の分子量を有 するＰＥＧ、に結合する。

好ましいイノヒビターの阻害機能は、１つ以上の別個の分離可能な部分により分 けて与えられ得るため、本発明の方法は、インターロイキン−１またはＴＮＦ阻 害を制御するＴＮＦインヒビターまたはＩＬ−１インヒビターの部分を活性成分 として有する治療組成物を投与することにより実施され得ることもまた推察され る。

本発明の治療組成物は、注射により非経口的に投与され得る。しかし、関節内注 射、吸入剤ミスト、経口活性処方物、経皮イオン導入法、または坐剤のような他 の有効な投与剤形もまた推察される。１つの好ましいキャリアは生理的食塩水溶 液であるが、他の薬学的に受容可能なキャリアもまた用いられ得ることが予期さ れ得る。

１つの実施態様では、キャリアおよびＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒ ビターは、生理的に適合性であり、遅延放出性の処方物を構成することが推察さ れる。そのようなキャリア中の基本の溶媒は、天然では水系または非水系であり 得る。

さらにそのキャリアは、処方物のｐＨ、モル濃度、粘稠度、透明度、色調、無菌 性、安定性、分解の速度、または香りを改変または維持するための他の薬学的に 受容可能な賦形剤を含み得る。同様に、そのキャリアは、ＴＮＦインヒビターお よび／またはＩＬ−１インヒビターの安定性、分解の速度、放出、あるいは吸収 のための、さらに他の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。そのような賦形剤 は、通常または習慣的に、単位投与量または複数投与量のいずれかで、非経口投 与の投与量を処方するために用いられるそれらの物質である。

一度治療組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、あるいは 乾燥粉末または凍結乾燥粉末として無菌のバイアルに保存され得る。そのような 処方物は、使用可能な型または投与の直前に再生を必要とするかのいずれかで保 存され得る。そのような処方物の好ましい保存は、少なくとも４℃程度の低い温 度であり、そして好ましくは一７０℃である。そのようなＴＮＦインヒビターお よびＩＬ−１インヒビターを含む処方物を、生理的ｐｌ＋でまたはその付近で保 存し、投与することが好ましい。高ｐＨ（すなわち８より高い）または低ｐｌ＋ （すなわち５未満）での処方における投与は好ましくないと現在考えられている 。

好ましくは、全身送達のためのＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビター を含む処方物を投与する様式は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または膣また は直腸の坐剤を介する。好ましくは、局所送達のためのＴＮＦインヒビターおよ びＩＬ−１インヒヒターを含む処方物の投与様式は、関節内、気管内、雌部注入 または気道への吸入を介する。さらに、消化管の特定の部分に、適切な処方また はデバイス中のＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒヒターの経口投与、あ るいは坐剤または浣腸のいずれかにより、ＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−ビン ヒビターを投与することが望まれ得る。

ＴＮＦ媒介疾患およびＩＬ−１媒介疾患を治療するさらに好ましい形態では、初 め１ニーＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターの静脈内のポーラス注 射を行った後、次いでＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターを持続的 に静脈内注入する。

敗唾症性ショックの治療の開始は、敗血症または敗血症の可能性が診断された後 できるだけすぐに開始するべきである。

例えば、治療は、手術または事故または敗血症性ショックの開始の危険性をもた らし得る他の出来事に続いてすぐ始められ得る。

ＴＮＦ媒介疾患またはＩＬ−１媒介疾患の治療、およびさらに特に関節炎の治療 の好ましい形態は以下を含む：（１）関節炎の再発の予防または治療に必要であ るとして定期的に行われるＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターの一 回の関節内注射：および（２）ＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビター の定期的な皮下注射。

ＴＮＦ媒介疾患またはＩＬ−１媒介疾患の治療およびさらに特に成人呼吸促進症 候群の治療の好ましい形態は以下を含む：　１）ＴＮＦインヒビターおよびＩＬ −１インヒビターの１回または数回の気管内投与：および２）ＴＮＦインヒビタ ーおよびＩＬ−１インヒビターのポーラスまたは持続的な静脈内注入。

ＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターを含む特定の処方物は経口的１ こ投与されるべきであることもまた考えられる。

