JPH0754323B2 - 免疫測定法および免疫測定試薬 - Google Patents

免疫測定法および免疫測定試薬

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JPH0754323B2
JPH0754323B2 JP63290977A JP29097788A JPH0754323B2 JP H0754323 B2 JPH0754323 B2 JP H0754323B2 JP 63290977 A JP63290977 A JP 63290977A JP 29097788 A JP29097788 A JP 29097788A JP H0754323 B2 JPH0754323 B2 JP H0754323B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、被測定物質の測定法および免疫測定試薬に関
する。さらに詳しくは、被検試料液中の被測定物質を被
測定物質と特異的に結合するモノクローナル抗体などの
抗体およびこの抗体のFc部分を認識する抗体を使用した
測定法により測定する方法および免疫測定試薬に関し、
種々の身体的疾患に伴う、例えば血清もしくは他の体液
中の被測定物質の検出および／または濃度を測定するこ
とができる方法および測定試薬に関するものである。
［従来の技術］ 従来、モノクローナル抗体のような被測定物質と特異的
に結合する抗体を使用した免疫測定法としては、不溶性
固体に結合したモノクローナル抗体、抗原性物質、標識
モノクローナル抗体を結合させて得た免疫複合体におけ
る標識物質量を測定する方法などが知られている（たと
えば、特開昭57−86051号公報、特開昭57−118159号公
報、特開昭57−79455号公報）。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の測定法は、被測定物質と抗体との
親和力が弱い場合、十分な感度が得られないなどの問題
点がある。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑みて、モノクローナル抗
体のような被測定物質と特異的に結合する抗体の親和力
にかかわらず、十分な感度を持つ測定法を得るべく鋭意
検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、 被測定物質、被測定物質と特異的に結合する抗体（第
一抗体）、不溶性固体上の第一抗体のFc部分を切断除去
した抗体（第二抗体）、および第一抗体のFc部分を認識
する標識抗体（標識抗体）を結合させて得た免疫複合体
における標識物質量を測定することにより、該被測定物
質を測定することを特徴とする被測定物質の免疫測定
法； 被測定抗原性物質、被測定抗原性物質を認識するモノ
クローナル抗体（第一抗体）、不溶性固体上の第一抗体
のFc部分を切断除去したモノクローナル抗体（第二抗
体）、および第一抗体のFc部分を認識する標識抗体（第
三抗体）を結合させて得た免疫複合体における標識物質
量を測定することにより、該被測定抗原性物質を測定す
ることを特徴とする抗原性物質の免疫測定法； 被測定物質と特異的に結合する抗体（第一抗体）、不
溶性固体上の第一抗体のFc部分を切断除去した抗体（第
二抗体）、および第一抗体のFc部分を認識する標識抗体
（標識抗体）を必須構成成分とすることを特徴とする免
疫測定試薬；並びに、 被測定抗原性物質を認識するモノクローナル抗体（第
一抗体）、不溶性固体上の第一抗体のFc部分を切断除去
したモノクローナル抗体（第二抗体）、および第一抗体
のFc部分を認識する標識抗体（第三抗体）を必須構成成
分とすることを特徴とする免疫測定試薬である。
本発明における被測定抗原性物質または被測定物質とし
ては、ホルモン（インシュリン、HCG−β、成長ホルモ
ン、TSH、サイロキシン、トリヨードサイロニン、ガス
トリン、グルカゴン、ソマトスタチンなど）、酵素（エ
ラスターゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、リ
ボヌクレアーゼなど）、血清タンパク質（IgG、IgA、Ig
M、IgE、IgD、糖タンパク質、β２−マイクログロブリ
ン、TBG、糖脂質など）、腫瘍関連抗原（CEA、α−フェ
トプロテイン、フェリチン、POA、CA19−９、CA125な
ど）、DNA結合性タンパク質因子、サイトカイン（イン
ターフェロン、インターロイキン１、インターロイキン
２など）または種々の細菌、ウイルス、原虫（真菌、連
