JPH07509638A - 細胞外マトリックスからの移植片組織の製造 - Google Patents

細胞外マトリックスからの移植片組織の製造

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病気にかかったり損傷を受けたりしている生体部分の代用をさせる目的で設計さ れた移植片としてポリエステル繊維［ダクロン（ＤａｃｒｏｎＴＭ）　］やポリ テトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）［テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ”）　］などの 合成材料が広く使われているが、これらの材料は限られた成果しか挙げていない 。これは、これらの材料の生体適合性が低いこと、中でも持続性炎症反応を引き 起こすことが多いという問題に起因するものである。また、これらの材料は分解 しないうえに、接触する組繊細胞による再モデル化に適していないので、生体か これらの材料を取り込むことができず、さらに問題が生しる。
動物材料やヒト材料をたとえばホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドで架橋し て使用する試みも満足な成果を挙げていない。全体的なアルデヒド架橋のプロセ スを施すと、生体材料が組繊細胞によって十分に認識されなくなるので、正常な 再モデル化と取り込みが促進されない。同様に、洗剤や高張緩衝液、低張緩衝液 による抽出なとの他のタイプの化学処理によって動物またはヒトの生体材料を処 理すると、血管形成を促進したり、置換しようとする組織や器官の機能代替物へ 移植片を変換するために必要な修復および再モデル化プロセスを刺激したりする 効果が失われてしまうほどそれらの生体材料を変化させてしまう可能性がある。
第３のアプローチは、たとえばコラーゲンなどの構造マトリックス成分を抽出し 、精製し、特殊処理（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）細胞と組み合わせたものから組 織や器官の同等物を再構成するというものであった。このプロセスは、細胞と細 胞が濃縮し組織化するマトリックスタンパク質との相互作用に依存する。組織様 構築物が作成され、自然のものとある程度似ていることか示されているが、模倣 しようとする実際の組織に特有のマトリックス構造は容易にはできない。たとえ ば米国特許第４４８５０９６号と４４８５０９７号、ベル（Ｅ、　Ｂｅ１ｌ　） 、１９８４年参照。
発明の概要 本発明は、目的の結合組織ソースを得、それを処理して細胞の成長に必要な因子 を除去することなく生細胞を除去することによる移植片組織製造方法に関する。
組織を凍結または凍結乾燥させた後で断片化し、生細胞を除去して結合組織マト リックス粒子を製造する。あるいは、組織は凍結前に断片化することもできる。
本発明はまた、上記方法と下記ステップｌ）と２）の一方または両方を組み合わ せたものを含む移植片組織製造方法をも包含する。ｌ）結合組織粒子を再処理し て細胞の成長と分化に必要な因子を除去することなく細胞質成分と核酸成分を除 去し、２）細胞が結合組織粒子に付着するが定着するような条件下で結合組織粒 子に培養細胞を接種する。
本発明の１つの態様においては、マトリックス粒子に選択され培養されたヒト細 胞またはその他の培養細胞を接種する。生じた細胞定着材料は融合させて様々な 形状の複合体とすることかできるが、この場合、成長因子や分化因子を加えても よいし加えなくてもよい。
本発明は、動物組織を損傷を受けたり病気にかかったりしている組織や器官の代 用をさせる目的で設計された移植片として調製する新規方法を提供するものであ る。この目的は、動物組織の本来の複雑さが保存され、したがって接触される特 殊処理細胞による再モデル化と組み込みが可能であるようなやり方で達成される 。すなわち、本発明のマトリックス粒子は細胞の成長と分化を刺激する分子を含 んでいるので、イン・ビボての細胞修復に必要な生体分子シグナルを提供する。
既報の方法とは対照的に、本発明の方法は、高塩分試薬のような苛酷な試薬やブ タノール／エーテルや洗剤などの膜脂質試薬の使用を避けている。既報の方法に おいてそのような試薬を使用することが、置換しようとする組織や器官のための 機能的代替物への移植片の変換に必要な修復および再モデル化のプロセスにその 存在が不可欠であると本発明者らが考える非常に多くの因子を結合組織から除去 してしまうことの原因となっている。