好ましくは、このように投与されるＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビ ターはカプセル化されている。カプセル化ＴＮＦインヒヒターおよびＩＬ−１イ ンヒビターは、固体の剤形の調剤で習慣的に用いられるそれらのキャリアととも に、あるいはキャリアなしで処方され得る。好ましくは、カプセルは、生物学的 利用率が最大になり、そして全身にゆきわたる前の分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍ ｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小となる場合、処方物中の活性部分が胃腸 管中のその地点で放出されるように設計される。添加の賦形剤が、ＴＮＦインヒ ビターおよびＩＬ−１インヒヒターの吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤 、アレーンくリング、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、 および結合剤もまた用いられ得る。

投与の様式に関わらず、およそ被験体の体重に従って特定の投与量が計算される 。ある実施態様では、投与は、被験体の血流中であらかじめ選択した濃度範囲の ＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターにするように設計される。Ｏ， Ｏ１ｎｇ／ｆｆ１ｌ血漿未満のＴＮＦインヒヒターおよびＩＬ−１インヒビター の循環濃度の維持は、効果的な組成物ではあり得ないと考えられる。ＩＯμｇ、 ’＋ｎｌを超える循環レベルの長期の維持は、望ましくなし１副作用を有し得る 。

さら１こ、上記の処方物のそれぞれを含む治療のｊこめの適正な投与量を決定す るのに必要な精妙な計算は、当業者冬こよりルーチン的に行われ、そして必要以 上に実験を行うことな（（特に本明細書で開示された投与量の情報およびア・ン セイの観占で）、当業者によりルーチン的に行われる手始めの仕事の中に含まれ る。これらの投与量は、適正な用員一応答データと組合せて、用いられる投与量 を決定するための確立されたアッセイの使用により確認され得る。

本明細書中に記載されたＴＮＦインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターの処方 物は、ヒトの適用と同様に獣医用）こも用０られ得ること、そして用語「被験体 」は限定したように解釈されないことに注意するべきである。獣医用の適用の場 合で（ま、投与量の範囲は上記で特定したのと同じである。

インターロイキンールセブターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）および腫瘍壊死 因子結合タンノくり質（ＴＮＦｂｐ）は、ＩＬ−１およびＴＮＦにより媒介され る炎症性疾患の治療用に開発されｔ二。２つの実験系、ラットにおける慢性関節 リュウマチおよびヒビ（こおける敗血症性ショック、において、ＩＬ−１まｔこ （ま’ＴＮＦの（１ずれかのみの作用の遮断は、炎症性応答をかなり阻害するの １二十分であった。げつ歯頚の関節炎において、関節腫脹（よ、ペプチドグリカ ン−多糖（ＰＧ／ＰＳ）によって誘導される再活性イし関節炎に冒されたラット において、ＩＬ−１ｒａまたはＴＮＦｂｐのｔ〜ずれ力λ単独の投与により最大 限に阻害された。敗血症性ツク・ツク１こおいて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉで感染させたヒビ１よ、ＩＬ−１ｒａまたはＴＮＦｂｐのいずれか単独の 投与により、致死率および血流力学友化に対して同様の程度に防御された。

いずれかのインヒビターの単独投与の有効な効果を示す実験系でのこれらの結果 は、ＩＬ−１およびＴＮＦの間の相乗的な相互作用が十分な病理学的応答を引き 出すのに望ましいこと、および、これらのキーメディエータ−の１つの作用の阻 害が炎症プロセスの程度を最大限に低下させるのに十分であることを示唆する。

ＩＬｉｒａまたはＴＮＦｂｐのいずれかの単独の投与は、ＩＬ−１媒介疾患およ びＴＮＦ媒介疾患の他の動物モデルにおいて炎症効果を最大限に低下させるのに 十分であること、および、上記インヒビターの組合せ投与は特別な利点を与えな いことが考えられた。しかし、予期されないことに、ＬＰＳ再活性化関節炎、Ｌ ＰＳ刺激性肺胞炎、およびＬＰＳ刺激性全身性炎症応答に冒されたラットのＩＬ −１ｒａおよびＴＮＦｂｐの組合せでの治療は、それぞれ関節腫脹、気管支肺胞 の好中球放出、および致死率に相乗的に阻害効果を引き起した。以下の実施例は 、慢性関節リュウマチ、成人呼吸促進症候群（＾ＲＤＳ）、および敗血症のよう なＩＬ−１媒介炎症性疾患およびＴＮＦ媒介炎症性疾患をＩＬ−１ｒａおよびＴ ＮＦｂｐでの組合せ治療により治療する方法を記載する。