鎖球菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイ
ルス、トキソプラズマ原虫、マラリア原虫、赤痢アメー
バーなど）などがあげられる。これらのうち、好ましく
は、特に高感度の測定系が要求されるホルモンおよび腫
瘍関連抗原である。
第一抗体としては、被測定物質と特異的に結合するモノ
クローナル抗体、ポリクロナール抗体を用いることがで
きる。このうち好ましくは、特異性に優れているモノク
ローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ミエロー
マ細胞を文献に記載の方法［たとえば、ジー・ケラー、
シー・ミルスタイン；ネイチャー（G.Kohler,C.Milstei
n;Natur）Vol.256,PP.495（1975）］によって融合させ
た細胞由来の抗体であり、同一クローンの抗体産生細胞
から産生された抗体であるので、その抗体は完全に同一
であり、被測定抗原性物質に対する特異性も完全に同一
であるという特徴をもつことが知られている。
第二抗体としては、第一抗体をプロテアーゼ（ペプシ
ン、パパイン、トリプシン、プラスミンなど）を用いる
方法［たとえば続生化学実験講座５免疫生化学研究法P8
9〜P101］によりFc部分を切断した後、ゲルろ過クロマ
トグラフィー法あるいはプロテインＡ−アフィニティー
クロマトグラフィー［たとえば続生化学講座５免疫生化
学研究法P100］により該Fc部分を除去した抗体を用いる
ことができる。
不溶性固体としては、ケイ酸質無機担体［ガラス（ポー
ラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲル、ベントナイ
トなど］、磁性体、および有機担体（プラスチック、デ
キストラン、ロ紙など）があげられる。これらのうち、
好ましくは、簡便かつ安定して抗体が結合でき、さら
に、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズおよびガラス
試験管）、およびプラスチック（プラスチックチューブ
およびプラスチックトレイ）である。
不溶性固体上に第二抗体を結合させる方法としては、ガ
ラスと抗体を化学的に結合させる（シランカップリング
剤および必要により架橋剤をもちいて）、または物理吸
着させる方法［たとえば、米国特許第4280992号明細書
および同第3652761号明細書記載の方法］あるいは、プ
ラスチックに抗体を物理吸着させる方法［たとえば、イ
ー・エングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パール
マン；バイオキム．バイオフィス．アクタ（E.Engvall,
J.Jons−son,P.Parlmann;Biochim.Biopys.Acta）,251
（1971）427〜434記載の方法］がある。
標識抗体又は第三抗体に用いる抗体としては、第一抗体
のFc部分を特異的に認識する抗体［たとえば、第一抗体
がマウスIgGモノクローナル抗体で切断除去部分がFc部
分なら抗マウスIgG Fc抗体、あるいは第一結合タンパク
質がマウスIgAモノクローナル抗体で切断除去部分がFc
部分なら抗マウスIgA Fc抗体など］があげられる。
標識抗体又は第三抗体に標識する標識物質としては、酵
素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、お
よびβ−ガラクトシダーゼなど）、放射線同位元素
（3H、125Iなど）、蛍光物質（フルオレセインイソチオ
シアネート、ローダミンなど）、化学発光物質（イソル
ミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体など）
などがあげられる。好ましくは、抗体標識が容易で、か
つ高い感度が得られるペルオキシダーゼおよび125Iであ
る。
請求項１記載の免疫複合体は、（１）不溶性固体上の第
二抗体と被結合物質を結合させたのち、洗浄し、この被
測定物質と第一抗体を結合させたのち、再び洗浄し、さ
らにこの第一抗体と標識抗体を結合させる方法、（２）
第一抗体、被測定物質、不溶性固体上の第二抗体を同時
に結合させたのち、洗浄し、さらにこの第一抗体と標識
抗体を結合させる方法、（３）第一抗体、被測定物質、
不溶性固体上の第二抗体、標識抗体を同時に結合させる
方法、および、（４）不溶性固体上の第二抗体と被測定
物質を結合させたのち、洗浄し、この被測定物質と第一
