JPH07509245A - 新規化学発光化合物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規化学発光化合物およびその使用方法本発明は、試料中の分析物を測定するた めの組成物、測定法および測定用キットに関する。

イムノアッセイ法および核酸プローブアッセイ法のための化学発光標識は、通常 使用される他の標識と比較して高い感度を提供する。この主題についての優れた 総説が、マソクカブラ等により、ジャーナル・オン・バイオルミネセンス・アン ド・ケミルミネセンス、第４巻、第５１−５８頁（１９８９年）に述べられてい る。

特に重要な化学発光化合物は、アクリジニウムエステルおよびアミドであり、そ れらは蛋白安定性要件に適合するｐＨで水中に貯蔵しなければならない。このこ とは、化学発光物質ではない疑似塩基の形成をもたらす。化学発光は、酸を加え て、アクリジニウム塩を形成させ、続いて強アルカリ性過酸化水素水を加えるこ とにより開始する。一般に、これらの条件は、受容体リガンド結合の保持に適し ておらず、また望しくないほどに複雑であるので、イムノアッセイ法には理想的 ではない。

臨床診断分野は、容易かつ正確に測定できる物質（分析物）並びに測定方法の多 様性に関して、近年幅広い展開がなされてきた。液体中低濃度の物質の存在を検 出するための便利で信頼でき、カリ危険ではない手段が望まれている。臨床化学 では、これらの物質は、１０１２モル以下の濃度で体液中に存在することがある 。これらの低濃度物質を検出する難しさは、利用できる試料サイズが相対的に小 さいことにより増大する。

アッセイ法を発展させる場合には、多くの検討がなされる。一つの検討課題は、 分析物の濃度の変化に対するシグナル応答である。第２の検討課題は、アッセイ 法のプロトコールを実施できる容易さである。第３の検討課題は、試料間の干渉 の変化である。試薬の製造および精製の容易さ、設備の入手可能性、自動化の容 易さ、および対象物質との相互作用は、有用なアッセイ法の開発において付随的 な検討課題となる。

広義の技術分野は、分析物の存在の機能として標識されたリガンドの特定の空間 的極性構造に特異的に結合することができる受容体の使用に関する。受容体によ り観測される結合の効果は、標識に応じて異なる。ある場合には、受容体の結合 は、単に結合および非結合標識リガンド間の分子量の区別を提供するだけである 。他の場合には、受容体の結合は、遊離標識リガンドから結合標識リガンドの分 離を容易にするか、または、標識から得られるシグナルの性質に影響を及ぼし、 シグナルがｌ！ｌｌｌ！！リガンドに結合した受容体量に応じて変化し得るよう にする。別の変法は、受容体を標識し、リガンドを非標識にすることである。別 法としては、標識がきわめて接近して相互作用するか、もしくは存在するリガン ドの量が受容体の標識が相互作用できる捏度に影響を及ぼす場合は、受容体およ びリガンドを両方とも標識するか、または、異なる受容体を異なる標識で標識す る。

異なるリガンドの幅広いスペクトルに適用することができるか、または、他の方 法が容易に適用できない特異な場合に使用することができる、新しい正確な技術 の絶えまない必要性がある。

均一系イムノアッセイ法は、以前は小分子量のものについて記載されている。

これらのアッセイ法は、シバ・カンパニーのフラット（商標）アッセイ法、エミ ツト（商標）アッセイ法、酵素チャネリング免疫測定法および蛍光エネルギー転 移イムノアッセイ法（ＦＥＴＩ）、酵素阻害イムノアッセイ法（ホフマン・ラロ シェおよびアボット・ラボラトリーズ）、および蛍光分極イムノアッセイ法（ダ ントリツカ−）、その他を含む。これらの全方法は、感度が限られており、ＦＥ ＴＩおよび酵素チャネリングを含むほんのわずかしか、大型の多エピトープ分析 物には適用しない。

化学発光化合物は、光を放射する能力があるため、アッセイ法分野において幅広 く適用できる。この理由で、発光体は核酸アッセイおよびイムノアッセイのよう なアッセイ法の標識として利用されている。例えば、特異的結合対のメンバーは 、発光体にコンジュゲートし、様々なプロトコールが採用され。発光体コンジュ ゲートは、分析物を含む可能性のある試料中の分析物量に関連して、固相および 液相間で分配することができる。いずれか一方の相の発光を測定することにより 、発光レベルを試料中の分析物濃度に関連させることができる。

化学発光標識が、結合相手に共有結合的に結合しており、かつ化学活性化で光を 放射する基のイムノアッセイおよび核酸アッセイについて記載されている。アク リジニウムエステルを利用する核酸アッセイキットが、ジエンプローブ（ペイス ２システム（商標）、サンディエゴ、カリフォルニア）により市販されており、 この型のｔｕｉを使用するマジックライト（商標）イムノアッセイキットが、チ ノく一ガイギー（バーゼル、スイス）により市販されている。

発光標識は、リガンド結合アッセイにおいて格別の感度を提供する利点を有する が、１またはそれ以上の化学的活性化段階が通常必要とされる。それ故、数段階 の活性化を必要としない新規な発光化合物が必要とされていた。

関連技術の簡単な説明 米国特許第３．８７６．６５９号は、新規スピロ三環式イソインドリンを開示し ている。

米国特許第４．３８０．５８０号および第４．３８３．０３１号は、それぞれ非 均−系および均一系化学発光特異的結合アッセイ法を記載している。

米国特許第４．８９１．３２４号は、アッセイ法の発光体を伴う粒子の使用を記 載している。

ヨーロッパ特許出願第０　２７０９４６　Ａ２号は、酵素の検出に有用な色素ア クリジノン酵素基質に関する。

ヨーロッパ特許出願第０３２２９２６　Ａ２号は、改良化学発光エステル、千オ ニステルおよびアミドを利用するアッセイ法を記載している。

ヨーロッパ特許出願第０　３２４　２０２　Ａ１号は、化学発光標識としてのア クリジニウム化合物を記載している。

ヨーロッパ特許出願第０　４２１　７８８　Ａ２号は、液体試料中の分析物の存 在または量を測定するための、ノーロベルオキシダーゼー酸−最適化学発光アツ セイ法システムを記載している。本システムは、ノ＼口ベルオキシダーゼ、ノ） ライド、オキシダントおよび化学発光基質を利用する。

ＰＣＴ　８８１００６９５号は、アッセイ法におけるジオキセタンの使用を記載 しており、ジオキセタンは酵素開裂可能な基を含み、その除去がジオキセタンと 結合しているマイナス荷電置換基をもたらす。これは、ジオキセタンを分解して 発光物質を形成させる。

ヘラ−等は、「感染剤の迅速検出および同定」、アカデミツク・プレス・インコ ーホレイテッド、第２４５−２５７頁（１９８５年）中で、ＤＮＡハイブリッド 化システムのための化学発光および蛍光プローブを記載している。

シマー等は、アナリティカ・シミ力・アクタ、第２２７巻、第１１−１９頁（１ ９８９年）で化学発光標識を記載している。

発明の要約 本発明は、スピロ−アクリダン化学発光化合物類に関する。

これらの化合物は、本化合物および過酸化水素を含む光放射化学組成物に有用で ある。

これらの化学発光化合物はまた、特に分析物を定量する方法において有用性を有 する。分析物を含む可能性のある試料は、本化学発光化合物の１種と検定培地中 で合わせられるが、それはｓｂｐメンバーに結合し、ｓｂｐメンバーは分析物ま たは第２３ｂｐメンバーと結合して分析物の存在に相関する錯体を形成し得る。

化学発光化合物は、例えば過酸化水素により活性化する。発生する発光量は、そ の後検出され、試料中の分析物量に関連づけられる。

本化学発光化合物を含むキットもまた本発明に含まれる。

図面の説明 本発明は添付の図面を参照して更に詳細に揮散される。それらの；第１図は、実 施例７の化合物（Ｉｃ）の化学発光の衰退を示すグラフである。

第２図は、実施例７の化合物（ＩＩａ）の化学発光の衰退を示すグラフである。

第３図は、実施例７の化合物（ＩＩＩａ）の化学発光の衰退を示すグラフである 。

第４図は、実施例９の化合物（ＩＶａ）の化学発光を示すグラフである。

第５図は、実施例９の化合物（ＩＶａ）および（２）の化学発光を示すグラフで ある。

具体的な実施態様の記載 上記の如く、本発明は、化学的に活性化して、発光生成物質とすることのできる 化学発光化合物、およびこれらの化合物の標識としての使用に関する。化学発光 化合物は、特異的結合対のメンバーと連合しており、この試薬は、分析物の検出 のための測定法における標識試薬として利用される。化学的活性化は、例えば過 酸化水素によって達成される。本発明の標識は、分析物を定量するための均−系 （ｈｏｓｏｇｅｎｅｏｕｓ）および非均−系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）ア ッセイプロトコールの両者で使用できる。アッセイプロトコールでは、構成成分 は合わせられ、そして、生成した光は分析物濃度の関数である。

更に、本発明の具体的な態様の記載を進める前に、多数の用語を定義または詳細 に記載する。

分析物：検出すべき化合物または組成物。分析物は、特異的結合対（ｓｂｐ）の メンバーであり得、さらにリガンドでもありうるが、それは−価（モノエピトー プ）または多価（ポリエピトープ）性で、通常抗原またはハブテンであり、また 少な（とも１種の共通エピトープ部位または決定基部位を共有する、単一化合物 または多種化合物である。分析物は、細菌のような細胞、またはＡ、Ｂ、Ｄ等の ような血液型抗原を有する細胞、またはＨＬＡ抗原、または例えば細菌、真菌、 原生動物またはウィルスのような微生物等の一部であり得る。

多価リガンド分析物は、ふつうポリ（アミノ酸）、すなわち、ポリペプチドおよ び蛋白質、多糖類、核酸およびそれらの組み合わせである。それらの結合は、細 菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜および同種物の成 分を含む。多くの場合、主題の発明が適用できるポリエピトープリガンド分析物 は、少な（とも約５，０００、さらに通常は少なくとも１０．０００の分子量を 有する。ポリ（アミノ酸）のカテゴリーでは、対象となるポリ（アミノ酸）は、 一般的に約５．０００から５．０００．ＯＯＯの分子量、さらに一般的には約２ ０゜０００から１．０００．ＯＯＯの分子量を有する。対象となるホルモンでは 、分子量は通常的５．０００から６０．０００の範囲内である。

幅広い種類の蛋白質が、類似の構造特徴を有する蛋白質、特定の生物学的機能を 有する蛋白質、特定微生物、特に病原性微生物等に関連した蛋白質の部類に属す るとみなされる。そのような蛋白質は、例えば、免疫グロブリン類、サイトカイ ン類、酵素類、ホルモン類、癌抗原類、栄養マーカー類、組織特異的抗原類等を 含む。

次記は構造関連の蛋白質分類である：プロタミン類、ヒストン類、アルブミン類 、グロブリン類、硬蛋白質類、リン蛋白質類、ムコ蛋白質類、色素蛋白質類、リ ポ蛋白質類、核蛋白質類、糖蛋白質類、Ｔ細胞受容体類、プロテオグリカン類、 未分類タンパク’ｉｒａ、例えば、ＨＬＡ、ソマトトロピン、プロラクチン、イ ンスリンおよびペプシン。

ヒト血漿中に見い出される多数の蛋白質は、臨床的に重要であり、プレアルブミ ン、アルブミン、α１−リポ蛋白質、α１−抗トリプシン、帽−糖蛋白質、トラ ンスコルチン、４．６８−ボストアルブミン、トリプトファン欠乏α１−糖蛋白 質、α１χ−糖蛋白質、チロキシン結合グロブリン、インター−α−トリプシン 阻害剤、Ｇｃ−グロブリン（Ｇｃｌ−１、Ｇｃ２−１およびＧｃ２−２）、ヘパ トグロビン（Ｈｐｌ−１、Ｈｐ２−１およびＨｐ２−２）　、セルロブラスミン 、コリンエステラーゼ、α２−リポ蛋白質（類）、ミオグロビン、Ｃ−反応蛋白 質、α２−マクログロブリン、α、−Ｈ３−糖蛋白質、Ｚｎ−α２−糖蛋白質、 α２−ノイラミノ糖蛋白質、エリスロポイエチン、β−リポ蛋白質、トランスフ ェリン、ヘモベキシン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、β２−糖蛋白質 ■およびβ２−糖蛋白ｉ１１．免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）またはγＧ−グロブ リン（分子式：γ２に、またはγ、λ２）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）または γＡグロブリン（分子式：　（α、に２）′または（α、λ、）”）、免疫グロ ブリンＭ（ＩｇＭ）またはγＭ−グロブリン（分子式・　（μ、に２）Ｓまたは （μ２λｚ）　’）　、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）またはγＤ−グロブリン（ γＤ）（分子式：δ１１またはδ、λ、）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＤ）または γＥ−グロブリン（γＥ）（分子式：ε。

に２またはε、λ２）、遊離におよびλＬ鎖、および補体因子（Ｃ’ｌｑ、Ｃ’ ｌｒおよびＣ’　１　ｓを含むＣ’　１　；　Ｃ’　２　；β１Ａおよびａ、Ｄ を含むＣ’３；Ｃ’４；Ｃ’５；Ｃ’６；Ｃ’７；Ｃ’８およびＣ′９）を含む 。

重要な血液凝固因子（国際名称）は、フィブリノーゲン（Ｉ）、プロトロンビン （ＩＩ）　、）ロンビン（ＩＩａ）、組織トロンボプラスチン（ＩＩＩ）　、プ ロアクモレリン／Ａｃグロブリン（ＶおよびＶＩ）　、プロコンベルチン（ＶＩ Ｉ）　、抗血友病グロブリン（ＶＩＩＩ）　、グリスマス因子／血漿トロンボプ ラスチン成分（ＩＸ）　、スチュアートーブラウワー因子／オートプロトロンビ ンＩＩＩ　（Ｘ）　、血漿トロンボプラスチン前駆体（ＸＩ）　、ハーゲマン因 子（ＸＩＩ）およびフィブリン安定化因子（ＸＩＨ）を含む。

