JPH0751054A - Ｌ−ソルボースの生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】Ｌ−ソルボース醗酵における生産菌の改良 【構成】グルコノバクター・オキシダンス及びグルコノ
バクター・サブオキシダンスの群に属する微生物から選
ばれるＤ−ソルビットを唯一炭素源として生育する能力
が親株の１／１０以下に低められた微生物。 【効果】Ｄ−ソルビットのＬ−ソルボースへの変換収率
が向上し、醗酵効率が改善される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＬ−ソルボースの生産菌
に関する。さらに詳しくは、グルコノバクター属に属
し、Ｄ−ソルビットからＬ−ソルボースを生産する能力
を有し、Ｄ−ソルビットを唯一炭素源として生育する能
力が低められた微生物に関する。その目的とするところ
は、ビタミンＣ合成の重要な合成中間体であるＬ−ソル
ボースの工業的に安価な製造法を提供することにある。

【０００２】

【従来の技術】現在Ｌ−ソルボースはＤ−ソルビットを
微生物、主にはグルコノバクター属細菌によって酸化す
る方法で製造されている。従来のＬ−ソルボースの発酵
的生産法によっても、原料であるＤ−ソルビットをＬ−
ソルボースへ変換する収率は９０％を越えているもの
の、未だＤ−フラクトース,５−ケトフラクトース,２−
ケト−Ｄ−グルコン酸、さらには低分子の有機酸類が同
時に副生し、その方法はＬ−ソルボースの収率面から十
分に完成されたものではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】ビタミンＣの原料コ
スト低減のために、その中間工程におけるＤ−ソルビッ
トのＬ−ソルボースへの変換収率を従来以上に向上させ
ることは、ビタミンＣの工業生産にとって切実な問題で
ある。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明者らはこの様な
状況に鑑み、Ｌ−ソルボース発酵の効率化につき鋭意研
究を重ねた結果、従来のＬ−ソルボース生産に用いられ
ているグルコノバクター属細菌から誘導したＤ−ソルビ
ットを唯一炭素源として生育する能力を低下せしめた菌
株は著しくＤ−ソルビットのＬ−ソルボースへの変換収
率の改善されていることを見い出し、本発明を完成する
に到った。すなわち、本発明はグルコノバクター・オキ
シダンス及びグルコノバクター・サブオキシダンスの群
に属する微生物から選ばれるＤ−ソルビットを唯一炭素
源として生育する能力が親株の１／１０以下に低められ
た微生物に関するものである。本発明の微生物は、グル
コノバクター属に属し、Ｌ−ソルボース生産能を有し、
かつＤ−ソルビットとを唯一炭素源として生育する能力
が低められた微生物であれば、いずれもこれを用いるこ
とが出来る。このような微生物は、グルコノバクター属
に属し、Ｌ−ソルボース生産能を有する微生物を親株と
して誘導することができ、かかる親株となり得る微生物
の種名とその菌株を〔表１〕に例示する。

【０００５】

【表１】 (注)上記の各菌株は財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)発行の
リスト・オブ・カルチャーズ（LIST OF CULTURES）, 19
84. セブンス・エディション（SEVENTH EDITION）に掲
載されている公知株である。 本発明の微生物はＤ−ソルビットを唯一炭素源とする最
少培地では生育が極めて遅いという点で親株と明らかに
区別することができる。ここで用いる最少培地は液体で
も固体でも良い。固体培地ではレプリカ法が親株との区
別に便利である。液体培地を用いる場合はＤ−ソルビッ
トを唯一炭素源とする最少培地に親株と同じ条件で本発
明の微生物を植菌し、通常３０℃前後で、１〜３日間振
盪培養する。得られる培養液中の生育度を吸光度,濁度
または菌体重量で公知の方法に従って測定して親株と区
別することが出来る。本発明の微生物はこの様にして測
定した生育度が親株よりも低められたものをいい、とり
わけ１／１０以下に低下したものが好ましく用いられ
る。 本発明の微生物の誘導および単離は通常の方法によって
容易に達成することができる。すなわち、上記のような
親株を用いて通常の変異処理法、例えば紫外線,Ｘ線,γ
線を照射した細胞、またはＮ−メチル−Ｎ´−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン,メチルメタンスルホン酸,亜硝
酸等で化学変異剤処理を施した細胞の中から常法によっ
て容易に選択分離することにより、本発明で目的とする
菌株を得ることができる。また該微生物は上記の性質に
加えて他の性質、例えば各種栄養要求性,薬剤耐性,薬剤
感受性等を併せ持っていてもよい。

