JPH07509481A - 破傷風ワクチンの産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 破傷風ワクチンの産生 本発明は、破傷風ワクチンとして使用のための破傷風トキシンの調製のための工 程に関する。

既存の破傷風ワクチンは、ホルムアルデヒドの添加によって不活性化された（″ トキソイド化された″）　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉの７日間のフ ラスコ培養物から産生される。ホルムアルデヒドは、その水溶液であるホルマリ ンとして添加される。トキソイドは、ワクチンとして使用するために、塩析分画 によって約１２００綿状凝集単位（Ｌｉｍｅｓ　ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎｉｓ 　；　Ｌ　ｆ　）　／ｍ　ｇタンパク室の窒素（ＰＮ）の比活性まで精製され、 これは、３０％〜４０％の純度に相当する。

免疫吸着剤（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔ　３７．　６０３− ６２１．　１９７４）を使用して、トキソイドを精製することにより、ワクチン の比活性を増加させる試みが行なわれた。しかし、これは、１６００　Ｌ　ｆ／ ｍｇＰＮまでの限られた増加を示すという結果に止った。ＧＢ−Ａ−９６９７７ ２には、精製細菌のトキシン、特に精製ジフテリアトキシンから、水性媒体中鎖 トキシンを、−級アミノ基、または２級アミノ基を含む分子量が２００以下の脂 肪族ジアミンの存在下でホルムアルデヒドで処理することによってトキソイドを 精製する一方法が開示されている。より好ましいジアミンは、リジンとエチレン ジアミンである。

本発明者らは、破傷風トキソイドの調製のための新しい工程を考案した。トキシ ンをトキソイド化してから、そのトキソイドを精製する代りに、本発明者らはま ずトキシンを精製してから、精製トキシンをトキソイド化した。しかし、驚くべ きことには、これらの調製物の多くは不安定であることが見出され、ホルマリン の不在下で、３７℃で貯蔵されるとき、種々の程度に毒性を取戻すことが明らか になった。

次に、本発明者は、トキソイド化反応に対して異なる濃度においてアミノ酸を加 えたり、また、ホルマリン濃度、Ｉ）Ｈｌおよびインキュベーション時間を変化 させてみた。免疫原性が不良な調製物を生した縁結合力（ＴＣＲ）／Ｌｆ比の低 下という犠牲を払わない限り、毒性への復帰をさけることは困難であった。特異 的な条件下においてのみ安定で高度に免疫原性の調製物を得ることができる。

したがって、本発明は、その工程が、精製破傷風トキシンを０．　２〜１％（Ｖ ／Ｖ）のホルムアルデヒドと共に、０．００５〜０．２５Ｍのリジンの存在下で ２４〜３２日間、ｐＨ１６，０〜８．０．３０〜４５℃の温度でインキュベート することからなる破傷風トキソイドの調製のための工程を提供する。

遠心分離し、次に培養の上清を、例えば、２段階の濾過によって透明にすること によって発酵ブロスから精製することができる。透明にしだ上清を濃縮すること ができ、次に、上清はダイアフィルトレーンヨンを行って小さい荷電分子を除き 、次にイオン交換クロマトグラフィーにかけることができる。

精製したトキシンは、Ｌｆ／ｒｌ！含量が２５０Ｌｆ／ｒｌ！以上、例えば２５ ０から５００Ｌｆ／ｍ１であることが望ましい。Ｌｆ含量が２５０Ｌｆ／ｍ１未 満であるならば、トキシンの収率をあげるために、さらなる濃縮工程によって再 調製することできる。

該トキシンの比活性は、精製試料のタンパク質窒素含量（ＰＮ）を推定し、ＰＮ に対するＬｆ比を計算することによって定量することができる。典型的には、精 製トキシンは、例えば２０００から３０００　Ｌ　ｆ／ｍｇＰＮ、または２００ ０から２８００Ｌｆ／ｍｇＰＮの２０００Ｌｆ／ｍｇ以上のＰＮ対しｆ比を有し ている。該トキシンの比活性が２０００　Ｌ　ｆ／ｍｇＰＮ未満あるならば、精 製試料は、イオン交換カラムを通して再精製することができる。２０００Ｌｆ／ ｍｇの比活性は約７０％の純度に相当し、１００％の純度のトキシンは、３００ ０から３２００Ｌｆ／ｍｇＰＮの比活性を有することが報告されている。