重要な蛋白質ホルモンは、副甲状腺ホルモン（パラトルモノ）、チロカルシトニ ン、インスリン、グルカゴン、レラキシン、エリスロボイエチン、メラノトロピ ン（メラニン刺激ホルモン、インターメジン）、ソマトトロピン（成長ホルモン ）、コルチコトロピン（副腎皮質刺激ホルモン）、チロトロピン、卵胞刺激ホル モン、黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン）、黄体腫刺激ホルモン（ルテ オトロピン、プロラクチン）、ゴナドトロピン（胎盤性性腺刺激ホルモン）のよ うなペプチドおよび蛋白質ホルモン：セクレチン、ガストリン、アンギオテンシ ン！およびＩＩ、ブラジキニンおよびヒト胎盤性ラクトゲンのような組織ホルモ ン；ＩＬ　■、ＩＬ　Ｉｌ、　ＩＬ　ＶＩ、ＥＧＦ、ＴＮＦおよびＮＧＦのよう なシトキニン：　ＰＳＡ、ＣＥＡ、α−フェトプロティン、酸性ホスファターゼ 、ＣＡ１９゜９およびＣＡ１２５のような癌抗原、アルカリ性ホスファターゼ、 ミオグロビン、ＣＰＫ−ＭＢ、カルシトニンおよびミニリン塩基性蛋白質のよう な組織特異性抗原およびオキシド／ン、バソプレッシンのような神経下垂体から のペプチドホルモン、および終結因子（ＣＲＦ、ＬＲＦ、ＴＲＦ、ソマトトロピ ン−ＲＦｌＧＲＦ、ＦＳＨ−ＲＦｌＰＩＦおよびＭＩＦ）を含む。

他の対象となる高分子物質は、ムコ多糖類および多糖類である。

微生物に由来する抗原多Ｗ類の例は次のとおりである。

微生物の種類　見い出されるヘモセンシチニンストレブトコッカス・ピオゲネス 　多糖類ディプロコツカス・ニューモニア　多糖類ナイセリア・メニギチディス 　多糖類 ナイセリア・ゴノロエアエ　多糖類 コリネバクテリアム・ジフテリア　多糖類アクチノバチルス・マレイ　粗抽出物 アクチノバチルス フラッジセラ・ツラレニス　リポ多糖類、多糖類パスツレラ・ペスティス　多糖 類 パスツレラ・ムルトシダ　きょう膜抗原プルセラ・アポルタス　粗抽出物 ヘモフィルス・インフルエンザ　多糖類ヘモフィルス・ペルッシス　粗製物 トレポネーマ・レイテリ　多糖類 ベイヨネラ属　リポ多糖類 エリジペロスリックス属　多糖類 リスチリアメ・モノントゲネス　多糖類クロモバクテリウム属　リポ多糖類 微生物の種類　見い出されるヘモセンンチニン（続き）ミコバクテリウム・ツベ ルクリンス　ミコバクテリア並びに細胞およびツベルクリンの多糖類画分を９０ ％ フェノールで抽出したものの 生理食塩水抽出物 クレブシェラ・アエロゲネス　多糖類 クレブシェラ・クロアカニ　多糖類 サルモネラ・チホサ　リポ多糖類、多糖類サルモネラ・チフィムリウム　多糖類 サルモネラ・デルビー サルモネラ・ブロラム ／ゲラ・ディセンチリア　多糖類 ７ゲラ・フレクスネリ ノゲラ・ソネ　粗製物、多糖類 リケッチア属　粗抽出物 カンジダ・アルビカンス　多糖類 エンタモエバ・アルビカンス　粗抽出物測定される微生物類は、そのまま、溶菌 、粉砕またはその他の方法でフラグメント化することができ、得られる組成物ま たは部分を、例えば抽出によって測定する。対象となる微生物は、 コリネバクテリア属 コリネバクテリウム・ジフテリア 肺炎法菌属 ディプロコツカス・ニューモニア 連鎖球菌属 ストレプトコッカス・ピオゲネス ストレプトコッカス・サリパルス ブドウ球菌属 スタフィロコッカス・アウレウス スタフィロコッカス・アルバス ナイセリア属 ナイセリア・メニギチディス ナイセリア・ゴノロエアエ 腸内細菌 大腸菌型バクテリア エンエリヒア・コリ アエロバクタ−・アエロバクタ クレブンエラーニューモニア サルモネラ属 サルモネラ・チホサ サルモネラ・コレラシス サルモネラ・チフィムリウム 赤痢菌属 ンゲラ・ディセンチリア シゲラ・シミライ シゲラ・アラビノタルダ シゲラ・フレクスネリ 赤痢菌ｒ１４（続き） 他の腸内細菌 プロテウス種 プロテウス・ブルガリス プロテウス・ミラビリス プロテウス・モルガニ 緑膿菌 アルカリゲネス・ファエカリス ビブリオ・コレラ ヘモフィルス−ボルデテラ群 ヘモフィルス・インフルエンザ ヘモフィルス・デュクレイ ヘモフィルス・ヘモフィルス へモフィルス・ニジブチカス へモフィルス・バラインフルエンザ ボルデテラ・ペルッシス パスツレラ属 パスツレラ・ペスティス パスツレラ・ツラレウシス プルセラ属 プルセラ・メリテンシス プルセラ・アボルタス プルセラ・スイス 好気性胞子形成菌 バチルス・アンスラシス バチルス・ズブチルス バチルス・メガテリウム バチルス・セレウス 嫌気性胞子形成菌 クロストリジウム・ボツリナム クロストリジウム・テタニ クロストリジウム・ベルフリンゲンス クロストリジウム・ノーヴイ クロストリジウム・セブチカム クロストリジウム・ヒストリチカム クロストリジウム・チルチウム クロストリジウム・ビフエルメンタンスクロストリジウム・スポロゲネス ミコバクテリア ミコバクテリウム・ツベルクロシスーホミニスミコバクテリウム・ボビン ミコバクテリウム・アビウム ミコバクテリウム・レプラ ミコバクテリウム・パララベルクロシス放線菌属（真菌様筒） アクチノマイセス・イスラエリ アクチノマイセス・ボビン アクチノマイセス・ネスルンディ ノカルジア・アステロイデス ノカルジア・ブラシリエンシス スピロヘータ属 トレポネマ・パリダム トレポネマ・ペルテヌ トレボネマ・カラチウム ボレリア・レフレンチイス スピロヘータ属（続き） レプトスピラ・イクテロヘモラジアエ レブトスピラ・カニコラ スピリルム・ミナス ストレプトバチルス・モニリホルミス トリパノゾーマ属 マイコプラズマ属 マイコプラズマ・ニューモニア 他の病原体 リステリア・モノサイトゲネス エリシペロスリクス・ルシオパチア ストレプトバチルス・モニリホルミス ドンバニア・グラヌロマティス バルトネラ・バシリホルミス リケッチア属（細菌様寄生虫） リケッチア・ブロワゼキ リケッチア・モオセリ リケッチア・リケッチア リケッチア・コノリ リケッチア・アウストラリス リケッチア・ンビリカス リケッチア・アカリ リケッチア・ツツガムン リケッチア・プルネッティ リケッチア・フィンタナ クラミジアＩｔ（未分類寄生虫細菌／ウィルス性）クラミジア剤（名称不祥） 真菌 クリプトコックス・ネオファルマンス ブラストマイセス・デルマチイブイス ヒストプラズマ・カブスラタム コクノノオイデス・イミティス バラコクシジオイデス・ブラジリエンンスカンンダ・アルビカンス アスペルギルス・フミガラス ムコール・コリムビフエル （アブシディア・コリムビフエラ） 藻菌類 リゾーブス・オリザ リゾーブス・アリヒズス リゾーブス・ニグリカンズ スポロトリクス・シエンキ フォンセサエ・ペドロソイ フォンセサエ・コムパクタ フォンセサエ・デルマチイブイス クラドスポリウム・カリオニ フィアロフォラ・ベルコサ アスペルギルス・ニデユランス マデュレラ・ミセトミ マデュレラ・グリセア アレンエリア・ボイディ フィアロスフォラ・ジエアンセルメイ ミクロスポラム・ジブセウム トリコフィトン・メンタグロフィテス ケラチノマイセス・アジェロイ ミクロスポラム・カニス トリコフィトン・ルブラム ミクロスポラム・アドウィニ ウィルス類 アデノウィルス類 ヘルペスウィルス類 単純ヘルペス 水痘（水ぼうそう） 帯状ヘルペス（帯状庖疹） Ｂウィルス サイトメガウィルス ポックスウィルス類 痘癒（天然痘） 完全疫痢 ポックスウィルス・ボビス バラワクシニア モルスカム・コンタジオスム ピコルナウィルス類 ポリオウィルス コクサソキーウイルス ルビタール、ジフェニルヒダントニン、ブリミドン、エトスルキシミドおよびそ れらの代謝生成物を含む、５ないし６員環ラクタム類である。

次の薬剤群は、アンフェタミン類を含む、炭素原子２から３個のアルキルを有す るアミノアルキルベンゼン類：エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリンを含む カテコールアミン類：ナルセイン；パパベリン；および上記の誘導体および代謝 生成物である。

次の薬剤群は、オキサゼパム、クロルプロマジン、テグレトールを含むベンズ複 素環類、それらの誘導体および代謝生成物であり、該複素環は、アゼピン、ジア ゼピンおよびフェノチアジンである。

次の薬剤群は、テオフィリン、カフェインを含むプリン類、それらの代謝生成物 および誘導体である。

次の薬剤群は、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールを含む、マリ ファナに由来した薬剤である。

次の薬剤群は、チロキシン、コルチゾール、トリョードチロニン、テストステロ ン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロンのようなホルモン類、アン ギオテンシン、Ｌ　ＨＲＨのようなポリペプチド類、およびシクロスポリン、Ｆ Ｋ−５０６、ミコフェノール酸その他のような免疫抑制剤等である。

次の薬剤群は、Ａ、Ｂ、例えば、ＢＩ！、Ｃ，ＤＳＥおよびに１葉酸、チアミン のようなビタミン類である。

次の薬剤群は、水酸化および不飽和の程度および部位により異なるプロスタグラ ンノン類である。

次の薬剤群は、イミブラミン、ジメチルイミプラミン、アミトリブチリン、ノル トリブチリン、プロトリブチリン、トリイミブラミン、クロムイミプラミン、ド キセピンおよびデスメチルドキセピンを含む３員環抗抑圧剤である。

次の薬剤群は、メトトレキサートを含む抗新生物薬である。

次の薬剤群は、ベニンジン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサ イクリン、テルラマインンを含む抗生物質、それらの代謝生成物および誘導体で ある。

次の薬剤群は、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジンお よびシチジンを含み、それらの適当な糖およびリン酸塩置換体を含むヌクレオチ ド類およびヌクレオチド類である。

次の薬剤群は、メタトン、メブロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイ ン、プロ力インアミド、アセチルブロ力インアミド、プロプラノロール、グリセ オフルビン、パルプロ酸、プチロフヱノン、抗ヒスタミン、クロラムフェニコー ル、アトロビンのような抗コリン性薬剤、それらの代謝生成物および誘導体を含 む種々の各薬剤である。

病的状態に関連する代謝生成物は、スペルミン、ガラクトース、フェニルピルビ ン酸およびポルフィリン１型を含む。

次の薬剤群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカシ ンのようなアミノ配糖体類である。

対象となる殺虫剤の中には、ポリハロゲン化ビフェニル類、リン酸エステル類、 チオリン酸塩類、カルバメート類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それら の代謝生成物および誘導体である。

受容体分析物では、分子量は一般的に１０，０００がら２Ｘ１０”、さらに通常 は１０．０００から１０６の範囲である。免疫グロブリンであるＩｇＡ、ＩｇＧ 。

ＩｇＥおよびＩｇＭでは、分子量は一般的に約１６０．０００から約１０＠に変 化し得る。酵素類は、標準的に約ｉｏ、ｏｏｏから１，０００．０００の分子量 の範囲である。天然の受容体は、一般的に少なくとも約２５，０００の分子量で 幅広く変化し、１０６またはそれ以上の分子量であることができ、アビジン、Ｄ ＮＡ。

ＲＮＡ１チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランス コルチン等のような物質を含む。

分析物という用語は、さらに以下に定義するポリヌクレオチドのようなポリヌク レオチド分析物を含む。これらは、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、ＤＮ Ａ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重体等を含む。分析物という用語は、また例えば、制限酵 素、活性化剤、抑制剤、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵素、化 学療法剤等のようなポリヌクレオチド結合剤である受容体も含む。

分析物は宿主から体液のような試料中に直接見い出される分子であることができ る。試料は直接試験できるが、より分析物を容易に検出できるように分析物を前 処理してもよい。さらに、対象となる分析物は、対象となる分析物に相補的な特 異的結合対メンバーのような、対象となる分析物が試料中に存在する場合にだけ その存在が検出される、対象となる分析物を証明する試剤を検出することにより 測定することができる。こうして、分析物を証明する試剤は、アッセイにおいて 検出される分析物になる。体液は、例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、 大便、痰、脳を髄液、涙液、粘液および同種物であり得る。