イン・ビトロ細胞培養における高度の方法によって、少数の分化細胞を大規模な 細胞バンクに拡大することができる。
診療施設におけるヒト受容体に投与されるこれらの特殊処理細胞の組織化と分化 を誘導しうる組織マトリックスビヒクルがめられている。本発明は、インスリン 生合成の欠損や不十分、またはインスリンの管理投与によって起きる諸問題を解 決するために、適当な機能を存する細胞が定着した再構成組織や複合体を作成し 移植することによって糖尿病なとの疾患をコントロールする目的に使用すること ができる。たとえば、本発明の粒子は、イン・ビトロでランゲルハンス島細胞ま たは未解離ランゲルハンス島と組み合わせて複合体を形成させた後で腎臓被膜下 に移植することができる。さらに、細胞定着マトリックス複合体は、たとえば皮 下注射器や類似の器具を用いて目的部位に送達させることによって直接的に移植 してもよい。同様に、本発明は、パーキンソン病患者にドーパミン産生細胞含有 組織を供与することによってパーキンソン病を治療する目的にも使うことができ る。また、粒子上に神経細胞をプレート移植して複合体を形成させることもでき る。これは神経組織欠損の修復に有用であろう。
本発明の方法は、皮膚、様々な管状構造、および骨、鍵、軟骨なとの骨格構造な との生体構造が損傷を受けたり異常を呈しているものの再建にも広い用途がある 。本発明はまた、目的部位への移植後に循環細胞が定着する組織足場としての結 合組織マトリックスを作成する目的にも使うことかできる。１つの態様において は、マトリックス粒子は、粒子を含有する多孔質膜ポリマーを形成しうる物質と 混合した後で、成形される。本発明の粒子を用いて形成することができる多くの 形状の１例として、マトリックス粒子含有糸か挙げられる。たとえば、粒子をコ ラーゲンやその他の生体吸収性または非吸収性のポリマーと混合し、無水エタノ ールやアセトンまたはその他の脱水性溶液を含有する脱水浴または凝固浴中に押 し出し成形することができる。糸は、たとえば真空乾燥なとその他の手段による 脱水に付すこ、ともできる。粒子は、コラーゲンや中空繊維として機能するその 他のポリマーとともに押し出し成形することもできる。粒子と中空繊維は一体と なって、粒子か中空ポリマー繊維のコアを充填している状態で負荷中空繊維とし て機能する。次いで、このようにして製造した糸を編んだり織ったりして、移植 用の織物やその他の複雑な構築物を作ることができる。編んだり織ったりした糸 は強度と柔軟性が高く、表面積も大きくなるという長所があるが、それ以外にも 、負荷中空繊維の糸をスリーブ状にしたものは、多孔質化させ、コロニー形成細 胞に糸表面を占拠せしめて系内の組織マトリックス粒子と接触できるようにする こともてきる。
さらに別の態様においては、本発明の方法を用いて、動物ソース由来の胎児骨格 要素からミネラル化前にマトリックス粒子を製造する。これらの胎児マトリック ス粒子は、円筒状に成形したコラーゲン容器内で骨形成細胞と混合して骨格構築 物を作ることができる。容器の外部コラーゲン面には、骨膜組織と関連のある第 ２の細胞タイプをプレート移植することができる。同様に、皮膚マトリックス粒 子または穿孔しておいた凍結済みマトリックスをシート状としたものに由来する 複合体の表面に角質細胞をプレート移植して皮膚様構築物を作ることもてきる。
発明の詳細な説明 本発明は、目的の結合組織ソースを得、ついでそれを処理して細胞の成長と分化 に必要な因子を除去することなく生細胞を除去することを含む移植片組織製造方 法を包含する。この無細胞結合組織ソースを凍結または凍結乾燥させ、凍結また は凍結乾燥の前か後に断片化して、結合組織粒子を製造する。あるいは、この組 織を断片化した後で凍結または凍結乾燥させることも可能である。この無細胞結 合組織粒子は宿主細胞を定着させる移植片として使用することができる。凍結乾 燥結合組織は断片化しないで使用することもてきるが、使用前に穿孔する。この 態様によれば、無細胞組織は、断片化を行なわず、穿孔されたシートまたはスト リップの形で使用することができる。
