JPH07509477A - 腫瘍診断または腫瘍治療のための新規プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍診断または腫瘍治療のための新規プローブ本発明は、作用物質として少なく とも１個の核酸を含有し、かつ殊に、腫瘍を診断および／または治療するために 適当である新規の治療剤または診断剤に関する。 ホメオボノクスを含有するタンパク質は、多細胞分化組織の発生の際に重要な役 割を果たす。ホメオボックスタンパク質による転写調節は、発生する胚中での成 長および分化の厳密な時空的順序を調整すると考えられる。文献（例えば、Ｋ、 Ｋｏｎｇｓｕｖ歳ｎ＋　Ｊ、Ｍ、Ａｄｓｍｓ、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｃｓ、］７（１９１１９）、１８８１〜１ｇ９１：Ｃ，Ｂｈｌｌ、Ｄ、＾ｂｅｔ ｄａｍ、Ｒ，Ｓｃｌｒｗ２＋ｌ＋、Ｌ、５ａｃｈｓ、ＥＭＢｏ　１．７（１９８ １１）、４２８３〜４２９０；Ｃ，ＢＩｉ口、Ｃａｎｅｅ＋　Ｃｅ１ｌｓ　２（ ＋９９０）、１８６〜＋！１９：Ｔ、）１．ＲａｂｂｉｌＩｓ　Ｃｅ１ｌ　６４ ７（＋９９１）、６４］〜６４４；Ａ、ＩＶ、Ｓｓｓ＊ｋｉ、Ｊ、Ｄｏｓｋｏｖ 、Ｃ。 Ｌ、Ｍ＊ｃ　Ｉ　ｅＯｄ、　Ｍ、　Ｂ、　Ｒｏｄｇｅ　【ｓ、　Ｌ、Ｊ、Ｇｏｕ ｄｓｓ　、Ｍ、Ｆ、Ｗｉ　１ｋｉｎｓｏｎ、ＭＯＤ３４　（１９９１）　、　１ ５５〜】６４）から、いくつかのホメオボソクス含有遺伝子がガン遺伝子と関連 があることは公知である。 共通の保存配列モチーフ（ｋｏｎｓｅ＋ｖｉｅｒｌｅｘ　Ｓｅｑｕｅｎｚｍｏ＋ ｉｖ）、［ベアード（Ｐａｉ＋ｅｄ）Ｊボックスを有する多重遺伝子族は、同様 に、穐々異なる生物における発生制御およびＮＡ織特異性と関連がある。「ペア ード」ボッ特表千７−５０９４７７　（３） クスからコードされた「ベアード」　ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインであり（ Ｊ、Ｔτｅｉｓｍ＠ｎ、Ｅ、Ｈｓτｒｉｓ、Ｃ，ＤｅｓｐＩａｎ、　Ｇｅｎｅｓ 、Ｄｅｖ、　５（＋９９１）　、　５９４〜６０４　：Ｇ、Ｃｈ＊　１ｅｐｉｋ 　ｉｓ、　Ｒ，Ｆｔ目ｓｃｈ、　Ｈ，Ｆ　１ｃｋｅｎｓｃｈｅｒ、　０．Ｄｃｕ ｌ　ｓｈ、Ｍ、Ｇｏｕ　Ｉｄ　ｉｎｋ、　Ｐ、Ｇｒｕｓ　ｓ。 Ｃｅ１ｌ　６６（１９９＋）、８７３〜１１８４）　、かつ種々異なる生物、例 えばショウジヨウバエ、マウス、カメ、ゼブラダニオ、センチュウおよびヒトに おいて同定された。「ベアード」　ドメインとガン遺伝子との関係は、今迄公知 ではなかった、 医学的研究において、腫瘍の発生と関連する新規の治療剤および診断剤の提供に 対する著しい努力が試みられている。本発明の課題は、殊に、腫瘍の診断および 治療に適当である新規薬剤を提供することであった本発明の課題は、 （Ｂ）Ｆａｘ−遺伝子とハイブリッド形成する少なくとも１個の核酸、 （ｂ）少なくとも１個のＦａｘ−タンパク質、または／および （Ｃ）少なくとも１個のＰａｘ−タンパク質またはその誘導体に対する抗体 を含有する作用物質を、場合により薬剤学的に慣例の担持剤、助剤および希釈剤 と共に処方することを特徴とする、腫瘍診断または／および腫瘍治療のための薬 剤を製造する方法により解決される。 意外にも、Ｐａｘ−タンパク質、すなわち、「ベアード」　ドメインを含有する タンパク質が、ガン遺伝子を促進しえ、かつ従って、細胞増殖、足場非依存性成 長および血管形成を誘導する強いガンタンパク質の新規の群として分類されうろ ことが分かった。Ｐａｘ−遺伝子で形質転換された細胞が、全ての典型的悪性特 性、例えば、「フォーカスアッセイＪでの接触阻止、軟寒天中での成長およびヌ ードマウスでの腫瘍誘導を示すことが分かった。 