抗体、標識抗体を同時に結合させる方法によって得るこ
とができる。たとえば、（１）第二抗体を結合させた不
溶性固体、および被測定物質を緩衝液中でインキュベー
ション（たとえば、５〜50℃、５分〜２日）し結合させ
たのち、不溶性固体を洗浄する。次に第一抗体を含む緩
衝液中に不溶性固体を移し、インキュベーション（たと
えば、５〜50℃、５分〜２日）し結合させたのち、再び
不溶性固体を洗浄する。さらに標識抗体を含む緩衝液中
に不溶性固体を移し、インキュベーション（たとえば、
５〜50℃、５分〜２日）し結合させることにより免疫複
合体を得る。（２）第一抗体、被測定物質、第二抗体を
結合させた不溶性固体を緩衝液中でインキュベート（た
とえば、５〜50℃、５分〜２日）し結合させたのち、不
溶性固体を洗浄する。次に、標識抗体を含む緩衝液中に
不溶性固体を移し、インキュベート（たとえば、５〜50
℃、５分〜２日）し結合させることにより免疫複合体を
得る。（３）第一抗体、被測定物質、第二抗体を結合さ
せた不溶性固体、標識抗体を緩衝溶液中でインキュベー
ト（たとえば、５〜50℃、５分〜２日）し結合させるこ
とにより免疫複合体を得る。または、（４）第二抗体を
結合させた不溶性固体、および被測定物質を緩衝液中で
インキュベーション（たとえば、５〜50℃、５分〜２
日）し結合させたのち、不溶性固体を洗浄する。次に第
一抗体、標識抗体を含む緩衝液中に不溶性固体を移し、
インキュベーション（たとえば、５〜50℃、５分〜２
日）し結合させることにより免疫複合体を得ることがで
きる。
免疫複合体の標識物質量の測定は、標識物質に応じて酵
素量を酵素活性の測定により測定する方法、放射線同位
元素量を放射線測定装置を用いて測定する方法、蛍光物
質量を蛍光光度計により測定する方法、化学発光物質量
を酵素を用いた化学発光により測定する方法などにより
行うことができる。たとえば、標識物質にペルオキシダ
ーゼを用いた場合、オルト−フェニレンジアミンと過酸
化水素溶液、４−アミノアンチピリンと過酸化水素溶液
などの発色基質溶液中で免疫複合体をインキュベート
（たとえば、５〜50℃、５分〜２日）した後分光光度計
を用いて発色量を測定することによりペルオキシダーゼ
活性を測定する方法などをあげることができる。
請求項３および４記載の免疫測定試薬は必須構成成分以
外に、この免疫測定試薬の使用を便ならしめるために種
々の補助剤を包含させることができる。第一抗体、標識
抗体または第三抗体が固体状である場合にはそれらを溶
解させるための溶解剤、免疫複合体を得る工程で不溶化
固体を洗浄するための洗浄液、標識物質が酵素である場
合にその酵素活性を測定するための基質、および酵素反
応を停止するための反応停止剤などを任意の組合せで包
含させることができる。
［実施例］ 以下、実施例および比較例により、本発明を更に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ CA19−９の測定 ａ） 抗CA19−９モノクローナル抗体の製造 CA19−９に対するモノクローナル抗体は、文献［ヒラリ
ー・コプロスキー、ゼノン・ステプルスキー、ケネット
・ミッチェル、ミーンハード・ヘリン；ソマチック セ
ル ジェネッティックス（Hilary Koprowski,Zenon Ste
plewski,Kenneth Mitchell,Meenhard Helyn;Somatic Ce
ll Genetics）Vol.5,No6,1979,pp.957−972］に記載の
方法に従って製造した。
簡単には、SW1116細胞（大日本製薬社から入手可能）1x
106個をBALB/cマウスの静脈内に投与し免疫した。１ケ
月後に再びSW1116細胞1x106個を投与し３日後に脾臓を
摘出して脾細胞を採取した。RPM1640培地にて洗浄した
後、脾細胞全量を2x107個のマウスミエローマ細胞（P3
−NS1/1−Ag4.1）と混ぜ、37℃の42.5％ポリエチレング
リコール1540および7.5％ジメチルスルフォキシドを含
むRPMI1640倍地1ml中で１分間融合させた。１分後にそ
の細胞懸濁物をRPMI1640倍地5mlで徐々に希釈した。そ
れらの細胞を遠心分離し、洗浄した後、HAT倍地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン、10％牛胎児血
清を含むRPMI1640培地）を20mlになるように加えて、96
ウェル マイクロプレートに0.2mlずつ分注して２週間