本発明は、目的の結合組織ソースを得て、上記のように処理して、細胞の成長と 分化に必要な因子を除去することなく生細胞を除去することを含む別の移植片組 織製造方法を包含する。結合組織ソースを凍結または凍結乾燥させた後で断片化 して結合組織粒子を製造する。その結合組織粒子に、培養細胞が結合組織粒子に 付着するか定着するような条件下で培養細胞を接種する。本発明の１つの態様に おいては、培養細胞を接種した後の結合組織粒子を、あらかじめ作成しておいた 多孔質ポリマー容器に充填する。この方法は、細胞をまく前に結合組織粒子をさ らに処理して、核酸以外の細胞の成長と分化に必要な因子を除去することなく核 酸を除去するステップがさらに含まれていてもよい。さらに、結合組織粒子をヌ クレアーゼ調製物と接触させる処理が含まれていてもよい。
本発明は、目的の結合組織ソースを得て、上記のように処理して、細胞の成長と 分化に必要な因子を除去することなく生細胞を除去することを含む別の方法を包 含する。この結合組織ソースを、次いで凍結または凍結乾燥させ、断片化して結 合組織粒子を製造する。あるいは、断片化に先立ち細胞を除去することができる 。粒子を、コラーゲンやその他の生体吸収性または非吸収性の多孔質ポリマーと 混合した後、押し出し成形に付してポリマーと結合組織粒子からなる糸を作成す る。本発明の糸は、混合繊維（糸がポリマーと細胞マトリックス粒子の混合物か らできている）または負荷中空繊維（糸が、多孔質ポリマースリーブに囲まれた 細胞マトリックス粒子のコアでできている）のいずれかであってよい。次いで、 これらの糸を編んだり織ったりして織物やその他の複雑な移植用構築物を作成す る。負荷中空繊維糸のスリーブは多孔質であるため、コロニー形成細胞がスレッ ド表面を占拠してスレッド内の組織マトリックス粒子と接触することができる。
本発明は、目的の結合組織ソースを得て、処理して、細胞の成長と分化に必要な 因子を除去することなく生細胞を除去することを含む別の移植片組織製造方法を 包含する。この方法によれば、結合組織ソースを凍結または凍結乾燥させるが、 断片化は行なわない。そのかわりに、組織をシート状またはストリップ状に処理 する。これらのシートやストリップを凍結または凍結乾燥させた後、融解し、穿 孔して細胞が組織に浸潤できるようにする。１つの態様においては、培養細胞が ノートまたはストリップに付着しかつ定着するような条件下で結合組織シートま たはストリップに培養細胞を接種する。細胞を接種したシートまたはストリップ は、さらに成形して有用な移植片組織を作成することができる。本発明の別の態 様においては、シートまたはストリップは、最初に培養細胞を接種することなく 、宿主に移植することができる。この態様によれば、シートまたはストリップは 宿主細胞が定着する場を提供する。
目的組織の断片化は、凍結または凍結乾燥の後で得られた凍結または凍結乾燥組 織を機械的に混合するか、ローラーの間で機械的に破砕することによって達成す ることができる。
目的の組織は、最初に凍結することなく組織を混合することによって断片化する こともできる。細胞と細胞核が破裂する際に放出される核酸を消化する目的で、 ヌクレアーゼ処理を任意に実施してもよい。次いで、結合組織粒子は、洗浄、遠 心分離、再懸濁、再遠心分離、再懸濁を連続的に行なうことによって回収される 。
本発明は、上記方法で得た結合組織粒子を合成多孔質膜上に塗布してずへての結 合組織粒子に栄養分を拡散させつる厚さに層化する方法をさらに包含する。この 方法の１つの態様には、融合剤を用いて結合組織粒子を融合させて複合体を形成 するステップがさらに含まれる。選択可能なタイプの融合剤は当該分野に習熟せ る者にとって公知である。好ましい態様においては、複合体を過不足なく被覆し て栄養分の輸送を可能にする容量のイン・ビトロ培養細胞を結合組織複合体にプ レート移植する。細胞は、この細胞を結合組織粒子に定着または付着させつる条 件下でプレート移植される。単数または複数のタイプの細胞を複合体上にプレー ト移植できる。
本発明はさらに、多細胞構築物（ｍｕｌｔｉ−ｃｅｌｌ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） をはじめとする上記方法のいずれかによって製造される構築物をも包含する。
結合組織ソースは、ウシ、ヒツジ、ブタ、または海洋動物の結合組織ならびにそ の他のを推動物または無を椎動物種から得ることができる。本発明はさらに、様 々な生体部分や組織から得られる結合組織を包含する。本発明の好ましい態様に おいては、結合組織は胚組織または胎児組織から得られる。胚組織や胎児組織は 、異なる細胞発育段階の正常組織中に存在する様々な生体分子因子を含んでいる という理由で有利である。たとえば胎児組織に存在する因子としては、細胞の分 裂や分化および組織形態形成に必要な因子などが挙げられる。
