JPH0753401A - 軟骨細胞不全治療剤 - Google Patents
軟骨細胞不全治療剤Info
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- JPH0753401A JPH0753401A JP5198167A JP19816793A JPH0753401A JP H0753401 A JPH0753401 A JP H0753401A JP 5198167 A JP5198167 A JP 5198167A JP 19816793 A JP19816793 A JP 19816793A JP H0753401 A JPH0753401 A JP H0753401A
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- Japan
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- igf
- growth factor
- receptor
- human insulin
- chondrocyte
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Abstract
(57)【要約】
【目的】軟骨細胞不全治療剤に関する。
【構成】ヒトインスリン様成長因子IIレセプターに選択
的に結合するヒトインスリン様成長因子II、ヒトインス
リン様成長因子IIの２７番目のアミノ酸をロイシンに置
換したものやヒトインスリン様成長因子IIの４３番目の
アミノ酸をロイシンに置換したものは、副作用である血
糖降下作用等を減弱できており、慢性関節リウマチなど
の軟骨細胞不全治療剤として使用できる。
的に結合するヒトインスリン様成長因子II、ヒトインス
リン様成長因子IIの２７番目のアミノ酸をロイシンに置
換したものやヒトインスリン様成長因子IIの４３番目の
アミノ酸をロイシンに置換したものは、副作用である血
糖降下作用等を減弱できており、慢性関節リウマチなど
の軟骨細胞不全治療剤として使用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトインスリン様成長因
子 II （以下 IGF-II と略す）が持つインスリン様活性
および細胞増殖活性と軟骨細胞に対するプロテオグリカ
ン合成促進活性を分離し、インスリン様活性および細胞
増殖活性を軽減せしめた IGF-II 誘導体からなる軟骨細
胞不全治療剤に関するものである。
子 II （以下 IGF-II と略す）が持つインスリン様活性
および細胞増殖活性と軟骨細胞に対するプロテオグリカ
ン合成促進活性を分離し、インスリン様活性および細胞
増殖活性を軽減せしめた IGF-II 誘導体からなる軟骨細
胞不全治療剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】軟骨細胞は軟骨型プロテオグリカンや I
I 型コラーゲン等の軟骨に特異的な細胞間基質を合成す
る極めて特異的な細胞である。これらの軟骨細胞が合成
する細胞間基質の中でプロテオグリカンは、分子内に水
酸基が多く、大量の水と結合して粘稠なゲルを形成して
いる。特に関節組織においては、プロテオグリカンが組
織表面への圧迫などのような負荷に耐える弾力性を組織
に与えている。軟骨細胞が慢性関節リウマチ、変形性関
節炎、骨関節炎等の疾患あるいは抗炎症ステロイド剤等
の副作用により障害を受け、機能が低下すると、関節中
の軟骨細胞により合成されるプロテオグリカンが減少
し、関節に加わる圧迫性の負荷を吸収できず、関節の疼
痛が発生する。
I 型コラーゲン等の軟骨に特異的な細胞間基質を合成す
る極めて特異的な細胞である。これらの軟骨細胞が合成
する細胞間基質の中でプロテオグリカンは、分子内に水
酸基が多く、大量の水と結合して粘稠なゲルを形成して
いる。特に関節組織においては、プロテオグリカンが組
織表面への圧迫などのような負荷に耐える弾力性を組織
に与えている。軟骨細胞が慢性関節リウマチ、変形性関
節炎、骨関節炎等の疾患あるいは抗炎症ステロイド剤等
の副作用により障害を受け、機能が低下すると、関節中
の軟骨細胞により合成されるプロテオグリカンが減少
し、関節に加わる圧迫性の負荷を吸収できず、関節の疼
痛が発生する。
【０００３】そしてこのような疾患に対して、現在では