従って、本発明による治療剤または診断剤は、腫瘍診断における分子プローブ（ ｍｏｌｅｋｕｌ＊＋ｅ　５ｏｎｄｅ）として使用することができる。それという のも、Ｐａｘ−タンパク質をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成す る核酸の使用は、それぞれのＦａｘ−遺伝子の発現の質的および量的、細胞−お よび組織特異的決定を可能にするからである。 しかしながら、本発明による薬剤は、Ｆａｘ−配列を有する遺伝子の発現の特異 な抑制のためのアンチセンス（Ａｎ＋１ｓｅｎｓｅ）−核酸としても、かつ従っ て、治療剤としても適当である。 本発明による薬剤は、診断的証明または／および治療的処置のために、Ｐａｘ− 遺伝子と結合する少なくとも１個の核酸を含有すべきである。特に、本発明の核 酸は、Ｐａｘ−遺伝子に、「厳しい条件（ｓｌ＋ｉｎｇｅｎ＋ｓｎ　Ｂｅｄｉｎ ｇｕｎｘｅｎ）　Ｊ下でハイブリッド形成する。本発明の意味における厳しい条 件とは、一定または多くのＦａｘ−遺伝子またはＦａｘ−転写物への核酸の選択 的および証明可能な特異な結合を可能にするような条件として定義される。この ような厳しい条件下でのハイブリッド形成は、特に、水溶液中で６８℃でまたは ５０％ホルムアミド中で４２℃でハイブリッド形成し、かつ引き続き、水溶液中 で６５℃でフィルターを洗浄した後に、更に、Ｐａｘ−遺伝子またはＦａｘ−Ｒ ＮＡへのプローブの結合を証明できることを意味する。しかしながら、プローブ として短い核酸を使用する際には、あまり厳しくないハイブリッド形成−または ／および洗浄条件を使用することが必要とされる。 本発明による治療剤または診断剤は、特に、作用物質として、（ａ）Ｐａｘ−タ ンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）その一部、（ｃ）（ａ）または ／および（ｂ）からの核酸と、厳しい条件下でハイブリッド形成する（前記）ヌ クレオチド配列または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または／および（Ｃ）からの核酸に 相補的なヌクレオチド配列を包含する、少なくとも１個の核酸を含有する。 本発明による核酸が、Ｐａｘ−遺伝子の保存範囲から、すなわち、「ペアードＪ 　ドメインをコードするヌクレオチド配列から由来することが望まれる場合、特 に、（ａ）「ベアード」　ドメインのアミノ酸１〜７４をコードするヌクレオチ ド配列、（ｂ）その一部、（ｃ）（ａ）または／および（ｂ）からの核酸と、厳 しい条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列または（ｄ）（ａ）、（ｂ ）または／および（ｃ）からの核酸に相補的なヌクレオチド配列を包含する、核 酸を使用する。 前記目的のためのもう一つの有利な実施態様において、本発明による薬剤は、（ ａ）［ペアード」　ドメインのアミノ酸５〜１９．３５〜４１．６８〜７４．９ ５〜１００または／および１１５〜１２０をコードするヌクレオチド配列、（ｂ ）その一部、（Ｃ）（ａ）または／および（ｂ）からの核酸と、厳しい条件下で ハイブリッド形成するヌクレオチド配列または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または／お よび（ｃ）からの核酸に相補的なヌクレオチド配列を包含する、少なくとも１個 の核酸を含有する。 その際、アミノ酸の前記命名法は、ワルター（Ｗ＊Ｈｈｅ＋）等、ゲノミンクス （Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）　１１　（１９９１）、４２４〜４３４頁、殊に図２の研 究に従い、これを参照することにより記載の一部とする。 