上記方法によって得られた結合組織マトリックス粒子には、選択され培養された ヒト細胞またはその他の培養細胞を接種することができる。生じた細胞定着マト リックスを融合させて様々な形状の複合体を作ることができるが、この場合、成 長因子や分化因子を加えてもよいし加えなくてもよい。
本発明の好ましい態様においては、組み立てようとする組織に合わせてマトリッ クス粒子を選択する。たとえば、皮膚置換を目的とする場合、真皮マトリックス を粒子化し、真皮細胞で複合体を構築するのが好ましい。神経組織置換を目標と する場合は、胚または胎児の中枢神経系結合組織マトリックスを選び、適当な細 胞と組み合わせて複合体を作るのが好ましい。
上記方法の処理ステップは、選んだ動物組織から細胞を除去することを目的とし て行なわれるもので、これにより結合組織マトリックス粒子ができる。結合組織 から細胞を除去する方法として多くのものが当該分野で公知である。これらの方 法の一部について、以下に具体例を挙げる。これらの具体例はすへてを網羅した ものではなく、上記公知方法の一部の例に過ぎない。どの方法を選ぶかというこ とと処理の順序は処理する組織のタイプによって決まる。
結合組織から細胞を除去する１つの方法においては、ブレードまたはブレード状 器具で組織をはぎ取る。組織は平行ローラーの間を連続的に通過させてもよく、 この場合、ローラーを連続的に互いに近接させることで細胞を含む軟成分を絞り だす。組織は酵素、とくにヌクレアーゼで処理することもてきる。また、組織を 凍結融解または凍結乾燥融解のサイクルに付して、生細胞を破砕する。これらの 方法は、結合組織ソースの断片化によって製造された結合組織粒子に残留する細 胞質成分と核成分を除去する目的にも使うことがてきる。
凍結および／または凍結乾燥と断片化のステップは、粒子を製造すること、およ び好ましくない成分を組織からさらに除去することを目的として行なわれる。処 理した組織を滅菌する方法は当該分野に習熟せる者にとって公知であり、過酢酸 溶液、好ましくは約０．５％の溶液に組織を接触させ、無菌緩衝液、好ましくは 無菌リン酸緩衝食塩水で組織を洗う手順が含まれる。次いで、組織を液体窒素温 度まで冷却することで凍結乾燥させた後、無菌条件下で断片化する。当該分野に 習熟せる者にとって公知の多くのやり方で低温断片化を実施することができる。
断片化方法としては、機械的混合機などの剪断装置の使用やローラーの間で組織 を機械的に破砕して、移植後の血管形成を可能にするようなサイズの粒子を得る 方法なとかある。本発明の好ましい態様においては、粒子は直径が約５０ないし ３００マイクロメートルであるが、用途によっては５〜ｌＯミクロンという小さ さであってもよい。原料組織のタイプによっては、さらにヌクレアーゼクリーニ ングと洗浄、ひき続き遠心分離および新鮮リン酸緩衝食塩水への再懸濁により免 疫原性成分の存在を最小にする努力をすることもできる。
本発明の別の態様においては、組織をアセトンや無水アルコール、またはカルボ ワックスなどの親水性ポリマーで化学的に脱水した後、断片化することができる 。本発明の好ましい態様においては、マトリックスに細胞を接種することによっ て粒子をさらに処理する。マトリックスに定着させる細胞としてはヒト細胞を使 うのが好ましいが、本発明はヒト細胞に限定されない。１つの態様においては、 接種プロセスは、成長補助物質や分化補助物質を添加したもしくは添加しない組 織培養培地を用いてマトリックス粒子を再水和させ、流体環境と平衡になるまで 粒子を膨潤させるようにすることで実施される。
本発明の別の態様においては、バイオリアクター、スピナーフラスコ、またはそ の他の類似の器具の中で単数または複数の表現型の細胞をマトリックス粒子に定 着させる。用いる細胞の数と器具内存夜時間は、細胞付着時間および細胞による 粒子被覆度の目標によって決まる。これらのパラメータは、用いる細胞のタイプ および最終生成物にめられる細胞密度によって変化する。各細胞タイプに特有の パラメータは、当該分野に習熟せる者にとって明らかである。本発明の好ましい 態様においては、当初細胞密度は１ｍｌあたり約１．０４個ないし約１０＠個の オーダーである。
