JPH0761278B2 - 成長因子の軟骨成長促進活性の測定法 - Google Patents
成長因子の軟骨成長促進活性の測定法Info
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- JPH0761278B2 JPH0761278B2 JP61222954A JP22295486A JPH0761278B2 JP H0761278 B2 JPH0761278 B2 JP H0761278B2 JP 61222954 A JP61222954 A JP 61222954A JP 22295486 A JP22295486 A JP 22295486A JP H0761278 B2 JPH0761278 B2 JP H0761278B2
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- Japan
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- growth
- cartilage
- culture
- promoting activity
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は成長因子の活性測定法に関する。より詳細には
本発明はニワトリなどの胚性軟骨の器官培養法を用いた
成長因子の軟骨成長促進活性の測定法に関する。
本発明はニワトリなどの胚性軟骨の器官培養法を用いた
成長因子の軟骨成長促進活性の測定法に関する。
近年多くの成長因子が発見されており、また遺伝子工学
の進歩によりそれらの成長因子の大量生産が可能になる
におよんで、人をはじめとする哺乳動物等への応用、つ
まり人をはじめとする哺乳動物等の疾病に対する治療薬
等としての応用が考えられている。しかし治療薬等とし
て市販される場合にはその薬剤の生物学的な活性の試験
が必須であり、その際に本発明は有用な手段となり得
る。
の進歩によりそれらの成長因子の大量生産が可能になる
におよんで、人をはじめとする哺乳動物等への応用、つ
まり人をはじめとする哺乳動物等の疾病に対する治療薬
等としての応用が考えられている。しかし治療薬等とし
て市販される場合にはその薬剤の生物学的な活性の試験
が必須であり、その際に本発明は有用な手段となり得
る。
軟骨に作用する成長因子としては成長ホルモン（GH）お
よびソマトメジン類が知られており、ソマトメジン類に
はソマトメジンＡ、ソマトメジンＣ、インスリン様成長
因子ＩおよびII、マルチプリケーション・スティミュレ
イテング・アクティビティ（MSA）、軟骨由来因子（CD
F）等が知られており、その生物学的活性の測定法とし
ては、成長ホルモンの場合は生後26〜28日の下垂体摘除
ラットの腹腔内にGHを４日間投与し、脛骨軟骨中の骨端
軟骨の幅の増加を測定する脛骨試験が一般的に用いられ
ている〔F.S.Greenspanら.Endocrinology,45,455（194
9）〕。また、ソマトメジン類では下垂体摘除ラットに
ソマトメジン類を投与した後、取り出した助軟骨に対し
て取り込ませた放射性標識された無機硫酸35SO4の量を
測定するSalmonとDaughadayらの方法（J.Clin.Endocrin
ol.Metab.,19,743,1959）や、Hallの方法による11日発
生のニワトリ胚の骨盤軟骨小片を用いる方法（Acta End
ocrinol.（kbh）、63,338,1970）が知られている。ま
た、近年幼若なラットまたはウサギの助軟骨の成長軟骨
の細胞培養系にソマトメジン類を添加して、その細胞増
殖活性をトリチウム標識チミジンの取り込みを指標に、
また軟骨基質合成促進活性を標識無機硫酸35SO4の取り
込みを指標に測定する方法も知られている。（組織培養
8、46頁、1982）、（組織培養応用研究法116〜128頁、1
985、ソフトサイエンス社） 〔発明が解決しようとする問題点〕 前記したように、従来の成長因子の軟骨に対する成長促
進活性の測定法において、下垂体摘除動物を用いる場合
には測定に用いる実験動物に下垂体摘除術という特殊な
処理を施す必要がある。その術式の習得には相当な経験
的熟練を要する。また、そのような処置動物は購入する
場合、非常に高額であり、動物飼育の施設と管理を含め
大きな経済的負担が伴う。更に、測定の感度もそれ程高