【０００６】本発明の微生物の具体例としては、Ｌ−ソ
ルボース生産菌であるグルコノバクター・サブオキシダ
ンス ＩＦＯ ３２５４から誘導したグルコノバクター
・サブオキシダンス ＢＬ−９(ＩＦＯ １４４８９,Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−８６３２)やＢＬ−１１５(ＩＦＯ １４４
９０,ＦＥＲＭ Ｐ−８６３１)あるいはグルコノバクタ
−・オキシダンス ＩＦＯ １２４６７から誘導したグ
ルコノバクタ−・オキシダンス ＧＯ−１０(ＩＦＯ
１４５３７,ＦＥＲＭ ＢＰ−１１６９)やＧＯ−１４
(ＩＦＯ １４５３８,ＦＥＲＭ ＢＰ−１１７０)を挙
げることができる。上記のＩＦＯ番号は財団法人発酵研
究所(ＩＦＯ,大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番
８５号)への寄託番号を、またＦＥＲＭ Ｐ番号は工業
技術院微生物工業技術研究所(ＦＲＩ,茨城県筑波郡谷田
部町東１丁目１番３号)への寄託番号をあらわす。さら
にＦＥＲＭ ＢＰ番号はブタペスト条約に基づくＦＲＩ
への寄託番号をあらわす。上記ＢＬ−９株およびＢＬ−
１１５株はＩＦＯへは1986年１月２１日に、またＦＲＩ
へは１９８６年２月１日に、一方ＧＯ−１０株およびＧ
Ｏ−１４株はＩＦＯへは１９８６年８月２８日に、また
ＦＲＩへは１９８６年９月５日にそれぞれ寄託されてい
る。なお、上記のＢＬ−９株およびＢＬ−１１５株のＦ
ＲＩへの各寄託については、該寄託がブタベスト条約に
基づく寄託に切り換えられてＦＥＲＭ Ｐ−８６３２は
ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４１として、またＦＥＲＭ Ｐ−
８６３１はＦＥＲＭ ＢＰ−１２４０としてそれぞれＦ
ＲＩに保管されている。

【０００７】次に、本発明の微生物を用いてＤ−ソルビ
ットを微生物学的に酸化せしめる方法について説明す
る。この具体的な方法としては、上記に特定する微生
物、すなわち、グルコノバクター属に属し、Ｌ−ソルボ
ース生産能を有し、Ｄ−ソルビットを唯一炭素源として
生育する能力が低められた微生物をＤ−ソルビットを含
有する培地に培養し、培養液中にＬ−ソルボースを蓄積
せしめ、次いで採取することにより実施できる。本培地
中のＤ−ソルビットは約１０〜５０％で用いられ、好ま
しくは２０〜５０％である。培地としては炭素源、窒素
源、無機塩類、生育因子等を含有する栄養培地または合
成培地が用いられる。 炭素源としてはＤ−グルコー
ス、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニット、グリセリン、
エタノール、糖密、澱粉加水分解物などを必要に応じて
添加してもよい。たとえば、Ｄ−ソルビットを唯一炭素
源とする最少培地でほぼ完全に生育できなくなった微生
物を用いる場合は、上記Ｄ−ソルビットの使用量の約0.
1〜１０％の炭素源を添加しておくのが一般に好まし
い。一方、Ｄ−ソルビットを唯一炭素源とする最少培地
での生育度合が親株よりも著しく低下せしめられている
が、ある程度は生育しうる微生物を用いる場合は、原料
として用いるＤ−ソルビットの一部が炭素源として利用
でき、他の炭素源を添加することなく培養することもで
きる。窒素源としてはコーンスティープリカー,酵母エ
キス,乾燥酵母,脱脂大豆粉,肉エキス,ペプトン,カザミ
ノ酸,その他の含窒素有機資源,硫酸アンモニウム,硝酸
アンモニウム,塩化アンモニウム,リン酸アンモニウム,
アンモニア水などの無機窒素化合物、グルタミン酸ナト
リウムなどのアミノ酸、その他尿素,酢酸アンモニウム
等も用いられる。培地には上記の炭素源や窒素源に加え
て、微生物の生育に必要な種々の金属,ビタミン,アミノ
酸,核酸,リン酸塩等が適宜添加される。培養は通常、振
盪または通気撹拌等の好気的条件下で行うのが良い。培
養温度は一般的には１５℃〜４０℃で好ましくは２５℃
〜３５℃であり、培地のpＨは3.0ないし8.0で好ましく
は4.0ないし6.5である。 また培養時間は約１０ないし10
0時間であり、 好ましくは１５ないし４０時間である。
以上の様にして培養を終了した培養物中のＬ−ソルボ
ースは公知の方法によって精製単離される。例えば、培
養物をろ過して除菌後、活性炭を用いて脱色し、減圧濃
縮を経て、メタノール,エタノール,アセトンなどでＬ−
ソルボースを晶出させてこれを単離することが出来る。