培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体活性を
測定した。
次に、活性の認められたウェルの細胞を限界希釈法を使
用して繰り返してクローン化した。クローン化した細胞
をマウスの腹腔内に投与し腹水腫瘍として成長させた
後、腹水を採取した。この腹水中モノクローナル抗体を
アフィ・ゲル・プロテインA MAPSキット（バイオラッド
社）を用いて精製単離し、以下の検討に用いた。
ｂ） 抗CA19−９モノクローナル抗体のFc部分の切断除
去 抗CA19−９モノクローナル抗体20mgを0.1M NaCl−0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）で透析した。透析後、
0.4mgペプシン（ベーリンガー マンハイム社）を加
え、37℃で６時間インキュベートした。次に、この溶液
に0.1M水酸化ナトリウム水溶液を加えpHを７に合わせた
のち、ウルトロゲルAcA44（エルケイビー ファルマシ
ア社）カラム（1.5cmx90cm）でゲルろ過を行いFc部分を
含む分画を除いた。さらに、アフィ・ゲル・プロテイン
Ａ MAPSキットを用いて未消化のモノクローナル抗体を
除去し、モノクローナル抗体Ｆ（ab′）２分画を得た。
ｃ） Fc部分を切断除去した抗CA19−９モノクローナル
抗体結合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面にFc部分切断除去抗CA19−９モノクローナル抗体
をコーティングした。
ｄ） ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG Fc抗体の作製 抗マウスIgG Fc抗体（バインディングサイト社）を文献
［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、
エトール；ジェイ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAW
A,E.ISHIKAWA,et.al.;J.Biochem.,Vol.92（1982）1413
−1424］に記載の方法にてペルオキシダーゼと結合し、
ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG Fc抗体を得た。この
試薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で10〜5000
倍に希釈して使用した。
ｅ） CA19−９標準溶液の調整 SW−1116細胞を10％牛胎児血清含有RPMI1640培地で培養
し、培養上清液を採取した。培養上清液中のCA19−９濃
度をイムノクロンCA19−９（富士レビオ社）を用いて測
定し、濃度が30,60,120,240unit/mlなるように１％牛血
清アルブミン含有緩衝液で希釈し標準溶液とした。
ｆ） CA19−９測定試薬の製造 Fc部分切断除去抗CA19−９モノクローナル抗体結合ガラ
スビーズ100個、抗CA19−９モノクローナル抗体10μg/m
l含有0.02Mリン酸緩衝液12ml、ペルオキシダーゼ標識抗
マウスIgG Fc抗体含有0.02Mリン酸緩衝液60ml、１％牛
血清アルブミン含有0.02Mリン酸緩衝液40ml、CA19−９
標準溶液30,60,120,240unit/mlを各1ml、生理食塩水100
0ml、基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジ
アミン溶液）60ml、および1.5規定硫酸水溶液350mlを別
々の容器に充填した後密栓して、CA19−９測定試薬を製
造した。
ｇ） CA19−９標準溶液の測定 CA19−9 240unit/mlを含む標準溶液50μl,抗CA19−９モ
ノクローナル抗体10μg/ml含有0.02Mリン酸緩衝液100μ
ｌおよび１％牛血清アルブミン含有0.02Mリン酸緩衝液3
00μｌを入れた試験管にFc部分切断除去抗CA19−９モノ
クローナル抗体結合ガラスビーズを１個入れインキュベ
ーション（37℃,15分間）したのち、生理食塩水にてビ
ーズを洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウス
IgG Fc抗体含有0.02Mリン酸緩衝液500μｌ中にビーズを
移し、インキュベーション（37℃,15分間）した。再
度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基