しかしながら、幾つかのＰａｘ−遺伝子を特異的に証明することまたは抑制する ことが必要である場合、有利には、それぞれの遺伝子の非保存範囲、すなわち、 特に、「ベアード」　ドメインをコードしない範囲からのヌクレオチド配列を有 する核酸を使用する。 本発明による薬剤は、任意のＦａｘ−遺伝子から由来する核酸を含有する。適当 なＦａｘ−遺伝子の例は、次のものである：Ｆ　ａ　ｘ　−１（Ｄｅｕｌｓｃｈ 等、Ｃｅ１１５３（１９８８）、６１７〜６２５）　、　Ｆ　ａ　ｘ　−２（Ｄ ＋ｅｓｘｌｅｒ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｏ＋ｅｎ１１０９（１９９０）、７８７〜７ ９５；Ｎｏｒｎｅｓ等、Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ａｅｎｌ　１０９（１９９０）、７９ ７〜８０９）　、Ｆ　ａ　ｘ　−３（Ｇｏｕｌｄｉｎｇ等、ＥＭＢＯＪ、］０（ ＋９９１）、］Ｉ３５〜＋１４７）　、Ｆ　ａ　ｘ　−４、Ｆ　ａ　ｘ　−５お よびＦ　ａ　ｘ　−６（Ｗ＊１ｌｈｅ＋等、（１９９＋）、５ｕｐｒａ）、Ｐａ ｘ　−７（Ｊｏｓｔｅｓ等、ＭＯＤ３３　（＋９９０）、２７〜３８）、Ｆａｘ −８（Ｐｌａｃｈｏｖ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１０（１９９０）、６４ ３〜６５１）、ＨｕＰｌ、ＨｕＰ２、Ｈｕ　Ｐ　４８　（Ｂｕ＋＋ｉ等、ＥＭＢ ＯＪ、８（＋９８９）、ｌ］８３〜１１９０）　、Ｐ　ｒ　ｄ　、　Ｂ　Ｓ　Ｈ ４およびＢ　Ｓ　Ｈ９（ＢｏＰＰ等、Ｃｅ１ｌ　４７（１９８６）、１０３３〜 １０４０）およびボックス・フィロ（Ｐｏｔ　ｎｅｕ＋ｏ）およびボックス・メ ン（Ｐｏ！ｍｅｓｏ）　（ＢｏｐＰ等、ＥＭＢＯＪ、８（＋９１１９）、３４４ ７〜３４５７）。 前記文献は、参照することにより、記載の一部とする。 殊に、ヒトＦａｘ−遺伝子は、殊に有利である。 本発明による薬剤中の核酸は、必要により、特に、修飾されていないまたは修飾 されたＤＮＡまたはＲＮＡである。核酸の長さも、それぞれの使用範囲に従う本 発明による薬剤を腫瘍診断における分子プローブとして使用する際に、特に、１ ０〜１００ヌクレオチド、特に１２〜５０ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡ− プローブが重要である。更に、核酸が、Ｆａｘ−遺伝子への結合の証明のために 使用される放射性または非放射性マーカーを有することは有利である。 本発明による薬剤をアンチセンス−核酸として、遺伝子発現の阻止に使用する場 合、特に、リボヌクレアーゼによる分解に対する体内でのその安定性を高めるた めに、場合により修飾塩基を含有していてよいＲＮＡが重要である。 本発明による薬剤を分子プローブまたは／および遺伝子発現の阻止のための治療 剤として使用することは、分子生物学の領域の専門家に公知の方法で行なわれる 更に、本発明は、作用物質として、少なくとも１個のＦａｘ−タンパク質を含有 することを特徴とする、治療剤または診断剤に関する。Ｆａｘ−タンパク質は、 特に、Ｆａｘ−１、Ｆａｘ−２、Ｆａｘ−３、Ｆａｘ−４、Ｆ　ａ　ｘ　−５、 Ｆａｘ−６、Ｆ　ａ　ｘ　−７、Ｆａｘ−８、Ｈｕ　Ｐ　１、Ｈｕ　Ｐ　２、Ｈ ｕＰ４８、ｐｒｄ、Ｂ５Ｈ４、ＢＳＨ９およびボックス・フィロおよびボックス ・メンからなる群から選択される。このタンパク質のアミノ酸配列は、核酸配列 と関連して記載されている前記の文献から見て取れる。殊に、ヒトＦａｘ−タン パク質は、有利である。 薬剤は、特に、腫瘍診断または／および腫瘍治療において使用される。 