【０００８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例１ グルコノバクター・サブオキシダンスＩＦＯ ３２５４
株を、Ｄ−ソルビット2.5％,ペプトン 1.0％,酵母エキ
ス1.0％からなるＳＣＭ培地(pＨ 7.0)５mlを含む試験管
に接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この培養液0.25
mlを同じ培地２５mlを含む200ml容三角フラスコに移植
し、 ３０℃で６時間振盪培養した。得られた培養液から
遠心分離(10,000rpm,１０分)によって細胞を集め、続い
て１０mlのトリス・マレイン酸緩衝液(0.05M,pＨ6.0)で
２回洗浄した。この洗浄細胞をＮ−メチル−Ｎ´−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン100μg/mlを含む前記緩衝
液５mlに懸濁(２×１０⁹細胞／ml)して３０℃で３０分
間振盪した。この処理液から遠心分離によって細胞を集
め、１０mlの0.85％食塩水で２回洗浄した。この洗浄細
胞を2.5％のグリセリンを加えたＳＣＭ培地５mlに移
し、３０℃で１時間振盪培養して変異株の分離(segrega
tion)を促進した。この様にして得られた変異処理細胞
懸濁液を、グリセリン(2.5％)を唯一炭素源として含む
最少培地〔表２〕のプレートに、 １枚当り約100個のコ
ロニーが生じる様に撤き、 ２８℃,３日間培養した。生
じたコロニーを、唯一炭素源としてＤ−ソルビット2.5
％を含む最少培地プレートと唯一炭素源としてＬ−ソル
ボース2.5％を含む最少培地プレートにレプリカ法で転
写して、 ２８℃,３日間培養した。その結果、グリセリ
ンを唯一炭素源とする最少培地では生育するが、Ｄ−ソ
ルビットを唯一炭素源とする最少培地とＬ−ソルボース
を唯一炭素源とする培地では、生育しないか、または親
株であるＩＦＯ ３２５４株と比較して生育が著しく遅
い変異株を多数分離した。この様な性質を示す変異株２
７株のＬ−ソルボース生産能を後述の実施例２と同じ方
法で調べ、特にＬ−ソルボース生産能が親株より著しく
優れた菌株として、ＢＬ−９株とＢＬ−１１５株を選択
した。

【０００９】

【表２】 ※註: 一般にグルコノバクター属細菌はＬ−グルタミ
ン酸を唯一炭素源として生育することは出来ない。 尚各種炭素源を唯一炭素源として含む最少培地でのグル
コノバクター・サブオキシダンスＢＬ−９株(ＩＦＯ
１４４８９,ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４１)とＢＬ−１１５
株(ＩＦＯ １４４９０,ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４０)の
生育度を親株であるＩＦＯ ３２５４株と対比させて
〔表３〕に示した。この実験条件は以下の通りである。
〔表３〕に示す炭素源（2.5％）を各々含む〔表２〕の
最少培地５mlに上記３菌株の細胞懸濁液各々１滴を植菌
し３０℃で２日間試験管振盪機で培養し、得られた培養
液に0.1mlの１Ｎ塩酸を添加して残存する炭酸カルシウ
ムを溶解させた後、生育度を吸光度（600nm）で測定し
た。