以下の実施例は本発明を例示する事を意図し、限定するものではない。

実施例１ 本実施例は、ＬＰＳ誘導性のＳＣｖ誘導性関簡炎の再活性化における１ｌ−１ｒ ａおよびＴＮＦｂｐの組合せ治療の相乗効果を示す。

慢性関節リュウマチおよび関連の関節炎の病因の現在の理論は、免疫学的媒介関 節炎症の２つの可能性のあるメカニズムを仮定する　（ａ）関節に局在する微生 物成分、または（ｂ）関節性自己抗原。Ｗｉｌｄｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉａ＋ｅｎ ｔａｌ＾ｎ１ｉａＬ　Ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ａｒｔｈｒｉｔｉ ｓ、　２つの微生物成分（リポ多糖（ＬＰＳ）およびペプチドグリカン−多糖（ ＰＣ／ＰＳ乃により誘導される慢性関節リュウマチの動物モデルを用いて、関節 炎の治療にヒト組換え３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター（ｈｒＴＮＦ／１ｎｈ３ ０）およびヒト組換えＩＬ−ルセプターアンタゴニスト（ｈｒｌＬ−１ｒａ）を 用いる組合せ治療の使用を研究した。Ｒ，Ｌ、Ｗｉｌｄｅｒ、　Ｉｍ＋＋＋ｕｎ ｏ　ａｔｈｏ　ｅｎｅｔｉｃ　ＭｅｃｈａｎｉｓｎｓＯ［へｒｔｈｒｉｔｉｓ、 　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞壁誘導性関節炎に関する、１９章ｒＥｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔａｌ　ＡｎｉＩＩＩａｌ　１ｌｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｎｉｃ ＾ｒｔｈｒｉｔｉＳ」によると、［実験的関節疾患の臨床的、組織学的、および 放射線学的特徴は、成人および若年性関節炎で観察される特徴に密接に類似して いる。」 次の実験において、Ｓｃｈｗａｂ、Ｅｘ　ｅｒｉｌＩｌｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃ ｉｎｅ、　１６８訃１７０２、　（１９８７）に記載の動物モデルを用いて正常 ラットの足根の関節に関節炎を誘導した。簡単にいうと、関節炎を２つの微生物 成分の順次投与により誘導した。（１）まず、ペプチドグリカン−多糖（ＰＧ／ ＰＳ）を含む５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞壁（ＳＣｆ）生成物を関節内に注 射し、そして（２）２１日後に５ａｌａ＋ｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｒｌｕｒｉｕ それぞれ１４０−１６０ｇの重さのＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖ ｅｒ）ｌ：は、足首の関節へ関節あたり３μｇのラムノース投与量でＳＣｆを関 節内注射した。生理食塩水を反対側性の関節に注射してコントロールを提供した 。ＳＣＷの関節内注射は、注射後１〜２日でピークをむかえる関節の腫脹を伴う 、比較的短期間の急性関節炎を引き起こす。急性炎症反応がおさまる２０日間の 後、リポ多Ｗ　（ＬＰＳ）を４５μｇ／ラットの投与量で静脈注射により投与し た。その投与量のＬＰＳはあらがじめｓｃｗを注射した足首の関節で炎症を十分 に再活性化し、生理食塩水を注射した足首においてはほとんど効果がながった。