くなく、動物の固体差、手術の手技的な誤差を考慮する
と非常に多くの動物を用いる必要があり、精度管理には
かなりの労力を必要とする。また、放射性標識された無
機硫酸の取り込み測定にも放射性物質管理が必要である
上、操作も煩雑である。ニワトリ胚の骨盤軟骨を用いる
場合でも、標識化合物を用いる点では下垂体摘除動物を
用いる場合と同様に放射性物質管理が必要である事は変
わらない。また、細胞培養を用いる方法では、培養細胞
を分離するための組織の採取から細胞の分離培養まで長
い時間を必要とし、組織の細片化やコラゲナーゼなどの
酵素処理などの細胞分離操作は極めて煩雑である。ま
た、幼若動物を用いるため多数の検体測定のために必要
な細胞量を得るためには多数の動物を必要とし、また測
定可能な状態にするために長い培養時間がかかる。ま
た、測定前あるいは測定時にも牛胎児血清などの血清成
分の添加が培養条件に必要であり、それら生体成分中に
は測定しようとする成長因子やそれ以外の未知の成長因
子を含んでいる可能性があるために、測定に際し、検体
である成長因子を特異的に測定し得るか否かについては
疑問がある。また、トリチウム標識チミジンや標識無機
硫酸を用いることは前述の場合と同様である。
よびソマトメジン類が知られており、ソマトメジン類に
はソマトメジンＡ、ソマトメジンＣ、インスリン様成長
因子ＩおよびII、マルチプリケーション・スティミュレ
イテング・アクティビティ（MSA）、軟骨由来因子（CD
F）等が知られており、その生物学的活性の測定法とし
ては、成長ホルモンの場合は生後26〜28日の下垂体摘除
ラットの腹腔内にGHを４日間投与し、脛骨軟骨中の骨端
軟骨の幅の増加を測定する脛骨試験が一般的に用いられ
ている〔F.S.Greenspanら.Endocrinology,45,455（194
9）〕。また、ソマトメジン類では下垂体摘除ラットに
ソマトメジン類を投与した後、取り出した助軟骨に対し
て取り込ませた放射性標識された無機硫酸35SO4の量を
測定するSalmonとDaughadayらの方法（J.Clin.Endocrin
ol.Metab.,19,743,1959）や、Hallの方法による11日発
生のニワトリ胚の骨盤軟骨小片を用いる方法（Acta End
ocrinol.（kbh）、63,338,1970）が知られている。ま
た、近年幼若なラットまたはウサギの助軟骨の成長軟骨
の細胞培養系にソマトメジン類を添加して、その細胞増
殖活性をトリチウム標識チミジンの取り込みを指標に、
また軟骨基質合成促進活性を標識無機硫酸35SO4の取り
込みを指標に測定する方法も知られている。（組織培養
8、46頁、1982）、（組織培養応用研究法116〜128頁、1
985、ソフトサイエンス社） 〔発明が解決しようとする問題点〕 前記したように、従来の成長因子の軟骨に対する成長促
進活性の測定法において、下垂体摘除動物を用いる場合
には測定に用いる実験動物に下垂体摘除術という特殊な
処理を施す必要がある。その術式の習得には相当な経験
的熟練を要する。また、そのような処置動物は購入する
場合、非常に高額であり、動物飼育の施設と管理を含め
大きな経済的負担が伴う。更に、測定の感度もそれ程高
くなく、動物の固体差、手術の手技的な誤差を考慮する
と非常に多くの動物を用いる必要があり、精度管理には
かなりの労力を必要とする。また、放射性標識された無
機硫酸の取り込み測定にも放射性物質管理が必要である
上、操作も煩雑である。ニワトリ胚の骨盤軟骨を用いる
場合でも、標識化合物を用いる点では下垂体摘除動物を
用いる場合と同様に放射性物質管理が必要である事は変
わらない。また、細胞培養を用いる方法では、培養細胞
を分離するための組織の採取から細胞の分離培養まで長
い時間を必要とし、組織の細片化やコラゲナーゼなどの
酵素処理などの細胞分離操作は極めて煩雑である。ま
た、幼若動物を用いるため多数の検体測定のために必要
な細胞量を得るためには多数の動物を必要とし、また測
定可能な状態にするために長い培養時間がかかる。ま
た、測定前あるいは測定時にも牛胎児血清などの血清成
分の添加が培養条件に必要であり、それら生体成分中に
は測定しようとする成長因子やそれ以外の未知の成長因
子を含んでいる可能性があるために、測定に際し、検体
である成長因子を特異的に測定し得るか否かについては
疑問がある。また、トリチウム標識チミジンや標識無機
