JPH07509618A - リパーゼ標識プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リパーゼ標識プローブ 本発明は、リパーゼで標識されたプローブまたは検定物質と、生物学材料の測定 のためのリパーゼの使用に関するものである。

生物学的に関与する基、ある種の遺伝子、抗原、抗体、バクテリアの表面タンパ ク質またはこれらに類するものの検出のため、これらの探索しようとする物質の 検出を助長することを目的として、マーカーおよび検定物質が開発され得ること は、これまでに知られていた。

特に、遺伝子工学の分野においては、遺伝子プローブを放射性標識し、こうした 遺伝子プローブを相補的核酸の探索に使用することが知られている。酵素で標識 した検定物質の場合には、酵素として、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスフ ァターゼが従来使用されてきた。どちらの酵素も、比較的良好な感受性と比較的 容易な検出性を有することを特徴としており、これはマーカーまたは検定物質と してのこれらの適合性を強調するものである。しかし、これらの特別の酵素は欠 点をも有している。すなわち、例えば、ある種の物質の検出にこれらの酵素を使 用することが不可能となるような、ある種の一般的な条件を伴わなければならな い点である。さらに、これらの酵素の貯蔵寿命および熱安定性には限度がある。

また、これらの酵素は、厳密に特定した媒質中で作用を実施することが必要であ り、このことはこれらの実用の面において、大きな制約である。最後に、例えば アルカリホスファターゼの使用に際して必要な、金属イオンの存在は、多くの検 定を困難なものとし、またＥＤＴＡのような金属イオンと複合体化する物質はホ スファターゼの使用を不可能とするばかりでなく、同時にペルオキシダーゼの場 合においても、変性の危険があり、そのために検定の限界をかなり悪化させる危 険性も生じる。

したがって、本発明の目的は、十分改善された安定性とかなり広い適用範囲を有 し、これによって、酵素標識プローブまたは検定物質の使用が以前は全く不可能 だった物質の分析測定を可能とすることで特徴づけられる、酵素で標識されたプ ローブまたは検定物質を製造することである。

この目的は、酵素として、植物由来のリパーゼ、それらのイソ酵素、または少な くとも７０％のアミノ酸の相同性とリパーゼ活性を有する構造類似体を使用する ことによって、基本的に達成される。起源として特に適当であることが証明され 、文献ではキャンディダ・ンリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｃｙｌｉｎｄｒａ ｃｅａ　）としても記載されている、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ 　ｒｕｇｏｓａ）は、構造か広範囲にわたって決定されているリパーゼを有して いる。このリパーゼ配列のクローニングおよび分析がＧｅｎｅ″１２４　：　ｌ 　（Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１４．１９９３．ｐａｇｅｓ　４５−５５）に特に詳細 に記載されている。この酵素は、この文献に、５３４アミノ酸を有する５７ｋＤ ａタンパク質で、８０％のアミノ酸相同性を有する５つのイソ酵素がすでに構造 的に分析されていることが記載されている。ともかく植物由来の、特に真菌類由 来の酵素である。キャンデイダ・ルゴーサＤＳＭ　２０３１由来のリパーゼが特 に好ましい。すべての既知の酵素、また別種の既知のリパーゼ、特に動物リパー ゼに比較して、この酵素の使用により、生成物の特性において、実質的な改善が 得られる。特に、本発明において提案されるリパーゼを使用する場合、少なくと も６０℃までの熱安定性が保証されることがわかった。これはアルカリホスファ ターゼにおいてもペルオキシダーゼにおいても達成できないことである。特に、 許容される反応速度を得るためには高温の使用が重要な必要条件となる、ハイブ リッド化試験に関しては、こうして達成された熱安定性が、これらの試験を合理 的な時間内に実施することを可能にする必要条件となる。

本発明によって提案されるリパーゼのさらに有利な点は、活性のために金属イオ ンを全く必要としないことである。アルカリホスファターゼの場合、酵素活性の ためにはマグネシウムおよび亜鉛イオンを必要とするが、これらの金属イオンは そのまま、例えばヌクレアーゼを活性化するので、その結果として遺伝子プロー ブのためのアルカリホスファターゼの使用が妨げられる。