主にヒアルロン酸が使用されている（バイオインテリジ
ェンス 日経ＢＰ社発行、１９９３年５月１０日号）
が、この薬剤は減少したプロテオグリカンの単なる代用
品にすぎず、直接的に軟骨細胞の細胞間基質の合成を促
進する作用は知られていない。
主にヒアルロン酸が使用されている（バイオインテリジ
ェンス 日経ＢＰ社発行、１９９３年５月１０日号）
が、この薬剤は減少したプロテオグリカンの単なる代用
品にすぎず、直接的に軟骨細胞の細胞間基質の合成を促
進する作用は知られていない。
【０００４】軟骨細胞の細胞間基質の合成を促進するも
のとして、成長ホルモンの刺激により肝臓で合成される
インスリン様成長因子Ｉ（以下 IGF-Iと略す）は、実験
動物において、軟骨の成長、基質合成を促進するだけで
なく、種々の培養軟骨細胞を用いた系においても細胞間
基質の合成を促進することが古くから知られている（細
胞成長因子 日本組織培養学会編、ｐ５５〜６５、１９
８４及び特開平４−２１０６４８号公報）。
のとして、成長ホルモンの刺激により肝臓で合成される
インスリン様成長因子Ｉ（以下 IGF-Iと略す）は、実験
動物において、軟骨の成長、基質合成を促進するだけで
なく、種々の培養軟骨細胞を用いた系においても細胞間
基質の合成を促進することが古くから知られている（細
胞成長因子 日本組織培養学会編、ｐ５５〜６５、１９
８４及び特開平４−２１０６４８号公報）。
【０００５】しかしながら、軟骨細胞の細胞間基質の合
成促進作用以外の作用も合わせ持ち血糖降下作用等の多
くの好ましからぬ作用の出現が危惧され、実用に供され
てはいない。その他、細胞間基質の合成を促進する物質
としてこれまでインスリン、IGF-II、トランスフォーミ
ング成長因子、副甲状腺ホルモン等が報告されている
（The Bone, 4 , p37-43, 1990) 。しかし、これらの物
質も軟骨細胞の細胞間基質の特異的な合成促進作用を持
つものではない（細胞成長因子 日本組織培養学会編、
ｐ１１２〜１１８、ｐ５５〜６５、ｐ９９〜１０５及び
ｐ１４０、１９８４）。
成促進作用以外の作用も合わせ持ち血糖降下作用等の多
くの好ましからぬ作用の出現が危惧され、実用に供され
てはいない。その他、細胞間基質の合成を促進する物質
としてこれまでインスリン、IGF-II、トランスフォーミ
ング成長因子、副甲状腺ホルモン等が報告されている
（The Bone, 4 , p37-43, 1990) 。しかし、これらの物
質も軟骨細胞の細胞間基質の特異的な合成促進作用を持
つものではない（細胞成長因子 日本組織培養学会編、
ｐ１１２〜１１８、ｐ５５〜６５、ｐ９９〜１０５及び
ｐ１４０、１９８４）。
【０００６】これらの物質の内、 IGF-II は、従来より
自身のレセプター (type 2 IGF receptor)のみならずア
ミノ酸配列上相同性の高い成長因子である IGF-Iのレセ
プター (type 1 IGF receptor)やインスリンのレセプタ
ー (insulin receptor) にも親和性を示すことが知られ
ていた。IGF-IIの持つ生物活性の内、インスリン様活性
である血糖降下作用や各種細胞における DNA合成の促進
あるいは細胞増殖といった成長因子としての作用は、 t
ype 2 IGF receptor 以外のレセプターを介して発現さ
れていると考えられている（日本内分泌学会誌, 62 , p
229, 1993. Endocrinology,128 , p1201-1203, 1991.
J.Biol.Chem.,266 , p20626-20635, 1991)。
自身のレセプター (type 2 IGF receptor)のみならずア
ミノ酸配列上相同性の高い成長因子である IGF-Iのレセ
プター (type 1 IGF receptor)やインスリンのレセプタ
ー (insulin receptor) にも親和性を示すことが知られ
ていた。IGF-IIの持つ生物活性の内、インスリン様活性
である血糖降下作用や各種細胞における DNA合成の促進
あるいは細胞増殖といった成長因子としての作用は、 t
ype 2 IGF receptor 以外のレセプターを介して発現さ
れていると考えられている（日本内分泌学会誌, 62 , p
229, 1993. Endocrinology,128 , p1201-1203, 1991.