トキシンの純度は、代替的に、または付加的に、高圧液体クロマトグラフィー（ Ｉ（ＰＬＣ）分析、そして／または、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリア クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価することができる 。

より好ましくは、純度はＨＰ　Ｌ　Ｃによって決定される。その場合、溶出ピー クが積分され、トキシン関連ピークが、総積分面積の百分率として表現されるト キシン関連ピークによって純度が評価される。還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥに よる分析によってトキシン分子は、その構成要素である重鎮（１００ＫＤ）と軽 鎖（５０ＫＤ）に分離される。２つの該バンドは、染色後に同定することができ 、そして密度測定によって定量された両者の和の強度が総バンドの百分率として 表現される。

ＨＰＬＣ分析、そして／または、５ＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、トキシンが７ ０％未満の純度であることが判明したならば、その試料は、純度を上げるために イオン交換カラムを通して再精製することができる。したがって、ＨＰＬＣ。

そして／または５ＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されたように、トキシンは例えば ７０％から１００％の純度であることがより好ましい。トキシンは、８０％以上 、または９０％以上の純度であることがある。

精製した破傷風トキシンは、０．００５〜０．２５Ｍのリジンの存在下で、０． ２〜１％ＣＶｙ”’Ｖ）ホルムアルデヒドによってトキソイド化される。精製ト キシンの溶液のｐＨを、６．０〜８．　Ｏ１好ましくは６．５〜７．５に調整す るために、ナトリウムポロコハク酸塩のようなバッファーを加えるのが典型的で ある。溶液中の精製トキシンの濃度は、典型的には１５０〜３００　Ｌ　ｆ／ｍ ｌ、より好ましくは約２００Ｌｆ／ｍ１に調整される。

典型的には、精製トキシンは、まずリジンの存在しないときに、ホルムアルデヒ ドとともにブレインキュベートされる。したがって、精製トキシンは、ホルムア ルデヒドと、３０〜４５℃で１０分から２時間、あらかしめブレインキュベート されることがある。ブレインキュベーションは、好ましくは、例えば約３０分の ように２０〜４０分間行われる。ブレインキュベーションの温度は、より好まし くは、例えば約３７℃のように、３５〜４０℃である。

次に、リジンを加える。リジンは、典型的には、Ｌ−リジンモノノ１イドロクロ ライドのようなＬ−リジンである。ナトリウムバイカーボネートバ・ソファ−の ようなバッファーがＤＨを調製するために加えられることがある。精製トキシン のホルムアルデヒドとりシンとのインキュベーションは、約２８日間行われる。

インキュベーションの温度は、より好ましくは、例えば約３７℃のような３５〜 ４０℃である。ホルムアルデヒドの濃度は、好ましくは、０．２５〜０．５％（ Ｖ／Ｖ）である。リジンの濃度は、好ましくは、０．０５〜０．２Ｍである。

適当な条件は −０，２５％（Ｖ／Ｖ）　ホルムアルデヒドと０．０５〜０．ＩＭＬ−リシンと の組合せ、および、 一〇、５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアルデヒドと０．１〜０．２ＭＬ−リジンとの組合 せである。

次に、生したトキソイドを精製することができる。残余のホルムアルデヒドリジ ンは除去する。該トキソイドを、限外濾過によって濃縮することができ、ダイア フィルターして残余のホルムアルデヒド、及びリジンを取除き、膜濾過によって 除菌することができ、該トキソイドのＰＮに対するＬｆの比は、例えば２０００ 〜３０００　Ｌ　ｆ／ｍｇＰＮ、または２０００〜２８００　Ｌ　ｆ／ｍｇＰＮ のように２０００Ｌｆ／ｍｇ以上であることが望ましい。また、該トキソイドは 、ＨＰＬＣｌそして／または、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されたとき、例え ば、７０％〜１００％のような７０％以上の純度であることが望ましい。したが って、ＨＰＬＣｌそして／または、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されたとき、 該トキソイドは８０％以上、または９０％以上の純度であると考えられる。もし ＰＮに対するＬｆの比が２０００Ｌｆ／ｍｇ未満であるかそして／またはＨＰＬ Ｃｌそして／または５ＤＳ−ＰＡＧＥによって定量されるとき、７０％未満の純 度であるならば、該トキソイドはイオン交換カラムを通して再精製することがで きる。