本発明のさらに別の態様においては、粒子を融合させて様々な形状の複合体を作 成するが、この場合、成長因子や分化因子を加えてもよいし加えなくてもよい。
このステップは、すてに細胞を接種した粒子または細胞を含んでいない粒子に対 して行なうことができる。後者の場合、粒子を融合させて複合体とした後で、融 合マトリックス複合体に細胞を接種することができる。次いで、細胞の存無に関 わらず、マトリックス複合体を合成多孔質膜上に層化する。合成多孔質膜の例と しては、たとえばトランスウェル状態の（ｉｎ　ａ　ｔｒａｎｓｗｅｌｌａｒｒ ａｎｇｅｍｅｎｔ）ポリカーボネートや、底部がコラーゲンシートを保持して下 方からの培地の通過を可能にする多孔質膜を有する梨を裏打ちする多孔質コラー ゲンシートなとの生体吸収性ポリマーててきた膜なとが挙げられるが、これらの 具体例は説明の目的て挙げたものてあって、いかなる意味でも本発明を限定する ものではない。膜は、ポリ−Ｌ−乳酸塩なとその他の生体吸収性ポリマーててき ていてもよい。本発明の１つの態様においては、粒子は単層に層化される。好ま しい態様においては、層の厚さは約０．５ミリメートル未満である。
マトリックスに細胞がすてに接種されていれば、必要な栄養分が細胞内に流入で きるようなやり方で層厚を制御しなければならない。マトリックスへの接種は、 複合体を過不足なく被覆するが複合体を流出させてしまわない容量の懸濁液中の 細胞を、細胞がマトリックスに定着する条件下で、粒子複合体に直接かけること によって実施される。
複合体の孔隙度を制御できる方法のうちの少数のものの非限定的具体例としては 、下記のものが挙げられる。すなわち、細胞成長の制限、架橋の制限、および粒 子を基質に接触させる前に、テフロン（Ｔｅｆ　ＩｏｎＴＭ）製の「ヘア」を適 当な間隔て埋め込んだブラシ状器具を基質に載せる機械的な方法なとである。最 後の方法を使うと、シートはマイクロポストすなわち「ヘア」の周囲にてき、「 ヘア」を除去したときに穴ができるようになっている。
マトリックスに細胞を接種した後に一定時間にわたり組織培養培地中でインキュ ベートすると、構築物は、単独で、またはたとえばその形成の場である多孔質コ ラーゲン膜によって扱うことができる密着したソートの形をとる。本発明の好ま しい態様においては、インキュベーション時間は約７〜１４日である。コラーゲ ン膜を用いて複合体を包んでもよい。
コラーゲン膜は、フラットなパッケージができるように、たとえば縫合によって 複合体に固定することができる。密着状態になった後にそれが展開されるどの段 階でも、シートをシャフトに巻き付けて管を形成させることができる。
本発明のさらに別の態様においては、細胞を複合体の一方の端にプレート移植す るか、細胞を、複合体を包むのに使う多孔質コラーゲン膜上にプレート移植する ことによって複数の細胞タイプを複合体と組み合わせて用いる。さらに、１層の 単一の細胞タイプを別の細胞タイプを含む１層上に重層してプレート移植植する ことができるが、異なるタイプの細胞を一緒にプレート移植してもよい。
本発明はさらに、あらかじめ作成しておいた多孔質のコラーゲンまたはその他の ポリマーでできた望みの形状の容器に細胞担持粒子が充填されている場合も包含 する。容器は直方体ホックスであってもよく、好ましい態様においてはそのボッ クスの厚さは約１．０ｍｍ未満である。さらに、本発明は半径の異なる同心チュ ーブの使用を開示するものであり、好ましい態様においてはそれらの半径が約１ ．０ｍｍ以下しか違わない。また、その他の形状も同様に使うことができると忠 われる。
容器は、支柱やその他の均一な厚みを維持する手段によって強化することができ る。支柱の密度は１平方ミリあたり約１〜１０本が好ましい。容器は、粒子を逸 失させないほど微小な孔隙を有するコラーゲンシートで作成することができる。
好ましい態様においては、孔隙のサイズは約３０〜６０ミクロンである。末端開 口部から粒子を導入した後、縫合やその他の手段によって容器を封鎖することが できる。
本発明の別の態様においては、結合組織粒子を成形して織りや編みに適した糸に する。糸は織物またはその他の複雑な移植用構築物の形に織り込むことができる 。編んだり織ったりした編織物は、宿主細胞の付着の場となるマトリックス材料 の足場を提供する。また、糸または糸から製造された織物は、上記のようにして イン・ビトロで細胞を接種した後で、宿主内の適当な部位に移植することができ る。