J.Biol.Chem.,266 , p20626-20635, 1991)。
【０００７】IGF-IIの持つ生物活性の内、インスリン様
作用は薬剤投与時に血糖降下に伴うショックを引き起こ
すし、成長因子作用は網膜症（Deabetes, 40, p1725-17
30,1991)や悪性腫瘍の悪化を引き起こすことが考えら
れ、両作用とも好ましいものとは考えられない。
作用は薬剤投与時に血糖降下に伴うショックを引き起こ
すし、成長因子作用は網膜症（Deabetes, 40, p1725-17
30,1991)や悪性腫瘍の悪化を引き起こすことが考えら
れ、両作用とも好ましいものとは考えられない。
【０００８】
【発明が解決する為の課題】IGF-IIの軟骨細胞に対する
プロテオグリカン合成促進作用は保持し、その他の作用
が軽減されれば、特異性の高い軟骨細胞不全治療薬とな
りうる。
プロテオグリカン合成促進作用は保持し、その他の作用
が軽減されれば、特異性の高い軟骨細胞不全治療薬とな
りうる。
【０００９】
【課題を解決する為の手段】IGF-II の特定のアミノ酸
を置換することにより type 2 IGF receptorのみに親和
性を保持した誘導体を作出すれば軟骨細胞に対するプロ
テオグリカン合成促進作用は保持し、好ましい作用とは
考えられないインスリン様活性である血糖降下作用や各
種細胞における DNA合成の促進あるいは細胞増殖といっ
た成長因子作用を減少させた、特異性のある骨細胞不全
治療剤ができる。
を置換することにより type 2 IGF receptorのみに親和
性を保持した誘導体を作出すれば軟骨細胞に対するプロ
テオグリカン合成促進作用は保持し、好ましい作用とは
考えられないインスリン様活性である血糖降下作用や各
種細胞における DNA合成の促進あるいは細胞増殖といっ
た成長因子作用を減少させた、特異性のある骨細胞不全
治療剤ができる。
【００１０】本発明は、 IGF-II レセプターに選択的に
結合する IGF-II 誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤に
関する。ここで言う、軟骨細胞不全治療剤とは、軟骨細
胞に障害または機能低下を起こさせるような疾患あるい
は副作用の治療を行えるものを指す。軟骨細胞不全治療
剤の例としては、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、骨
関節炎などの疾患治療剤が挙げられ、また抗炎症ステロ
イド剤などの副作用として知らている軟骨細胞障害など
の治療をも挙げられる。
結合する IGF-II 誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤に
関する。ここで言う、軟骨細胞不全治療剤とは、軟骨細
胞に障害または機能低下を起こさせるような疾患あるい
は副作用の治療を行えるものを指す。軟骨細胞不全治療
剤の例としては、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、骨
関節炎などの疾患治療剤が挙げられ、また抗炎症ステロ
イド剤などの副作用として知らている軟骨細胞障害など
の治療をも挙げられる。
【００１１】IGF-II 誘導体が、 IGF-II のＮ末端から
２７番目または４３番目のアミノ酸をロイシンに置換し
たものは、好ましくない作用を軽減でき、特異性のある
軟骨細胞不全治療剤として使用できる。
２７番目または４３番目のアミノ酸をロイシンに置換し
たものは、好ましくない作用を軽減でき、特異性のある
軟骨細胞不全治療剤として使用できる。
【００１２】本発明は、ヒトインスリン様成長因子IIレ
セプターに選択的に結合するヒトインスリン様成長因子
II誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤である。
セプターに選択的に結合するヒトインスリン様成長因子
II誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤である。
【００１３】ヒトインスリン様成長因子II誘導体が、ヒ
トインスリン様成長因子IIの２７番目のアミノ酸をロイ
シンに置換したものであれば軟骨細胞不全治療剤として
使用できる。
トインスリン様成長因子IIの２７番目のアミノ酸をロイ
シンに置換したものであれば軟骨細胞不全治療剤として
使用できる。
【００１４】また、ヒトインスリン様成長因子II誘導体
が、ヒトインスリン様成長因子IIの４３番目のアミノ酸
をロイシンに置換したものでも軟骨細胞不全治療剤とし
て使用できる。
が、ヒトインスリン様成長因子IIの４３番目のアミノ酸
をロイシンに置換したものでも軟骨細胞不全治療剤とし
て使用できる。
【００１５】本発明は、慢性関節リウマチ、変形性関節
炎、骨関節炎または抗炎症ステロイド剤の副作用の治療
という群から選ばれる軟骨細胞不全治療剤であるヒトイ
ンスリン様成長因子IIレセプターに選択的に結合するヒ
トインスリン様成長因子II誘導体からなる軟骨細胞不全
治療剤である。
炎、骨関節炎または抗炎症ステロイド剤の副作用の治療
という群から選ばれる軟骨細胞不全治療剤であるヒトイ
ンスリン様成長因子IIレセプターに選択的に結合するヒ
トインスリン様成長因子II誘導体からなる軟骨細胞不全
治療剤である。
【００１６】これら IGF-II 誘導体は、さまざまな剤形
で投与可能であるが、好ましくは治療局所への注射が望
ましく、投与量は10mgから１gが挙げられ、好ましくは5
0mgから100mgである。また、軟骨細胞不全治療剤には、
生理学的に許容される塩、無痛化剤等の添加剤などを加
えることもできる。
で投与可能であるが、好ましくは治療局所への注射が望
ましく、投与量は10mgから１gが挙げられ、好ましくは5
0mgから100mgである。また、軟骨細胞不全治療剤には、
生理学的に許容される塩、無痛化剤等の添加剤などを加
えることもできる。
【００１７】本発明における IGF-II 誘導体の作成方法
および IGF-II 誘導体の作用につき詳細に説明する。 Ａ． IGF-II 誘導体の調製 IGF-II の２７番目のアミノ酸をロイシンに置換した
誘導体（[Leu27]IGF-II と略す） [Leu27]IGF-II は Burgisser, D.M.ら、Beukers, M.W.