硫酸を用いることは前述の場合と同様である。
本発明者は、これら従来技術の問題点を解決するため
に、即ち成長因子の軟骨成長促進活性の測定法に関し、 1.操作が手技的に簡単、 2.経済的負担が小さい、 3.高い感度、精度および再現性を得ること、 4.放射性物質管理が必要でない、 5.血清成分の添加が培養条件に必要でない、 などを満足するものを提供すべく種々の研究を重ねた結
果、以下の新知見を得た。
に、即ち成長因子の軟骨成長促進活性の測定法に関し、 1.操作が手技的に簡単、 2.経済的負担が小さい、 3.高い感度、精度および再現性を得ること、 4.放射性物質管理が必要でない、 5.血清成分の添加が培養条件に必要でない、 などを満足するものを提供すべく種々の研究を重ねた結
果、以下の新知見を得た。
即ち、組織の大部分が軟骨よりなる胚性骨原基の器官培
養系に成長因子を添加し、全く血清類を含まない培養液
で培養することによって、培養胚性骨原基の大きさ、乾
燥重量、総タンパク質量およびヘキソサミン量が無添加
で培養した組織のそれらに比べて、濃度依存的に有意に
増加することを見出した。
養系に成長因子を添加し、全く血清類を含まない培養液
で培養することによって、培養胚性骨原基の大きさ、乾
燥重量、総タンパク質量およびヘキソサミン量が無添加
で培養した組織のそれらに比べて、濃度依存的に有意に
増加することを見出した。
本発明はかかる新知見に基づいて完成されたものであ
り、成長因子の軟骨に対する成長促進活性を測定するの
に際し、胚性骨原基の器官培養系に成長因子を添加して
培養後、培養した組織の重量を測定することを特徴とす
る成長因子の軟骨成長促進活性の測定法を提案するもの
である。
り、成長因子の軟骨に対する成長促進活性を測定するの
に際し、胚性骨原基の器官培養系に成長因子を添加して
培養後、培養した組織の重量を測定することを特徴とす
る成長因子の軟骨成長促進活性の測定法を提案するもの
である。
本発明における測定対象である成長因子は動物、特に哺
乳動物（ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、マウス、ラット等）
の軟骨に対する成長促進作用を有するものであれば、特
に制限はなく、その動物の由来は特に限定されない。た
とえば、ヒト由来のものとしては、成長ホルモン（G
H）、ソマトメジン類が例示され、ソマトメジン類とし
ては、ソマトメジンＡ、ソマトメジンＣ、インスリン様
成長因子ＩおよびIIなどが例示される。また他の動物由
来としては、ラットの肝細胞培養液中に産生されるマル
チプリケーション・スティミュレイティング・アクティ
ビィティ（MSA）やウシ胎児軟骨由来の軟骨成長因子で
ある軟骨由来因子（CDF）等が例示される。
乳動物（ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、マウス、ラット等）
の軟骨に対する成長促進作用を有するものであれば、特
に制限はなく、その動物の由来は特に限定されない。た
とえば、ヒト由来のものとしては、成長ホルモン（G
H）、ソマトメジン類が例示され、ソマトメジン類とし
ては、ソマトメジンＡ、ソマトメジンＣ、インスリン様
成長因子ＩおよびIIなどが例示される。また他の動物由
来としては、ラットの肝細胞培養液中に産生されるマル
チプリケーション・スティミュレイティング・アクティ
ビィティ（MSA）やウシ胎児軟骨由来の軟骨成長因子で
ある軟骨由来因子（CDF）等が例示される。
本発明で使用される胚性骨原基とは、胚の状態にある動
物の将来骨または軟骨となる部分をいい、一般には測定
を意図する成長因子に反応しうる時期のもので、かつ培
養液中で、培養液を内部にまで吸収しうる程度の大きさ
に成長したほとんどが軟骨組織よりなるものが使用され
る。胚性骨原基は測定の対照とされる成長因子の種類に
応じて適宜選択すればよく、好ましくは鳥類、特に好ま
しくはニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ等の胚性骨原
基（たとえば、大腿骨原基、脛骨原基）が使用される。
胚の成長時期としては、たとえば鳥類においては、６〜
12日発生のものが好適であり、マウス、ラット等におい
ては、14〜17日発生のものが好適である。
物の将来骨または軟骨となる部分をいい、一般には測定
を意図する成長因子に反応しうる時期のもので、かつ培