本発明の糸は混合繊維または負荷中空タイプのいずれてあってもよい。混合繊維 の糸は、結合組織粒子に生体吸収性または非吸収性のポリマーを混合した後、混 合物をたとえばスピナレットなどを用いて押し出し成形して混合糸を作ることに よって作成される。中空繊維の糸は、本発明の結合組織粒子のコアが多孔質ポリ マーの筒（ｓｌｅｅｖｅ）で囲まれたものからなる。この糸の製造に使われるポ リマーは生体吸収性であてもよいし非吸収性であってもよい。好ましい態様にお いては、ポリマーはコラーゲンである。押し出し成形後、本発明の糸を、たとえ ば無水アルコール、カルボワックス、またはアセトンを含む浴に押し出すことに よって脱水、凝固させる。
次いて、たとえばローラーで糸を凝固浴から引き上げて食塩水を含んだ冷却浴に 移すことによって、糸をアニーリングすることができる。次いて、たとえばより 多数の乾燥用ローラーで糸を引き上げ乾燥させた後でスプールに巻き取ることに よってスレッドをを乾燥させ、巻き取ることができる。
実施例 器官なとの結合組織マトリックス材料は、動物ソース、たとえばブタ、ウシ、ヒ ツジ、海洋動物、またはその他の動物から得られる。たとえば、内分泌膵臓同等 物を再構成するために、少なくとも３つの器官を使用することができる。第１は 膵臓そのものであり、このマトリックスに組織特異性を提供する。第２は十二指 腸または空腸てあり、第３は皮膚である。
動物を屠殺した後、ただちに器官を氷詰め滅菌容器に入れ、研究施設に送る。膵 臓はランゲルノ＼ンス島除去プロトコルを用いて処理する。すなわち、膵管にカ ニユーレを挿入し、２ｍｇ／ｍ＋のコラゲナーゼ（タイプＸ、　Ｓｉｇｍａ社） と２％ウシ胎児血清を含むバンク液を注入する。また、膵臓と腹腔と上部腸間膜 に血液を送る２本の動脈にヘパリン含有コラゲナーゼ溶液を同様に潅流させて、 膵臓の循環系から内皮を除去する。膵臓を適切に洗浄するには、屠殺前の動物を ヘノくリン処理する必要がある。冷所の無菌チャンバー内で器官を潅流および再 潅流させながら、圧縮器具を用いて器官を静かに混練する。
再循環の過程で、コラゲナーゼ溶液が徐々に希釈される。
管と血管からなる繊維性ネットワークがコラゲナーゼ消化後に残る。リン酸緩衝 食塩水で洗った後、繊維状材料を凍結乾燥させ、オムニミキサー（Ｏｍｎｉｍｉ ｘｅｒ？Ｍ）剪断チューブ中で機械的に破砕する。融解後、粒子を再び洗い、５ ．０％過酢酸中で滅菌する。
凍結破砕操作の目的は直径１００〜２００μｍのマトリックス粒子を提供するこ とである。インスリンおよびその他のホルモンの分泌を担当している膵臓ランゲ ルハンス島自体の直径は１００〜２００μｍである。粒子のサイズは、宿主に対 して作成される組織移植片の最大許容厚さによっても決まる。厚さは、イン・ビ ボ移植後の生着と一貫性がなければならない。移植片は、血管を形成するまでは 、ガス交換と栄養分を組織流体の拡散に依存せざるをえないので、０．５ｍｍを 超える拡散距離は好ましくない。材料を摩擦熱で溶かしてしまわない機械的プロ セスによって凍結組織から比較的均一サイズの粒子を製造することが目標である 。−３０°Ｃまたはそれ以下の温度の冷所での混合、粉末化、破砕、および／ま たは震動（ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ）なとの方法が使用できる。
次いて、粒子を小塊状の培養細胞と合わせて凝集体にするか、ランゲルハンス島 細胞培養物由来の細胞を接種する細胞バイオリアクター中でマイクロビーズとし て使用する。細胞はバイオリアクター中のマトリックスマイクロビーズの表面に 付着する。最後に述べた方法は、ランゲルハンス島細胞培養物を増殖させる手段 として作用であり、疑似ランゲルハンス島を構築する手段としても使える。
マトリックスを得るために処理される器官の第２の具体例は、切開後に機械的に かき取られる空腸または十二指腸である。バブイラクら（Ｂａｄｙｌａｋ、　ｅ ｔ　ａｌ、　）　（米国特許第４９０２５０８号／１９９０年）が記載している ように、一方の側の管腔層と他方側の部層の間にある厚さ約１００μｍの緻密層 を離層させると、無細胞コラーゲン結合組織が残る。洗った緻密層を上記のよう にして凍結乾燥させた後に粒子化する。