特に酵素で標識された遺伝子プローブを使用する場合、ヌクレアーゼの活性化の 防止を確実にするため、例えばＥＤＴＡのような錯体化物質がしばしば使用され る。ＥＤＴＡは金属イオンと錯体化し、そのためアルカリホスファターゼの使用 ができなくなるばかりでなく、かなり大量のＥＤＴＡはタンパク質を変性する傾 向をも有している。本発明によって提案されるリパーゼは、既知の酵素よりも実 質的に高い熱安定性ばかりてなく、ＥＤＴＡに対する完全な安定性によっても特 徴づけられる。本発明によって提案されるリパーゼの既知の酵素に対するさらに 有効な優位性は、尿素およびこれに関連する誘導体もまた、リパーゼの機能を全 （害さないことである。リパーゼを使用するときは、ＳＨ基を保護するためにＥ ＤＴＡを使用することができる。これは、従来の酵素で標識されたプローブまた は検定物質においては全く不可能だったことである。

本発明において使用する酵素は、有機溶媒に対するがなり改善された耐性によっ ても特徴づけられる。特に、本発明によって提案されるリパーゼはトルエン中で も使用することができ、このことにより、本発明のプローブまたは検定物質の分 析用適用の範囲がかなり広がる。

高安定性により、本発明のプローブまたは検定物質をｐＨ２，５から９までの範 囲で使用することが可能であり、尿素に対する非感応性により、高度に疎水性の 物質の検出も可能となる。他の酵素で標識されたプローブまたは検定物質におい ては許容されるはずがなかった、例えば尿素の人員の使用により、ＤＮＡの２次 構造をある程度伸長させることができ、そのため遺伝子プローブの信頼性をかな り向上させることもできる。

本発明によって提案されるリパーゼのかなり高い安定性により、反応性物質、特 に生物学的認識物質への結合のタイプの点でほとんど何らの制限もない。

これらの高安定性により、リパーゼ複合体を乾燥すること、および必要ならば凍 結乾燥形態で、または単に空気中乾燥したもので、活性の損失を伴わないで、室 温で数年保存することが可能である。全体として、既知の酵素により標識された プローブに比較して、変換率は同し程度の大きさであるが、リパーゼの検出能力 が優れているため、結果的に優れた感受性を有している。

例えばアルカリホスファターゼとの比較試験において、検出限度がおよそ２５０ から１１００１）であるのに対し、実験によれば、リパーゼはおよそ５ｐｇの範 囲まで正確に測定され、そして純粋に定性的な分析の他、１０ｎｇの範囲まで比 較的簡単な定員さえも可能であることが示された。

リパーゼの測定は、例えばフェノールのエステルまたはその誘導体を基質として 使用した通常の方法によって実施することができる。この方法において発現する 呈色反応により、直接的なそして簡単な分析が可能である。適当な操作法は、当 分野の技術を有する者により知られている。

本発明のリパーゼの安定性における優位性は特にオリゴヌクレオチドプローブに 関してきわめて意義深い。

本発明の好ましい実施態様によれば、プローブまたは検定物質は、リパーゼがビ オチン、アビジン、レシチン、プロティンＡ。

プロティンＧ、抗体結合タンパク質、抗体、抗原、ウィルスタンパク質抗原、バ クテリア表面タンパク質、ジゴキシゲニン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチ ドまたは合成類似体、金属コロイドまたはプラスチック微粒子（く５μｍ）と複 合体化したものとして特徴づけられる。これらの複合体は広い範囲での適用のた めの特異的な反応性基を有し、特に生物学的認識物質を有し、こうしてこの方法 で標識されたプローブまたは検定物質のきわめて広い適用分野を提供する。

本発明はさらに、分析用プローブまたは検定物質の製造のために、植物由来、特 にキャンディダ・ルゴーサＤＳＭ　２０３１由来のリパーゼ、それらのイソ酵素 または少なくとも７０％のアミノ酸相同性およびリパーゼ活性を有する構造類似 体を使用すること、そしてその中でリパーゼが生物学的認識基との複合体の形態 で使用され、これらの検定物質が特に生物検定、試験片、バイオセンサーのため 、または遺伝子プローブとして好適なもの、に関するものである。これに関連し て、遺伝子プローブとして特に典型的なオリゴヌクレオチドプローブを使用する ことができ、これはリパーゼの好ましい熱安定性によって、苛酷な条件下での選 択的ハイブリッド化が可能となっている。

本発明において提案する植物由来の、特にキャンディダ・ルゴーサ由来のリパー ゼまたはそれらのイソ酵素および上記の構造類似体の優位性を、以下の図および 実施例によって、さらに詳細に明らかにする。

困」ユはキャンディダ種由来のリパーゼの熱安定性を示す。活性は、温度５０℃ においては、ｐＨ値５では試験時間中はとんど一定で、ｐＨ値７ては１時間後に おいてもなお初期活性の７５％以上が保持されていることがわかる。温度６０℃ においてもｐＨ値５では、１時間後最初の活性のおよそ８０％が保持されている 。