【表３】 〔表３〕から明らかな様にＢＬ−９株とＢＬ−１１５株
のＤ−ソルビットを唯一炭素源とする最少培地での生育
は親株ＩＦＯ ３２５４株と比較して著しく低下してい
る。

【００１０】実施例２ 種菌として、グルコノバクター・サブオキシダンス Ｂ
Ｌ−９株(ＩＦＯ １４４８９,ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４
１)とＢＬ−１１５株(ＩＦＯ １４４９０,ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１２４０)を使用した。この両菌株をそれぞれＤ−
ソルビット５０g/L, グリセリン５g/L,Ｌ−グルタミン
酸モノナトリウム２g／L,酵母エキス0.3g／L, ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄ 0.47g/L,ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.1g/L, ＣaＣＯ₃
0.18g/L,ニコチン酸アミド３０mg/L, パントテン酸カル
シウム３mg/L, ビタミンＢ₂ 1mg/L, パラアミノ安息香
酸１mg/L, ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1.5mg/L, ＭgＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ 0.1mg/Lからなる第１種培地(pＨ6.5)２０mlを
含む200ml容三角フラスコに接種し、３０℃で２４時間
培養した。この培養液２mlを第２種培地(第１種培地の
Ｄ−ソルビット濃度を200g/Lに増加したもの)２０mlを
含む200ml容三角フラスコに移植して３０℃で２４時間
振盪培養し、第２種培養液を得た。この第２種培養液１
mlを、Ｄ−ソルビット300g/L, グリセリン１g/L, 酵母
エキス0.3g/L, ＫＨ₂ＰＯ₄ 0.47g/L, ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ 0.1g/L, ＣaＣＯ₃ 0.18g/L, 酢酸アンモニウム 0.
29g/L, ニコチン酸アミド３０mg/L, パントテン酸カル
シウム３mg/L, ビタミンＢ₂ １mg/L, パラアミノ安
息香酸１mg/L, ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1.5mg/L, ＭnＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ 0.1mg/L からなる発酵培地(pＨ6.5)２０ml
を含む200ml容のヒダ付(バッフル付)三角フラスコに移
植し、 ３０℃で２４時間振盪培養した。また対照として
親株であるグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦ
Ｏ ３２５４株を同一条件下で同時に培養し、これらの
結果を併せて〔表４〕に示した。これらの培養液中のＤ
−ソルビットは全て消費されていた。

【表４】 尚、Ｄ−ソルビットとＬ−ソルボースの定量は、スルホ
ン化ポリスチレンゲル充填カラム(島津製作所製,ＳＣＲ
−101Ｈカラム,7.9mm×30cm)を用いる高速液体クロマト
グラフィー法(移動層;pＨ 2.2の希硫酸, 流量;0.5ml/mi
n, 検出器;示差屈折計)で行った。

【００１１】実施例３ 種菌としてグルコノバクター・サブオキシダンス ＢＬ
−１１５株(ＩＦＯ１４４９０,ＦＥＲＭ Ｐ−８６３
１)を使用し、実施例２と同じ方法で第２種培養液を得
た。この第２種培養液150mlを実施例２と同じ発酵培地
３Lを含む５L容発酵槽に移植し、通気2.4L/min,撹拌800
rpm, 温度３０℃の条件下に２４時間培養した。本培養
で原料Ｄ−ソルビットは完全に酸化され、培養液中にＬ
−ソルボースが対Ｄ−ソルビット収率98.4％で蓄積され
た。 また親株であるグルコノバクター・サブオキシダン
スＩＦＯ ３２５４株を同条件下で同時に培養したとこ
ろ、その培養液中には、Ｌ−ソルボースが対Ｄ−ソルビ
ット収率93.7％で蓄積していた。 実施例４ グルコノバクタ−・オキシダンス ＩＦＯ １２４６
７株を実施例１と同じ手順で、Ｎ−メチル−Ｎ´−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる突然変異誘起処理を
行った。得られた変異処理細胞懸濁液を、グリセリン
(２.５％)を唯一炭素源として含む最少培地〔表２〕の
プレ−トに、１枚当り約１００個のコロニ−が生じる様
に撒き、２８℃,４日間培養した。生じたコロニ−を唯
一炭素源としてＤ−ソルビット２.５％を含む最少培地
プレ−トにレプリカ法で転写して２８℃,３日間培養し
た。その結果、グリセリンを唯一炭素源とする最少培地
では生育するが、Ｄ−ソルビットを唯一炭素源とする最
少培地では、生育しないか、または親株であるＩＦＯ
１２４６７株と比較して生育が著しく遅い変異株を多数
分離した。上記の様な性質を示す変異株４３株のＬ−ソ
ルボ−ス生産能を後述の実施例５と同じ方法で調べ、特
にＬ−ソルボ−ス生産能が親株より著しく優れた菌株と
してＧＯ−１０株(ＩＦＯ １４５３７,ＦＥＲＭ ＢＰ
−１１６９)とＧＯ−１４株(ＩＦＯ １４５３８,ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１１７０)を選択した。尚各種炭素源を唯
一炭素源とに含む最少培地でのグルコノバクタ−・オキ
シダンスＧＯ−１０株とＧＯ−１４株の生育度を親株で
あるＩＦＯ １２４６７株と対比させて〔表５〕に示し
た。この実験条件は実施例１と同じである。