養液中で、培養液を内部にまで吸収しうる程度の大きさ
に成長したほとんどが軟骨組織よりなるものが使用され
る。胚性骨原基は測定の対照とされる成長因子の種類に
応じて適宜選択すればよく、好ましくは鳥類、特に好ま
しくはニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ等の胚性骨原
基（たとえば、大腿骨原基、脛骨原基）が使用される。
胚の成長時期としては、たとえば鳥類においては、６〜
12日発生のものが好適であり、マウス、ラット等におい
ては、14〜17日発生のものが好適である。
本発明の測定法においては、成長因子の存在下に培養さ
れた胚性骨原基と、成長因子の不存在下に培養された胚
性骨原基との重量を対比することによって、当該成長因
子の活性を測定するものである。
れた胚性骨原基と、成長因子の不存在下に培養された胚
性骨原基との重量を対比することによって、当該成長因
子の活性を測定するものである。
当該測定に当たっては、通常複数個ウェルの培養プレー
トに、各種濃度の成長因子を加えたウェルおよび成長因
子を加えないウェルについて培養を行い、それぞれにお
ける胚性骨原基の軟骨組織の増加を対比して成長因子の
活性を測定する。
トに、各種濃度の成長因子を加えたウェルおよび成長因
子を加えないウェルについて培養を行い、それぞれにお
ける胚性骨原基の軟骨組織の増加を対比して成長因子の
活性を測定する。
胚性骨原基は、培養に付す前に、たとえばカルシウム不
含のリン酸緩衝食塩液等の緩衝液（好適にはpH7〜８、
特にpH7.4程度）中に浸漬して分離組織の生存性を保持
しておくことが好ましい。
含のリン酸緩衝食塩液等の緩衝液（好適にはpH7〜８、
特にpH7.4程度）中に浸漬して分離組織の生存性を保持
しておくことが好ましい。
胚性骨原基の器官培養の培養条件は、たとえば、次の通
りである。
りである。
培地としては、イーグルのMEM系統の培養液（MEM、ダル
ベッコ改変MEM、α−MEM等）や、HamのＦ−10、Ｆ−1
2、CMRL1066、BGJb、BGJb−HW2等が使用される。炭酸ガ
ス（０〜10％、好ましくは５％）の存在下に培養を行う
ことが好ましい。
ベッコ改変MEM、α−MEM等）や、HamのＦ−10、Ｆ−1
2、CMRL1066、BGJb、BGJb−HW2等が使用される。炭酸ガ
ス（０〜10％、好ましくは５％）の存在下に培養を行う
ことが好ましい。
培養時間は48時間〜６日、好ましくは３日程度であり、
培養温度は36〜38℃、好ましくは37℃程度である。
培養温度は36〜38℃、好ましくは37℃程度である。
なお、前記培養前に前培養として、前記と同様の培地
で、20時間〜２日、好ましくは24時間程度、培養温度36
〜38℃、好ましくは37℃程度の条件下で培養を行って、
胚性骨原基の軟骨組織を培養状態に馴化しておくことが
好適である。
で、20時間〜２日、好ましくは24時間程度、培養温度36
〜38℃、好ましくは37℃程度の条件下で培養を行って、
胚性骨原基の軟骨組織を培養状態に馴化しておくことが
好適である。
９日間孵卵し、正常に発育した白色レグホン種の孵化卵
より胚を無菌的に取り出し、ピンセットにて左右の大腿
骨原基を分離し、濾紙上で分離した大腿骨をころがすこ
とによって、付着している筋肉などの柔組織をていねい
にほぼ完全に除去し、培養を開始するまで少量のカルシ
ウム不含のリン酸緩衝食塩水（pH7.4）中に静置した。
その後、合成培養液α−MEM培養液（GIBCO社製）0.5ml
を入れた24ウェルのプラスチック製培養プレート（Falc
on 3047）に、１ウェルあたり大腿骨１本を入れ、１日
間37℃、５％CO2の炭酸ガス培養装置内で前培養を行っ
た。翌日前培養を終えた同じ胚より分離した左右一対の
大腿骨原基の一方を、軟骨の成長因子であるインスリン
様成長因子−１（IGF−１）を種々の濃度に含む培養液
で、また他の一方を対照としてIGF−１を含まない培養
液で６ウェルのプラスチック製培養プレート（Falcon 3
046）に１ウェルあたり１つの大腿骨を移し、３日間、3
7℃、５％CO2の炭酸ガス培養装置内で培養した。（な
お、培養は一群の数を５とし対培養を行った）IGF−１
を含む培養液の調製は、固相合成法によって全合成され
たIGF−１の凍結乾燥標品を0.1M酢酸水溶液で溶解した