ＬＰＳの静脈注射後７２時間の炎症の程度を評価するために、足首の関節の面積 を関節炎の再活性化後０１２４．３６．４８、および７２時間で１ｌｌｌｌ定し た。

単独および組合せで投与された場合の、ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの効果を 、関節炎の活性化の間の関節腫脹の発達について試験した。インヒビターおよび 溶媒をＬＰＳの静脈内注射に関して０．２．６．１２．１８．２４．３０．３６ 、および４２時間で首の背部で皮下に投与した。第一の実験において、ラットを 以下のように処置した 第１群−溶媒（クエン酸ナトリウム、ＮａＣ１、およびＥＤＴ＾）第■群−ＩＬ −１ｒａ（２ｍｇ／ｋｇ）第一　！Ｊ　−ＴＮＦｂｐ（１＋＋＋ｇ／ＪＨ）第■ 群−ＩＬ−１ｒａ（２ｍｇ／ｋｇ）　＋　ＴＮＦｂｐ（１１ｒ１ｇ／ｋｇ）再活 性化後７２時間の関節の直径における最大の増加を表１に示す。その結果により 、ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの組合せ治療はＬＰＳ再活性化関節炎において さらに阻害効果を引き起こしたことが示される。ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐ 単独ではそれぞれ３１％および１６％で関Ｂ＠脹を阻害したが、組合せ治療は４ １％で腫脹を阻害した。

（以下余白） Ｂ、友！ユ 第二の実験において、インヒビターをＬＰＳ誘導性再活性化後、０．２．６．１ ２．１８．２４．３０．３６、および４２時間に皮下注射により単独および組合 せで再び投与した。ＩＬ−１ｒａの投与量は実験ｌで用いた投与量に比較して減 少した。一方ＴＮＦｂｐの投与量は変更しなかった。ラットは以下のように処置 した：第夏群−溶媒 第■群−ＩＬ−１ｒａ（０，１ｍｇ／ｋｇ）第■群−ＴＮＦｂｐ（１ｍｇ／ｋｇ ） 第■群−ＩＬ−１ｒａ（０，１ｍｇ／ｋｇ＞　＋　ＴＮＦｂｐ（ｌＩ１ｇ／ｋｇ ）表２に第１群、第■群、第■群、および第■群のう、トの関節の直径における 変化の時間経過を示す。ラットの関節腫脹は比−１ｒａおよびＴＮＦｂｐ単独で の治療の関節腫脹における効果の欠失に比較して、ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂ ｐの組合せ治療により減少した。組合せ治療の相乗的な阻害効果は図１および表 ３に明確に示される。図１に、ＬＰＳ誘導性再活性化後７２時間の関節の直径に おける最大の増加を示す。ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの組合せ治療は関節腫 脹の有意な抑制（３５％）を引き起こしたが、いずれかの薬剤単独での治療は有 意な減少は引き起こさながった。表３で、表２にあげた値についての曲線下面積 （直径変化（ｎ＋ｍ）対時間（ｈｒ）ｌ　を示す。再活性化の７２時間でＩＬ− １ｒａおよびＴＮＦｂｐでの組合せ治療は全体的な関節腫脹に有意な減少（５３ ％）を引き起こし、いずれかの薬剤単独での治療は有意な減少を引き起こさなか った。

表２ ｎ＝１群あたり１４〜１６匹のラット。

表８ ”　ｒＶ　ｖｓ　Ｉ　＋　ｗｍ　３．Ｑ５．　ｐ＜Ｏ，ＯＱ５’　ｒＶ　ｖｓ　 ＩＩ　＋　ｍ　３．３４．　ｐ＜０．００５”　ＴＶ　ｖｓ　ＩｉＩ　＋　−３ ，９８，ｐ＜０．００１（以下余白） 組合せ治療での腫脹の減少を反映する割合は、実験１および２で似ていた（それ ぞれ、４１％および３５〜５３％）。関節腫脹におけるＩＬ−１ｒａおよびＴＮ Ｆｂｐの阻害作用の相乗作用を利用して、実験２で同様のレベルの治療効果が、 ＩＬ−１ｒａの投与量が１０倍減少したにもかかわらず達成された。

実施例■ 本実施例は成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を治療する方法として、ＬＰＳ刺激 性好中球肺胞におけるＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの組合せ治療の相乗効果を 示す。