ら、あるいは坂野らの報告した製造法（J.Biol.Chem.,
266, p1029-1033, 1991. Endocrinology 128,p1201-12
03, 1991. J.Biol.Chem., 266, p20626-20635, 1991
）により調製できる。
および IGF-II 誘導体の作用につき詳細に説明する。 Ａ． IGF-II 誘導体の調製 IGF-II の２７番目のアミノ酸をロイシンに置換した
誘導体（[Leu27]IGF-II と略す） [Leu27]IGF-II は Burgisser, D.M.ら、Beukers, M.W.
ら、あるいは坂野らの報告した製造法（J.Biol.Chem.,
266, p1029-1033, 1991. Endocrinology 128,p1201-12
03, 1991. J.Biol.Chem., 266, p20626-20635, 1991
）により調製できる。
【００１８】 IGF-II の４３番目のアミノ酸をロイシ
ンに置換した誘導体（[Leu43]IGF-II と略す） [Leu43]IGF-II は坂野らの報告した製造法（J.Biol.Che
m., 266, p20626-20635, 1991. 特開平４ー１４８６７
８号公報）により調製できる。
ンに置換した誘導体（[Leu43]IGF-II と略す） [Leu43]IGF-II は坂野らの報告した製造法（J.Biol.Che
m., 266, p20626-20635, 1991. 特開平４ー１４８６７
８号公報）により調製できる。
【００１９】Ｂ．ヒト軟骨細胞におけるプロテオグリカ
ン合成促進活性の評価は滝川らの報告した方法（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 77, 1481-1485, 1980. Cancer Re
s.,49,3996-4002, 1989.）に従い実施でき、[Leu27]IGF
-II および[Leu43]IGF-II は、IGF-IIと同程度のプロテ
オグリカン合成促進活性を有していた。
ン合成促進活性の評価は滝川らの報告した方法（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 77, 1481-1485, 1980. Cancer Re
s.,49,3996-4002, 1989.）に従い実施でき、[Leu27]IGF
-II および[Leu43]IGF-II は、IGF-IIと同程度のプロテ
オグリカン合成促進活性を有していた。
【００２０】Ｃ．insulin receptor、 type 1 IGF rece
ptorおよびtype 2 IGF receptor に対するIGF-II誘導体
の親和性は、坂野らの報告した方法（J.Biol.Chem., 26
6, p20626-20635, 1991. 特開平４ー１４８６７８号公
報）に従い検討でき、[Leu27]IGF-II および[Leu43]IGF
-II は、insulin receptor および type 1 IGF recep-
tor に対する親和性を減弱し、type 2 IGF receptor へ
の親和性を保持していた。
ptorおよびtype 2 IGF receptor に対するIGF-II誘導体
の親和性は、坂野らの報告した方法（J.Biol.Chem., 26
6, p20626-20635, 1991. 特開平４ー１４８６７８号公
報）に従い検討でき、[Leu27]IGF-II および[Leu43]IGF
-II は、insulin receptor および type 1 IGF recep-
tor に対する親和性を減弱し、type 2 IGF receptor へ
の親和性を保持していた。
【００２１】Ｄ． IGF-II の血糖降下作用の程度は、特
開平４ー１４８６７８号公報に従い検討でき、[Leu27]I
GF-II および [Leu43]IGF-II は IGF-II に比べ、弱い
血糖降下作用しか有していなかった。
開平４ー１４８６７８号公報に従い検討でき、[Leu27]I
GF-II および [Leu43]IGF-II は IGF-II に比べ、弱い
血糖降下作用しか有していなかった。
【００２２】Ｅ． IGF-II 誘導体のDNA 合成の促進作用
については、坂野らの報告した方法（J.Biol.Chem., 26
6, p1029-1033, 1991. Endocrinology 128, p1201-120
3,1991. J.Biol.Chem., 266, p20626-20635, 1991）に
従い検討ができ、[Leu27]IGF-IIおよび [Leu43]IGF-II
は IGF-II に比べ、弱いDNA 合成活性しかなかった。
については、坂野らの報告した方法（J.Biol.Chem., 26
6, p1029-1033, 1991. Endocrinology 128, p1201-120
3,1991. J.Biol.Chem., 266, p20626-20635, 1991）に
従い検討ができ、[Leu27]IGF-IIおよび [Leu43]IGF-II
は IGF-II に比べ、弱いDNA 合成活性しかなかった。
【００２３】以下実施例により本発明を説明する。
【００２４】
実施例１ IGF-II 誘導体の insulin receptor 、type
1 IGF receptor およびtype 2 IGF receptor に対す
る親和性比較 ラット胎盤より部分純化した約 0.5 mg の type 2 IGF
receptorと 20,000cpm の放射性125I-IGF-II および 0.