分析物アナログまたはりガントアナログ（「アナログ」）：受容体への結合にお いて類似の分析物またはりガントと競合することができ、その修飾がアナログを 別の分子に結合する手段を提供するものである、修飾した分析物または分析物代 用物、修飾したリガンドまたはリガンド代用物、または通常１００以上の分子量 をもつ有機ラジカル。分析物代用物またはリガンド代用物という用語は、分析物 またはリガンドに相補的な受容体に特異的に結合する能力を有する化合物を意味 する。アナログは、通常、いつもではないが、分析物またはリガンドとは、アナ ログを中心または標識に連結する結合で水素を変換する以上に異なる。アナログ は、分析物またはリガンドと同様の方法で受容体に結合することができる。アナ ログは、例えば、リガンドに対する抗体のイディオタイプに対する抗体であり得 る。

特異的結合対メンバー（ｒｓｂｐメンバー」）二表面上にまたは空洞中に、他の 分子の特定の空間的および極性の構造に特異的に結合する領域を有し、その故に それと相補的と定義される、２種の異なる分子のうちの１種。特異的結合対メン バーは、抗原−抗体およびハブテン−抗体のような免疫学的対のメンバーである 場合のように、リガンドおよび受容体（抗リガンド）を意味し得る。免疫学的対 ではない他の特異的結合対、例えば、酵素−基質、ビオチンーアビンン、ホルモ ン−ホルモン受容体、核酸二本鎖分子（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｄｕｐｌｅ ｘｅｓ）、Ｉ　ｇＧ−プロティンＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ５ＤＮＡ−ＲＮＡのような ポリヌクレオチド対、ちまた本発明に含まれる。

リガンド・それに対する受容体が天然に存在するかまたは製造することができ、 抗原類およびハプテン類を含む任意の有機化合物。

抗原：抗体に結合することができ、それに対して抗体を産生できる全ての化合物 。

ハプテン・抗体に特異的に結合することができるが、それ自体では抗体産生のた めの免疫ｌＷ（または抗原）として作用しない全ての化合物。ハプテンを認識す る抗体は、免疫源（または抗原）性担体に連結したハブテンを含む化合物に対し て調製できる。

受容体（「抗リガンド」）　分子の特定の空間的および極性の構造、例えばエピ トープまたは決定基部位、を認識できる全ての化合物または組成物。例となる受 容体は、天然に生成する受容体、例えば、チロキノン結合グロブリン、抗体類、 酵素順、Ｆａｂフラグメント類、レクチン類、核酸類、プロティンＡ１補体成分 Ｃ１ｑ、および同種物を含む。

抗体・他の分子の特定の空間的および極性の構造に特異的に結合し、そのためそ れと相補的であると定義される免疫グロブリン。抗体は、モノクローナルまたは ポリクローナルであることができ、宿主の免疫および血清（ポリクローナル）の 収集のように当業者によく知られた技術によって、または連続的なハイブリッド セルラインの調製と分泌蛋白？ｉ（モノクローナル）の収集によって、または少 なくとも天然の抗体と特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列またはその変異版のクローニングおよび発現によって製造できる。抗体類 は、完全な免疫グロブリンまｔ二はそれらのフラグメントを含むことができ、そ の免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩ ｇＧ３、ＩｇＭ等のような様々な種類およびイソタイプを含む。それらのフラグ メントは、ＦａｂＳＦｖおよびＦ（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂ’等を含むことができる 。さらに、凝東体、ポリマー類、および免疫グロブリン類またはそれらのフラグ メントのフンシュゲートは、特定の分子の結合親和性が維持される限り、適当な 場合に使用することができる。

ポリヌクレオチド　自然な状態で約５０から５００．０００またはそれ以上のヌ クレオチドを有し、単離した状態で約１５から５０，０００またはそれ以上のヌ クレオチドを有し、通常は約１５から２０．０００のヌクレオチド、さらに頻繁 には１５から１０．０００のヌクレオチド、を有する高分子ヌクレオチドである 化合物または組成物。ポリヌクレオチドは、天然に生成するかまたは合成的に製 造され、ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡおよび５ｓＤＮＡ）およびＲＮＡ１通常はＤＮＡ を自む、任意の資源由来の精製または未精製形態の核酸を含み、ｔ−ＲＮＡＳｍ −ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ１クロロプラストＤ ＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはそれらの混合物、遺伝 子、染色体、プラスミド、微生物、例えば細菌、酵母、ウィルス、ウィロイド、 かび、真菌、植物、動物、ヒト、およびそれらのフラグメント、および同種物の ような、生物学的物質のゲノム等である。

アルキル基　脂肪族炭化水素から１つの１１原子を除去して誘導される一価の分 枝または非分枝ラジカルで、低級アルキルおよび高級アルキル基の両方を含む。

低級アルキル基は、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、 イソブチル、ペンチル、イソペンチル等のようなＪないし５個の炭素原子を含む 。

高級アルキル基は、６個以上の炭素原子、通常、例えばヘキシル、ペンチル、オ クチル等のような６ないし２０個の炭素原子を含む。

アリール基：芳香族炭化水素から１つの原子の除去により誘導され、１つまたは それ以上の芳香族環、通常は例えば、フェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナ フタレンから）等のような１ないし４個の芳香族環を含む有機う２／カル。

置換：ある分子のある水素原子が別の原子と置き換わった場合。、ユニで別の分 子とはハロゲン等のような単一原子であるか、または１がら５０個の原子を有す る置換基または有機ラジカルのような官能性を形成する（それらの原子の原子価 を満たすのに必要な所要水素原子以外の）原子群の一部であり、それらの原子は 、独立して炭素（Ｃ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびリン（Ｐ） からなる群から選択されたものであり、１つまたはそれ以上の金属原子と結合し 得るかまたはし得ないものである。これらのＯ，Ｎ、ＳまたはＰは、それらが存 在する場合、炭素と、または各々互いに１つまたはそれ以上と、または水素と、 または金属原子と結合して、例えば、カルボン酸、アルコール、チオール、カル ボキサミド、カルバメート、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エス テル、リン酸、リン酸エステル、尿素、カルバメート、ホスホルアミド、スルホ ンアミド、エーテル、スルフィド、チオエーテル、オレフィン、アセチレン、ア ミン、ケトン、アルデヒド、ニトリル等のような様々な官能基を形成する。その ような有機ラジカルまたは基の例としては、アルキル、アルキリノン、アリール 、アラルキル、および前述の官能性の１つまたはそれ以上に置換したアルキル、 アリールおよびアラルキルが例示的に、かつ非限定的にあげられる。

連結基：分子間の共有結合。連結基は、分子の性質、すなわち化学発光化合物、 ｓｂｐメンバー、または連結する粒子にアン／エートするかまたはその部分であ る分子により異なり変化し得る。化学発光化合物上に標準的に存在するか、また は導入される官能基が、これらの物質を、ｓｂｐメンバーまたは、リポソームま たは油滴の親油性成分、ラテックス粒子、シリコン粒子、金属ゾルまたは色素微 結晶のような粒子に連結するのに使用される。

カルボニル官能性群は、多くの場合、例えばアルデヒドのようなオキソカルボニ ル、および例えばカルボニル、アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチ オノカルボキンのような非オキソカルボニル（窒素および硫黄アナログを含む） の両方に使われる。本明細書中で使用するときは、「非オキソカルボニル」とい う用語は、カルボン酸のカルボニル基、−ＣＯＯＨ；アミド酸のイミノカルボニ ル基、−Ｃ（ＮＨ）ＯＨを含む窒素；およびチオ酸のチオノカルボニル基、−Ｃ （Ｓ）ＯＨを含む硫黄を含む。オキソの別の官能性群は、活性ハロゲン、シア゛ 人メルカプト、オレフィン、特に活性化オレフィン、アミノ、ホスホロおよび同 種のものを含む。連結基の記載は、米国特許第３．８１７．８３７号に見ること ができ、その記載は、引用して本明細書に包含させる。

連結基は、工ないし１００個の原子、通常は約１ないし７０個の原子、好ましく は１ないし５０個の原子、さらに好ましくは１ないし２０個の原子からなる結合 ないし鎖まで変化し、各々は独立して、標準的に炭素、酸素、窒素、硫黄および リンからなる基から選択される。連結基中のへテロ原子の数は、標準的には約０ ないし２０個、通常は約１ないし１５個、さらに好ましくは２ないし６個の範囲 である。鎖中の原子は、工ないし５０個の原子を有する置換基について記載した のと同様の方法で水素以外の原子群で置換され得る。一般的に、ある特定の連結 基の長さは、合成上の利便性および任意の所望基の導入をもたらすべく任意に選 択できる。連結基は、脂肪族または芳香族であり得るが、ジアゾ基を伴うときは 通常芳香族基が関与する。

ペテロ原子が存在する場合、酸素は標準的に、炭素、硫黄、窒素またはリンに結 合しているオキソまたはオキ／として存在し、窒素は標準的に、炭素、酸素、硫 黄またはリンに結合しているニトロ、ニトロソまたはアミノとして存在し；硫黄 は、酸素と同様であるが；リンは、通常はホスホネートおよびリン酸モノまたは ジエステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合している。

連結基とコンジュゲートすべき分子間の共有結合を形成する共通の官能性群は、 アルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジ ノ、ア゛人チオエーテルおよびカルボキシレート、スルホネート、およびホスホ ン酸エステル、アミドおよびチオエステルである。

コンジュゲート、互いに結合して単一の構造を形成する２つまたはそれ以上のサ ブユニットを含んで成る単一分子。結合は、サブユニット間の直接結合（例えば 化学結合）、もしくは連結基の使用のいずれかによって形成できる。例えば、本 発明の１つの状況では、本発明の化学発光標識にコンジュゲートしたリガンドは 、リガンド標識フンシュゲートである。サブユニットＢにコンジュゲートしたサ ブユニットＡを含んど成るものとして記載されている組成物とは、サブユニット ＡがサブユニットＢに結合している組成物である。

コンノユゲーンヨン：２つのサブユニットを互いに結合させる全ての方法。コン ジュゲーシヨン法は、何段階も含むことができる。

支持体または表面、多孔性または非多孔性の水不溶性材料を含んで成る表面。

この表面は、ストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子および同種物のような、多 種の任意の形のものを有し得る。この表面は、親水性であるかまたは親水性とな し得るものであり、シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナのような無機粉末 、天然の高分子物質、特にセルロース系物質、および、例えば濾紙、クロマトグ ラフィー紙のような紙を含む繊維のようなセルロースから誘導される物質；ニト ロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架 橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレ ン、ポリ　（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメトアクリレート、ポリ （エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等のような 、合成の、または修飾した天然産生ポリマー類、それ自体でまたは他の物質との 併用で、バイオガラスとして入手できるガラス、セラミックス、金属および同種 物を含む。リポソーム類、リン脂質媒体および細胞のような天然または合成アセ ンブリーもまた使用できる。

支持体または表面へのｓｂｐメンバーの結合は、文献で通常入手できる、よ（知 られた技術により達成することできる。例えば、「固定化酵素」イチロー・チバ タ、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（１９７８年）およびクアトレカサス 、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー、第２４５巻、第３０５９ 頁（１９７０年）を参照。

表面は、通常多機能であるか、または多機能にすることができるか、または特異 的、非特異的、共有または非共有相互作用によってオリゴヌクレオチド、Ｓｂｐ メンバーおよび／または化学発光化合物、に結合することができる。様々な官能 基が入手可能であるかまたは導入できる。この官能基は、カルボン酸、アルデヒ ド、アミノ基、ンアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基および類 似物を含む。幅広く多様な化合物を表面に結合させる方法が、よ（知られており 、文献に十分説明されている。例えば、クアトレカサス、前掲。オリゴヌクレオ チド、ｓｂｐメンバーまたは化学発光化合物との連結基の長さは、連結しようと する化合物の性質、連結しようとする化合物間の距離の影響および特異的結合特 性の表面および類似物により異なり、幅広（変化し得る。ｓｂｐメンバーは、支 持体の外側表面に実質的に結合する。

粒子：少なくとも２０ｎｍで約５０ミクロン以下、通常少なくとも４０ｎｍで約 ２５ミクロン未満、好ましくは直径が約０．１０−５．０ミクロンで、標準的に １ピコリツトル以下の容量を有する粒子。この粒子は、有機、無機、膨張性、非 膨張性、多孔質または非多孔質であり、任意の密度を有するが好ましくは水に近 い密度を有し、一般に約０．７ないし約１．５ｇ／ｍｌ好ましくは水中に懸濁で き、透明、部分的に透明、または不透明である物質からなることができる。この 粒子は、電荷を有するかまたは有しないことができ、荷電している場合は、好ま しくはマイナス荷電である。この粒子は、固体（例えば、ポリマー、金属、ガラ ス、有機物および無機物、例えば、鉱物、塩およびけいそう類）、油滴（例えば 、炭化水素、フッ化炭素、シリコン液）または媒体（例えば、リン脂質のような 合成の、または細胞やオルガネラのような天然の）であることができる。この粒 子はラテックス粒子または、有機もしくは無機ポリマー類３例えばリポソーム、 リン脂質媒体のような脂質二重層：油滴：シリコン粒子：金属ゾル；細胞；およ び色素微結晶を含む、他の粒子であることができる。

有機粒子は、標準的にポリマー類、付加または濃縮ポリマー類のいずれがであり 、それらはアッセイ培地中で容易に分散することができる。有機粒子はまた、そ れらの表面でｓｂｐメンバーに直接または間接的に結合するために、吸着性また は官能付与性をである。