本実験は敗血症刺激剤のエツトトキシンを用いて急性好中球媒介肺障害を誘導し た。それは本明細書に参考として特に援用したＵｌｉｃｈらのＡｍｅｒｉｃａｎ 　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏ　１３８：１４８５−１４９６（１９ ９１）で開示されたモデルに従った。本モデルは以下のように簡単にまとめられ る：麻酔したラットの気管の中央首部分にエツトトキシンを気管内注射する。６ 時間の潜伏期の後、肺の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を停止の方法として行う。総 および個別の白血球細胞の計数をＢＡＬ液で行う。発熱物質フリーの生理食塩水 の気管内注射により、少数の優勢な肺胞マクロファージ（約９９％）を有するＢ ＡＬ液が生じる。エツトトキシンの気管内注射で、ＢＡＬ細胞および優勢な好中 球数の大きな増加か引き起こされる。肺胞空間への急性好中球の流入は６〜１２ 時間にピークをむかえ、肺胞空間へのタンパク質含有水腫液の蓄積を伴う。ＩＬ −１およびＴＮＦは、エンドトキシンでの刺激後ＢＡＬ液中に存在する。肺胞マ クロファージはサイトカイン合成の材料であると考えられる。さらに外因性］Ｌ −１およびＴＮＦの気管内注射は、急性肺胞内好中球滲出液を誘導し、この滲出 液はエツトトキシンにより誘導される液と質的に同様である。

柿実質の障害の急性期の間の肺水腫変化、リンパ球の隔離、および低酸素血症に 似る多（の動物モデルが、Ｍｕｒｒａｙら、■ｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏ ｒ　Ｒｅｓ　１ｒａｔｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　１３８ニア２Ｏ−７２３（１９９ １）に従ってＡＲＤＳの間に用いられる。ＡＲＤＳの急性型は、敗血症、吸引、 または多くの輸血のような特定の同定できる危険因子の存在下で起こる。現在の 研究は、ＡＲＤＳの病態生理学における好中球媒介障害の主な役割を強調する［ Ｔａｔｅ、υＬ且勉−盈先」工旺虹１２８：５５２−５５９（１９８３）］。活 活性化生中により放出された毒性生成物が肺胞の毛細血管膜を損傷すると考えら れる。損傷した膜の浸透性が大きく増加し、肺胞空間への血漿タンパク質および 炎症性細胞の移動を刺激する。敗血症起源のＡＲＤＳの実験ウノモデルにおいて 、好中球の枯渇が肺障害の発達に対して防御した［Ｈｅｆｌｉｎ、　Ｊ、Ｃｌ１ ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　６８：１２５３−１２６０（１９８１）］。

ラットの好中球性肺胞炎のＴＮＦｂｐ（組換えヒト３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ ター）およびＩＬ−１ｒａ（組換えヒトＩＬ−１ｒａ）の組合せ治療の気管内投 与による治療法を記載する。肺障害は、外科的に曝された気管の中央首領域中の 気管リングの間に進入された２７ゲ一ジ１７２インチの針を通してエンドトキシ ン、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｃｌ吐」工工已由来のリボ多糖（ＬＰＳ）の総量０ ．５ｍｌの無ｍ　ＰＢＳ中の５μｇ／ラットの投与量での投与により誘導された 。接種物をう７トの呼吸の速さおよび深さをモニターしながら気管にゆっくりと 投与した。６時間後、ラットを肺の洗浄を容易にするために開腹を行い得るよう にインフルランで麻酔した。尾静脈の大静脈を切断して肺の血液含量を減少した 。横隔膜を開けて肺を洗浄の間広げ得るようにした。ＢＡＬは、血管カテーテル （ａｎｇｉｏｃａｔｈ　ｃａｔｈｅｔｅｒ）を介して気管支肺胞空間に４０１の ハンクス調製塩溶液（Ｒａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔ ｉｏｎ）を注入して行った。血管カテーテルは、首の中央の気管切開の部位に差 し込み、固定した。炎症性細胞流入を１５０Ｏｒｐｍで１５分間ＢＡＬ液を遠心 して得られた沈殿から回収した。リンパ球の総数をＣｏｕｌｔｅｒカウ／ターで 計数した。多形核好中球の割合を、染色細胞のスライド上で異なる細胞の計数を 手動で行うことにより測定した。

ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの気管支肺胞空間へのＬＰＳ刺激性流入における 効果を、気管内にインヒビターを投与し、同時にＬＰＳの気管内ＩＦ、ａ注入を 行うことにより測定した。ＴＮＦ／ｉｎｈを０．１μｇ／ラット〜１０μｇ／ラ ットの範囲の投与量で１回で投与した。

結果を表４にまとめた。０１ｕｇ／ラットの投与量でのＴＮＦｂｐは肺胞空間へ の好中球の流入を減少しなかった。しかし、２．５μｇ／ラット〜１０μｇ／ラ ットの間の投与量でのＴＮＦ／　ｉｎｈの気管内投与は、３０〜４０％の範囲で 肺胞空間への好中球の流入において最大限の減少を引き起こす。ＩＬ−１ｒａを ０．７５μｇ／ラット〜１０μｇ／ラットの範囲の投与量で投与したく表５）。