」はリパーゼおよびアルカリホスファターゼの呈色反応の検出限度を示す。アル カリホスファターゼの場合は、およそ２５０＋）ｇにおいてほぼ検出限度に達し ているのに対し、リパーゼの場合には、原図ではｓｐｇにおいてさえも呈色反応 のスポットを検出し得ることかわかる。リパーゼの場合はスポットの直径は１０ ｎｇの範囲でも実際の量と実質的に相関しているが、アルカリホスファターゼの 場合はおよそ５００ｐｇ以下ては単純な定量評価は容易にはできない。

図３はオリゴヌクレオチド遺伝子プローブのためのリパーゼの使用を、流れ図に おいて模式的に描いている。この過程において、構造遺伝子２はビオチン−アビ ジンカップリングを介してマイクロタイタープレート１に固定されている。オリ ゴヌクレオチドプローブ４がリパーゼ３に連結されているが、マイクロタイター プレートｌに固定された遺伝子とオリゴヌクレオチド４の両方に結合する被検体 ５がある場合、このリパーゼがマイクロタイタープレートに固定される。結果と して、検出すべき特定の生物学的物質５が存在すると、リパーゼ３はハイブリッ ド化反応によって、マイクロタイタープレートｌに固定される。したがって、適 当な方法、例えば適当な基質を試薬として使用したリパーゼの呈色反応によって 、定性的検出が可能である。

盈」は、リパーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼの最適ｐＨ 値の比較を示す。

皿】は、リパーゼおよびアルカリホスファターゼの色素沈降検定を示す。

実施例 一般操作 ＡＢＴＳを使用した西洋ワサビペルオキシダーゼの活性検定原理： ０、１Ｍクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ４，５中、２３℃において、過酸化 水素（０，０４５％）存在下でのＡ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　（１，４９ｍＭ）の酸化速度 を波長４２０ｎｍにおいてモニターすることにより、西洋ワサビペルオキシダー ゼを分光光学的に検出した。

方法の説明： Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　（２０ｍｇ／水１０ｍ１）　０．５ｍｌ、過酸化水素（水中０ ．６％）１ｍｌおよび０．１Ｍクエン酸塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ４，５９，５ ＋＋＋ｌの基質混合物を準備した。

酵素溶液５０μｌを上記の基質溶液５００μｌと混合し、１分間にわたり、波長 ４２０ｎｍにおいて、酵素反応の動力学をモニターした。

ＡＢＴＳについての吸光係数を使用して、酸化された基質の濃度を計算した。反 応条件下で吸光曲線の直線状経時変化が確保されるように、酵素溶液の濃度を設 定した。

０．１ＭＴＲｌ５、Ｏ，１ＭＮａＣ１および５０ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１２、ｐ　Ｈ８ ，５中、２３°Ｃにおいて、Ｏ，１ｍＭｐ−ニトロフェニルホスフェートの加水 分解を、波長４０５ｎｍにおいてモニターすることにより、アルカリホスファタ ーゼを分光光学的に測定した［Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ、　Ｃ，ａｎｄＬａｚｄｕｎ ｓｋｉ、Ｍ、　（１９６６）　ＢＢＡ　１１３，５５１−５６６］。

方法の説明： 酵素溶液５μｌをＯ，ＩＭＴＲＩＳ、０，１ＭＮａｃ］および５０ｍＭＭ　ｇ　 ＣＩ２　（ｐＨ８，５）　５００μＩ　と混合した。０．６ｍＭｐ−−−トロフ ェニルホスフェート溶液１００μＩを添加した後、１分間にわたって、４０５０ ｍにおいて、反応経時変化を動力学的にモニターした。反応条件下で吸光曲線の 直線状経時変化が確保されるように、酵素溶液の濃度を設定した。ｐｌ（＝８． ５におけるｐ−ニトロフェノールの検量線を使用して、加水分解された基質の濃 度を測定した。

ｐ−ニトロフェニルブチレートを使用したリパーゼ活性の測定原理： ０、１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０中、２３℃において、０．１ｍＭｐ−ニト ロフェニルブチレートの加水分解を、波長４０５ｎｍにおいてモニターすること により、リパーゼを分光光学的に測定した。