したがって、本発明に記載の破傷風トキソイドは、３７℃で３か月以上、より好 ましくは６か月までの間貯蔵したとき、トキシンに戻らず、例えば２４００〜２ ７００ＬＦ／ｍｇＰＮのような２０００〜２８００　Ｌ　ｆ／ｍｇＰＮの比活性 を有し、例えば２００〜２５０１Ｕ／３．５−Ｌｆのような１３０〜２７０国際 （ＩＵ）／３．　５Ｌｒの力価を有している。

その結果得られたトキソイドは、毒性へ復帰せず既存のワクチンよりも免疫原性 が高い。したがって、トキソイドは、ワクチン組成物を形成するために、医学的 に受入れることができる担体、または希釈剤で製剤することができる。該トキソ イドは、生理的食塩水のような生理的に受入れることができる溶剤を混合するこ とができる。代替法として、血液と等張性の生理的食塩水か、または前の適切な 溶液中の適切な担体上に沈着させるか、それによって吸着させることができる。

このような製剤は、使用前には、２〜８℃に一般的に貯蔵することができる。

Ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌが、該ワクチン製剤中に存在することができる。該トキソ イドは、ジフテリア−破傷風ワクチン、またはジフテリア−破傷風−百日咳の組 合せワクチンのような多成分ワクチンの一部となることができる。

したがって、ヒトは本破傷風トキソイドの効果的な量の投与によって破傷風に対 して免疫感作することができる。典型的には、投与は、筋肉内、または皮下注射 によって達成される。いずれの場合にも、投与を受けたトキソイドの開始用量は ３ｉｆ−ｔｏｔ、ｒであると考えられる。この用量は、２か月の間隔で２回まで 繰返される。５年か１０年後に３Ｌｆ−１０Ｌｆの増強用量が与えられることが ある。

以下の例は、本発明を分り易く説明する。

参照例、および比較例も提供されている。

参照例：精製破傷風トキシンの調製 Ｃ１，ｔｅｔａｎｉ　（ＭｕｅｌｌｅｒとＭｉｌｌｅｒＪ、Ｉ＋ｍ＋ｕｎｏｌ　 ５０　；３７７−３８４．　１９４５）のＨａｒｖａｒｄ株の継代培養物モある Ｃ１．　ｔｅｔ’ａｎｉ　（Ｃ１，ｔｅｔａｎｉ株ＣＮ３９１１を改変Ｍｅｕｌ ｌｅｒの培地（Ｌａｔｈａｍら、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１０．　 １４６．　１９６２）中で培養した。さらに具体的には、１０％（Ｖ／Ｖ）Ｎの ４８時間種培養−を用いてＭｕｅｌｌｅｒの改変培地を含む静置びん、または調 節された発酵槽に接種した。静止培養の場合には、接種の前にアルミニウムの粉 を培地に加えた。１５１’の発酵槽は、５０ｒｐｍで拡拌し、培養の表面に沿っ て０．２ＵＭのフィルターを濾過した空気を５００ｍＡ’／分の速度で送風した 。静置びん、または発酵槽中での発酵は、３３±２℃において４〜７日間続行し た。

発酵ブロスはＸ３０００ｇにおいて４０分間パッチ式遠心分離（６Ｘｌｆのロー ター）によって分離された。上清は、さらに１．　２１０．　８μｍ組み合せフ ィルターに袂いて０．２μ′Ｍの除菌用フィルターを通して２段階の濾過を行っ て透明化した。

次に、培養上清を３０にカットオフ限外濾過膜を使用して１０倍に濃縮し、同じ 膜を使用し、１０倍量のバッフｙ−［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２５ｍＭＮａＣ］、 ０．２Ｍエチレンジアミンテトラアセティツクアシッド（ＥＤＴＡ）ｐＨ７，５ ］を使用して徹底的にダイアフィルターした。この結果、ＨＰＬＣによって□定 量したところによると、純度において１８倍の増加を生じた。この工程からの平 均回収率は８０％であることが判明した。