本発明のもう一つの対象は、作用物質として、ＰａＸ−タンパク質に対する少な くとも１個の抗体を含有することを特徴とする治療剤または診断剤である。Ｐａ ｘ−１、Ｆａｘ−２、Ｆａｘ−３、Ｆ　ａ　ｘ　−４、Ｐａｘ−５、Ｆａｘ−６ 、Ｆａｘ−７、Ｆａｘ−８、ＨｕＰｌ、ＨｕＰ２、Ｈｕ　Ｐ　４８、ｐｒｄ％Ｂ ５Ｈ４、ＢＳＨ９およびボックス・フィロおよびボックス・メンからなる群から の１個以上のＰａｘ−タンパク質に対する抗体は、有利である。ヒトＦａｘ−タ ンパク質に対する抗体は殊に有利である。 本発明による抗体は、特に、公知の方法で、ケーラー−ミルシュタイン−法によ り、相当するＦａｘ−タンパク質または／およびＰａｘ−タンパク質の混合物を 用いて実験動物、特に、マウスを免疫化し、免疫化された実験動物から抗体産生 Ｂ細胞または肺臓細胞を入手し、かつ引き続き、抗体産生細胞と適当な白血病細 胞とを融合することによりハイブリドーマを生じることにより得られる、モノク ローナル抗体である。適当な抗体の例は、Ｆ　ａ　ｘ　−１−１Ｆａｘ−２−お よびＰ　ａ　ｘ　−６−抗体（図２）である。 本発明による、抗体は、特に、試験管内または／および生体内で、腫瘍診断また は／および腫瘍治療における薬剤として使用することができる。その際、抗体は 、フラグメント（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ）ｚフラグメント）としても、か つ場合により、検出可能な群（酵素、蛍光マーカー、放射性マーカー、核磁気共 鳴マーカー等）または毒素（例えばリシン、ジフテリア毒素）と連結して、使用 することができる。このような抗体−誘導体の製造は、免疫学の領域の専門家に 公知の方法で行なわれる（例えば、二官能性リンカ−を介する共有結合）。 本発明を更に明らかにするために、図１および図２と関連して、次の例を使用す る。 図１は、試験したＦａｘ−１、Ｆ　ａ　ｘ　−２、Ｆａｘ−３、Ｆａｘ−６およ びＦａｘ−８並びに突然変異Ｐａｘ−タンパク質Ｕｎの図構造を示す。 図２は、特異な抗体とのインキュベーションおよび抗体−タンパク質−結合の酵 素的検出による、Ｆａｘ−タンパク質を発現する細胞抽出物のウェスタンプロッ トを示す。 例 １、試験したＦａｘ−タンパク質 タンパク質Ｐａｘ−１、Ｆａｘ−２、Ｆａｘ−３、Ｆａｘ−６およびＦａｘ−８ 並びに突然変異Ｆａｘ−タンパク質（Ｕｎ）の作用を試験した。図１は、これら のＰａｘ−タンパク質の図構造を示す、タンパク質内の保存ドメインは、そのお およその位置を、開いた読取枠（Ｌｅｓｅｒｉｈｍｅｎ）内に示されるバルク（ Ｂｓｌｋｅｎ）として示される。Ｆａｘ−１は、ホメオドメインの完全な欠落が 知られている唯一のＰａｘ−タンパク質である。 Ｆａｘ−３およびＦａｘ−６は、完全なホメオドメインを、「ベアードｊ　ドメ インに付加して含有している。 詩表千７−５０９４７７　（５） 双方のＤＮＡ結合モチーフは、少なくとも１００個のアミノ酸により互いに分け られている。タンパク質Ｐａｘ−２およびＦａｘ−８は、ホメオドメインのα− へソックスのアミノ酸を２３個だけ含有する。Ｕｎ−タンパク質をコードする遺 伝子中のＧのＡへの点突然変異は、ＧｌｙからＳａｒへの生じる交換により特徴 付けられる。ヌクレオチド−およびアミノ酸配列は、Ｆ　ａ　ｘ　−１に関して はドイチュ（Ｄｅｕｌｓｈ）等（Ｃｅｌｌ　５３（１９８８）、６１７〜６２５ ）　、Ｆ　ａ　ｘ　−２に関してはドレスラ−（Ｄｔｅｓｓ　１ｅｔ）等（Ｄｃ ｖｅ１ｏｐｍｅｎｔ１０９（１９９０）、７８７〜７９５）、Ｆａｘ−３に関し てはボウルディング（Ｇｏａｌｌｉｎｇ）等（ＥＭＢＯＪ、１０（１９９＋）、 １１３５〜＋１４７）　、Ｆ　ａ　ｘ　−６に関してはワルター（Ｗ＠目ｈｅｍ ）およびグルメ（Ｇａｕｓｓ）　（Ｄ＠ｒｅ１ｏｐｍｅｎ１１１３（＋９９１） 、１４３５〜＋４３９）およびＦａｘ−８に関してはプラコフ（Ｐｌｉｅｈｏｖ ）等（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１０（１９９０）　、　６４３〜６５１）で 明らかにされている。 ２、形質転換試験 Ｆａｘ−ｃＤＮＡｓを、ベクターｐＣＭＶ５（へｎｄｅ１３０ｎ等、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２６４（１９８９））の複数のクローニング箇所に挿入した。こ れらの構造物を、選択マーカー　（Ｓｏｒｉａｎｏ等、Ｃａ１ｌ　６４（＋９９ １）、６９３〜７０２）としてのｐＧＫｎｅｏと一緒に、２０８−およびＮＩＨ ３Ｔ３−細胞中で共形質転換した。２０８−細胞を、ＤＭＥ　Ｍ　（Ｂｉｏｃｈ ｒｏｍｅ）および１０％胎児子牛血清（ＢｏｅｈｒＴ３−細胞を、５％新生子牛 血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｉｅｒ　Ｍｓｎｎｈｅｉｍ）を有するＤＭＥＭ中で培養し た。それぞれのｐＣＭＶ−Ｆａｘ−発現プラスミド２／ｊｇを、ｐＧＫｎｅｏｌ μｇおよびキャリアー−ＤＮＡ７ｕｇと一緒に、１００　ｍ’ｍ組織培養プレー ト（Ｇｅｖｅｂｅｋｕｌｌｕｒｐｌｉｌｌｅ）の７０％密集固有細胞層上で、変 法を有するリン酸カルシウム法（Ｗｅ　ｂ　ｅ　ｔおよび５ｃｈｉｆｆｎｅｒ、 　Ｎａ１ｕｒｅ　３１５（１９８４）、７５〜７７）の使用下に形質転換した。 形質転換された細胞を、２４時間後に、３つのグループに分けた。 １つのグループを、２〜４週間、フォーカス形成の開始に依存して放置した。そ の後、細胞を、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）数滴および水中の１％メチレ ンブルー（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。組織培養プレートを、水ですすぎ、 かつフォック（Ｆｏｅ　ｉ）を数えた。 細胞の他の３分の１を、０．６％、０．９％または１．２％軟寒天中に、フィド ラ−（Ｆｉｄｌｅｒ）等、アンチカンサー　Ｒｅｓ、１１　（１９９１）　、１ ７〜２４に記載されているようにしてまいた。残りの３分の１を、Ｇ　４１８　 （Ｇｉｂｃｏ）の添加によるＤＮＡ−取込み（Ａｕｒｎａｈｍｅ）のために、細 胞のためのショック（Ｓｃｈｏｃｋ）の２４時間後に選択した。２０８−細胞に おいて０．４ｍｇ／ｌのおよびＮＩＨ３Ｔ３−細胞において０．６ｍｇ　／　ｍ 　ｌのＧ４１８を添加した。形態学的に形質転換されたフォックを取り出し、か つその後、培養した。 これらの細胞単離を、選択培地中での連続インキュベーションにより繰返し、か つ発現分析および形質転換試験のために使用した。 ３、形質転換試験の結果 第１表中に、Ｆａｘ−タンパク質での２０８−細胞の形質転換の結果を示す。左 欄には、細胞中に導入されたＤＮＡが挙げられている。ｐＣＭＶは、ｐ　ＣＭＶ 構造のみを負の制御として含有する細胞を表し、ｐＳＶは、正の制御として使用 されるＴ−抗源（ＳＶ４０−ウィルス）発現構造である。種々異なるｐＣＭＶ− Ｆａｘ−発現構造は、これらを発現するＦａｘ−タンパク質の名で記載されてい る。細胞の成長を、０．６％、０．９％および１．２％軟寒天中で試験した。細 胞コロニーを、平板培養の２〜３週間後に数えた。発現を、それぞれの細胞タイ プに関して少なくとも２回実施した。＋は、軟寒天中での成長を表し、−は、成 長しないことを表す。＋−は、二つの発現における反対の結果を表す。 