方法の説明 ｐ−ニトロフェニルブチレート（ｐＮＰＢ）２３μｌを水中１％ポリビニルアル コール５ｍｌと激しく撹拌しながら混合して、ｐＮＰＢの原液を製造した。未溶 解のｐＮＰＢを含む相を遠心分離（４℃、１５００ｇ、７分）によって分離した 。

残っているｐＮＰＢの水性溶液の濃度を、ｐＨ＝７．０におけるｐ−ニトロフェ ノールの検量線を使用して測定した。

酵素溶液５μｌを０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）　５００μｌに混合 した。０．６ｍＭｐ−二トロフェニルブチレート溶液１００μＩを添加した後、 反応動力学を１分間にわたって波長４０５ｎｍにおいてモニターした。反応条件 下で吸光曲線の直線状経時変化が確保されるように、酵素溶液の濃度を設定した 。ｐＨ＝７．０におけるｐ−ニトロフェノールの検量線を使用して、加水分解さ れた基質の濃度を測定した。

リパーゼの前処理： 各種リパーゼのＸ線結晶学研究によれば、その活性中心はらせん形タンパク質部 分によってふたをされた状態のみぞのような形をしていることがわかった［Ｓｃ ｈｒａｇ、Ｊ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｃｙｇｌｅｒ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　２３０．５７５−５９１　（１９９３）　；　Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ 、Ｕ、、　Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ、Ａ、Ｍ、。

Ｌａｗｓｏｎ、Ｄ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ、Ｚ、Ｓ、、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１．１５３２−１５４１（１９９２）］。各種エフェクタ ーによって、伸長させて立体的再構成を起こさせることが可能であり、それによ って、活性中心がより自由に基質と接触し得るようになる。

リパーゼ（タンパク質濃度０．０９ｍｇ／ｍｌ　；　Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により 測定）を室温において、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ５゜０中 の２０から４４％（Ｖ／Ｖ　）エフェクター溶液（例えばテトラヒドロフラン、 ２−メチル−ベンタンジオール、２−イソプロパツール・・・）と１から６０分 インキュベートした。続いて酵素溶液を０、１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０，０ ，１％ＢＳＡ、またはＯ，１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０，０，１％ＢＳＡ中の ０．２％（ｖ　／ｖ　）　Ｔｗｅｅｎによって測定可能な濃度まで希釈した。試 料を４℃において貯蔵した。ｐＮＰＢ検定を使用して活性を測定した。

０．１Ｍ緩衝液、ｐＨ１，５−９，０中、２３℃において、０．３８ｍＭヒドロ キノンモノブチレートの加水分解を、波長２９５ｎｍにおいてモニターすること により、リパーゼを分光光学的に測定した。

方法の説明： ヒドロキノンモノブチレート（ＨＭＢ）１０ｍｇを水性１％ポリビニルアルコー ル６ｍｌに激しく撹拌しながら混合して、ＨＭＢの原液を製造した。ヒドロキノ ン検量線によって、ＨＭＢ溶液の濃度を測定したところ、３．０８ｍｍｏｌ／　 Ｉたった。

酵素溶液２０μｌを、必要なｐＨ値に設定しておいたＯ、　１Ｍ緩衝液７００μ ｌに混合した。３．０８ｍＭＨＭ　Ｂ溶液１００μｍを添加した後、酵素の反応 動力学を、２分間にわたって波長２９５ｎｍにおいてモニターした。反応条件下 で吸光曲線の直線状経時変化が確保されるように、酵素溶液の濃度を設定した。

ヒドロキノンの検量線を使用して、加水分解された基質の濃度を測定した。

実施例１： ｐ−ニトロフェニルブチレートまたはｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用し たリパーゼおよびアルカリホスファターゼの比活性の比較 １、精製西洋ワサビペルオキシダーゼ　１０５０μｍｏｌ　／ｍｉｎ　−ｍｇ（ ＡＢＴＳ、ｐＨ＝４．５．２３°Ｃ）２、精製アルカリホスファターゼ　９００ 　μｍｏｌ　／ｍｉｎ　−ｍｇ　（ｐ　−二トロフェニルホスフェート、ｐＨ＝ ８．５．２３℃）３、キャンディダ・ルゴーサ由来のリパーゼの粗調製品　２７ ００μｍｏｌ　／ｍｉｎ　−ｍｇ　（ｐ−ニトロフェールブチレート、ｐ）（＝ ＝７．０．２３°Ｃ） 活性は酵素粗調製品の総タンパク質濃度と関連性があった。

精製リパーゼイソ酵素の場合には、比活性は有意な増加が期待される。

実施例２： リパーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼの最適ｐ Ｈの測定および比較 ヒドロキノン検定によって、異なるｐＨ値におけるリノく−ゼ活性を測定した。