質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶
液）500μｌ中に移し、インキュベーション（37℃,15分
間）したのち、1.5規定硫酸水溶液3mlを加えて反応を停
止した。この液の492nmの吸光度を測定し、ビーズに結
合した酵素の酵素活性を測定した。
同様に、CA19−９標準溶液30,60,120unit/mlおよび０ブ
ランクの測定も行った。
第１図に本測定法によるCA19−９標準溶液の測定結果を
示した。
比較例１ サンドウィッチ法EIAによるCA19−９の測定 実施例１と比較するため、抗CA19−９モノクローナル抗
体を用いたサンドウィッチ法酵素免疫測定法（EIA）に
よりCA19−９の測定を行った。
ａ） 抗CA19−９モノクローナル抗体の製造 実施例1.a）に準じた。
ｂ） 抗CA19−９モノクローナル抗体結合ガラスビーズ
の作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗CA19−９モノクローナル抗体をコーティング
した。
ｃ） ペルオキシダーゼ標識抗CA19−９モノクローナル
抗体の作製 抗CA19−９モノクローナル抗体を文献［エス・ヨシタ
ケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェ
イ．バイオケム（S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,e
t.al.;J.Biochem.,Vol.92（1982）1413−1424］記載の
方法にてペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダーゼ
標識抗CA19−９モノクローナル抗体を得た。この試薬は
通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で10〜5000倍に希
釈して使用した。
ｄ） CA19−９標準溶液の調整 実施例1.e）に準じた。
ｅ） CA19−９標準溶液の測定 CA19−9 240unit/mlを含む標準溶液50μｌおよび１％牛
血清アルブミン含有0.02Mリン酸緩衝液400μｌを入れた
試験管に抗CA19−９モノクローナル抗体結合ガラスビー
ズを１個入れインキュベーション（37℃,15分間）した
のち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオ
キシダーゼ標識抗CA19−９モノクローナル抗体含有0.02
Mリン酸緩衝液500μｌ中にビーズを移し、インキュベー
ション（37℃,15分間）した。再度、生理食塩水にてビ
ーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含
有オルト−フェニレンジアミン溶液）500μｌ中に移
し、インキュベーション（37℃,15分間）したのち、1.5
規定硫酸水溶液3mlを加えて反応を停止した。この液の4
92nmの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活
性を測定した。
同様に、CA19−９標準溶液30,60,120unit/mlおよび０ブ
ランクの測定も行った。
第１図に本測定法によるCA19−９標準溶液の測定結果を
示した。
実施例２ ａ） 抗HBsモノクローナル抗体の製造 HBsに対するモノクローナル抗体は文献［ケイ・クニト
モ、エス・ヤハラ、エイチ・サジ、ティー・ホソイ；ボ
ックス サンジーニス（K.Kunitomo,S.Yahara,H.Saji,
T.Hosoi;Vox Sanguinis）Vol.45,No.2,1983,pp.104−11
1］に記載の方法に従って製造した。
簡単には、HBs抗原500μｇ（ミドリ十字社製）をフロイ
ントの完全アジュバントとともにBALB/cマウスの腹腔内
に投与し免疫した。10日後に再びHBs抗原100μｇを静脈
内に投与し３日後に脾臓を摘出して脾細胞を採取した。
RPMI1640培地にて洗浄した後、脾細胞全量を2x107個の
マウスミエローマ細胞（P3−NS1/1−Ag 4.1）と混ぜ、3
7℃の42.5％ポリエチレングリコール1540および7.5％ジ
メチルスルフォキシドを含むRPMI1640培地1ml中で１分
間融合させた。１分後にその細胞懸濁物をRPMI1640培地
5mlで徐々に希釈した。それらの細胞を遠心分離し、洗
浄した後、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640培地）を