この粒子は、天然産生物質、合成的に修飾した天然産生物質、および合成物質か ら調達できる。例えばリポソームや非リン脂質媒体のような脂質二重層のような 天然または合成アセンブリが好ましい。特に有利な有機ポリマーの中には、多糖 類、アガロースのような特定の架橋した多糖類、それはセファロ−・スとして入 手できる、があり、セファデックスおよびセファクリルとして入手できるデキス トラン、セルロース、デンプンおよび同種物；ポリスチレン、ポリアクリルアミ ド、アクリレートやメタアクリレート誘導体、特にヒドロゲルや同種物を含む遊 離ヒドロキシ官能性を有するエステルやアミドのホモポリマーおよびコポリマー 付加ポリマーがある。無機ポリマーは、シリコン、バイオガラスとして入手でき るガラス等を含む。ゾルは、金、セレンおよび他の金属を含む。粒子はまた、け いそう、細胞、ウィルス粒子、マグネットシーム、細胞核および同種物を含むこ とができる。

粒子が商業的に入手できる場合、粒子径は、粉砕、音波破砕、撹拌等のような機 械的手段により、大きい粒子を小さい粒子に細かくすることにより変え得る。

標識二ノグナルを産生じたり、産生ずるように誘導できる全ての分子。標識は、 分析物または抗体、または受容体のような別の分子、もしくはリガンド、特にハ ブテンのような受容体と結合できる分子にコンジュゲートできる。主題の発明で は、標識は、以下に定義するように、シグナル産生手段を含むシグナル産生シス テムのメンバーである。

本発明のスピロアクリダン化学発光化合物は、クロモゲンシステムの１部分であ り、したがって標識として特によく適合する。化学発光化合物は、例えば化学発 光のような直接的光放射を導く生成物を産生ずることにより、所望の増幅を提供 する。

シグナル産生システム（ｒｓｐｓＪ）：シグナル産生システムの機能は、結合お よび／または非結合標識量に関連して検出できるシグナルを提供する生成物を産 生ずることである。ｓｐｓは１種またはそれ以上の成分を有し得る。ｓｐｓは、 ｍａｌと相互作用してシグナルを産生できるシグナル産生手段を含む、測定可能 なシグナルを産生ずるのに必要な全ての試薬を含む。

／グナル産生システムは、外部手段、標準的には電磁放射測定、望ましくは目視 検査により検出可能な／グナルを提供する。例えば、シグナル産生システムは、 発色基質および酵素を含むことができ、発色基質は、紫外部または可視領域、蛍 りん光体または蛍光体で、光を吸収する色素に酵素的に変換する。

／グナル産生手段は、／グナル産生システムの成分と相互作用して検出可能なシ グナルを産生できる。そのような手段は例えば、電磁放射、熱、化学試薬および 類似物を含む。化学試薬を使用する場合、ある種の化学試薬は、展開液の１部分 として含め得る。化学試薬は、基質、補酵素、エンハンサ−５第２酵素、活性化 剤、コファクター、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、シグナル発生物質の 結合に必要な特異的結合基質および同種物を含むことができる。補酵素、酵素物 質、池の酵素および触媒等と反応する物質のようなある種の化学試薬は、他の分 子または支持体に結合することができる。

補助物質　様々な補助物質が、本発明の測定法で頻繁に使用される。例えば、緩 衝液は、アッセイ培地および測定成分の安定剤とともに標準的にアッセイ培地に 存在する。しばしば、これらの付加物に加えて、アルブミンのような蛋白質；ホ ルムアミドのような有機溶媒：第４級アンモニウム塩；硫酸デキストランのよう なポリアニオン、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤；結合エンハンサ−、 例えばポリアルキレングリコールおよび類似物を含むことができる。

完全または部分的逐次配列性・本発明で利用する試料および様々な試剤が付随的 に（同時に）でなく結合する場合、１種またはそれ以上が残りの試剤の１種また はそれ以上と結合して剛結合を形成することができる。各剛結合は、その後本発 明の方法の１またはそれ以上の段階に付すことができる。こうして、各剛結合は 、それぞれの条件下に培養して、１またはそれ以上の所望の結果を達成すること ができる。

本発明のスピロアクリダン化学発光化合物は、アクリジンの誘導体である。これ らの化合物は、６−１０の範囲内、好ましくは７−９の範囲内の緩和なｐＨで、 前もって酸性化しないで過酸化水素と接触して、発光させることができる。

本発明の化学発光化合物の検出能力は、最も有効な化学発光アクリジニウム塩の １種であるＮ−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸フェニルに少なくとも匹 敵する。本発明の化合物は、化学発光体として上記アクリジニウム塩の使用より もっと好ましい。アクリジニウム塩がアクリジニウムエステルまたはアミドとし て水中で貯蔵される場合、蛋白安定要件と一致するｐＨで、水酸化イオンを疑似 塩基を形成させるために加える。化学発光は、次いでアクリジニウム塩を再生す る酸を始めに加え、続いてアルカ性過酸化水素を加えることによらないでは、効 果的に開始されない。一般に、これらの条件は、受容体−リガント結合を開裂し 、望ましくな（複雑であるため、イムノアッセイ法には理想的ではない。本発明 の化合物は、疑似塩基形成には影響されないという利点を有する。それ故、化学 発光体は、過酸化水素を加えることにより１段階で開始できる。

本発明の化学発光化合物は、ｐＨ４−７、好ましくは脱ガスして、約０．１−５ ％の共存溶媒、例えばアセトニトリルを含む緩衝液中で貯蔵できる。貯蔵温度は 約４℃にする。

過酸化水素は、過酸化水素の添加により直接供給できる。過酸化水素はまた、過 酸化水素産生手段により供給することもできる。過酸化水素を産生ずる１手段は 、例えば過ホウ素酸や、過酸化ジベンゾイルまたはメタクロロ過安息香酸のよう な過酸化ア／ルのような、水性アッセイ培地に加えたとき過酸化水素を生成する 化合物である。本発明での使用に適する、他の過酸化水素産生手段は、オキシダ ーゼおよびそれに対応する基質、例えばグルコースオキシダーゼおよびグルコー スの使用である。過酸化水素はまた、ジチオエリスランまたはヒドロキノンのよ うな還元剤、および鉄または銅のような金属イオンの使用により産生ずることが できる。

場合によっては、化学発光を増強するために、過酸化水素に加えて触媒を加える ことができる。適当な触媒には、過ホウ素酸塩、過硫酸塩、高酸化状態での金属 の過塩、西洋ワサビペルオキ／ダーゼ、ヘモグロビン、鉄フタロシアニンおよび フエロンアン化カリウムが含まれるが、いずれも例示であって、これらに限定さ れるものではない。

本発明の化学発光化合物の１つの態様は、式。

（式中、ＸおよびＹは、独立してＯ，Ｓ、ＳｅおよびＮＨからなる群から選択さ れ、Ｚは原子１−５個の長さの鎖であり、化合物（Ｄの０−８個の水素が、単独 または一緒になってＷにより置換されていることができ、各Ｗは独立して選択さ れ、水素以外の１−５０個の原子を含む。化合物（＋）の芳香族炭素原子１−４ 個は、窒素原子で置換できる。さらに、化合物（１）の０−１個の水素は、有機 ラジカルによって置換できる） を有する化合物（１）である。

化合物（１）は、本発明の範囲から逸脱することなく多様な上記Ｗ置換体を有し 得る。個々の置換基選択は、本発明の化学発光体特性を有する安定な化合物を製 造する当業者の能力によってのみ限定される。しばしば、電子供与性置換基が過 酸化物との反応性を増加するために使用される。これらの電子供与基には、ヒド ロキシ、エーテルおよびアミド、特にジアルキルアミンが含まれるが、いずれも 例示であって、これらに限定されるものではない。反応性の低下が望ましい場合 、電子吸引基を使用し得る。これらの電子吸引基には、アリール；カルボニルま たはスルホニル、ハロゲン、特にフッ素および塩素およびペルフルオロアルキル 、ポリフルオロヒドロカルビルおよびトリクロロエチルのような基；スルホンア ミド：およびカルバメートが含まれるが、例示であって、これらに限定されるも のではない。

さらに、放射光の波長を移動させる蛍光基を結合することが望ましいこともある 。一般に、蛍光体は４００ｎｍ以上の波長で光を吸収するものである。有用な蛍 光体には、ウムベリフエロンのようなりマリン類：フルオレセインおよびローダ ミンのようなキサンチン類：およびスクアレート類を含むが、いずれも例示であ って、これらに限定されるものではない。さらに、トリブレットエネルギーを受 け入れ、その後効果的に放射する基、例えばランクニドキレート類、特にＥｕお よびＳｍ、およびジブロモアントラセンを使用することができる。

化合物の（１）の好ましい態様では、ＸおよびＹは独立してＯｌＳおよびＮＨか らなる群から選択され；Ｚは原子１−２個の長さをもつ鎖である。さらに好まし くは、Ｚは、少なくともベンゼン環中の１個の水素がＷで置換されているベンゼ ン環の１部である炭素原子、２＠を含むものである。そのような化合物の例は、 を有する化合物（Ｉａ）である。

化合物（１）として記載する群中の他の化合物例は、次のとおりであるが、いず れも例示であって、これらに限定されるものではない：次の構造を有する化合物 （Ｔｂ）： 鴫 次の構造を有する化合物（ＩＣ）： 次の構造を有する化合物（Ｉｄ）　・ 次の構造を有する化合物（Ｉｅ）： 次の構造を有する化合物（Ｉ　ｆ’）　・ＣＩ″３ 本発明の化学発光化合物の他の実施態様は、式。

（式中、ＸｏおよびＹ゛は、各々１個の原子の鎮を含んで成るものであり、独立 してＯ，Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ，ＮＲ’、Ｎ５Ｏ２Ｒ’およびＮＣＯＲ’からなる群か ら選択され、ここでＲ゛はアルキル、アリールおよびハロゲン化アルキル基から なる群から選択されるものであり：Ｚは１−２個の原子の鏑を含んで成るＸｏお よびＹ゛を連結する基であり、ここで１個の原子はＣであり、もう１個の原子は 、Ｃ，Ｏ。

ＳおよびＮからなる群から選択されるものである。化合物（ＩＩ）の１個または それ以上の水素は、環または二重結合を一緒になって形成することができる１個 またはそれ以上の有機ラジカルによって置換されていることができ、工ないし４ 個の芳香族炭素原子は、窒素原子により置換されていることができる）を有する 化合物（ＩＩ）である。

化合物（ＩＩ）として記載する群中の化合物の例は、次のとおりであるが、いず れも例示であって、これらに限定されるものではない；次の構造を有する化合物 （Ｉｌａ）： および次の構造を有する化合物（ＩＩｂ）：〇５ 本発明の化学発光化合物の他の実施態様は、式：（式中、Ｘ°゛およびＹ”は、 各々１個の原子の鎖を含んで成るものであり、独立して０、ＳおよびＮ（Ｅ）ｐ Ｒ”からなる群から選択され、ここでＥはＣＯおよびＳＯ７からなる群から選択 され、ｐは０−１の整数であり、またＲ”は、Ｈ１低級アルキルおよびハロゲン 化低級アルキルからなる群から選択され；Ｚｏｏは、ｌ−２個の原子の鏑を含む ｘ゛およびＹ”を連結する基であり、ここで１個の原子はＣであり、池の原子は 、Ｃ，Ｏ，ＳおよびＮからなる群から選択される。化合物（ＨＩ）の１個または それ以上の水素は、有機ラジカルにより置換され得る。

有機ラジカルは特異的結合対メンバー、例えばハブテンまたは抗体であるこてが でき、またこのラジカルは蛍光基であることができる）を有する化合物（ＩＩＩ ）である。

この群の化合物の例は、次の構造： ｄＨｌ 化合物（ＩＩＩ　ａ　）である。

本発明の化学発光化合物の他の実施態様は、式：（式中、ｘ゛“およびＹ°°゛ は、各々１個の原子を含み、独立してＯｌＳおよびＮＨからなる群から選択され 、Ｚ°゛°は１−２個の原子の鎖を含むＸ゛°゛およびＹ”゛を連結する基であ り、その１個の原子はＣであり、他のの原子は、Ｃ，ＯＳＳおよびＮからなる群 から選択される。化合物（ｍの１個またはそれ以上の水素は、有機ラジカルによ り置換されていることができる）を有する化合物（ｍである。

この群の化合物の一例は、次の構造。

を有する化合物（ＩＶａ）である。

本発明の化学発光化合物は、ｐＨ約６−１０、好ましくは７−９で発光するもの であり、過酸化水素により化学的に活性化することができる。

この化学発光化合物は、溶解性特性を付与する基または官能性を含むことができ る。例えば、化合物を少な（とも１ナノモル程度の水溶性にさせる基または官能 性を化合物中に取り込むことが可能である。水溶性を付与する基は、一般に水素 以外の原子１−３０個、好ましくは１−１２個を含み、その原子は、炭素、酸素 、窒素、硫黄、リンおよび原子番号９−５３のハロゲンからなる群から選択され るものである。そのような基または官能性群は、硫酸塩、リン酸塩、ホスホナー ト、カルボキシレート、ヒドロキシ、アミン、エーテル、アミド及び同種物を含 むことができる。化合物を脂溶性にする基または官能性を化合物中に取り込むこ ともできる。脂溶性を付与する基は、通常少なくとも総計７個の炭素原子、好ま しくは少なくとも１２個の炭素原子を有する１個またはそれ以上のアルキルまた はアリール基を含み、かつ、ハロゲン以外のへテロ原子対炭素の低い比率、通常 ０−１０％を含む。そのような基または官能性群には、ベンジル、ドデシル、エ イコ／ル、ジオクチルアミ人デンルオキシ及び類似物が含まれるが、これらは例 示であって、これらに限定されるものではない。

本発明の化学発光化合物は、他の化合物、例えば、特異的結合対（ｓｂｐ）メン バー、例えばリガンド、ハブテン、受容体、抗体、または核酸、または蛍光分子 とアソノエートしてもよい。好ましくは、この化学発光化合物は結合手または連 結基によってこの他の化合物と共有結合している。