酵素リパーゼはきわめて広い範囲の最適ｐＨ（１）Ｈ３−８間）を有しているの で、（例えばペルオキシダーゼとの）連鎖的酵素検定に好適である。アルカリホ スファターゼは７以上のｐＨ値で活性であり、ペルオキシダーゼは基質としてＡ ＢＴＳを使用した時、約ｐＨ＝５の最適ｐＨを有する（図４）。

実施例３ ＥＤＴＡに対するリパーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスフ ァターゼの安定性 上記のすべての酵素を５０ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ存在下、４℃でインキュベートし た。すべての測定酵素濃度をタンパク質含有量２０ｎｍｏｌに設定した。

・西洋ワサビペルオキシダーゼは０．０５％ＢＳＡを含有するＯ、　１Ｍリン酸 塩緩衝液、ｐＨ７，５を使用して測定した。

・アルカリホスファターゼは１ｍＭＭｇＣＩ２および０．１ｍＭＺｎＣｌ　２． ０．０５％ＢＳＡを含有すル５０ｍＭＴ　ＲＩ　Ｓ緩衝液、ｐＨ７，６で希釈し た。

・リパーゼは０．０５％ＢＳＡを含有する０、　１ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５， ０で希釈した。

実施例４： ５０℃において１２０分間インキュベートすることにより、タンパク質濃度０． ２ｍｇ／ｍｌにおける上記酵素の熱安定性を比較した。

・西洋ワサビペルオキシダーゼは０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５中でイン キュベートした。

・アルカリホスファターゼは５０ｍＭＴ　ＲＩ　Ｓ　、１　ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１ｇ および０．１ｍＭ　ＺｎＣＬ　、ｐＨ７，６中でインキュベートした。

・リパーゼは０．５％ＢＳＡを含有する０、１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０で希 釈した。

実施例５： ２５℃および４℃において０．０５％アジ化ナトリウム存在下で、すべての上記 酵素をインキュベートした。これらの酵素を相互に比較するため、２０ｎｍｏｌ ／ｍｌのモル当量タンパク質濃度を使用した。

・西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は０．１Ｍリン酸塩緩衝液、０．５％ ＢＳＡ、ｐＨ７，５で希釈した。

・アルカリホスファターゼは５０ｍＭＴ　ＲＩ　Ｓ　、１　ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１ｔ および０．１ｍＭ　Ｚ　ｎ　Ｃ＋　２．０．０５％ＢＳＡ、ｐＨ７，６で希釈し た。

・リパーゼはＯ，１Ｍ酢酸塩緩衝液、０．０５％ＢＳＡ、ｐＨ５，０で希釈した 。

アジド類はすべての上記酵素の保護のために使用することができる。アルカリホ スファターゼについては、酵素活性のわずかな減少（１日当たり１０−２０％） が観察された。さらに、アジドは、過酸化水素の存在下（検定中）では、ペルオ キシダーゼ（ＨＲＰ）の不活性化による活性の低下をもたらす。

実施例６： すべての上記酵素を、２５°Ｃおよび４℃において７Ｍ尿素とともに、インキュ ベートした。これらの酵素を比較するため、２０ｎｍｏｌ、７ｍ１のタンパク質 濃度を使用した。

・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）　、０ ．０５％ＢＳＡて希釈した。

・アルカリホスファターゼは５０ｍＭＴ　ＲＩ　Ｓ　（ｐＨ７，６）、１ｍＭＮ ｉｇｃ１２および０．１ｍＭ　Ｚ　ｎ　Ｃｌ　２．０．０５％ＢＳＡで希釈した 。

・リパーゼは０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ５，０）　、０．０５％ＢＳＡで希 釈した。

４℃において、７Ｍ尿素溶液はすべての上記酵素のわずかな変性をもたらすのみ である（１日当たり１０％の活性減少）。２５℃においては、これらの酵素の活 性は５０％減少する。

実施例７： 最終タンパク質濃度３ｍｇ／ｍｌとして、Ｏ，ＩＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　Ｏ，１Ｍ リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５中で、１０倍過剰の２−イミノチオレインを使用し て、リパーゼへのチオール基の導入を実施した。

室温で２０分インキュベートした後、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−３ ０管を使用した超遠心分離によって、修飾された酵素から過剰の２−イミノチオ レインを分離した。Ｅｌ１ｍａｎ試薬［５，５’　−ジチオ−ビス−（２−ニト ロ安息香酸）コを使用して、修飾の程度を測定した。ＳＨ基で修飾されたタンパ ク質を、４℃において、０．１ＭＥＤＴＡ、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５中で 保存した。