０．７５〜２．５μｇの間の投与量でのＩＬ−１ｒａは、肺胞空間への好中球の 流入を減少巳なかった。しかし、５μｇ／ラットおよび１ｏＩ１ｇ／ラットの投 与量でのＩＬ−１ｒａの気管内投与は、それぞれ５７％および４７％の有意な割 合の阻害を引き起こした。

表４ ＢＡＬａ液への好中球の流入の阻害率 ｎ＝１群あたり４〜８゜ 表５ 鈷ｕ容液への好中球の流入の阻害率 ｎ＝１群あたり４〜８゜ 予備実験において、最大阻害用量のＩＬ−１ｒａ（１００μｇ／ラット）および ＴＮＦ／１ｎｈ（１０ｕｇ／ラット）での組合せ治療は、いずれかの薬剤単独の 効果より有意に異ならなかった好中球の流入において阻害効果を引き起こした。

実験１および２において、組合せ治療の効果を、最大下投与量または閣下投与量 のＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ／ｉｎｈを用いて気管支肺胞への好中球流入につい て試験した。実験１において、ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ／　ｉｎｈを次の投与 量でＬＰＳと同時に気管内に与えた： 第１群−溶媒 第■群−ＴＮＦ／１ｎｈ（０，１ｔｔ　ｇ／シラノト）第ｍ　ｕ　−ＩＬ−１ｒ ａ＜２．５μｇ／ラ　ノ　ト）第■群−ＴＮＦ／１ｎｈ（０１ｕ　ｇ／ラ　）　 ト）＋　ＩＬ−１ｒａ（２，５μｇ／ラ　ノド）気管支肺胞空間へ移動した好中 球の数を表６に示す。その結果により、ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ／　ｉｎｈの 組合せ治療がＬＰＳ刺激性好中球肺胞炎においてさらに阻害効果を引き起こした ことが示された。ＴＮＦ／ｉｎｈおよびＩＬ−１ｒａはそれぞれ１９％および２ ９％で好中球流入を阻害したが、組合せ治療は４７％で腫脹を阻害した。

（以下余白） °値は１群あたり６匹のラットについての平均＋標準誤差である。

実験２において、インヒビター（単独および組合せ）を実験ｌのようにＬＰＳ障 害と同時に気管内の経路により投与した。ＩＬ−１ｒａは前の実験において２． ５μｇ／ラットで好中球流入に最大阻害用量を引き起こしたので、ＩＬ−１ｒａ の投与量を閾値下阻害効果を引き出し得る投与量に減少した。その目的は、イン ヒビターが単独では有意な減少を引き出さないが、組み合わせて投与された場合 に相乗作用をするレベルに、投与量を操作することであった。ＴＮＦ／ｉｎｈの 投与量は変えなかった。

第１群−溶媒 第■群−ＴＮＦ／１ｎｈ（０，１μｇ／ラッ　ト）第ｍ群−ＩＬ−１ｒａ（０， ＩＳｕ　ｇ／ラット）第■群−ＴＮＦ／１ｎｈ（０１ｕ　ｇ／ラ　）　ト）＋　 ＩＬ−１ｒａ（０，７５μｇ／ラット）表７に、第１群、第■群、第ｍ群、およ び第■群のう、トの気管支肺胞に移動する好中球の数を示す。好中球流入は、Ｔ ＮＦ／ｉｎｈおよびＩＬ−１ｒａ単独の治療では好中球流入に影響を示さなかっ たのに比較して、ＴＮＦ／ｉｎｈおよびＩＬ−１ｒａの組合せ治療により減少し た。組合せ治療の相加的および相乗的な阻害効果は、急性肺障害における明らか な証拠である。ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ／ｉｎｈの組合せ治療は、４０％の好 中球流入における有意な減少を引き起こしたが、ＴＮＦ／ｉｎｈおよびＩＬ−１ ｒａ単独の治療はそれぞれ１２％および７％であり、好中球流入に有意な減少を 引き起こさなかった。