後、α−MEM培養液で0.3nMから100nMの濃度に希釈して
用いた。この時、酢酸の最終濃度は0.1mM以下とし、培
養液量は2ml/ウェルとした。３日間の培養終了後、大腿
骨のそれぞれをリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、濾紙上
で付着した水分を除去し、2mlのアセトンを入れたガラ
ス試験管に移し約30分間浸漬し脱水した。その後アセト
ンを捨て、乾燥させたシリカゲルを入れたデシケータ中
に移し、陰圧下で数分間吸引し、陰圧下のままデシケー
タを密栓し１日間放置して完全に乾燥させた。乾燥させ
た大腿骨は一本づつ微量化学天秤（Mettler AE163）に
てその重量を測定した。IGF−１の活性は添加群、未添
加群の乾燥重量比を指標とした。この場合、左右一対の
大腿骨は培養前には全く同等の重量であり、同一条件下
で培養された後もほとんど同じ重量となることが確認さ
れている。
より胚を無菌的に取り出し、ピンセットにて左右の大腿
骨原基を分離し、濾紙上で分離した大腿骨をころがすこ
とによって、付着している筋肉などの柔組織をていねい
にほぼ完全に除去し、培養を開始するまで少量のカルシ
ウム不含のリン酸緩衝食塩水（pH7.4）中に静置した。
その後、合成培養液α−MEM培養液（GIBCO社製）0.5ml
を入れた24ウェルのプラスチック製培養プレート（Falc
on 3047）に、１ウェルあたり大腿骨１本を入れ、１日
間37℃、５％CO2の炭酸ガス培養装置内で前培養を行っ
た。翌日前培養を終えた同じ胚より分離した左右一対の
大腿骨原基の一方を、軟骨の成長因子であるインスリン
様成長因子−１（IGF−１）を種々の濃度に含む培養液
で、また他の一方を対照としてIGF−１を含まない培養
液で６ウェルのプラスチック製培養プレート（Falcon 3
046）に１ウェルあたり１つの大腿骨を移し、３日間、3
7℃、５％CO2の炭酸ガス培養装置内で培養した。（な
お、培養は一群の数を５とし対培養を行った）IGF−１
を含む培養液の調製は、固相合成法によって全合成され
たIGF−１の凍結乾燥標品を0.1M酢酸水溶液で溶解した
後、α−MEM培養液で0.3nMから100nMの濃度に希釈して
用いた。この時、酢酸の最終濃度は0.1mM以下とし、培
養液量は2ml/ウェルとした。３日間の培養終了後、大腿
骨のそれぞれをリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、濾紙上
で付着した水分を除去し、2mlのアセトンを入れたガラ
ス試験管に移し約30分間浸漬し脱水した。その後アセト
ンを捨て、乾燥させたシリカゲルを入れたデシケータ中
に移し、陰圧下で数分間吸引し、陰圧下のままデシケー
タを密栓し１日間放置して完全に乾燥させた。乾燥させ
た大腿骨は一本づつ微量化学天秤（Mettler AE163）に
てその重量を測定した。IGF−１の活性は添加群、未添
加群の乾燥重量比を指標とした。この場合、左右一対の
大腿骨は培養前には全く同等の重量であり、同一条件下
で培養された後もほとんど同じ重量となることが確認さ
れている。
結果を第１図に示すが、IGF−１は1.0nMから100nMの濃
度に培養液に添加された場合、濃度依存的に培養軟骨の
重量を増加させ、対照に比べ最高約2.3倍にまで増加さ
せることが確かめられ、IGF−１の軟骨成長促進活性を
十分評価し得た。
度に培養液に添加された場合、濃度依存的に培養軟骨の
重量を増加させ、対照に比べ最高約2.3倍にまで増加さ
せることが確かめられ、IGF−１の軟骨成長促進活性を
十分評価し得た。
本発明によれば、胚性骨原基の器官培養系に成長因子を
添加し、全く血清類を含まない培養液で培養することに
よって、培養胚性骨原基の大きさ、乾燥重量および総タ
ンパク質量が、無添加で培養した組織のそれらに比べ
て、濃度依存的に有意に増加するので、これを利用して
成長因子の軟骨に対する成長促進活性を測定することが
出来る。かくして成長促進活性を測定することによっ
て、 1.操作が手技的に簡単、 2.経済的負担が小さい、 3.高い感度、精度および再現性を得ること、 4.放射性物質管理が必要でない、 5.血清成分の添加が培養条件に必要でない、 等の効果が得られる。
添加し、全く血清類を含まない培養液で培養することに
よって、培養胚性骨原基の大きさ、乾燥重量および総タ
ンパク質量が、無添加で培養した組織のそれらに比べ