池の化合物は、任意の原子に結合していすることができるが、しばしば、アクリ ジン環／ステムの窒素と、または特に連結基が芳香族環を含む場合に、連結基Ｚ と結合していることが好都合である。幅広い多様な連結基が、化学発光化合物お よび例えばｓｂｐメンバーのような他の化合物を結合するために使用することが できる。連結基の選択は、入手できる官能性、または化学発光化合物またはＳｂ ｐメンバー中に存在するか、または容易に導入できる官能性、所望する連結アー ムの長さ、特定の環境に提供する連結アームを有することの望ましさ、化学特性 または物理的特性、例えば陽性または陰性荷電、溶解性増強、双極性効果等によ り幅広く変化する。連結基は、好ましくは非オキソカルボニル、カルバモイル、 チオカルバモイル、スルホニル、アミノ、チオ、特に非オキソカルボニルを有す る官能性、およびそれらの硫黄アナログを含む。

結合のための官能性、例えば、カルボン酸、ヒドロキシル、チオール、アミノ、 アルデヒド、例えばマレイミドのような活性エチレン、スルホン酸及び同種物は 、それらの官能性が化学発光化合物またはｓｂｐメンバーに本来存在しない場合 は、該化学発光化合物またはｓｂｐメンバーに導入することができる。ｓｂｐメ ンバーが関連するコンジュゲーションの方法は、例えば米国特許第３．８１７． ８３７号に記載されており、その関連する開示は、参照して本明細書に包含する 。

本発明の化合物は、例えば次の反応順序により製造することができ、その個々の 段階は別々に当業者に知られているものである。本発明の化学発光化合物のうち 、あるものは、相当する９−アクリジニウムカルボン酸またはそれらの活性化誘 導体から有利に製造できる。化合物は、化合物Ｈ−Ｙ−Ｚ−Ｘ−Ｈ（Ｘ、Ｙおよ びＺは化合物（１）と同じと定義される）と反応させることができる。同様に、 Ｈ−Ｙ’−Ｚ’−Ｘ’−Ｈが適用でき、以下同様である。テトラヒドロフラン、 エタノール、塩化メチレン、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシド のような極性溶媒を、通常使用する。Ｈ−Ｙ−Ｚ−Ｘ−Ｈの特異的な構造によっ ては、第３級アミン、炭酸カリウムまたは水素化金属のような非求核性塩基を使 用することが望ましいこともある。得られる生成物は、収集され、例えば再結晶 、昇華、クロマトグラフィー等により精製できる。

本発明の１つの実施態様は、過酸化水素、または過酸化水素を産生ずる手段を含 む、ｐＨ６−１０の水溶液中に本発明の化学発光化合物を含んで成る化学発光組 成物に関する。化学発光化合物は、ｓｂｐメンバー、例えばハブテンまたは抗体 のような別の分子と上記方法でアソシエートさせることができる。化合物（１） は、そのような組成物に使用するものに特に適している。過酸化物を検出しよう とする場合、相対的に高濃度の、通常１０−６ないし１０”Ｍ、好ましくは少な くとも１０−”Ｍの化学発光化合物を有することが通常望ましい。化学発光化合 物が標識として使用される場合、通常１０”−１０−ＩＭ、好ましくは少な（と も１０゛！Ｍの高濃度過酸化物を使用するのが通常望ましい。

本発明の他の実施態様は、過酸化水素と本発明の化学発光化合物、例えば化合物 （ＩＩ）と含む、光放射化学組成物である。少なくとも１０”Ｍの化学発光化合 物と、少なくとも１０４Ｍの過酸化水素またはこの濃度の過酸化水素を産生ずる 手段、とを有することが通常好ましい。さらに好ましくは、少なくとも１０−５ Ｍの化学発光化合物と少なくとも１０°２Ｍの過酸化水素とである。

本発明の他の実施態様は、次の式： （式中、Ａは本発明の化学発光化合物、例えば化合物（ＩＩＩ）であり、Ｌは連 結基、モしてＱは水素またはｓｂｐメンバーである）を有する化合物に関する。

本発明の方法および組成物は、リガンド−受容体、例えば抗原−抗体反応、ポリ ヌクレオチド結合アッセイ、等のような、ｓｂｐメンバーが関連するほとんどの 測定法に適用することができる。これらの測定法は、均一系または非均−系、競 合的またはサンドイッチ型である。均一系アッセイのやり方では、試料は、もし 不要な物質を除去することが必要ならば、前処理される。サンドイッチ型アッセ イのための免疫反応には、通常、分析物に相補的であり、化学発光化合物に結合 する抗体のようなｓｂｐメンバー、第２８ｂｐメンバー、例えば、分析物にやは り相補的である抗体、および対象となる試料が関連する。競合的プロトコールで は、化学発光化合物は、分析物に類似であり、通常その誘導体であるｓｂｐメン バー、分析物または例えば抗体のような分析物に相補的であるｓｂｐメンバーと アソノエートされ得る。

測定法において本発明の化合物を使用する利点は、当技術分野で知られている他 の化学発光化合物を用いる場合のように、活性化前にアッセイ培地のｐＨを増加 させておく必要がないことである。

均一系アッセイでは、全ての試薬を合せた後、必要ならばそれらをインキコベー トしてもよい。その後、化学発光化合物を活性化させ、得られる光放射を測定す る。放射光は、試験した試料の分析物量に相関する。均一系アッセイで使用する 本発明の試薬の量は、分析物の性質により異なる。

非均−系アッセイのやり方では、ｓｂｐメンバーである分析物を含む可能性のあ る試料は、化学発光化合物を有する表面または粒子であり得る支持体に結合させ た相補的なｓｂｐメンバーを含む試薬と合せる。これらのものは、一般に同時に 、または一括して、または部分的に順次合せる。その後、支持体は液相から分離 し、固相または液相のいずれか一方について、通常過酸化物を供給する手段を供 することにより、蛍光エネルギーの存在を検査する。

本発明のい（つかの異なった実施態様は、分析物を測定する方法における化学発 光化合物の使用に関する。本発明の化学発光化合物により産生される発光または 光は、以下に記載した測定法で視覚的に、写真的に、光量測定的に、分光分析的 に、または任意の他の好便な手段により、培地中の分析物量に相関するそれらの 量を測定することにより、測定することができる。研究または臨床適用用に設計 された発光光度計、蛍光光度計、インスタント写真機およびフィルター等を含む 、多様な商業的に入手可能な装置が、化学発光検出用に適している。通常化学発 光は、視覚的よりむしろ機器的に検出し、通常、光量測定的または写真的よりむ しろ光電子増倍管またはフォトダイオードにより検出する。

上記方法の１つは、化学発光溶液の溶液と未知量の過酸化水素を有する試料を合 わせ、発生する発光、その量は試料中の過酸化水素量に相関する、を検出する段 階を有する。

上記方法の他の１つは次の各段階：　（ａ）（１）分析物を含む可能性のある試 料、（２）本発明の化学発光化合物、例えば化合物（ＩＩ）　、および（３）化 学発光化合物を化学的に活性化する手段、を液体培地中で合わせ；そして（ｂ） その量が試料中の分析物量と相関する化合物により発生した発光量を検出する、 を有する。

段階（ａ）における各要素の混和は、同時または連続的に起こることができる。

例えば、化学的活性化手段が過酸化水素である場合、１つの態様では、過酸化水 素は、試料および化学発光化合物の混和と同時に培地と混和する。別の態様では 、過酸化水素は、試料および化学発光化合物の混和後、培地に加える。

別の方法は、（１）化学発光化合物と、直接または間接的に過酸化水素を産生し 得る分析物を含むことができる試料の結合、（２）分析物存在の作用として過酸 化水素を産生ずるために必要な任意の補助試薬の添加、および（３）混合物によ り産生ずる発光の検出、を含み、各成分は任意の都合のよい順序で加えることが できる。

本発明の別の態様では、化学発光化合物は、支持体、好ましくは化学発光化合物 の放射波長で光を吸収しない支持体に結合する。過酸化水素または過酸化水素の 形成に影響することができる分析物を含む可能性のある試料は、支持体を流れ通 りすぎ、支持体の表面で産生された発光が検出される。この態様は、特に注入流 動分析および連続流動分析に適用する。

本発明の別の態様は、次の各段階：　（ａ）（１）分析物を含む可能性のある試 料および（２）化学発光化合物、例えば化合物（ＩＩＩ）とアソシェートする第 １ｓｂｐメンバーを含む標識試薬（ここで第１ｓｂｐメンバーは分析物、または 分析物に結合することができる第２ｓｂｐメンバーに結合して、分析物の存在に 相関する量の複合体を形成する）を培地中で合わせ：　（ｂ）化学発光化合物を 化学的に活性化し、さらに（Ｃ）化学発光化合物により発生する発光量、その量 は試料中の分析物量に相関する、を検出する、を有する分析物の測定方法を含む 。

段階（ａ）では、ｓｂｐメンバー複合体は、分析物の存在に相関して形成される ように条件が選ばれる。例えば、第１ｓｂｐメンバーは、分析物または第２ｓｂ ｐメンバーに結合することができ、分析物の存在に相関して、複合体を形成する 。

第１ｓｂｐメンバーは化学発光化合物に共有結合することができる。分析物およ び第１ｓｂｐメンバーは、各々独立してリガンド類、受容体類およびポリヌクレ オチド類からなる群から選択される。第２ｓｂｐメンバーは、分析物に類似また は相補的である。別の態様では、第２ｓｂｐメンバーは、支持体に結合している 第３ｓｂｐメンバーに類似または相補的である。

段階（ａ）で形成された複合体は、支持体に結合したものとできる。別の態様で は、第２または第３ｓｂｐメンバーを支持体に結合する。

本発明の分析物測定方法の別の態様は、次の各段階を含む：　（ａ）（１）分析 物を含む可能性のある試料および（２）標識試薬を含むｓｂｐメンバー複合体が 試料中の分析物の存在に関連して形成される条件下、化学発光化合物、例えば化 合物（ＩＶ）に結合している特異的結合対のメンバー（ｓｂｐメンバー）を含む 標識試薬を合わせ；　（ｂ）化学発光化合物を化学的に活性化し、さらに（Ｃ） アッセイ培地をその存在または強度が試料中の分析物量に相関するシグナルにつ いて試験する。化学的活性化は、過酸化水素によりすることができる。

第１ｓｂｐメンバーは、分析物に類似または相補的であり得る。アッセイ培地は 、分析物以外に第２Ｓｂｐメンバーを含むことができ、それは分析物および／ま たは第１ｓｂｐメンバーに相補的または類似であり得る。第２８ｂｐメンバーは また第３ｓｂｐメンバーに類似または相補的であり得る。分析物およびｓｂｐメ ンバーは、各々独立してリガンド類、受容体類およびポリヌクレオチド類からな る群から選択される。

本方法では、第２または第３ｓｂｐメンバーは、支持体に結合しているかまたは 結合したものとなり得る。支持体は、標識試薬の添加より前に、と同時に、また は、に引き続いて、アッセイ培地に混和してもよい。

分析物測定方法の別の態様は、次の各段階を有する・　（ａ）（１）分析物を含 む可能性のある試料、（２）化学発光化合物、例えば化合物（ＩＩ）に結合して いる特異的結合対（ｓｂｐメンバー）の第１メンバーを含む標識試薬、および（ ３）第２ｓｂｐメンバーを含む不溶性化試薬を、標識試薬および不溶性化した試 薬を含むｓｂｐメンバー複合体が、試料中の分析物の存在に関連して形成される 条件下に、全部一度にまたは一部づつ順次にアッセイ培地中に混和し、（ｂ）ア ッセイ培地および不溶性化試薬を分離し：　（Ｃ）培地中または不溶性化試薬上 で化学発光化合物を化学的に活性化し、さらに（ｄ）その存在または強度が試料 中の分析物量に相関するシグナルについて、アッセイ培地または試薬を試験する 。化学的活性化は過酸化水素によりすることができる。

本方法の分析物およびｓｂｐメンバーは、各々独立してリガンド類、受容体類お よびポリヌクレオチド類からなる群から選択される。ｓｂｐメンバーは分析物　 。

に相補的であり得る。１つの態様では、第１ｓｂｐメンバーは、分析物に類似し ており、第２ｓｂｐメンバーは、分析物および第１ｓｂｐメンバーに相補的であ る。

本発明の別の態様は、分析物の存在または量が、過酸化水素および化学発光化合 物、例えば化合物（ＩＩＩ）により産生ずる発光に相関し、その改良が過酸化水 素と本発明の化学発光化合物との反応により発光を産生ずることを含むところに ある、分析物の改良測定法に関する。

本発明の化学発光化合物は、オキシダーゼ活性の検出、またはオキシダーゼの基 質として役立つ化合物の存在についての測定に特に有用である。オキシダーゼは 、その基質との反応により過酸化水素を産生じ、化学発光化合物を化学的に活性 化する。例えば、グルコースオキシダーゼを含む可能性のある培地へのグルコー スの添加またはその逆は、オキシダーゼが培地に存在すると、過酸化水素の産生 をもたらす。本発明の化学発光化合物を培地に加えると、過酸化水素により活性 化すると発光する。

さらに一般的に、本発明の化学発光化合物は、過酸化水素を産生ずる他の触媒ま たは試薬の検出に有用である。例えば、鉄および銅塩は、メルカプタンまたはヒ ドロキノンのような適当な還元剤の存在で過酸化水素を産生ずる。過酸化水素を 産生ずるために必要とされる各成分のうち１種を除いた全てと結合した本発明の 化合物は、残留成分を含む可能性のある試料と混和することができ、その存在は 発光量を検出することにより測定する。