表７ ゝｒＶ　ｖｓ■＋＃　２．ｇ２．　Ｐ＜０．０２５”ｒＶｖｓＩｎ＋　ｍ２ｊコ 、　ｐ＜Ｏ，Ｑ５実施例■ ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐを個々におよび組合せて試験し、敗血症を誘導す る高用量のエンドトキシンを投与した動物の生存期間の強化における効果を測定 した。この実験系において、う、、ト（ｎ＝６／群）を実施例■の方法に従って ２５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを注射した。ＰＥＧ化した（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ＴＮ Ｆｂｐ（ポリエチレン−２０にでＰＥＧ化した３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター のＣｌＯ３変異タンパク質）または溶媒単独をＬＰＳと同時に静脈注射した。一 方、ＩＬ−１ｒａを表８で同定した投与量で０．４．８．１２、および１８時間 に皮下に注射した。最終生存評価をエンドトキシンの投与後９６時間で行った。

各試験群の生存率もまた表８に与える。その結果により、ＩＬ−１ｒａおよびＴ ＮＦｂｐの組合せは生存の相乗的な強化を生じたが、ＩＬ−１ｒａまたはＴＮＦ ｂｐは単独では十分な防御は行われなかったことが示される。

（以下余白） 表８ 生存率 実施例［Ｖ 特定の症状、例えば敗血症および火傷の被験体のような症状と関係のあるコルチ コステロンレベルの上昇は、これらの症状で観察される免疫抑制効果および悪液 質の効果にかなり寄与すると考えられる。血清コルチコステロンレベルにおける ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの効果を、個々におよび組合せて、ラットにおけ るエンドトキシン誘導性敗血症について測定した。

Ｌｅｗｉｓラットに、実施例Ｈの方法に従って１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを投与し た。実施例■のＰＥＧ化ＴＮＦｂｐ（１，５ｍｇ／ｋｇ）をＬＰＳと同時に静脈 注射した。一方、ｈｒｌｔ、−１ｒａ＜１００ｍｇ／ｋｇ）をエンドトキシンの 投与後０．４．８．１２、および１８時間で皮下注射シタ。

血、ｎコルチコステロンレヘルをコルチコステロター’Ｈ＋ノド（ＩＣＮ　Ｂｉ ｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎ ｉａ）を用（Ｘで、製造者の指示に従ってラジオイノムノア／セイにより２４時 間で試験した。表９にアッセイの結果をまとめる。

表９ ’　ｔ　−ｍ　Ｌ９５．　ｐ＜、０２５　（組合セｖｓ、　ＩＬ−１ｒａ　＋　 ＬＰＳ）ｂｔ瓢７．８５．　ｐ＜、００１　（組合せ　■・ＴＮＲ甲＋ＬＰＳ） ”　ｔ　ｍ　１３．３０．　ｐ＜０．００１　（組合せ　ｖｓ、ｖｅｈｉｄｅ　 ＋　ｕ句表９に示スように、コルチコステロンレベルは、ＩＬ−１ｒａおよびＴ ＮＦｂｐ単独で得られるレベルに比較して、ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦｂｐの組 合せが与えられた動物で有意に減少した。組合せ治療は、ＩＬ−１ｒａおよびＴ ＮＦｂｐとも血清コルチコステロンレベルの減少にさらに影響を引き起こすこと を示した。これらの結果は、組合せ治療が抗免疫抑制効果および抗悪液質効果を 有し得、その結果、敗血症および火傷の被験体の治療のために治療的に有効な方 法となることを示唆する。

実施例Ｖ 血小板数もまた、内毒素血症を誘導するエンドトキシンをｔｔ射しこラットで試 験した。血小板は内毒素血症の間に使い尽くされ、その結果血小板ががなりの減 少することが知られている。

Ｌｅｗｉｓラットに、実施例■の方法に従ってｌＯｎｇ／ｋｇのＬＰＳを投与し た。実施例伍のＰＥＧ化ＴＮＦｂｐ（１，５ａ＋ｇ／ｋｇ）をＬＰＳと同時に各 ラットに静脈注射した。一方、ｈｒｌＬ−１ｒａ（１００ｍｇ７ｋｇ）をエンド トキシンの投与後０．４．８．１２、および１８時間で皮下注射しｔこ。