0016 4mM 濃度の各サンプルを 0.1% BSA 、0.5% オク
チルグルコシド、10 mM グルコース、2.5 mM KCl、1 mM
EDTA および120 mM NaCl を含む HEPES 緩衝液 (pH
8.0) 0.4 mlに入れ、４℃で一晩インキュベーションし
た。この溶液に 0.1 ml の 0.4% g-グロブリン溶液と
0.5 mlの 25% ポリエチレングリコール 6000 溶液を加
え、生成した沈殿の放射活性をガンマーカウンターで計
数して 125I-IGF-IIの type 2 IGF receptor への結合
を 50% 阻害する各サンプルの濃度を求めた (J. Biol.
Chem., 266, 20626-20635 (1991))。
1 IGF receptor およびtype 2 IGF receptor に対す
る親和性比較 ラット胎盤より部分純化した約 0.5 mg の type 2 IGF
receptorと 20,000cpm の放射性125I-IGF-II および 0.
0016 4mM 濃度の各サンプルを 0.1% BSA 、0.5% オク
チルグルコシド、10 mM グルコース、2.5 mM KCl、1 mM
EDTA および120 mM NaCl を含む HEPES 緩衝液 (pH
8.0) 0.4 mlに入れ、４℃で一晩インキュベーションし
た。この溶液に 0.1 ml の 0.4% g-グロブリン溶液と
0.5 mlの 25% ポリエチレングリコール 6000 溶液を加
え、生成した沈殿の放射活性をガンマーカウンターで計
数して 125I-IGF-IIの type 2 IGF receptor への結合
を 50% 阻害する各サンプルの濃度を求めた (J. Biol.
Chem., 266, 20626-20635 (1991))。
【００２５】ヒト胎盤より純化した約 12 から 32 fmol
の insulin receptor と 20,000 cpm の 125I-Insulin
および 0.04 から 267 nM 濃度の各サンプルを 0.075%
Triton X-100と 0.1% BSA を含む 50 mM Tris-HCl 緩
衝液 (pH 7.4) 0.3 ml 中に入れ４℃で 16 時間インキ
ュベーションした後、ポリエチレングリコール不溶性沈
殿の放射活性をガンマーカウンターで計数して125I-Ins
ulinの insulin receptor への結合を 50% 阻害する各
サンプルの濃度を求めた (J. Biol. Chem., 266, 20626
-20635 (1991))。
の insulin receptor と 20,000 cpm の 125I-Insulin
および 0.04 から 267 nM 濃度の各サンプルを 0.075%
Triton X-100と 0.1% BSA を含む 50 mM Tris-HCl 緩
衝液 (pH 7.4) 0.3 ml 中に入れ４℃で 16 時間インキ
ュベーションした後、ポリエチレングリコール不溶性沈
殿の放射活性をガンマーカウンターで計数して125I-Ins
ulinの insulin receptor への結合を 50% 阻害する各
サンプルの濃度を求めた (J. Biol. Chem., 266, 20626
-20635 (1991))。
【００２６】同様にして125I-Insulinの代わりに125I-I
GF-Iを、そして insulin receptorの代わりにヒト胎盤
より純化した type 1 IGF receptor を用いて、125I-IG
F-Iの type 1 IGF receptor への結合を 50% 阻害する
各サンプルの濃度を求めた(J. Biol. Chem., 266, 2062
6-20635 (1991))。
GF-Iを、そして insulin receptorの代わりにヒト胎盤
より純化した type 1 IGF receptor を用いて、125I-IG
F-Iの type 1 IGF receptor への結合を 50% 阻害する
各サンプルの濃度を求めた(J. Biol. Chem., 266, 2062
6-20635 (1991))。
【００２７】これらの結果を表ー１に示した。
【００２８】
【表１】 表１：IGF-II、[Leu27]IGF-II および [Leu43]IGF-II の各種レセプターに対す る親和性比較 ─────────────────────────────────── IGF-IIおよび 各種レセプター IGF-II誘導体 insulin type 1 IGF type 2 IGF ─────────────────────────────────── IGF-II 0.9 0.5 0.04 [Leu27]IGF-II 88 66 0.05 [Leu43]IGF-II 200 39 0.06 ───────────────────────────────────
【００２９】表１中の数値はおのおの 125I-Insulin の
insulin receptor への結合、125I-IGF-Iの type 1 IG
F receptor への結合そして 125I-IGF-IIの type 2 IG
F receptor への結合を 50% 阻害する各サンプルの濃
度 (nM) を表す。
insulin receptor への結合、125I-IGF-Iの type 1 IG