濾過した試料は、陰イオン交換カラムに適用した［Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ　ＦａｓｔＦｌｏｗｌ。該カラムをｐＨ７，５の２０ｍＭ）リスバッフ ァーで洗浄した。破傷風トキシンは、８０ｍＭ　ＮａＣｌ、トリスバッファーｐ Ｈ７，５で溶出した。溶出した資料は、０．２μｍの除菌用フィルターを通して 除菌濾過した。このようにして精製した物質を以下の試験にかけた。

（ｉ）Ｌｆ含量の推定 本試験は、精製されたトキシン試料のトキシンの収量をモニターした。約５ｍｌ の精製トキシンを試験のために採取した。試料は、試験の前に貯蔵しなかっ２に おいて記載された手順によって行なわれた。精製物質のＬｆ含量は２５〇−５０ ０Ｌｆ／ｒｒ＋ｔ’であった。

（ｉｉ）タンパク質窒素に対するＬＦの比の推定本試験は、精製した試料の純度 を定量した。精製した物質の１ｍ１以上が試験のために使用された。直ちに試験 が行われないならば、試料は、５℃±３℃に貯蔵された。タンパク質の窒素（Ｐ Ｎ）の含量は、トリクロロ酢酸で沈澱させた後、ケルダールの消化技術（Ｋｇｅ ｌｄａｈｌ　Ｊ、（１８８８）　Ｃ，Ｒ，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｌａｂｏｒ。

（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）ん　ｌ−１２）を使用して推定された。Ｌｆ：ＰＮ比 は２０００−３０００　Ｌ　ｆｌｍｇであった。

（ｉｉ）サイズ排除によるＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃプロファイルの定量本試験により、精 製トキノンのＨＰＬＣプロファイルは、受入れ限界内であることか保証された。

１ｍｉ’以上の精製試料か試験のために採取された。試料は、試験を行うまで＋ ４℃で貯蔵された。精製されたトキシンの試料は、ＨＰＬＣゲル濾過カラム（Ｓ ＴＫＧ３０００ＳＷｘｌ）に適用された。試料中の成分の分離は、２．８０％ｍ においてモニターされ、ピーク領域が積分された。ＨＰＬＣの結果はニ ーピークｌ　（保持時間１０．６−１０．７分）−トキシンモノマーニーピーク ２（保持時間１２．４−１２．５分）−トキシンフラグメントＣ；および 一ビーク３（保持時間＞１４分）−汚染物質ピークｌと２の結合積分面積は、ピ ークｌから３までの総積分面積の７０−１００％であった。

（ｉｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルの定量本試験によって、精製トキシンの ５ＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルが受け入れることができる限界内であることが保 証された。精製試料の０．　５ｍＡ’以上を試験のために採取した。試料は、試 験を行うまで＋４℃で貯蔵された。試料は、メルカプトエタノールを使用して還 元した後に、Ｌａｅｍｉｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ、２２７．　６８０−６８５．ｌ ’９７０）によって記載された方法による５ＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。

ゲルは密度計と積分したピーク面積によって走査した。トキシンの重鎮（１００ ＫＤ）と軽鎖（５０ＫＤ）バンドは、密度計測によって検出された積分面積から 計算し、クーマシーブルーで染色した全バンドの７０〜１０ｏ％をなしていた。

例：精製破傷風トキシンのトキソイド生成参照例からの精製破傷風トキシンを最 終トキシンの濃度が２００Ｌｆ／ｍ／になるのに十分量のナトリウムボロコハク 酸（Ｓ　Ｂ　Ｓ　Ａ）バッファーｐＨ７，５で希釈した。部分量が以下の如くト キソイド化された。

１、　０．　２５％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒドを１つの部分量にフォルマリ ンの形で加え、混合物を３７℃で３０分間ブレインキュベートした。次いでＬ− リジンモノハイドロクロライドをＯ，１Ｍナトリウムバイカーボネートの存在下 で最終濃度０．０５−０．１Ｍになるまで加えた。反応混合物のｐＨは６．５か ら７゜５であった。そして、トキソイド化反応を３７℃±２℃で２８日間進行さ せた。