反応は溶液中で実施することができ、また１種またはそれ以上の成分を支持体に 結合させてすることができる。例えば、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸オキシダ ーゼを支持体に、また本発明の化合物を支持体に結合することにより検出するこ とができる。Ｄ−アミノ酸を含む可能性のある溶液試料は、次いで支持体上のＤ −アミノ酸オキシダーゼに接触させ、さらに同時に、または順次に支持体上の化 学発光化合物に接触させる。培地は、回収率、酵素の安定性、および化学発光化 合物の過酸化水素との反応性を最適化するのに適した水性緩衝液であることがで きる。

アッセイ法が水性培地に関連する場合、化学発光化合物が水溶性を付与する基ま たは官能性を含むものとするのが望ましい。このような基または官能性は、化学 発光化合物がコンジュゲートするｓｂｐメンバー、例えばポリ（アミノ）酸であ ることができる。このような基または官能性はまた、それ自身化学発光化合物の １部分であることができる。水不溶性化学発光化合物もまた、例えば培地が水以 外の場合に、使用することができる。そのような化合物は固体支持体に結合して いるか、またはその水が、化学発光化合物を可溶性にする物質を含んでいる。そ のような物質は、例えば、洗浄剤または例えばシクロデキストリンのような錯化 剤であることができる。

本発明の１一つの態様では、化学発光化合物はエネルギー受容体に結合する。本 明細書中で使用するとき、「エネルギー受容体」という用語は、３１．Ｏｎｍよ り高く、標準的には３５０ｎｍより高く、好ましくは約４００ｎｍより高い波長 の一般に使用した化学発光化合物により左右され、通常化学発光化合物の放射光 を吸収することができる。エネルギー受容体はまた、化学発光化合物に結合させ ずにアッセイ培地中に含めることができる。この状態では、エネルギー受容体の 吸収最大値は、化学発光化合物の放射最大値と類似する波長であることが好まし い。

高い吸光係数が望ましく、通常１０以上、好ましくは１０”以上、特に１０４以 上であるのが好ましい。エネルギー受容体の濃度は、通常１０−・から１０”Ｍ 、好ましくは１０−４から１０−’Ｍが好ましい。通常、エネルギー受容体は、 高い量子収率、好ましくは少なくとも０．１で蛍光を発する。そのような上記蛍 光体の多くは、アメリカ特許第４．１７４．３８４号、第７および８欄に記載さ れており、その関連する部分は引用して本明細書に包含する。

分析物の上記測定法は、一般に最適アッセイ感度をもたらす緩和なｐＨで、水性 緩衝培地中で標準的に実施される。上で説明したように、測定法は、任意のアッ セイ成分または産生物の分離なしに（均−系）または分離を伴って（非均−系） のいずれかで実施することができる。

水性培地は、水だけであることができ、また０　０１ないし８０またはそれ以上 の容量パーセントの共存溶媒を含むこともできる。水性溶媒では、培地のｐＨは 、通常約４ないし１３の範囲、さらに多（の場合、５ないし１０の範囲、好まし くは約６５ないし９，５の範囲にある。ｐＨは、結合メンバーを使用する場合、 通常、結合メンバーの最適結合、ノブナル産生システムのメンバーのような他の アッセイ試薬の最適ｐＨ１および各試薬および分析物の安定性の妥協である。例 えば、活性化化学発光化合物は、減衰して発光を生成するために、ｐＨ６−１０ 、好ましくは７−９の範囲内のｐＨを必要とする。

水性培地中では、所望のｐＨを達成し、かつ測定中そのｐＨを維持するために様 々な緩衝液を使用することができる。緩衝液の例としては、ホウ酸塩、リン酸塩 、炭酸塩、トリス、バルビツールおよび類似物がある。使用した特定の緩衝液は 、本発明で限定的ではなく、個々のアッセイでは、１種または他種の緩衝液も好 適に使用のできる。非水性培地が使用される場合、それは通常、アルコール、エ ーテル、エステル、ハロアルカン、スルホキシド、アミドおよび類似物のような 極性溶媒を含む。

緩和な温度が標準的にアッセイを実施するのに使用され、測定中は、通常一定の 温度、好ましくは室温が使用される。インキュベーション温度は、標準的に約５ ℃ないし９９℃、通常約１５℃ないし７０℃、さらに多くの場合的２０℃ないし ４５℃である。測定中の温度は、一般的に約１０℃ないし７０℃、さらに多（の 場合は約２０℃ないし４５℃、さらに多（の場合２０℃ないし２５℃の範囲であ る。

測定できる分析物の濃度は、一般的に約１０−６ないし１０−”Ｍ、さらに多く の場合、約１０１ないし１０−１４Ｍで変化する。測定法が定性的か、半定量的 か、定量的であるかどうかの考慮、個々の検出技術、および対象となる分析物の 濃度が、通常、各種試薬の濃度を決める。

アッセイ培地中の各種試薬の濃度は、一般的に分析物の対象となる濃度範囲によ り定めるが、各試薬の最終濃度は、通常、その範囲内で測定法の感度を最適化す るために実験的に決定される。すなわち、重要な分析物の濃度の変更は、正確に 測定できるシグナルの差異を提供する。

添加の順序は広く変更し得るが、測定法の性質により異なってくるある優先順序 がある。特に均−系アッセイの場合、最も簡単な添加順序は、全ての材料を同時 に加えることである。別法としては、試薬類を全部または一部づつ順次に合わせ ることができる。場合によっては、インキュベーション段階は、試薬を混和した 後、一般的には約３０秒ないし６時間、さらに多くの場合は約２分ないし１時間 の範囲内で行うことができる。

化学発光化合物が分析物の存在の結果として表面とアソシエートさせられる場合 、通常ｓｂｐメンバーとアソシエートする。これは、多種の方法で達成できる。

化学発光化合物は、ｓｂｐメンバーに結合するための官能性を含むことができ、 またはｓｂｐメンバーは、化学発光化合物に結合するための官能性を含むことが できる。この結合は、２分子間の直接結合により達成することができ、または連 結基を、ｓｂｐメンバーおよび化学発光化合物間で使用することができる。別の 態様では、化学発光化合物は、ｓｂｐメンバーにもまた結合している粒子に結合 または取り込むことができる。いずれの場合でも、ｓｂｐメンバーは分析物に結 合することができる。化学発光化合物は、少なくとも粒子の１相中に可溶性とす ることにより粒子中に取り込むことができる。化学発光化合物は、それが粒子に 取り込まれない場合、粒子に結合させることができる。この理由で、化学発光化 合物または粒子、またはそれらの成分は、化学発光化合物および粒子を結合する 手段を提供するために官能性化する。油滴または脂質二重層である粒子では、化 学発光化合物は、粒子組成物と適合する長い炭化水素鎖に結合することにより粒 子に結合することができる。しばしば、８ないし２０個以上の炭素原子を有する 少なくとも１種、好ましくは２種の炭化水素鎖を使用する。

上記のように、化学発光化合物は、ｒｓｂｐメンバーにアソシエートする」こと ができ、それ故に本発明の化合物の１つの用途は、標識である。本明細書中で使 用するとき、ｒｓｂｐメンバーにアソンエートする」という用語は、次のことを 含む。通常、化学発光化合物およびｓｂｐメンバーのアソンエーションは、共有 結合による。しかしながら、標識試薬は、さらに化学発光化合物が結合または、 化学発光化合物を非共有的に取り込む懸濁可能粒子を含み得る。懸濁可能粒子は また、それに結合するｓｂｐメンバーをも有し得る。このｓｂｐメンバーは、一 般に分析物または、分析物に結合できるｓｂｐメンバーと結合することができる 。

化学発光化合物と結合したｓｂｐメンバーはまた、分析物に類似であることがで き、その場合は、競合的アッセイプロトコールを生じ得る。

明らかなように、本発明の測定法は、簡単で、効率的、再生できる方法で幅広く 多様な分析物を検出および測定する便利な方法を提供するものであり、それは、 反応中に産生される光の量を測定するために目視検査または慣用の装置を使用す ることができるものである。

以下のアッセイは、当業者が本発明の範囲を認識し、過度の実験を要しないで本 発明を実施できるようにするために、例示として提供するもので、制限するため のものではない。分析物、化学発光化合物、表面、粒子および反応条件の選択は 、本書の開示および以下の実施例を考慮して当業者に示唆するものであることが 認識されよう。

以下のアッセイでは、各成分は主にｐＨ６ないし１０の水性培地で合せる。

（Ａ）ｈＣＧのアッセイでは、本発明の化学発光化合物、例えば、ｈＣＧに対す る抗体にコンジュゲートした化合物（Ｉｌａ）を利用する。

尿試料を抗ｈＣＧ化学発光化合物コンジュゲート：および１ミクロンラテックス 粒子に結合しているｈＣＧの分離非重複エピトープに対する抗体と合せる。懸濁 液を３０分間インキュベージタン後、粒子を遠心分離により培地から分離し、洗 浄し、ｐＨ８に緩衝した過酸化水素を含む水溶液に懸濁させる。化学発光化合物 と過酸化水素との反応中に放射した光の強度は、試料のｈＣＧ量に直接関係する 。

（Ｂ）血清中のジゴキシンのアッセイでは、ジゴキンゲニンにコンツユゲートし た本発明の化合物、例えば化合物（ＩＩＩａ）を利用する。ジゴキシゲニン化学 発光化合物共役体 鴫 は、その表面をジゴキシンに対する抗体で被Ｉしたポリスチレンウェル中で試料 をインキュベートする。１０分間のインキュベーション後、ポリスチレンウェル を洗浄し、ｐＨ９で過酸化水素を加える。過酸化水素の添加に続いて放射した光 の強度は、試料中のジゴキシン濃度に逆相関する。

（Ｃ）尿中のアルブミンのアッセイでは、アルブミンに対する抗体にコンジュゲ ートした本発明の化学発光化合物、例えば化合物（Ｉｃ）を利用する。試料は、 抗アルブミン化学発光化合物コンジュゲート。

およびガラスピーズに結合した非重複アルブミンエピトープ配同性のアルブミン の抗体と合わせる。培地を１０分間インキュベートし、ビーズを分離し、洗浄す る。次いで、ビーズを過酸化水素添加水性培地中に移す。放射光の強度は、試料 のアルブミン量に直接関連する。

（Ｄ）ＤＮＡを含む試料中の標的ポリヌクレオチド配列のアッセイでは、標的配 列に相補的である最初の２５塩基オリゴヌクレオチドの３°末端は、本発明の化 合物、例えば化合物（Ｉｂ）： にコンツユゲートする。最初のオリゴヌクレオチドの結合部位に隣接し、かつそ の５°側にある部位で、標的配列に相補的な第２の２５塩基オリゴヌクレオチド の５°末端は、フルオレセインにコンジュゲートする。２種のオリゴヌクレオチ ドを試料と混合する。培地はその後７５℃に加熱し、存在する任意の標的配列へ オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせるために５５℃に冷ます。過 酸化水素を、ハイブリダイゼーション反応の完了後に加える。５２０ｎｍで放射 した光りを適当なバンドパスフィルターを使って測定する。この波長での光強度 は、標的配列の存在に直接関連する。

（Ｅ）血清中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアッセイでは、試料はＨＢＳ Δｇ抗原で被覆した試験管で、本発明の化学発光化合物に結合しているＨＢｓＡ ｇ抗体と合わせる。混合物を１時間インキュベーション後、試験管を洗浄し、過 酸化水素を加える。放射光の強度は、試料中のＨＢｓＡｇ量に相関する。

（Ｆ）グルコースオキシダーゼのアッセイでは、試料はグルコースおよび本発明 の化学発光化合物をｐＨ８の緩衝液中で合わせる。放射光の強度は、試料中に存 在するグルコースオキシダーゼ量を示している。

本発明の別の態様では、分析物を含む可能性のある試料中における、分析物の存 在または量を測定する本発明の測定方法を便利に実施するのに有用なキットに関 する。主題の発明の多能性を高め、試薬の割合が、この方法およびアッセイの価 値ある最適化を提供するために、試薬類は、同一または分離容器入り組合わせパ ッケージで提供することができる。試薬類は、各別の容器中に入れてもよいし、 各種試薬をそれらの試薬の交差反応性および安定性に応じて１つまたはそれ以上 の容器中に合せて入れてもよい。

上記キットの１種は、（１）特異的結合対メンバーを結合している本発明の化学 発光化合物、例えば化合物（１）を含む組成物、および（２）　ｉＡ過酸化水素 たは過酸化水素を産生ずる手段、組合わせパッケージを含む。本発明に含まれる 別のキットは、過酸化水素または過酸化水素の生成を調節する分析物の検出に有 用であり、（１）本書に記載した化合物Ａ−Ｌ−Ｑを含む組成物、および（２） 上記分析物が過酸化水素ではない場合、上記分析物から過酸化水素を産生ずるた めに必要とされる任！の補助試薬、の組合わせパッケージを含む。

過酸化水素を産生できる化合物の分析に有用な他のキットは、本発明の化学発光 化合物、および分析される化合物から過酸化水素を生成できる触媒を含む。

過酸化水素または過酸化水素の生成を調節できる化合物を検出するのに有用な他 のキットは、固体支持体に結合している本発明の化学発光化合物を含む。

キットはまた、１種またはそれ以上の付加的なｓｂｐメンバー試薬を含むことも できる。エネルギー受容体は、ｓｂｐメンバーまたは化学発光化合物に結合させ て試薬とすることができ、また、それ自体を試薬として提供することもできる。