隣の欄は、相当する形質転換細胞が、通常の２０８−細胞との混合の際に、フォ ーカス形成を誘導することができたか否かを挙げている。これらの混合実験を２ 回行なった。 最後の欄には、注射したヌードマウスの数および腫瘍形成を生じた注射の数を示 す。このために、４週間の年齢の雄ヌードＮＭＲＩマウスに、形質転換細胞１〜 ５Ｘ１０６個を、わき腹に皮下注射した。細胞を、注射の前にトリプシン化しく ＋Ｂｐｓｉｎｉｓｉｅ目）、かっ血清からの刺激作用を除外するために、リン酸 塩緩衝塩溶液で２回洗浄した。動物を一週間を基礎として、最大３週間、腫瘍の 形成に関して調べた。 第１表 形質転換された　軟寒天試験　フォーカス　腫瘍発生０．６％　０，９％　１， ２ｔ ｐＣＭＶ　−＋　−−−−−５／□ ｐＳＶ　＋＋　＋＋　＋＋　＋　６／６Ｆａｘ−１＋＋　十＋　＋＋　＋　６／ ６υｎ　−＋　−−−６／Ｉ Ｆａｘ−２＋＋−＋＋　←　＋　６７６第１表の結果は、Ｐａｘ−遺伝子もしく は［ペアードｊ　ドメインのガン遺伝子ポテンシャルを示す。種々異なるＦａｘ −タンパク質を発現するクローンを、種々異なる濃度を有する軟寒天中で示す試 験において、増大する軟寒天濃度の成長を、腫瘍の発生の確率と関係づけること ができる。ｐＣＭＶ−発現ベクターのみを含有する細胞は、０．６％軟寒天で、 もはや全く成長を示さない。Ｆａｘ−１−１Ｆａｘ−２−５Ｆａｘ−３−１Ｆａ ｘ−６−もしくはＦ　ａ　ｘ　−８−タンパク質を発現した細胞は、これに対し て、１．２％までの軟寒天の濃度において成長することができた。この半固形培 地中での成長は、・Ｆａｘ−タンパク質が、細胞に、足場非依存性成長のための 能力を付与することを示している。突然変異Ｏｎ−タンパク質は、より高い軟寒 天濃度での足場非依存性成長の不足が明らかであるように、この細胞を完全に形 質転換することができなかった。 ｐ　ＣＭＶ　−Ｆ　ａ　ｘ−発現構造の注射により得られる腫瘍を、スタンダー ドインサイトウハイブリダイゼーション（Ｓｌｉｎｄｉ＋ｄ　ｉｎ　５ｉｌｕ　 Ｈｙｂ＋ｉ＋１ｉｘａ口ｏｎ）　（ＧｏｕｌｄｉｎＫ、Ｆ、ＭＢｏ　１．．１Ｏ （１９９１＞、１１３５〜１１４７）により分析した。Ｐａｘ−腫瘍中の細胞は 、紡錘形である。腫瘍は、良好に血管を備えていて、かつ著しい細胞外マトリッ クス生成を示す。全ての腫瘍は固く、かつ包まれていた。 更に、接触阻止を克服するための細胞の能力を測定するために、メチレンブルー 試験を実施した。この試験を、トランスフェクション後の未処理細胞中で、２回 実施した。形質転換ＤＮＡを取込んだ（暑ｕｒｇｅｎｏｍｍｅｎ）細胞は、形質 転換されていない細胞を覆って成長することができ、これは、黒くマーキングさ れたセルフォソシ（Ｚｅ　ｌ　ｌ　ｆｏｅ　ｉ）を生じる。Ｆａｘ−遺伝子で形 質転換された細胞中（ｐＳＶでの正の制御におけるように）でセルホッシの形成 が観察された一方、負の制御ｐＣＭＶで形質転換された細胞および形質転換され ていない細胞（２０８−およびＮＩＨ３Ｔ３−細胞）中では明らかに少ないフォ ックが見られた。 軟寒天試験の結果は、２０８−およびＮＩＨ３Ｔ３−細胞トランスフェクション において、官能性の「ペアード」　ドメインを含有するＦａｘ−タンパク質の使 用下でのメチレンブルー試験で著しく染色されたフオノンの発生およびヌードマ ウスでの腫瘍発生と一致している。 ４、形質転換された細胞におけるＦａｘ−発現の免疫学的証拠 ２点により形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３−および２０８−細胞から、公知の調亘 書（Ｂａｌｌｉ＋Ｄ等、Ｃｅ１１５５、　（１９８ｇ）、５３１〜５３５）によ り、全細胞抽出物を製造した。