２、　０．　５％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒドをホルマリンの形で別の部分量 に加え、混合物を３７℃で３０分間ブレインキュベートした。次に、Ｌ−リジン モノハイドクロライドを、０．１Ｍのナトリウムバイカーボネートの存在下で最 終濃＃ｔｏ、ｔ〜０．２Ｍまで加えた。反応の混合物のｐＨは、６．５〜７．５ であった。そして、トキソイド化を３７℃±２℃において２８日間進行させた。

インキュベートした試料のＬｆ含量を、参照例に記載の如くに試験した。インキ ュベートした試料を、３０にカットオフ限界濾過膜を使用した限外濾過によって 濃縮した。濃縮物を、残余のホルムアルデヒドとリジンを除くために、同じ３０ に膜を使用して、５ＢＳＡバッファーｐＨ７，５に対してダイアフィルターした 。Ｔｈ１ｏＩＤｅｒｓａｌ　（ｅｔｈｙｌ　ｗｘｒｃｕｒｉｔｈｉｏｓａｌｉｃ ｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　、ナトリウム塩）を最終濃度０．　１　ｇ／　ｌ　（２， ５Ｘ　１０−’ｍｏ　ｌ／ｆ）　ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌになるまで加えた。

得られた溶液を、膜濾過によって除菌（０，２μｍ膜）した。試料を採取し、以 下の如く試験を行った。

（ｉ）タンパク質窒素含量の推定 本試験は、参照例中に記載されたように行われた。結果は、２０００−２８００ Ｌｆ／ｍｇＰＮであった。

（ｉｉ）縁結合力（ＴＣＰ）の推定 本試験は、破傷風トキソイドの抗原含量を定量した。ＴＣＰは、破傷風の分野に おいてよく使用される用語である。そして、ＷＨＯマニュアル（１１゜Ａｐｐｅ ｎｄｉｘ　Ｔ、Ｉ　Ｏ）に引用さてている。ＴＣＰは、トキソイドを希釈し、１ 国際車位（ＷＨＯＢＬＧ／ＵＮＤＰ／７７．１　Ｒｅｖ、１）に等価になったと きのトキソイドの容量の逆数として定義される。トキソイドの質は、Ｌｆ単位に 対するＴＣＰ　（結合単位）の比をめることによって測定することができ、それ は、ｌより大きいはずである。

５．０ｍ１以上のトキソイドが、試験のめに採取された。その試料は、直ちに試 験されないときは、５℃±３℃で貯蔵された。補正された幾何学的数列を形成す る０、０！〜０．０３μｌの適当な範囲の容量の試験物質と参照破傷風トキソイ ド８７国際車位（ＩＵ）／ｍｌは、一連の試験管に分注された。参照破傷風アン チトキシン溶液の２［Ｊｌｏ、５ｍｌの一定量が各試験管に加えられ、室温で６ ０分間保たれた。

各チューブに、アンチトキシン用量の１倍半に等価である破傷風テストトキシン の用量を加え、３０分間放置した。各チューブの内容物を、それぞれ、体重が１ Ｂ−２２ｇのマウスに皮下注射した。マウスは、４日間破傷風の典型的な麻痺の サインについて観察された。

もし、特異的な破傷風の麻痺が３日以内に起ったならば、試験試料は、加えたア ンチトキシンの用量の１．　５倍以上のアンチトキシンに等価な用量を含んでい た。もしマウスが３日以上の間破傷風に特異的な麻痺なしで生存したならば、該 試験は、加えたアンチトキシンの用量の１倍半未満と等価な破傷風トキソイドを 含んでいた。３日目における破傷風固有の麻痺の発現は、加えたアンチトキシン の１倍半の量に等価な破傷風のトキソイドの量が正確に採取されたことを示唆し ている。

結果は、平均値の２０％以上異ならない限り、２つの試験の平均値として容認さ れた。結果は２００−３５０Ｕ／ｍ／であった。

（ｍ）Ｌｆ含量の推定 Ｌｆ含量は、参照例に記載の如く定量された。その結果は、１５０−２５０Ｌｆ ／ｍｌであった。

（ｉｔ）ＨＰＬＣプロファイルの定量 ＨＰＬＣプロファイルは、参照例において記述された如く定量された。結果は、 ７０〜１００％の純度であった。

（ｖ）復帰についての試験 本試験は、貯蔵または使用中にトキソイドからトキシンへの復帰を全く起きない ことを示し、ＷＨＯＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、 ７２５．　ｐ、６７の要求事項を満していることが証明された。１０ｍ１のシア ファイルターしたトキソイド試料を採取し、上述のようにＬＦ含量が推定される まで５±３℃において貯蔵した。該試料を１６Ｌｆ／ｍｊ’に希釈した。希釈し た試料は、３７℃で保持された。６週間、２か月、および３か月の貯蔵後に、試 料を無毒性について試験した。５ｍｌの試料を２匹の健康なモルモットの各々に 対して皮下に接種した。モルモットを、死と固有の麻痺の徴候について１４日間 観察した。トキシンへの復帰の証拠はなかった。