実施例８： （スルホ）スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン）； 　（ＰＩＥＲＣＥ　２２３２２Ｘ）　ｍ−７レイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステル；（ＰＩＥＲＣＥ　２２３１２Ｘ）　（スルホ）スク シンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート；（ＰＩＥＲＣＥ２ ２３１７Ｘ）　（スルホ）スクシンイミジル＝（４−ヨードアセチル）アミノベ ンゾエート；　（Ｐ　Ｉ　ＥＲＣＥ　２２３２７Ｘ）少なくとも２つの異なる反 応基を有する、上記の商業的に入手し得るヘテロ２官能性架橋剤は、逐次結合を 可能にし、望ましくない高分子化や自己複合体化を最小限に留める。これらの架 橋剤を以下のようにして試験した： ５０ｍＭホウ酸塩緩衝液、０．ＩＭＥＤＴＡＳｐＨ＝７中で５０モル過剰のへテ ロ２官能性架橋剤を使用して、リパーゼを上記の架橋剤で修飾した。リパーゼ画 分のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ試験によって測定したところ、３ｍｇ／ ｍｌだった。このリパーゼは有意な活性の減少を何ら示さなかった。

実施例９： リパーゼのカルボキシル基を、ポリエチレングリコール、■＝エチルー３−（３ −ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシ スクシンイミド（ＮＨ３）の存在下で、修飾した。

方法の説明： 当型点ｐｌ＝５．５からｐｌ＝７．０の修飾リパーゼ０．０゛−ビス−（２−ア ミノプロピル）ポリエチレングリコール１９００　（Ｍ、　Ｗ：２０００）　（ ジアミノＰＥＧ）の原液を、水中０．５９ｇ　／ｍｌの濃度で調製し、希塩酸で ｐＨ＝４．６に設定した。

５ｍｇ／ｍｌだった。５００ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５によって、反応をＥＤＣ の水性溶液とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　中のＮＨ８溶液をモル比１５： １で混合して、ＥＤＣ／ＮＨ８の原液を製造した。この原液を即時使用した。

リパーゼ（３８４ｕｇ　；　６．７ｎｍｏｌ　）とジアミノＰＥＧ溶液（１２， ２ｍｇ、　６．４　μｍｏｌ　）を混合した。その後ＥＤＣ／ＮＨ３混合物（Ｅ Ｄ　Ｃ：　０．１５ｍｇ、　７８０ｎｍｏｌ　；　ＮＨＳ　：　０．００６ｍｇ 　、　５２ｎｍｏｌ）を添加し、この混合物を暗所で４℃において１６時間イン キュベートした（反応混合物のｐＨは６．８だった）。最終タンパク質濃度は５ ｍｇ／ｍｌだった。５００ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５によって、反応を停止させ 、５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０に対する電気透析によって、過剰のジアミ ノＰＥＧを分離した。反応生成物を未処理のポリアクリルアミドゲル上で分析し 、インドリル酢酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム塩（Ｎ　Ｂ　Ｔ）を使用した 染色によって検出した。

当型点ｐｌ＝７からｐＩ＝９の修飾リパーゼ０．０“−ビス−（２−アミノプロ ピル）ポリエチレングリコール１９００　（Ｍ、　Ｗ：２０００）　（ジアミノ ＰＥＧ）の原液を、水中０．５９ｇ　／ｍｌの濃度で調製し、希塩酸でｐＨ＝４ ．６に設定した。

ＥＤＣの水性溶液とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮＨ８溶液をモル比１ ５：１で混合して、ＥＤＣ／ＮＨＳの原液を製造した。この原液を即時使用した 。

リパーゼ（３８４ｕｇ　；　６．７ｎｍｏｌ　）とジアミノＰＥＧ溶液（１２， ２ｍｇ、　６．４　μｍｏｌ　）を混合した。その後ＥＤＣ／ＮＨ３混合物（Ｅ ＤＣ：　０，６１ｍｇ、　３．２　μｍｏｌ　；　ＮＨＳ　＋　０．０２４ｍｇ 　、　０．２１μｍｏｌ　）を添加し、この混合物を暗所で４℃において１６時 間インキュベートした（反応混合物のｐＨは６．８だった）。最終タンパク質濃 度は実施例１Ｏ： 停止させ、５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０に対する電気透析によって、過剰 のジアミノＰＥＧを分離した。反応生成物を未処理のポリアクリルアミドゲル上 で分析し、インドリル酢酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム塩（Ｎ　Ｂ　Ｔ）を 使用した染色によって検出し当型点ｐ　Ｉ＝７からｐｌ＝９の修飾リパーゼ０． ０°−ビス−（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール１９００　（Ｍ、 　Ｗ：２０００）　（ジアミノＰＥＧ）の原液を、水中０．５９ｇ／ｍｌの濃度 で調製し、希塩酸でｐＨ＝４．６に設定した。