20mlになるように加えて、96ウェルマイクロプレートに
0.2mlずつ分注して２週間培養した後、増殖したウェル
中の培養上清の抗体活性を測定した。
次に、活性の認められたウェルの細胞を限界希釈法を使
用して繰り返してクローン化した。クローン化した細胞
をマウスの腹腔内に投与し腹水腫瘍として成長させた
後、腹水を採取した。この腹水中モノクローナル抗体を
アフィ・ゲル・プロテインＡ MAPSキット（バイオラッ
ド社）を用いて精製単離し、以下の検討に用いた。
ｂ） 抗HBsモノクローナル抗体のFc部分の切断除去抗H
Bsモノクローナル抗体20mgを0.1M NaCl−0.1M酢酸ナト
リウム緩衝液（pH4.5）で透析した。透析後、0.4mgペプ
シン（ベーリンガー マンハイム社）を加え、37℃で６
時間インキュベートした。次に、この溶液に0.1M水酸化
ナトリウム水溶液を加えpHを７に合わせたのち、ウルト
ロゲルAcA44カラム（1.5cmx90cm）でゲルろ過を行いFc
部分を含む分画を除いた。さらに、アフィ・ゲル・プロ
テインA MSPSキットを用いて未消化のモノクローナル抗
体を除去し、モノクローナル抗体Ｆ（ab′）２分画を得
た。
ｃ） Fc部分を切断除去した抗HBsモノクローナル抗体
結合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面にFc部分切断除去抗HBsモノクローナル抗体をコ
ーティングした。
ｄ） 125I標識抗マウスIgG Fc抗体の作製 抗マウスIgG Fc抗体（バインディングサイト社）を文献
［バーバラ・ビー・ミッシェル、スタンレイ・エム・ジ
ギ；セレクティッド メソッズ イン セルラー イム
ノロジー（Barbara B.Mishell Stanley M.Shigi;SELECT
ED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY）PP.315−316,198
0］に記載の方法にて125Iと結合し、125I標識抗マウスI
gG Fc抗体を得た。この試薬は通常１％牛血清アルブミ
ン含有緩衝液で10〜5000倍に希釈して使用した。
ｅ） HBs標準溶液の調整 ミドリ十字社から入手したHBs抗原（40μg/バイアル）
を0.02Mりん酸緩衝液で希釈し、濃度が0.5,1,2.5,5,10n
g/mlとなるようにHBs標準溶液を調製した。
ｆ） HBs測定試薬の製造 Fc部分切断除去抗HBsモノクローナル抗体結合ガラスビ
ーズ100個，抗HBsモノクローナル抗体10μg/ml含有0.02
Mリン酸緩衝液12ml、125I標識抗マウスIgG Fc抗体含有
0.02Mリン酸緩衝液60ml、１％牛血清アルブミン含有0.0
2Mリン酸緩衝液40ml、HBs標準溶液0.5,1,2.5,5,10ng/ml
を各1ml、および生理食塩水1000mlを別々の容器に充填
した後密栓して、HBs測定試薬を製造した。
ｇ） HBs標準溶液の測定 HBs 10ng/mlを含む標準溶液50μl,抗HBsモノクローナル
抗体10μg/ml含有0.02Mリン酸緩衝液100μｌおよび１％
牛血清アルブミン含有0.02Mリン酸緩衝液300μｌを入れ
た試験管にFc部分切断除去抗HBsモノクローナル抗体結
合ガラスビーズを１個入れインキュベーション（37℃,1
5分間）したのち、生理食塩水にてビーズを洗浄した。
次に、125I標識抗マウスIgG Fc抗体含有0.02Mリン酸緩
衝液500μｌ中にビーズを移し、インキュベーション（3
7℃,15分間）した。再度、生理食塩水にてビーズを洗浄
したのち、ビーズに結合した125Iの量をγ線カウンター
で測定した。
同様に、HBs標準溶液0.5,1,2.5,5ng/mlおよび０ブラン
クの測定も行った。
第２図に本測定法によるHBs標準溶液の測定結果を示し
た。
比較例２ 実施例２と比較するため、抗HBsモノクローナル抗体を
用いたサンドウィッチ法放射線免疫測定法（RIA）によ
りHBs抗原の測定を行った。
ａ） 抗HBsモノクローナル抗体の製造 実施例2.a）に準じた。
ｂ）抗HBsモノクローナル抗体結合ガラスビーズの作製 米国特許第652761号明細書の方法に従い、ガラスビーズ
の表面に抗HBsモノクローナル抗体をコーティングし
た。
ｃ） 125I標識抗HBsモノクローナル抗体の作製 抗HBsモノクローナル抗体を文献［バーバラ・ビー・ミ
ッシェル、スタンレイ・エム・ジギ；セレクティッド
メソッズ イン セルラー イムノロジー（Barbara B.