表面に結合させたｓｂｐメンバーもまた含まれる。キットはさらに、補助試薬そ の他を含むアッセイを実施するための他の分離包装した試薬を含むこともできる 。

キットのｓｂｐメンバー（群）は、リガンド類、受容体類およびポリヌクレオチ ド類からなる群から選択してもよい。

以下の実施例は、例示として提供したものであり、これに限定されるものではな い。

実験 別に指示しない場合、全ての温度は摂氏表示である。別の指示がなければ、全て のパーセントおよび部は、容量表示の液体混合物を除き、重量表示である。

原料 エーテルおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、アルゴン雰囲気下、ナトリウ ム／ベンゾフェノフケチルから蒸留した。ピリジンおよびＮ、Ｎ−ジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）は乾燥し、使用前にＣａＨ，から蒸留した。無水ＣＨｓＣＮ はアルドリッチから購入した。トルエンは乾燥し、ナトリウムから蒸留した。過 酸化水素は、マリンクロットから３０％溶液として購入した。全ての他の化合物 は、市販品を購入するかまたは実施例に記載しているように合成した。別に言及 しない限り、全ての他の溶媒は、さらに精製しないで使用し、はとんどの反応は アルゴン雰囲気下で実施した。フラッシュクロマトグラフィーに使用したシリカ ゲルは、サイエンティフィック・プロダクツから購入した２３０−４００メツシ ュＡＳＴＭであるが、分取用プレート（１０００μ）および分析用プレートはア ナルテソクから購入した。

’Ｈ−ＮＭＲはＦＴ−ＩＢＭ　ＷＰ−１００ＭＨｚＮＭＲ分光計およびプルッカ ーＷＰ−３００ＭＨｚＮＭＲ分光計で記録した。全ての化学レットは、ＴＭＳよ り低磁場の６ユニツトで記録した。分裂パターンは次のように示す：Ｓ、シング レット、ｄ、ダブレット；（、トリブレット；ｑ、カルチット；ｍ、マルチプレ ット：およびす、ブロード。

赤外スペクトルは、パーキン・エルマー２９７１Ｒ分光計で記録した。略号、ｓ 、ｍおよびｂは、それぞれンヤーブ、メディウムおよびブロードを意味する。

脱離化学イオン化（ＣＩ）および電子イオン化（Ｅｌ）は、パリアン−ＭＡＴ３ １１Ａ、二重焦点高分解能質量分析計で行った。フィンニガンＴＳＱ−７０また はＭＡＴ−８２３０をＦＡＢ　（高速原子衝突）質量分析に使用した。

Ｕｖ可視吸収スペクトルおよび時間トレースを含む動態研究を、ＨＰ８４５２Ａ ダイオード配列分光光度計で行った。

化学発光測定は、オプトコンブＩおよびターナ−ＴＤ−２０６発光計で行った。

実施例１ 化学発光化合物（Ｉａ）の合成 １、Ｎ−メチルアクジノニウム９−カルボニル（ｐ−ニトロフエニレート）エス テル（２） Ｎ−メチルアクリジニウム９−カルボニル（ｐ−ニトロフエニレート）エステル （２）を、マツクカブラ等、ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー、第２ ４巻、第６１１頁（１９７０年）に記載された方法により、市販されているアク リジン９−カルボン酸（］）から３段階で製造した。

２　スピロアクリダン（Ｉａ）の合成 室温で乾燥アセトニトリル（５ミリ）を含む乾燥アルゴンで一掃した２０ｍ１丸 底フラスコに、エステル（２）（２３３ｍｇ、０．５ミリモル）および０−アミ ンフェノール（２２０ｍｇ、４．０ミリモル）を加えた。

反応混合物を、アルゴン雰囲気下２４時間静かに撹拌しながら７０℃まで加熱し た。溶媒を真空上蒸発させて黄色油状物を得、溶離剤として塩化メチレン中の２ ０％酢酸エチルを使用する、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカゲ ル、１０００ミクロン）で精製して、純粋な生成物として化合物（Ｉａ）を９８ ｍｇ　（６０％）を得た。

’Ｈ−ＮＭＲ：　（ＣＤＣＩ、、３００ＭＨｚ）：δ３．５　（ｓ、３Ｈ）、４ 、５　（ｂ　ｓ、ＮＨ）　、６．７−７、５　（ｍ、　１２Ｈ）［Ｒ（ＣＨＣＩ ｓ）　、ａｍ−’：３２５０　（ｗ）　、１７５０　（ｓ）　、１５９０　（ｓ ）、１４９０　（ｓ）、１４７０　（ｓ） 吸収スペクトル （０，８ｍｌホウ酸緩衝液、ｐＨ９，ｏ＋ｏ、２ｍｌＣＨ３ＣＮ）２６５ｎｍ　 （ε〜２０．０００） （０，８ｍ　ｌ希ＨＣ１１ｐＨｉ、　１＋０．２ｍ　ｌ　ＣＨｓＣＮ）３５７ｎ ｍ　（ε１５．６０００）　、４２５ｎｍ　（ε４０００）マススペクトル（Ｃ Ｉ）：ｍ／ｅ３２８　（Ｍ’）高分解能マススペクトル・ 実験式−Ｃｔ　ｌＨ＋　ｓ　Ｎ　２０２理論質量＋３２８．１２１１７８ 測定質量：　３２８．１２０８９２ 実施例２ 化学発光化合物（ＩＶａ）の合成 １０−メチルアクツノニウム−９−カルボキンレート（３）をマツクカプラ等、 ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー、第２４巻、第６１１頁（１９７０ 年）に記載された方法により製造した。

ＤＭＦ５．０ミリを含む乾燥２０ｍ１丸底フラスコに、カルボキシレート（３） （２７４ｍｇ、１．０ミリモル）およびカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（ ２２５ｍｇ、１．５ミリモル）を加えた。反応混合物を１６時間室温で撹拌した 。

この時点で、反応混合物の１部分が、過ホウ酸塩（ｐＨ９，５）を加えた場合、 高い化学発光性であることが見出された。アセトニトリル３ｍｌ中の１．２．４ −トリヒドロキシベンゼン（５０４ｍｇ、４．０ミリモル）を上記反応混合物に 加えた。反応は、１２時間アルゴン雰囲気下に置いた。

溶媒を真空上蒸発させて、油状物を得、それをクロロホルム中２０％アセニド１ ノルを使用して分取ＴＬＣ（シリカゲル、１０００ミクロン）で精製して、純粋 な生成物として化合物（ＩＶａ）１５２ｍｇ　（４４％）を得た。

’Ｈ−ＮＭＲ：　（ＣＤＣＩ　ｓ、１００ＭＨｚ）：δ３．５５　（ｓ、３Ｈ） 、６．６５−７．５　（ｍ、　１１Ｈ） ＩＲに−ト）、　Ｃｍ−’：３４５０　（ｍ）、　１７５０　（ｓ）、　１５９ ０　（ｓ）、１４６０　（ｓ） マススペクトル（ＣＩ）：ｍ／ｅ３４５　（Ｍつ実施例３ 化学発光化合物（ＩＨａ）の合成 １．２−アミンメチルスルホンアニリド（５）の合成ＣＨ，Ｃｈ　（１００ｍｌ ）のＯ−フェニレンジアミン（４）（５，２０ｇ、４８１ミリモル）の溶液を、 塩化メタンスルホニル（３，６ミリ、４６．５ミリモル）で処理し、その混合物 を、ＴＬＣが出発原料の消失を示すまで撹拌した。混合物を濃縮し、アルミナに 吸着させ、溶離剤としてＣＨ３ＣＨ２中のＣＨｓＯＨ（０−５％）の段階的クロ マトグラフにかけた。

黄褐色固体として得られた生成物（Ｒｆ＝０．６、ＣＨｚＣＩ　ｘ中１％Ｃｔ（ ３０Ｈ）を水性ＣＨ３ＣＨ２０Ｈから結晶化して、明褐色葉状物として化合物（ ５）６．０ｇ（６７％）を得た。

’Ｈ−ＮＭＲ：　（ＣＤＣｌ　３．１００ＭＨｚ）：６７．２０　（ｍ、　２Ｈ ）、６．８６　（ｍ、２Ｈ）　、６．２（ｂ、１Ｈ）２　スピロアクリダン（Ｉ ＩＩ　ａ　）の合成乾燥、脱ガスしたＣＨｓＣＮ　（１０ｍｌ）中のエステル（ ２）（８０ｍｇ、１２２ミリモル）のｖ４液を、アルゴン雰囲気下スルホンアニ リド（５）（４０ｍｇ、０．２２ミリモル）、続いて（ＣＨ３ＣＨ２）ｓＮ−滴 で処理した。

急速にほとんど無色になる当初、黄色の溶液を１４時間撹拌した。混合物を濃縮 し、分取ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨｔｅ１２溶離剤）で精製して、９−付加体（ ６）１０ｍｇ　（９％）と−緒に化合物（ＩＩＩａ）５２ｍｇ　（６０％）を得 た。この９−付加体は、ＴＨＦ中のＮａＨで容易に化合物（ＩＩＩ　ａ　）に変 換した。

’Ｈ−ＮＭＲ：　（ＣＤＣＩｓ、１００ＭＨｚ）：δ７．４−６．５　（ｍ、　 １２Ｈ）、４．４０　（ｓ、ＬＨ）　、３．５５　（ｓ、３Ｈ）　、３．５０　 （ｓ、３Ｈ）質量スペクトル（Ｅｌ）Ｃ２□ＨＩＩＮ３０３Ｓ＋の計算値：４０ ５実測値４０５（Ｍ”、１０％）、３２６　（Ｍ　５０２Ｃ８３，１００％）Ｕ Ｖ可視（ＣＨ，ＣＮ）、２８４ｎｍ（ε＝２０．０００）、３２８（ε＝８，０ ００）実施例４ 化学発光化合物（ＩＩａ）の合成 １２−アミノ−５−カルボキンメチルスルホンアニリド（８）の合成ジアミノ安 息香酸（７）（５，０ｇ、３２．８ミリモル）の乾燥ピリジン（１００ｍｌ）溶 液を撹拌し、０℃に冷却した。塩化メタンスルホニル（２，５ｍｌ。

３２３ミリモル）を３０分間にわたって１滴ずつ加えた。赤色溶液を室温で一装 置いた。

溶液をペースト状になるまでａ縮し、ＣＨｚＣｈ（２Ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、 濾過した。残留物を続いて冷水で洗浄し、５０℃で真空乾燥させた。ＩＨ−ＮＭ Ｒは、粗製物が４二１（化合物（８）　化合物（９））の異性体混合物であるこ とを示した。沸騰水から再結晶して黄褐色葉状物としてスルホンアニリド（８） ４．１０ｇ（５６％）を得た。

’Ｈ−ＮＭＲ：　（ＤＭＳＯ−ｄ、、３００ＭＨｚ）：δ８．７９　（ｓ、ＬＨ ）、７．６７　（ｄｌ＝１．５Ｈｚ、ＬＨ）　、７．５６　（ｄｄ、Ｊ＝７Ｈｚ 。

１．５Ｈｚ、　ＬＨ）　、６．７２　（ｄ、　Ｊ　＝７Ｈｚ、　ＩＨ）、２．９ ５　（ｓ、３Ｈ） ＩＲ（ＫＢＲ）　・３６００　（ｂ）　、３２６５　（ｓ）　、１６４２　（ｓ ）、１５８２　（ｍ）　、１５２３　（ｍ）　、１３８７　（ｍ）　、１２０３ 　（ｍ）、１１６６　（ｓ）　、１１３４　（ｓ）、１０３２　（ｓ）　、９９ ３　（ｓ）、７８３　（ｓ） 質量スペクトル（Ｅｌ）Ｃ，Ｈ，。Ｎ２０．Ｓ、の計測値、２３０実測値２３０ 　（Ｍ”、３０％）　、１５１　（Ｍ−３ＯＩＣＨ３，１００％）２、スピロア クリダン（ＩＩ　ａ　）の合成エステル（２）（２００ｍｇ、０４３ミリモル） の無水ＣＨｓＣＮ　（２５ｍｌ）懸濁液に、アルゴン雰囲気下（ＣＨｓＣＨｔ） ｓＮ　（０，５ｍ１）　、続いてスルホンアニリド（８）（１２０ｍｇ、０．４ ５ミリモル）を加えた。最初黄色の溶液が、次第にほとんど透明になるが、それ は付加体の形成を示す。反応混合物を、ＴＬＣが出発原料の消失を示した後に濃 縮した。

濃縮物をシリカ（１００ｇ、ＣＨｚＣ１ｉ中１０％ＣＨ，ＣＮ）に通し、２種の 化合物の混合物である高いＲｆ　（０，６０−０，４０）の方の原料を集めた。

この混合物（２６０ｍｇ）を無水ＤＭＦ　（２０ｍｌ）に溶解し、ＮａＨ（１０ ０ｍｇ）で、次の添加までに最初の沸騰が静まるようにバッチ方式で処理した。

３時間後、反応混合物を１０％水性Ｎ８４ＣＩ　（２ｍｌ）でクエンチし、ＣＨ ２Ｃｈ（３Ｘ５０ｍｌ）で抽出した。水性部分を１０ｍ１まで濃縮し、３Ｎ　Ｈ ＣＩでｐＨ３゜０に酸性化して、ｃｌ−１ｔＣ＋ｉ（２ｘ２５ｍｌ）で再抽出し た。集めた有機成分を無水ＮａｘＳＯ４Ｃ乾ｍし、分取ＴＬＣ（シリカ、ＣＨＩ ＣＩ２中１０％ＣＨｓＯＨ）で精製して、スピロアクリダン（ＩＩａ）３２ｍｇ 　（１６％）を得た。