ＥＤＣの水性溶液とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　中のＮＨ８溶液をモル比 １５：ｌで混合して、ＥＤＣ／ＮＨ８の原液を製造した。この原液を即時使用し た。

リパーゼ（３８４ｕｇ；　６．７ｎｍｏｌ　）とジアミノＰＥＧ溶液（１２，２ ｍｇ、　６．４　μｍｏｌ　）を混合した。その後ＥＤＣ／ＮＨ３混合物（ＥＤ Ｃ：０．６１ｍｇ、　３．２　μｍｏｌ　；　ＮＨ３：０．０２４ｍｇ　、　０ ．２１μｍｏｌ　）を添加し、この混合物を暗所で４℃において１６時間インキ ュベートした（反応混合物のｐＨは６．８だった）。最終タンパク質濃度は５ｍ ｇ／ｍｌだった。５００ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５によって、反応を停止させ、 ５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０に対する電気透析によって、過剰のジアミノ ＰＥＧを分離した。反応生成物を未処理のポリアクリルアミドゲル上で分析し、 インドリル酢酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム塩（Ｎ　Ｅ　Ｔ）を使用した染 色によって検出した。

デオキシオリゴヌクレオチドへのリパーゼの結合ＳＭＣＣを使用したリパーゼ（ ポリエチレングリコールで修飾さ８れたもの）の修飾： ２０ｍＭリン酸塩緩衝液、１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ］、１ｍＭＥＤＴＡＳｐＨ７ ，４中最終タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧリパーゼを、（５つのアミノ 基が修飾されるとみなして）２０倍モル過剰のＳＭＣＣを使用して、修飾した。

暗所で室温において３０分インキュベートした後、２１１ｍＭリン酸塩緩衝液＋ ２ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ６，５）であらかしめ平衡化したセファデックス（Ｓｅ ｐｈａｄｅｘ）−１０カラム上で、過剰の架橋剤を分離した。

求めるリパーゼ活性を有する両分を、４℃においてセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉ ｃｏｎ　）　−３０管を使用して、濃縮し、続いて凍結乾燥した。修飾されたリ パーゼを一２０℃において保存し、オリゴヌクレオチドへの結合に直接使用した 。

ＳＨ−オリゴヌクレオチドの製造： ホスホルアミダイト法を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。最終合成段 階で、Ｃ６−チオール修飾剤を使用して、５′末端に末端スルフヒドリル基を導 入した。逆相ＨＰＬＣ（移動相としてＯ，ＩＭ　トリエチルアンモニウム酢酸塩 、ｐＨ７およびメタノール）上で精製した後、硝酸銀を使用してトリチル基を開 裂し、ＤＴＴ中、−２０°Ｃて保存した（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈによる操作指示）。

Ｓ　Ｍ　ＣＣリパーゼとデオキシオリゴヌクレオチドの結合：５０μｌ容量中ト リチルを含まないオリゴヌクレオチド５μｇをセファデックスＧ−２５カラム上 で脱塩し、凍結乾燥酵素と直接混合した。

酵素を溶解させた後、最初室温で１時間、その後反応を完成させるため４℃で１ ６時間、反応を実施した。

実施例１１： 金属コロイド上の固定化リパーゼおよび抗原コロイド金の合成をＦｒｅｎｓ、Ｇ 、ｅｔ　ａｌ、、［Ｎａｔｕｒｅ　Ｌｏｎｄ、Ｐｈｙｓ、Ｓｃｉ。

２４１、２０（１９７３）］にしたがって実施した。０．１Ｍリン酸塩緩衝液中 のリパーゼ（１０μｍ、タンパク質濃度１　ｍｇ／　ｍ　ｌ　）およびウィルス 抗原（０，８ｍｇ　／ｍｌ）　６μｌとコロイド金溶液１ｍｌを混合し、室温で ３０分インキュベートした。