（ｖｉ）電気泳動移動度によるトキソイドの特徴づけ本試験は、トキソイド化し た試料の力価を予告した。０．５ｍｌのダイアフィルターされたトキソイドの試 料を、試験のために採取した。試料は、直ちに試験されない場合は、５±３℃に おいて貯蔵された。ガラスのプレートを、ｐＨ８゜６の６０ｍＭトリスバッファ ー中の１％（Ｖ／Ｖ）アガロースで覆った（０．　１８ｍ１／ｃｍ”　）ｏ試料 （５μｌ）を、−次元で、２ｏポルト／ｃｍで６ｏ分間電気泳動を行った。ウマ ー抗−破傷風血清を含む（０，０６％Ｖ／Ｖ）アガロース中に、２番目の次元の 電気泳動を、６ボルト／ｃｍで１６時間行った。

ゲルを、クーマシーブルーで染色し、トキソイドピークの原点からの移動度を測 定した。参照トキソイド（１４ｍｍ）の結果を含めて、結果は５−３０ｍｍで本 試験は、英国薬局方（１９８０）、ＩＩ巻、ｐ８８０．Ｐｈ、Ｅｕｒ、、ｍ巻に 対する補遺（１９７７）、ｐ１７５とＷＨＯＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ 　５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ。

６３８、ｐ、９０．５ｅｃｔｉｏｎ　Ａ、３．　５．　６の要求事項を満足して いた。力価は、トキソイド試料をアジュバント上（アルミニウムヒドロキシド、 　Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）に吸着させることによって調製したワクチンでの免疫 感作に対する応答から決定された。

最終バルク吸着ワクチンのトランジットの容器からの試料が、試験のために使用 された。試料は、即座に試験されなけば、５℃±３℃で貯蔵された。試料は、Ｐ ｈ、Ｅｕｒ、ＶｏｌｌｌＩ　（１９７７）に対する補遺、ｐ、１７５に記載の方 法によって試験された。力価は、ホルムアルデヒドでトキソイド化し、次にトキ ソイドを精製することによって調製された現行ワクチンの７０〜１１０Ｉｕ／７ Ｌｆの力価よりも有意に高い１３０〜２７０Ｉｕ／３．５Ｌｆと定量された。

（ｖｉ）特異的毒性のための試験 本試験は、英国薬局方（１９８８）、ＶｏｌＩＩ、ｐ、１０６２；Ｐｈ。

Ｅｕｒ、、１９８５．ｐ、４５２、およびＷＨＯＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏ ｒｔ　５ｅｒｉｅｓＮｏ、６３８．　ｐ、９０．５ｅｃｔｉｏｎ　Ａ、３．　５ ．　５の要求事項に基づいている。

試験は、破傷風トキソイドのためと考えられる検出できる毒性が存在しないこと を確認した。　１２．５ｍ１以上のトキソイド試料が、試験のために採取された 。

直ちに試験をしない場合には、試料は５℃±３℃で貯蔵した。方法は、Ｐｈ。

Ｅｕｒ、、１９８５．ｐ、４５２に記述された方法に基づいていた。少くとも５ ００Ｌｆ単位の破傷風トキソイドを含む１ｍｊ７の希釈液を、それぞれ、体重が 、２５０ｇ〜３５０ｇの５匹の健常なモルモットの各々に皮下注射した。動物を 、特異的毒性、または麻痺の徴候について２１日間観察した。破傷風のトキソイ ドのためと考えられる毒性の証拠はなかった。