て、濃度依存的に有意に増加するので、これを利用して
成長因子の軟骨に対する成長促進活性を測定することが
出来る。かくして成長促進活性を測定することによっ
て、 1.操作が手技的に簡単、 2.経済的負担が小さい、 3.高い感度、精度および再現性を得ること、 4.放射性物質管理が必要でない、 5.血清成分の添加が培養条件に必要でない、 等の効果が得られる。
第１図はIGF−１の軟骨成長促進活性を示す。縦軸はIGF
−１添加群と未添加群の乾燥重量比を示し、横軸は培養
液に添加したIGF−１の濃度（nM）を示す。
−１添加群と未添加群の乾燥重量比を示し、横軸は培養
液に添加したIGF−１の濃度（nM）を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】成長因子の軟骨に対する成長促進活性を測
定するのに際し、胚性骨原基の器官培養系に成長因子を
添加して培養後、培養した組織の重量を測定することを
特徴とする成長因子の軟骨成長促進活性の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61222954A JPH0761278B2 (ja) | 1986-09-19 | 1986-09-19 | 成長因子の軟骨成長促進活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61222954A JPH0761278B2 (ja) | 1986-09-19 | 1986-09-19 | 成長因子の軟骨成長促進活性の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6374498A JPS6374498A (ja) | 1988-04-04 |
| JPH0761278B2 true JPH0761278B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=16790480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61222954A Expired - Fee Related JPH0761278B2 (ja) | 1986-09-19 | 1986-09-19 | 成長因子の軟骨成長促進活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0761278B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6309635B1 (en) | 1986-11-20 | 2001-10-30 | Children's Medical Center Corp. | Seeding parenchymal cells into compression resistant porous scaffold after vascularizing in vivo |
| US5041138A (en) * | 1986-11-20 | 1991-08-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Neomorphogenesis of cartilage in vivo from cell culture |
| US5804178A (en) * | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
| US5741685A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-21 | Children's Medical Center Corporation | Parenchymal cells packaged in immunoprotective tissue for implantation |
-
1986
- 1986-09-19 JP JP61222954A patent/JPH0761278B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6374498A (ja) | 1988-04-04 |
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