１６００　ｇにおいて１５分遠心分離することによって、結合していないタンパ ク質を除去した。上清をピペットで除去し、沈殿を１０％ポリエチレングリコー ル２００００　（Ｐ　ＥＧ２００００　）　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）１００ ０μｌに溶解した。１回毎の溶解に１０％５ＤＳ５０μｍと数分間の超音波の使 用を必要とした（Ｂａｎｄｅｌｉｎ　５ＯＮＯＲＥＸ　５ｐｅｒ　ＲＫ５１０１ １）。この操作を３回繰り返した。

最後の遠心分離後、沈殿を１％Ｐ　Ｅ　Ｇ２００００５０μｌおよびＰＢＳＴ− ３％Ｂ５Ａ２００μｌに溶解した。リパーゼ活性および抗原活性について、上清 および溶解させた沈殿物を試験した。最初の上清のみがリパーゼ活性を示した。

これはつまり結合していないタンパク質の存在を示すものである。その後の遠心 分離後は、上清中に何ら酵素活性が見られなかった。対照的に、溶解させた沈殿 物は、予想されたように、リパーゼ活性を示した。

実施例１２： リパーゼの沈降検定： 基質原液２１００％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍｌ中のインドリルアセ テート５０ｍｇ　；ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（Ｎ　Ｂ　Ｔ）の原 液＝７０％ジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解したＮ　Ｂ　Ｔ　５０ｍｇ、基質 溶液は、Ｏ，１Ｍリン酸塩緩衝液　ｐＨ６，５１０ｍ１中ＮＥＴ原液６６μｍを 混合することによって調製した。混合物を即時使用した。

アルカリホスファターゼの沈降検定； 基質原液＋　１００％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶解した５−ブ ロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩ　Ｐ）　５０ｍｇ；　 ＮＢＴ原液ニア０％ジメチルホルムアミド１ｕｌｌに溶解したＮ　Ｂ　Ｔ　５０ ｍｇ０基質溶液は、Ｏ，１Ｍ基質緩衝液（０，１ＭＴ　ＲＩ　Ｓ、０．１ＭＮａ Ｃ１，５０ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１２、ｐ　Ｈ８，５）　１０ｍ１中で基質原液３３μ ｌとＮＢＴ原液６６μｌを混合することによって調製した。混合物を即時使用し た。

いずれの場合も、リパーゼ反応生成物の低溶解性に起因し、高濃度の方が良好な 結果が得られる（図５）。

この場合に使用した酵素は最善の精製をされていなかった。したがって、予備精 製および前処理をしたリパーゼを使用すれば、よりよい検出限界が達成され得る 。

ｏ　ｏｏ　。

Ｆｉｇ、２ Ｆｉｇ、５ アルカリ リパーゼ　ホスファターゼ フロントページの続き （７２）発明者　エカー、バーンハルトオーストリア国　エイ−２５５１エンツ ェスフエルト　ヒルテンベルガーシュトラーセ１３０エイ番地 （７２）発明者　キンクローヴ乙工ヴアオーストリア国　エイ−１１４０ウィー ン。

リンツァーシュトラーセ　８３／１１番地（７２）発明者　ヴアコルビンガー、 ヴエルナーオーストリア国　エイ−４０６１パーシンクイム　バッカーフェルト 　１番地

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素が植物由来のリパーゼ、対応イソ酵素または少なくとも７０％のアミノ 酸相同性とリパーゼ活性を有する構造誘導体である、酵素標識プローブまたは検 定物質。
2. ２．リパーゼ活性を有する酵素がキャンディダ・ルゴーサＤＳＭ２０３１から得 られるものである、請求の範囲１記載の酵素標識プローブまたは検定物質。
3. ３．リパーゼがピオチン、アビジン、レシチン、プロテインＡ、プロテインＧ、 抗体結合タンパク質、抗体、抗原、ウィルスタンパク質抗原、バクテリア表面タ ンパク質、ジゴキシゲニン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは合成類 似体、金属コロイドまたはプラスチック微粒子（＜５μｍ）と複合体化したもの である、請求の範囲１または２記載の酵素標識プローブまたは検定物質。
4. ４．生物学的認識基との複合体の形態である、植物由来のリパーゼ、それらのイ ソ酵素または少なくとも７０％のアミノ酸相同性およびリパーゼ活性を有するこ れらの構造類似体の、分析用プローブまたは検定物質の製造のための使用。
5. ５．リパーゼがキャンディダ・ルゴーサＤＳＭ２０３１から得られるものである 、請求の範囲４記載の使用。
6. ６．生物検定、試験片、バイオセンサーまたは遺伝子プローブ用検定物質の製造 のための、請求の範囲４または５記載の方法。