血小板数を当該分野で既知の標準法に従って２４時間で１ｆｌｌｌ定した（粒子 サイズに基づく自動化カウンター）。表１０にアッセイの結果をまとめる。

（以下余白） 表１Ｏ 皿小板しヘル＝　１０”／　μｌ　＋Ｓ、　Ｅ。

両方の実験において、組合せ治療の値は、ＩＬ−１ｒａまたはＴＮＦｂｐの単独 治療の値とかなり異なる。これらの結果は、内毒素血症の間、組合せ治療が血小 板の消耗を減少することを示唆する。

本発明の上記の記載は、例示および説明の目的のための例である。変更および修 飾が本発明の範囲および趣旨からはずれることなく可能であることは、当業者に 明らかである。次の請求の範囲は、全てのそのような変更および修飾を包含する のを妨げないことが意図される。

＋ＬＬＩＬＬＩＩ　阻喬西凶￥曹 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．治療効果のある量のＩＬ−１インヒピターおよびＴＮＦインヒピターを、そ の必要のある被験体に投与することを含む、ＴＮＦ媒介疾患またはＩＬ−１媒介 疾患である疾患を治療または予防する方法。
2. ２．前記ＩＬ−１インヒピターがＩＬ−１ｒａである、請求項１に記載の方法。
3. ３．請求項２に記載の方法であって、前記ＩＬ−１ｒａが以下からなる群から少 なくとも１つの化合物を含む、方法：ＩＬ−１ｒａα、ＩＬ−１ｒａβ、および ＩＬ−１ｒａｘ。
4. ４．請求項１に記載の方法であって、前記ＴＮＦインヒピターが、以下からなる 群より選択される化合物を少なくとも１つ含む、方法：３０ｋＤａＴＮＦインヒ ピター、４０ｋＤａＴＮＦインヒピター、４０ｋＤａＴＮＦインヒピターΔ５１ 、および４０ｋＤａＴＮＦインヒピターΔ５３。
5. ５．前記ＩＬ−１ｒａがヒト組換えＩＬ−１ｒａである、請求項２に記載の方法 。
6. ６．前記ＴＮＦインヒピターがヒト組換え３０ｋＤａＴＮＦインヒピターである 、請求項１に記載の方法。
7. ７．請求項１に記載の方法であって、前記ＩＬ−１インヒピターがヒト組換えＩ Ｌ−１ｒａであり、そして前記ＴＮＦインヒピターがヒト組換え３０ｋＤａＴＮ Ｆインヒピターである、方法。
8. ８．請求項１に記載の方法であって、前記ＩＬ−１インヒピターおよび前記ＴＮ Ｆインヒピターが薬学的に許容されるキャリア中で投与される、方法。
9. ９．請求項１に記載の方法であって、前記疾患が以下からなる群より選択される 、方法：関節炎、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、虚血性障害、再灌流障害、 骨粗鬆症、喘恩、インスリン性糖尿病、骨髄性白血病、他の白血病、乾癬、成人 呼吸促進症候群、悪液質／食欲不振、および肺繊維症。
10. １０．薬学的に許容されるキャリア中にＩＬ−１インヒピターおよびＴＮＦイン ヒピターを含む薬物組成物。
11. １１．前記ＩＬ−１インヒピターがＩＬ−１ｒａである、請求項１０に記載の薬 物組成物。
12. １２．請求項１１に記載の薬物組成物であって、前記１Ｌ−１ｒａが以下からな る群から少なくとも１つの化合物を含む、薬物組成物：ＩＬ−１ｒａα、　ＩＬ −１ａβ、およびＩＬ−１ｒａｘ。
13. １３．請求項１０に記載の薬物組成物であって、前記ＴＮＦインヒピターが以下 からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、薬物組成物：３０ｋ ＤａＴＮＦインヒピター、４０ｋＤａＴＮＦインヒピター、４０ｋＤａＴＮＦイ ンヒピターΔ５１、および４０ｋＤａＴＮＦインヒピターΔ５３。
14. １４．請求項１３に記載の薬物組成物であって、前記ＴＮＦインヒピターがヒト 組換え３０ｋＤａＴＮＦインヒピターである、薬物組成物。
15. １５．請求項１４に記載の薬物組成物であって、前記ＩＬ−１インヒピターがヒ ト組換えＩＬ１−１ｒａである、薬物組成物。