F receptor への結合そして 125I-IGF-IIの type 2 IG
F receptor への結合を 50% 阻害する各サンプルの濃
度 (nM) を表す。
【００３０】これより、[Leu27]IGF-II と[Leu43]IGF-I
I のtype 2 IGF receptor に対する親和性はIGF-IIに
比べほとんど変化していないのに対し、insulin recept
orおよびtype 1 IGF receptor に対する親和性はIGF-II
に比べ大幅に低下していることがわかる。つまり、[Leu
27]IGF-IIと[Leu43]IGF-IIは選択的にtype 2 IGF recep
tor に結合している。
I のtype 2 IGF receptor に対する親和性はIGF-IIに
比べほとんど変化していないのに対し、insulin recept
orおよびtype 1 IGF receptor に対する親和性はIGF-II
に比べ大幅に低下していることがわかる。つまり、[Leu
27]IGF-IIと[Leu43]IGF-IIは選択的にtype 2 IGF recep
tor に結合している。
【００３１】実施例２ IGF-II 誘導体の血糖降下作用 雄性ラット（ＳＤ系、ＳＬＣ社、平均体重 240 g）4 匹
を一群とし、各ラットの尾静脈から IGF-II 、[Leu27]
IGF-II または [Leu43]IGF-II の生理食塩溶液を 1 m
g/kg 投与量になるように投与した。投与前、投与後 3
0 分、60分および 90 分後に尾動脈から血液を採取し、
各血清中のグルコース濃度を Blood Sugar-GOD-Perid-T
est キットを用いて血中グルコース濃度を測定した。
を一群とし、各ラットの尾静脈から IGF-II 、[Leu27]
IGF-II または [Leu43]IGF-II の生理食塩溶液を 1 m
g/kg 投与量になるように投与した。投与前、投与後 3
0 分、60分および 90 分後に尾動脈から血液を採取し、
各血清中のグルコース濃度を Blood Sugar-GOD-Perid-T
est キットを用いて血中グルコース濃度を測定した。
【００３２】結果を表２に示した。
【００３３】
【表２】 表２：IGF-II、[Leu27]IGF-II および [Leu43]IGF-II のラットにおける血糖降 下作用 ─────────────────────────────────── 時間（分） 投与薬物 0 30 60 90 ─────────────────────────────────── コントロール 67 85 86 89 IGF-II 64 39 45 57 [Leu27]IGF-II 68 58 65 72 [Leu43]IGF-II 64 55 62 67 ───────────────────────────────────
【００３４】表２中の数値は各時間における血中グルコ
ース濃度（mg/dl）を表す。
ース濃度（mg/dl）を表す。
【００３５】これより、[Leu27]IGF-II と[Leu43]IGF-I
I の血糖効果作用は、IGF-IIより大幅に弱減しているこ
とが分かる。
I の血糖効果作用は、IGF-IIより大幅に弱減しているこ
とが分かる。
【００３６】実施例３ IGF-II誘導体の軟骨細胞におけ
るプロテオグリカン合成促進作用 ヒト由来軟骨肉腫培養細胞株 (HCS-2/8)を９６穴プレー
トに１穴当たり一万細胞植え込み、１０％ウシ胎仔血清
含有ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）で培養した。コンフ
ルエントに達した培養８日目に、細胞を血清不含のＤＭ
ＥＭ／ハム１２培養液（１：１）で洗浄後、同培養液で
２４時間、３７℃でプレインキュベートした。次いで、
新鮮な同培養液で（１００μｌ／穴）に換えると同時に
IGF 誘導体を添加し、５時間後に放射性36Ｓ硫酸を終濃
度５μＣｉ／ｍｌ添加し１７時間ラベルした。0.2 Ｍ T
ris-HCl 緩衝液（pH 7.8) に溶解し滅菌したアクチナー
ゼＥ（科研科学）（５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加し
て、５５℃で一晩消化後、１０μｇのコンドロイチン硫
酸を添加し、１％セチルピリジニウムクロライドでグリ
コサミノグリカンを沈殿させその放射活性を測定した。
るプロテオグリカン合成促進作用 ヒト由来軟骨肉腫培養細胞株 (HCS-2/8)を９６穴プレー
トに１穴当たり一万細胞植え込み、１０％ウシ胎仔血清
含有ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）で培養した。コンフ
ルエントに達した培養８日目に、細胞を血清不含のＤＭ
ＥＭ／ハム１２培養液（１：１）で洗浄後、同培養液で
２４時間、３７℃でプレインキュベートした。次いで、
新鮮な同培養液で（１００μｌ／穴）に換えると同時に
IGF 誘導体を添加し、５時間後に放射性36Ｓ硫酸を終濃
度５μＣｉ／ｍｌ添加し１７時間ラベルした。0.2 Ｍ T
ris-HCl 緩衝液（pH 7.8) に溶解し滅菌したアクチナー
ゼＥ（科研科学）（５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加し
て、５５℃で一晩消化後、１０μｇのコンドロイチン硫