’ＨＮＭＲ：　（ＣＤｓＯＤ、３００ＭＨｚ）：δ８．１９　（ｓ、　ＩＨ）、 ７．７４　（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、ＩＨ）　、７．３６　（ｍ、４Ｈ）、７．１４　 （ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）　、６．８８　（ｍ、３Ｈ）、３．５９　（ｓ、 ３Ｈ）　、３．５２　（ｓ、３Ｈ）質量スペクトル（ＣＬ　ＣＨ＝）Ｃ２３ＨＩ ＩＮ３Ｓｌの計測値：４４９実測値４４９（Ｍ”、２２％）、３７０（Ｍ’−８ Ｏ１ＣＨ３，１００％）ＵＶ可視（ＣＨ３ＣＮ）：　２６４ｎｍ（ε＝２０．０ ００）、３２６（ε＝７．８００）実施例５ 化学発光化合物（Ｉｃ）の合成 １２−ヒドロキシ−５−カルボキンメチルスルホンアニリド（１１）の合成カル ボン酸（１０）（３，１ｇ、２０．２ミリモル）の乾燥ピリジン（５０ｍｌ）溶 液を０℃に冷却した。塩化メタンスルホニル（１，８ｍｌ、１９．０ミリモル） を１０分間にわたってゆっくり加えた。混合物を６時間撹拌し、この間に室温と なるようした。ＴＬＣが出発原料の消失を示した後、ピリジンを留去した。

こうして得られた粗製物を冷水で洗浄し、濾過した。残留物を沸騰水でから結晶 化してオフホワイト固体として化合物（１１）３．３ｇ　（７０％）を得た。

’ＨＮＭＲ：　（ＤＭＳＯｄｓ、３００〜＋Ｈｚ）＋６１０．７　（ｂｓ、　〜 ＩＨ）、８．８７　（ｓ、ＩＨ）　、７．８１　（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、ＩＨ）、７ ．６６　（ｄｄ、Ｊ＝９および２Ｈｚ、ＩＨ）、６．９７　（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、 ＩＨ）　、２．９６　（ｓ、３Ｈ）質量スペクトル（ＣＬＣＨ４）ＣｓＨ＊Ｉ’ ＬＯｇＳ＋の計測値；２３１実測値２３１（Ｍ”、３０％）　、１５２　（Ｍ’ −３ＯｚＣＨｓ、１００％）２、スピロアクリダン（ＩＣ）の合成 スピロアクリダン（Ｉｃ）は、実施例４でスピロアクリダン（ＩＩ　ａ　）に使 用したのと同様の方法により製造した。

’ＨＮＭＲ：　（ＣＤ３０Ｄ、３００ＭＨ２）＋６８．２０　（ｓ、ＩＨ）、７ ．７４（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、ＬＨ）　、７．４０　（ｍ、４Ｈ）、７．１４　（ｄ 、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、６．９４　（ｍ、３Ｈ）　、３．６５（ｍ、６Ｈ） 実施例６ 化学発光測定 アクリジニウムフェニルエステル（１２）を、ロー／１ツト等、ジャーナル・オ フ・オーガニック・ケミストリー、第３０巻、第３５８７頁（１９６５年）に記 載された方法により製造した。

それは、ＩＨ−ＮＭＲおよび質量分析法により特性を示された。強酸中でのその 吸収スペクトルは、３６８ｎｍ（ε＝１９，８００）で最高値を有し、アクリジ ニウム核と一致した。

化学発光化合物（Ｉａ）は、実施例１のようにして製造した。

第１表 放射した相対光ユニット 化合物　１．　ＯｐＭ　２．　ＯｐＭ （Ｉａ）　１３．１０　２０．６ 化合物（Ｉａ）の化学発光は、化合物（ｒａ）のホウ酸緩衝（ｐＨ９，０，０， ２Ｍ）溶液への１００ｍＭＨｔＯｔの添加により開始した。化合物（１２）の化 学発光は、１０ｍＭＨ２Ｏ２を含む化合物（１２）の希硝酸溶液へのｌ、ＱＭＮ ａＯＨの添加により開始した。化合物（１２）を試験した条件は、ウィークス等 、クリニカル・ケミストリー、第２９巻、第１４７４−１４７９頁（１９８３年 ）　（ｐＨジャンプ方法）に、最大の化学発光を得るための最良条件として報告 されている条件とした。両化合物の化学発光は、ターナ−発光計で測定した。

実施例７ 化学発光化合物の検出限界 化合物（Ｉｃ）、（ＩＩ　ａ　）および（ＩＩＩ　ａ　’）の検出限界測定は、 ２種のインジェクターを装備したオプトコンブ１発光計で実施した。各試験化合 物の貯蔵溶液をＣＨ３ＣＮ中で製造した。連続希釈は、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９， ０，２００ｍＭ）で実施した。

１０−”Ｍ濃度の貯蔵溶液１００μＩを、さらに１２Ｘ７５試験管でホウ酸緩衝 液９００μｌで処理した。試験管を発光計中に置き、ｐＨ９，０緩衝液中１％Ｈ ｚＣｈｌＯＯｍｌを加えることにより反応を開始した。光出力は、ＯＳインター バル、１０ｓインテグレーシジンの動態モードで遅延なしに測定した。データは 第１−３図に表す。

実施例８ 加水分解および検出限界試験 化学発光化合物（Ｉｃ）、（ＩＩ　ａ　）および（ＩＩＩ　ａ　）の安定性およ び検出限界を既知化合物（１２）と比較した。化合物（Ｉｃ）、（ＩＩ　ａ　） および（ＩＩＩ　ａ　）は、化学発光であり、より安定である。特に、化合物（ ＩＩ　ａ　）および（ＩＩＩ　ａ　）は、顕著な加水分解安定性を示し、ｐＨ９ ，０でＨｌｏ、で処理する場合、１．５±０．５Ｘ１０−’″Ｍ（１５±５原子 モル／ｍ＋）で検出できる。すべての化学発光化合物のシグナルは、短命であっ た。

第２表 化合物　ｐＨ９，０での安定性　検出限界（ｍｌ）ｐＨ９，０およびＨ８０゜ （ＩＨａ　）　ｔ　ｌ／！＝　１２時間　１０原子モル（１２）　ｔ＋ｚ２＝２ ９０分　１０原子モル＊（ＩＩ　ａ　）　安定　１０−２０原子モル（Ｉ　Ｃ） 　Ｌ　１７２＝５．３時間林　１０原子モル＊　ｐＨジャンプ方法で測定、酸性 化した試料は、山Ｏ！、続いてｌＮＮａＯＨで処理（最終ｐＨは１３−１４）。

林　位置異性体が存在していることもある。

実施例９ ＨＲＰ増強化学発光 化学発光を増強させるための、酸化剤、ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ ＨＲＰ）の添加の効果を、実施例２のようにして製造した化合物（ＩＶａ）につ いて研究した。使用した貯蔵溶液は、 緩衝液ニホウ酸塩、ｐＨ８，０（０，１Ｍ）ＨｘＯｚ：　１．０Ｍ脱イオン水 ＨＲＰ　：　１．０ｍＭ／ホウ酸緩衝液、ｐＨ８，０であった。

化合物（ＩＶａ）１５μｌ　（１０００μＭ）を、ホウ酸緩衝液９７５μ＋に希 釈し、ＨｚＯｔｌＯμｌを加えた。試験管をターナ−発光計に移し、光出力をモ ニターした。発光シグナルは、最初の１０秒で１２００相対光ユニツト（ＲＬＵ ｓ）であった。データは、第４図に示す。

化合物（ＩＶａ）１５μｌ　（１０００μＭ）を、ホウ酸緩衝液８７５μｌおよ びＨＲＰｌｏｏｍｌに希釈した。その後、Ｈ！０４０μｍを加えた。試験管をタ ーナ−発光計に移し、光出力をモニターした。発光信号は、最初の１０秒で３５ ０ＱＲＬＵｓであった。データは、第４図に示す。

化合物（ＩＶａ）５μＩ　（１０００ｃｚＭ）を、ホウ酸綬衝液８８５μｍおよ びＨＲＰ１００μＩ（１，０μＭ）に希釈した。その後、ＨｔＯｄＯμｌを加え た。

試験管をターナ−発光計に移し、光出力をモニターした。発光信号は、最初の１ ０秒で１３３ＯＲＬＬｌｓであった。データは、第５図に示す。

化合物（２）５μ＋（１，０μＭ）を、ホウ酸緩衝液９８５μｍに希釈し、Ｈ３ Ｏ１ｌＯμｍを加えた。試験管をターナ−発光計に移し、光出力をモニターした 。

発光シグナルは、最初の１０秒で１０７０ＲＬＵｓであった。データは、第５図 に示す。

実施例１０ 過酸化水素の検出 グルコースオキシダーゼの処理時に、グルコースは、グルコン酸（グルクツラク トン経由）およびＨ２０，に転移する。ニゲルコースオキシダーゼ Ｃｓ　Ｈｌ　２０　ｇ　＋０２　＋　Ｈ２０→　グルコン酸十Ｈｔ　Ｏを溶液中 の既知Ｈ２Ｏ２量を、化合物（ｌａ）１０−’Ｍで処理し、化学発光を測定した 。バックグラウンド、すなわちＨ２Ｏ２なしでの化合物（Ｉａ）によるシグナル を超える光を発生したＨ、Ｏ！の最小量は、１ｘｌＯ−”Ｍであった。化合物（ １２）のようなアクリジニウムエステルによるＨ２０．の検出可能限界は、７ｘ ｌＱ−＠Ｍであることが見い出された。

上述の発明は、例示として詳細に、また明快さおよび理解の目的で実施例を記載 してきたが、ある変更または修飾が、添付の請求の範囲内で実施できることは明 らかである。

時間（秒） 時間（秒） ＴＯ２０３０４０５０１１０７０ ０ＴＯＯ２００３００ａ 時間（秒） 時間（秒） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３ ２　Ｂ　７０５５−２Ｊ３３１５８　Ａ　７０５５−２Ｊ （７２）発明者　メネイン、フランク アメリカ合衆国０３４３にニー・ハンプシャー州、キーン、チャツプマン・ロー ド２０５番 Ｉ （７２）発明者　ウルマン、ニドウィン・エフアメリカ合衆国９４０２５カリフ オルニア州、アサ−トン、セルビー・レーン１３５番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： ▲数式、化学式、表等があります▲ ［式中、ＸおよびＹは、独立してＯ、Ｓ、ＳｅおよびＮＨからなる群から選択さ れ、Ｚは原子１−５個の長さの鎖であり、該化合物の０ないし８個の水素が単独 にまたは一緒になってＷにより置換されていることができ、各Ｗは独立して選択 される水素以外の１−５０個の原子を含み、それらのうち１ないし４個の芳香族 炭素原子は窒素原子で置換されていることができ、該化合物の０ないし１個の水 素は有機ラジカルにより置換されていることができる］の化学発光化合物。 ２．ｓｂｐメンバーとアンシユートしている、請求の範囲第１項記載の化合物。 ３．該有機ラジカルがｓｂｐメンバーである、請求の範囲第１項記載の化合物。 ４．該ｓｂρメンバーがハプテンまたは抗体である請求の範囲第３項記載の化合 物。 ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▲ を有する請求の範囲第１項記載の化合物。 ６．ＸおよびＹが独立してＯ、ＳおよびＮＨからなる群から選択され、Ｚは原子 １−２個の長さの鎖である請求の範囲第１項記載の化合物。 ７．式： ▲数式、化学式、表等があります▲ を有する請求の範囲第６項記載の化合物。 ８．Ｚが２個の炭素原子を含む鎖であり、それらの原子はベンゼン環の１部分で あり、該ベンゼン環中の少なくとも１個の水素は、Ｗにより置換している、請求 の範囲第１項記載の化合物。 ９．式：を有する請求の範囲第８項記載の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▲ １０．式： ▲数式、化学式、表等があります▲ を有する請求の範囲第８項記載の化合物。 １１．ＮＨの水素がＷで置換されており、ＷはＲ、ＳＯ２ＲおよびＣＯＲからな る群から選択されるものであり、Ｒはアルキル、アリールおよびハロゲン化アル キル基からなる群から選択されるものであり、さらにＺは２原子の鎖を含むＸお よびＹを連結する基であり、該２原子のうち１個はＣであり、もう一方はＣ、Ｏ 、ＳおよびＮからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の化合物。 １２．式： ▲数式、化学式、表等があります▲ を有する請求の範囲第１１項記載の化合物。 １３．次式： Ａ−Ｌ−Ｑ ［式中、Ａは請求の範囲第１項の化合物であり、Ｌは連結基、そしてＱは水素ま たはｓｂｐメンバーである］ を有する化合物。 １４．過酸化水素および請求の範囲第１項の化合物を含む光放射化学組成物。 １５．ａ）（１）分析物を含む可能性のある培地、および（２）請求の範囲第１ 項の化合物とアンシユートしている第１特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーを含む 標識試薬、但し、該第１ｓｂｐメンバーは、該分析物にまたは該分析物と結合で きる第２ｓｂｐメンバーに結合し得るものであり、結合して該分析物の存在と相 関する量の複合体を形成するものである、を合わせ、ｂ）上記化合物を化学的に 活性化し、さらにｃ）上記化合物により発生する発光量、その量は上記培地中の 分析物の量に相関するものである、を検出すること を含む、分析物の測定方法。 １６．上記化合物が、過酸化水素または過酸化水素を産生し得る触媒により、化 学的に活性化される、請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．上記複合体が支持体に結合したものとされ、かかる支持体が上記標識試薬 の添加より前に、と同時に、または、に引き続いて上記培地と合わせられる、請 求の範囲第１５項記載の方法。 １８，（１）特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーを結合した請求の範囲第１項の化 合物を含む組成物、および（２）過酸化水素または過酸化水素を産生する手段を 組合わせバッケージとしたものを含んで成るキットであって、上記ｓｂｐメンバ ーがリガンド類、受容体類およびポリヌクレオチド類からなる群から選択される ものである、キット。 １９．（１）請求の範囲第１項の化合物を含む組成物、および（２）分析物が過 酸化水素でない場合に、該分析物から過酸化水素を産生するのに必要となる任意 の補助試薬を祖合わせパッケージとしたものを含んで成る、過酸化水素または過 酸化水素の生成を調節する分析物の検出用キット。