【表５】 〔表５〕から明らかな様にＧＯ−１０株とＧＯ−１４株
は、Ｄ−ソルビットを唯一炭素源とする最少培地で殆ど
生育することが出来なくなっている。なお、Ｌ−ソルボ
−スを唯一炭素源とする最少培地では親株であるＩＦＯ
１２４６７自身殆ど生育し得えず、ＧＯ−１０株およ
びＧＯ−１４株も同様に殆ど生育できなかった。

【００１２】実施例５ 種菌としてグルコノバクタ−・オキシダンスＧＯ−１０
株(ＩＦＯ １４５３７,ＦＥＲＭ ＢＰ−１１６９)と
ＧＯ−１４株(ＩＦＯ １４５３８,ＦＥＲＭＢＰ−１１
７０)を使用した。この両菌株をそれぞれＤ−ソルビッ
ト５０g／L,グリセリン５g／L,Ｌ−グルタミン酸モノナ
トリウム２g／L,酵母エキス１g／L,ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.４
７g／L,ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１g／L,ＣaＣＯ₃ ０.
１８g／L,ニコチン酸アミド３０mg／L,パントテン酸カ
ルシウム３mg／L，ビタミンＢ₂ １mg／L,パラアミノ安
息香酸 １mg／L,ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１.５mg／L,ＭnＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１mg／Lからなる種培地(pＨ６.５)２０
ｍｌを含む三角フラスコに接種し、３０℃,２４時間振
盪培養した。この種培養液１ｍｌを醗酵培地（上記の種
培地のＤ−ソルビットを２００g／Lに増加したもの）２
０ｍｌを含む２００ｍｌ容フラスコに移植して３０℃で
４０時間振盪培養した。また対照として、親株であるグ
ルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２４６７株を同
一条件下で同時に培養し、これらの結果を併せて〔表
６〕に示した。これらの培養液中のＤ−ソルビットは全
て消費されていた。

【表６】 なお、Ｄ−ソルビットとＬ−ソルボ−スの定量は、実施
例２に記載の方法で行った。

【００１３】

【発明の効果】本発明の微生物を用いると、Ｄ−ソルビ
ットを微生物学的に酸化してＬ−ソルボースを製造する
方法において従来法に比較して、Ｌ−ソルボースの収率
を増大させることができる。すなわち、従来法ではＤ−
ソルビットに対するＬ−ソルボースの収率は高くても約
９３％程度までであったが、本発明の微生物を用いる製
造方法によると従来法よりも２〜３％以上収率を上げる
ことができ、しかもＤ−フラクトース,２−ケトグルコ
ン酸,５−ケトフラクトースなどの副生物の生成を少な
くすることができる。この結果、ビタミンＣ製造におい
て原料コストの占める割合がきわめて高いＬ−ソルボー
スを従来法よりも安価に供給することができ、医薬、食
品等において幅広い用途を有するビタミンＣの製造コス
トを低減し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グルコノバクター・オキシダンス及びグル
   コノバクター・サブオキシダンスの群に属する微生物か
   ら選ばれるＤ−ソルビットを唯一炭素源として生育する
   能力が親株の１／１０以下に低められた微生物。