酸を添加し、１％セチルピリジニウムクロライドでグリ
コサミノグリカンを沈殿させその放射活性を測定した。
【００３７】HCS-2/8 に対するIGF-IIおよび[Leu27]IGF
-II のプロテオグリカン合成促進活性の比較結果を、図
１に示す。
-II のプロテオグリカン合成促進活性の比較結果を、図
１に示す。
【００３８】これよりHCS-2/8 に対して、[Leu27]IGF-I
I がIGF-IIとほぼ同等のプロテオグリカン合成促進活性
を有していることが分かる。
I がIGF-IIとほぼ同等のプロテオグリカン合成促進活性
を有していることが分かる。
【００３９】
【発明の効果】本発明のIGF-IIの成長因子作用を軽減し
たIGF-II誘導体を用いれば、軟骨細胞不全治療剤として
の利用が可能である。
たIGF-II誘導体を用いれば、軟骨細胞不全治療剤として
の利用が可能である。
【図１】第１図は、[Leu27]IGF-II がIGF-IIとほぼ同等
のプロテオグリカン合成促進活性を有していることを示
す図である。
のプロテオグリカン合成促進活性を有していることを示
す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年９月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】また、ヒトインスリン様成長因子II誘導体
が、ヒトインスリン様成長因子IIの４３番目のアミノ酸
をロイシンに置換したもの、さらに５９番目のアミノ酸
をアラニンに置換したものでも軟骨細胞不全治療剤とし
て使用できる。
が、ヒトインスリン様成長因子IIの４３番目のアミノ酸
をロイシンに置換したもの、さらに５９番目のアミノ酸
をアラニンに置換したものでも軟骨細胞不全治療剤とし
て使用できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】本発明は、慢性関節リウマチ、変形性関節
炎、骨関節炎または抗炎症ステロイド剤の副作用の治療
という群から選ばれる、ヒトインスリン様成長因子IIレ
セプターに選択的に結合するヒトインスリン様成長因子
II誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤である。
炎、骨関節炎または抗炎症ステロイド剤の副作用の治療
という群から選ばれる、ヒトインスリン様成長因子IIレ
セプターに選択的に結合するヒトインスリン様成長因子
II誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】 IGF-II の４３番目のアミノ酸をロイシ
ンに置換した誘導体([Leu43]IGF-II と略す） [Leu43]IGF-II は坂野らの報告した製造法(J.Biol.Che
m., 266, p20626-20635, 1991. 特開平４ー１４８６７
８号公報）により調製できる。 IGF-II の５９番目のアミノ酸をアラニンに置換し
た誘導体([Ala59]IGF-II と略す) [Ala59]IGF-II はBach, L. A.らの報告した製造法(J.Bi
ol.Chem., 268, p9246-9254, 1993.）により調製でき
る。
ンに置換した誘導体([Leu43]IGF-II と略す） [Leu43]IGF-II は坂野らの報告した製造法(J.Biol.Che
m., 266, p20626-20635, 1991. 特開平４ー１４８６７
８号公報）により調製できる。 IGF-II の５９番目のアミノ酸をアラニンに置換し
た誘導体([Ala59]IGF-II と略す) [Ala59]IGF-II はBach, L. A.らの報告した製造法(J.Bi
ol.Chem., 268, p9246-9254, 1993.）により調製でき
る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】
【実施例】 実施例１ IGF-II 誘導体の insulin receptor 、type
1 IGF receptor およびtype 2 IGF receptor に対する
親和性比較 ラット胎盤より部分純化した約 0.5 mg の type 2 IGF
receptorと 20,000cpm の放射性125I-IGF-II および 0.
0016 〜 4mM 濃度の各サンプルを 0.1% BSA、 0.5% オク
チルグルコシド、10 mM グルコース、2.5 mM KCl、1 mM
EDTA および120 mM NaCl を含む HEPES 緩衝液 (pH 8.
0) 0.4 mlに入れ、４℃で一晩インキュベーションし
た。この溶液に 0.1 ml の 0.4% γ−グロブリン溶液と
0.5 ml の 25% ポリエチレングリコール 6000 溶液を
加え、生成した沈殿の放射活性をガンマーカウンターで
計数して 125I-IGF-IIの type 2 IGF receptor への結
合を 50% 阻害する各サンプルの濃度を求めた (J. Bio
l. Chem., 266, 20626-20635 (1991))。
1 IGF receptor およびtype 2 IGF receptor に対する
親和性比較 ラット胎盤より部分純化した約 0.5 mg の type 2 IGF
receptorと 20,000cpm の放射性125I-IGF-II および 0.