同様に、第３の器官である皮膚から表皮とその下の脂肪物質をはぎ取り、デルマ トームで真皮を真反面に対して平行な厚さ１００〜２００μｍのシート状に薄切 りする。次いて、真皮を凍結乾燥させ、粒子化し、洗って、細胞との混合または 移植に備える。あるいは、空腸や真皮がら得たシートをメツツユ作成機または類 似の装置によって多孔質または穿孔して、細胞または疑似ランゲルハンス島また はそれらの両方を接種できるようにすることができる。
コスタール社（ＣｏｓｔａｒＴＭ）製のものなとトランスウェルチャンバー内で 培養細胞懸濁液をマトリックス粒子と混合する場合にも、凝集体を形成すること ができる。細胞と粒子を懸濁する流体は、チャンバーのフロアとなっている多孔 質膜を通過し、細胞はその表面が付着光となる粒子と近接状態になる。分泌され た細胞産生物は、粒子塊に密着性を与える追加マトリックスを提供する。
その他にも、粒子と細胞または粒子と疑似ランゲルハンス島を組み合わせたもの に密着性を与えてシート状の移植を促進する下記のような２つのアプローチがあ る。フラットな多孔質コラーゲン容器またはポリ−Ｌ−乳酸塩またはその他の生 体ポリマーでてきたものを作成し、バイオリアクターまたはその他の装置中で構 成したマトリックス粒子と付着細胞を充填する。次いて、バイオポリマー容器と その中身は、栄養培地と接しているトランスウェル膜がフロアとなっているチャ ンバー内で維持することができる。
その他の方法は、硫酸デルマタンとフィブロネクチンの存在下で非毒性的に粒子 をトランスグルタミナーゼと架橋させて、３次元再構成組織を作成する手順から なる。この方法は細胞を傷つけないので、細胞の存在下で架橋が起きつる。３次 元再構成組織である集合構築物を５％ＣＯ２インキユベーター中、３７℃でイン キュベートして、イン・ビトロで分化を行なわせて、移植に備える。
均等物 当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述へた発明の具体的態様 に対する多くの均等物を認識し、また確認し得るであろう。これらの及びそのよ うな他のすべての均等物は下記のクレームの範噴に含まれるものである。
補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成７年２月３日 １ニジ

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. １．下記の工程を含む移植片組織の製造方法、ａ）結合組織ソースを凍結し、 ｂ）細胞成長に必要な諸因子を除去することなく生細胞を除去するために結合組 織ソースを処理し、およびＣ）結合組織を断片化して結合組織粒子を製造する工 程。
  2. ２．下記の付加的工程をさらに含んでなる請求項１記載の方法、 ｄ）結合組織粒子に細胞が付着するような条件下で結合組織粒子へ培養細胞を接 種する工程。
  3. ３．下記の工程を含む移植片組織の製造方法、ａ）結合組織ソースを凍結し、 ｂ）細胞成長に必要な諸因子を除去することなく生細胞を除去するために結合組 織ソースを処理し、ｃ）結合組織を断片化して結合組織粒子を製造し、ｄ）細胞 成長に必要な諸因子を除去することなく細胞質成分および核成分をさらに除去す るために結合組織粒子を処理し、 ｅ）結合組織粒子に細胞が付着するような条件下で結合組織粒子へ培養細胞を接 種する工程。
  4. ４．工程ｂにおける結合組織の断片化が、凍結した結合組織の機械的混合を含む ものである請求項１記載の方法。
  5. ５．工程ｂにおける結合組織の断片化が、ローラ間での機械的破砕を含むもので ある請求項１記載の方法。
  6. ６．工程ｂにおける結合組織の断片化の後に核酸を除去するための酵素処理を行 う、請求項１記載の方法。
  7. ７．結合組織粒子のすべてに栄養物が拡散できるような厚さまで合成多孔質膜上 に結合組織粒子を層化させる、請求項１記載の方法。
  8. ８．結合組織粒子が融合剤により融合して複合体を形成する、請求項７記載の方 法。
  9. ９．結合組織粒子のすべてに栄養物が拡散できるような厚さまで合成多孔質膜上 に結合組織粒子を層化させる、請求項２記載の方法。
  10. １０．結合組織粒子が融合剤により融合して複合体を形成する、請求項９記載の 方法。
  11. １１．培養細胞が結合組織粒子に定着するような条件下において、複合体をちょ うど覆い栄養物の移動を可能とする容量でその培養細胞を複合体上に懸濁しプレ ート移植する、請求項１０記載の方法。
  12. １２．一種以上の型の細胞を複合体上にプレート移植する、請求項１１記載の方 法。