比較例１：リジンの不在下におけるトキソイド形成参照例の精製破傷風トキシン を、ホルマリン単独添加によってトキソイド化した。０．２５〜１．　０％のホ ルムアルデヒＦをホルマリンの形で、２００１．ｆ／ｍｌにおけるトキシンと共 に、３７℃±２℃で１４日間インキュベートした。したがって、リジンを添加し なかった。

その結果得られたトキソイドを、例に記載の如く、復帰について試験した。トキ ソイドは、毒性に復帰した。復帰したトキシンは古典的な破傷風を誘発すること は希であったが、異なる神経症候群を生じた。

比較例２：異なる条件下でのリジンの存在におけるトキソイド形成参照例の破傷 風トキシンを以下のようにトキソイド化した：（ｉ）対照例の破傷風トキシンを 最終トキシン濃度が、２００Ｌｆ／ｒｒｌになるように、十分量のｐＨ７，５の ５ＢＳＡバツフアーで希釈した。０．１−１．０％のホルムアルデヒドを、ホル マリンの形で部分量に加え、混合物を３７℃で３０分間ブレインキュベートした 。次に、Ｌ−リジンモノハイドロクロライドを、０．１Ｍナトリウムバイカーボ ネートの存在下で最終濃度が０．００５〜０．１Ｍになるまで加えた。反応混合 物のｐＨは、６．５〜７．５であった。そして、トキソイド形成を、３７℃で１ ４日間進行させた。

（ｉｉ）トキソイド形成反応のｐＨを６．０から８．５に変更したことを除き（ ｉ）のように行った。

（斑）リジンの代りに、アルギニン（０，０５〜０．１Ｍ）が使用されたことを 除き、　（ｉ）のように行った。

（ｉｖ）インキュベーション期間を１４日間から２１日間まで増加させたことを 除き、　（ｉ）のように行った。

（Ｖ）プレインキュベーションの期間を設けなかったことを除き、（ｉ）のよう に行った。

得られたトキソイドは、すべて、例に記載の如く復帰について試験した。トキソ イドはすべて毒性へ復帰した。

事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　ザ　ウェルカム　ファウンデーション　リミテッド６、補正によ り増加する請求項の数 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文 明細書、請求のｌ１ｉｌ！ｉｌ！及び！釣書翻訳文の浄書（内容に変更なし）、 　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９３１０１０３７

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．精製破傷風トキシンを０．００５〜０．２５Ｍのリジンの存在下で０．２〜 １％（Ｖ／Ｖ）のホルムアルデヒドとともに、６．０〜８．０のｐＨ、３０〜４ ５℃の温度で、２４〜３２日間インキュベートすることからなる破傷風トキソイ ドの調製方法。
2. ２．破傷風トキシンが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉの培養物から精製 された請求項１に記載の方法。
3. ３．精製トキシンの比活性が、２０００〜３０００Ｌｆ／ｍｇＰＮである請求項 １、または２に記載の方法。
4. ４．精製トキシンが、高圧液体クロマトグラフィー、そして／またはナトリウム ドデシルサルフェートーポリアクルアミドゲル電気泳動で定量したとき、８０％ 以上の純度を有する請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
5. ５．精製トキシンが、リジンの存在下で３５〜４０℃において、２０〜４０分間 プレインキュベートされる請求項１から４のいずれかｌつに記載の方法。
6. ６．精製トキシンが、ホルムアルデヒドとリジンと共に、３５〜４０℃で約２８ 日間インキュベートされる請求項１から５のいずれか１つに記載の方法。
7. ７．該インキュベーションの工程において、０．２５〜０．５％（Ｖ／Ｖ）のホ ルムアルデヒドが用いられる請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
8. ８．０，０５〜０．２Ｍのリジンが該インキュベーションの工程に用いられる請 求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
9. ９．トキソイド化されたトキシンがワクチン組成物を形成するために、医薬的に 受入れることができる担体、または希釈剤と製剤化されている請求項１から８の いずれか１つに記載の方法。
10. １０．３７℃で３か月間貯蔵されたときトキシンに復帰せず、２０００〜２８０ ００Ｌｆ／ｍｇＰＮの比活性を有し、１３０〜２７０Ｉｕ／３．５の力価を有す る破傷風トキソイド。
11. １１．医薬的に容認できる担体または希釈剤、および活性成分として、請求項１ ０に定義されている破傷風トキソイドを含むワクチンの組成物。