タンパク質濃度の測定後に、細胞抽出物それぞれ ５０μｇを、１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、かつ半乾 燥した電気的トランスファーによって不動−Ｐ−膜上に移動する。膜を、５％乾 燥粉ミルク／リン酸塩緩衝塩溶液中でブロックし、かつそれぞれのＰａｘ−抗体 の１＋２００希釈物と１晩インキユベートし、かつペルオキシダーゼ／ジアミノ ベンジジン反応を用いて現像させた（Ｂａｉｌｉｎｇ等、５ｕｐｅａ）　ｅ図２ からは、Ｆａｘ−１，Ｆａｘ−２、Ｆａｘ−３およびＦａｘ−６に対する抗体が 、相当する形質転換された細胞との反応を示したことが明らかである。Ｆａｘ− ２−抗体は、Ｆａｘ−８との交差反応を示し、かつＦａｘ−８−発現の証明を、 それぞれの細胞抽出物（示されていない）を用いて可能にした。ＰａＸ−タンパ ク質の分子量を、レインボータンパク質マーカー（Ａｍｅ＋ｓｈａｍ）との比較 により測定した。タンパク質の可視分子量は、ｋ、Ｄで示される。２０８−もＮ ＩＨ３Ｔ３−細胞抽出物も、細胞抽出物５０μｇ当たりほぼ同じ量のそれぞれの Ｆａｘ−タンパク質を含有した。このことは、ＣＭＶ−プロモーターが双方の細 胞系中で同様に良好に機能することを示している。 Ｆａｘ−１のウェスタンプロットは、Ｆａｘ’−１および突然変異Ｕｎ−タンパ ク質が、はぼ同じ量で発現することを示している。ｐ　ＳＶ４０プロモーター／ 　Ｆ　ａｘ　−１−構造を有する細胞のトランスフェクションにより製造された 他の細胞抽出物は、更に多量のＰａｗ−タンパク質を含有する。全ての場合、ウ ェスタンプロットは、ｐＣＭＶで形質転換された制御細胞が非常に少ないかまた は全く検出できない量のタンパク質を生じることを示している。 ｒｏ　の　ｒｏ　−巾　ｍ （６１’ｏ　ｒｏ　ｌ’ｏ　ｆ’Ｄ　Ｑ）９−　Ｘｅｄ　Ｅｌε 八ｋ〕〔１ε ９　−　Ｘｅｄ　９０？ 八Ｗｌ　［１０こ ボ マ ｘ　−ｘｐｄＥｌ［ＩＩ マ 八ｋ〕　９０乙 ｕｎ　８ｏｘ　＠ しｘ２ｄ８ｏｘ　＠ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４８１００　８ ３１４−４ＣＣ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｑ　１／６８　Ａ　９４５３−４ＢＧＯＩＮ　３３１５７４　Ａ　７０５ ５−２ＪＩ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍診断または／および腫瘍治療のための薬剤を製造する方法において、 （ａ）Ｐａｘ−遺伝子とハイブリッド形成する少なくとも１個の核酸 （ｂ）少なくとも１個のＰａｘ−タンパク質、または／および （ｃ）Ｐａｘ−タンパク質またはその誘導体に対する少なくとも１個の抗体 を含有する作用物質を、必要に応じて、薬剤学的に慣例の担持剤、助剤および希 釈剤と共に処方することを特徴とする、腫瘍診断または／および腫瘍治療のため の薬剤を製造する方法。
2. ２．薬剤は、作用物質として、Ｐａｘ−遺伝子とハイブリッド形成する少なくと も１個の核酸を含有する、請求項１記載の方法。
3. ３．薬剤は、作用物質として、（ａ）Ｐａｘ−タンパク質をコードするヌクレオ チド配列、（ｂ）その１部、（ｃ）（ａ）または／および（ｂ）からの核酸と厳 しい条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列または（ｄ）（ａ）、（ｂ ）または／および（ｃ）からの核酸に相補的なヌクレオチド配列を包含する少な くとも１個の核酸を台有する、請求項２記載の方法。