0016 〜 4mM 濃度の各サンプルを 0.1% BSA、 0.5% オク
チルグルコシド、10 mM グルコース、2.5 mM KCl、1 mM
EDTA および120 mM NaCl を含む HEPES 緩衝液 (pH 8.
0) 0.4 mlに入れ、４℃で一晩インキュベーションし
た。この溶液に 0.1 ml の 0.4% γ−グロブリン溶液と
0.5 ml の 25% ポリエチレングリコール 6000 溶液を
加え、生成した沈殿の放射活性をガンマーカウンターで
計数して 125I-IGF-IIの type 2 IGF receptor への結
合を 50% 阻害する各サンプルの濃度を求めた (J. Bio
l. Chem., 266, 20626-20635 (1991))。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】
【表１】 表１：IGF-II、 [Leu27]IGF-II、[Leu43]IGF-II および[Ala59]IGF-II の各種レ セプターに対する親和性比較 ─────────────────────────────────── IGF-IIおよび 各種レセプター IGF-II誘導体 insulin type 1 IGF type 2 IGF ─────────────────────────────────── IGF-II 0.9 0.5 0.04 [Leu27]IGF-II 88 66 0.05 [Leu43]IGF-II 200 39 0.06[Ala59]IGF-II 600 270 0.08 ───────────────────────────────────
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】これより、[Leu27]IGF-II、 [Leu43]IGF-II
および[Ala59]IGF-II のtype 2 IGF receptor に対す
る親和性はIGF-IIに比べほとんど変化していないのに対
し、insulin receptorおよびtype 1 IGF receptor に
対する親和性はIGF-IIに比べ大幅に低下していることが
わかる。つまり、[Leu27]IGF-II、[Leu43]IGF-II およ
び [Ala59]IGF-II は選択的にtype 2 IGF receptor に
結合している。
および[Ala59]IGF-II のtype 2 IGF receptor に対す
る親和性はIGF-IIに比べほとんど変化していないのに対
し、insulin receptorおよびtype 1 IGF receptor に
対する親和性はIGF-IIに比べ大幅に低下していることが
わかる。つまり、[Leu27]IGF-II、[Leu43]IGF-II およ
び [Ala59]IGF-II は選択的にtype 2 IGF receptor に
結合している。
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒトインスリン様成長因子IIレセプター
に選択的に結合するヒトインスリン様成長因子II誘導体
からなる軟骨細胞不全治療剤。 - 【請求項２】 ヒトインスリン様成長因子II誘導体が、
ヒトインスリン様成長因子IIの２７番目のアミノ酸をロ
イシンに置換したものである請求項１記載の軟骨細胞不
全治療剤。 - 【請求項３】 ヒトインスリン様成長因子II誘導体が、
ヒトインスリン様成長因子IIの４３番目のアミノ酸をロ
イシンに置換したものである請求項１記載の軟骨細胞不
全治療剤。 - 【請求項４】 慢性関節リウマチ、変形性関節炎、骨関
節炎または抗炎症ステロイド剤の副作用の治療という群
から選ばれる軟骨細胞不全治療剤であるヒトインスリン
様成長因子IIレセプターに選択的に結合するヒトインス
リン様成長因子II誘導体からなる軟骨細胞不全治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5198167A JPH0753401A (ja) | 1993-08-10 | 1993-08-10 | 軟骨細胞不全治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5198167A JPH0753401A (ja) | 1993-08-10 | 1993-08-10 | 軟骨細胞不全治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0753401A true JPH0753401A (ja) | 1995-02-28 |
Family
ID=16386584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5198167A Pending JPH0753401A (ja) | 1993-08-10 | 1993-08-10 | 軟骨細胞不全治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0753401A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936266B2 (en) | 1998-05-12 | 2005-08-30 | L'oreal | Desquamation/epidermal renewal of the skin and/or combating skin aging |
| WO2007020402A1 (en) * | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Cancer Research Technology Limited | Insulin-like growth factor ii (igf-ii) binding factors |
-
1993
- 1993-08-10 JP JP5198167A patent/JPH0753401A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936266B2 (en) | 1998-05-12 | 2005-08-30 | L'oreal | Desquamation/epidermal renewal of the skin and/or combating skin aging |
| WO2007020402A1 (en) * | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Cancer Research Technology Limited | Insulin-like growth factor ii (igf-ii) binding factors |
| US8293875B2 (en) | 2005-08-15 | 2012-10-23 | Cancer Research Technology Limited | Insulin-like growth factor II (IGF-II) binding factors |
| US8658423B2 (en) | 2005-08-15 | 2014-02-25 | Cancer Research Technology Limited | Insulin-like growth factor II (IGF-II) binding factors |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050614 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051025 |