Mishell Stanley M.Shigi;SELECTED METHODS IN CELLUL
AR IMMUNOLOGY）PP.315−316,1980］に記載の方法にて
125Iと結合し、125I標識抗HBsモノクローナル抗体を得
た。この試薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で
10〜5000倍に希釈して使用した。
ｄ） HBs標準溶液の調整 実施例2.e）に準じた。
ｅ） HBs標準溶液の測定 HBs10ng/mlを含む標準溶液50μｌおよび１％牛血清アル
ブミン含有0.02Mリン酸緩衝液400μｌを入れた試験管に
抗HBsモノクローナル抗体結合ガラスビーズを１個入れ
インキュベーション（37℃,15分間）したのち、生理食
塩水にてビーズを洗浄した。次に、125I標識抗HBsモノ
クローナル抗体含有0.02Mリン酸緩衝液500μｌ中にビー
ズを移し、インキュベーション（37℃,15分間）した。
再度、生理食塩水にてビーズを洗浄したのち、ビーズに
結合した125Iの量をγ線カウンターで測定した。
同様に、HBs標準溶液0.5,1,2.5,5,10ng/mlおよび０ブラ
ンクの測定も行った。
第２図に本測定法によるHBs標準溶液の測定結果を示し
た。
［発明の効果］ 本発明の測定方法におよび免疫測定試薬よれば、従来の
免疫測定方法に比較して高感度な測定が可能となる。特
に、請求項２記載発明の測定方法および請求項４記載の
免疫測定試薬によれば、従来のモノクローナル抗体を用
いた測定方法に比較して高感度な測定が可能となる。従
来のモノクローナル抗体を用いた測定方法は測定精度は
優れているが測定感度が低いという問題点があったが、
本発明の測定方法および免疫測定試薬によれば測定精度
を低下させることなく測定感度を向上させることができ
る。更に、高感度の測定方法を検査薬に応用した場合測
定感度が向上するために測定時間の大幅な短縮が可能で
ある。
以上の点から、本発明は、特に高感度の測定が要求され
る血清またはその他の体液中に極微量含まれている腫瘍
関連抗原、ホルモン、ウイルスなどの検出に応用でき、
かつ、これらの検出時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１および比較例１のCA19−９の測定検量
線、第２図は実施例２および比較例２のHBs抗原の測定
検量線である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被測定物質、被測定物質と特異的に結合す
    る抗体（第一抗体）、不溶性固体上の第一抗体のFc部分
    を切断除去した抗体（第二抗体）、および第一抗体のFc
    部分を認識する標識抗体（標識抗体）を結合させて得た
    免疫複合体における標識物質量を測定することにより、
    該被測定物質を測定することを特徴とする被測定物質の
    免疫測定法。
  2. 【請求項２】被測定抗原性物質、被測定抗原性物質を認
    識するモノクローナル抗体（第一抗体）、不溶性固体上
    の第一抗体のFc部分を切断除去したモノクローナル抗体
    （第二抗体）、および第一抗体のFc部分を認識する標識
    抗体（第三抗体）を結合させて得た免疫複合体における
    標識物質量を測定することにより、該被測定抗原性物質
    を測定することを特徴とする抗原性物質の免疫測定法。
  3. 【請求項３】被測定物質と特異的に結合する抗体（第一
    抗体）、不溶性固体上の第一抗体のFc部分を切断除去し
    た抗体（第二抗体）、および第一抗体のFc部分を認識す
    る標識抗体（標識抗体）を必須構成成分とすることを特
    徴とする免疫測定試薬。
  4. 【請求項４】被測定抗原性物質を認識するモノクローナ
    ル抗体（第一抗体）、不溶性固体上の第一抗体のFc部分
    を切断除去したモノクローナル抗体（第二抗体）、およ
    び第一抗体のFc部分を認識する標識抗体（第三抗体）を
    必須構成成分とすることを特徴とする免疫測定試薬。
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