4. ４．薬剤は、（ａ）「ベアード」ドメインのアミノ酸１〜７４をコードするヌク レオチド配列、（ｂ）その１部、（ｃ）（ａ）または／および（ｂ）からの核酸 と厳しい条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列または（ｄ）（ａ）、 （ｂ）または／および（ｃ）からの核酸に相補的なヌクレオチド配列を包含する 少なくとも１個の核酸を含有する、請求項２または３記載の方法。
5. ５．薬剤は、（ａ）「ベアード」ドメインのアミノ酸５〜１９、３５〜４１、６ ８〜７４、９５〜１００または／および１１５〜１２０をコードするヌクレオチ ド配列、（ｂ）その１部、（ｃ）（ａ）または／および（ｂ）からの核酸と厳し い条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列または（ｄ）（ａ）、（ｂ） または／および（ｃ）からの核酸に相補的なヌクレオチド配列を包含する少なく とも１個の核酸を含有する、請求項２から４までのいずれか１項記載の方法。
6. ６．薬剤は、Ｐａｘ−遺伝子の非保存範囲からのヌクレオチド配列を含有する、 請求項２または３記載の方法。
7. ７．薬剤は、Ｐａｘ−１、Ｐａｘ−２、Ｐａｘ−３、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−５、 Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−７、Ｐａｘ−８、ＨｕＰ１、ＨｕＰ２、ＨｕＰ４８、ｐｒ ｄ、ＢＳＨ４、ＢＳＨ９、ボックス・ノイロおよびボックス・メソからなる遺伝 子の群からのＰａｘ−遺伝子のヌクレオチド配列を有する少なくとも１個の核酸 を含有する、請求項２から６までのいずれか１項記載の方法。
8. ８．核酸はＤＮＡである、請求項２から７までのいずれか１項記載の方法。
9. ９．核酸は、場合により修飾されたＲＮＡである、請求項２から７までのいずれ か１項記載の方法。
10. １０．腫瘍診断における分子プローブとしての、請求項２から９までのいずれか １項記載の方法。
11. １１．遺伝子発現を避けるためのアンチセンス−核酸としての、請求項２から９ までのいずれか１項記載の方法。
12. １２．薬剤は、作用物質として少なくとも１個のＰａｘ−タンパク質を含有する 、請求項１記載の方法。
13. １３．薬剤は、Ｐａｘ−１、Ｐａｘ−２、Ｐａｘ−３、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−５ 、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−７、Ｐａｘ−８、ＨｕＰ１、ＨｕＰ２、ＨｕＰ４８、ｐ ｒｄ、ＢＳＨ９、ボックス・ノイロおよびボックス・メソからなる少なくとも１ 個のＰａｘ−タンパク質を含有する、請求項１２記載の方法。
14. １４．薬剤は、作用物質として、Ｐａｘ−タンパク質またはその誘導体に対する 少なくとも１個の抗体を含有する、請求項１記載の方法。
15. １５．抗体は、Ｐａｘ−１、Ｐａｘ−２、Ｐａｘ−３、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−５ 、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−７、Ｐａｘ−８、ＨｕＰ１、ＨｕＰ２、ＨｕＰ４８、ｐ ｒｄ、ＢＳＨ９、ボックス・ノイロおよびボックス・メソからなる群からのＰａ ｘ−タンパク質１個以上に対向している、請求項１４記載の方法。
16. １６． （ａ）Ｐａｘ−遺伝子とハイブリッド形成する少なくとも１個の核酸、 （ｂ）少なくとも１個のＰａｘ−タンパク質または／および （ｃ）Ｐａｘ−タンパク質またはその誘導体に対する少なくとも１個の抗体 を含有する作用物質を使用することを特徴とする、腫瘍を診断または／および治 療するための方法。