  13. １３．結合組織粒子のすべてに栄養物が拡散できるような厚さまで合成多孔質膜 上に結合組織粒子を層化させる、請求項３記載の方法。
  14. １４．結合組織粒子が融合剤により融合して複合体を形成する、請求項１３記載 の方法。
  15. １５．培養細胞が結合組織粒子に定着するような条件下において、複合体をちょ うど覆い栄養物の移動を可能とする容量でその培養細胞を複合体上に懸濁しプレ ート移植する、請求項１４記載の方法。
  16. １６．一種以上の型の細胞を複合体上にプレート移植する、請求項１５記載の方 法。
  17. １７．培養細胞を接種された際の結合組織粒子を予め成型された多孔質ポリマー 容器中に充填する、請求項２記載の方法。
  18. １８．培養細胞を接種した際の結合組織粒子を予め成型された多孔質ポリマー容 器中に充填する、請求項３記載の方法。
  19. １９．請求項１記載の方法により製造される構築物。
  20. ２０．請求項２記載の方法により製造される構築物。
  21. ２１．請求項３記載の方法により製造される構築物。
  22. ２２．請求項７記載の方法により製造される構築物。
  23. ２３．請求項８記載の方法により製造される構築物。
  24. ２４．請求項９記載の方法により製造される構築物。
  25. ２５．請求項１０記載の方法により製造される構築物。
  26. ２６．請求項１１記載の方法により製造される構築物。
  27. ２７．請求項１３記載の方法により製造される構築物。
  28. ２８．請求項１４記載の方法により製造される構築物。
  29. ２９．請求項１５記載の方法により製造される構築物。
  30. ３０．請求項１２記載の方法により製造される多細胞構築物。
  31. ３１．請求項１６記載の方法により製造される多細胞構築物。
  32. ３２．移植片組織として利用される、粒子とポリマーからなる混合糸の下記工程 を含んでなる製造方法、ａ）結合組織ソースを凍結し、 ｂ）細胞成長に必要な諸因子を除去することなく生細胞を除去するために結合組 織ソースを処理し、ｃ）結合組織を断片化して結合組織粒子を製造し、およびｄ ）この粒子をポリマーと混ぜ、得られる混合物を押し出すことにより粒子とポリ マーからなる混合糸を作成する工程。
  33. ３３．ポリマーが生体吸収性である、請求項３２記載の方法。
  34. ３４．バイオポリマーがコラーゲンである、請求項３２記載の方法。
  35. ３５．移植片組織として利用される負荷中空多孔質ポリマー糸の下記の工程を含 んでなる製造方法、ａ）結合組織ソースを凍結し、 ｂ）細胞成長に必要な諸因子を除去することなく生細胞を除去するために結合組 織ソースを処理し、ｃ）結合組織を断片化して結合組織粒子を製造し、ｄ）多孔 質ポリマーの筒（ｓｌｅｅｖｅ）内にその粒子を押し出すことにより、多孔質ポ リマーの筒により囲まれた結合組織粒子の核からなる糸を作成する工程。
  36. ３６．ポリマーが生体吸収性である請求項３５記載の方法。
  37. ３７．ポリマーがコラーゲンである請求項３５記載の方法。
  38. ３８．結合組織粒子と多孔質ポリマーを含んでなる糸。
  39. ３９．ポリマーが生体吸収性である請求項３８記載の糸。
  40. ４０．ポリマーがコラーゲンである請求項３８記載の糸。
  41. ４１．中央の核と外側の筒からなる糸であって、中央の核が結合組織粒子を含み そして筒が多孔質ポリマーを含むものである糸。
  42. ４２．ポリマーが生体吸収性である請求項４１記載の糸。
  43. ４３．ポリマーがコラーゲンである請求項４１記載の糸。
  44. ４４．結合組織マトリックスと多孔質ポリマーからなる糸を編むことにより製造 される織物。
  45. ４５．ポリマーが生体吸収性である請求項４４記載の織物。
  46. ４６．ポリマーがコラーゲンである請求項４４記載の織物。
  47. ４７．移植片組織として利用される無細胞組織マトリックスシートの下記工程を 含んでなる製造方法、ａ）結合組織ソースを凍結し、 ｂ）細胞成長に必要な諸因子を除去することなく生細胞を除去するために結合組 織ソースを処理し、それにより無細胞結合組織マトリックスシートが製造され、 およびｃ）ｂ）工程で製造されたシートを穿孔し、それにより移植片組織として 利用される無細胞結合組織マトリックスシートが製造される工程。
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