JPH0761280B2

JPH0761280B2 - グルコ−ス及び１，５−アンヒドログルシト−ルの同時測定法

Info

Publication number: JPH0761280B2
Application number: JP62128037A
Authority: JP
Inventors: 茂田島; 正橋場; 茂夫田中; 正彦 ▲藪▼内
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1987-05-27
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1995-07-05
Anticipated expiration: 2010-07-05
Also published as: JPS63294799A

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は糖尿病の診断マーカーであるグルコースと新し
い診断マーカーとして実用化が期待されている1,5−ア
ンヒドログルシトール（以下1,5−AGという）のバイオ
センサーを用いた同時測定法に関するものである。

〈従来の技術〉グルコースは糖尿病の診断マーカーとして古くから知ら
れている。特に血糖値は糖尿病診断あるいは治療効果の
判定に最も頻繁に活用される測定項目であり、バイオセ
ンサー法を初めとして種々の測定法が実用化されてい
る。

一方、1,5−AGはヒト髄液、血漿および尿中に存在し糖
尿病において血漿中の量が低下する事が報告されている
化合物である。この1,5−AGを定量する方法は従来から
主にガスクロマトグラフイーによって行われていた（糖
尿病、25巻、1115〜1118、1982年、吉岡等）。最近血漿
中のグルコースを除いた後、ピラノースオキシダーゼ
（以下PRODという）によって1,5−AGを酸化し、そのと
き生成する過酸化水素を比色により定量する方法が考案
された。

〈発明が解決しようとする問題点〉体液中のグルコース及び1,5−AGは、同じ糖尿病のマー
カーでありながら、それぞれ別々に測定されている。

即ち、グルコースは、グルコースセンサー、ドライケミ
ストリー等で測定され、1,5−AGはガスクロマトグラフ
イー法や比色法等で測定されている。1,5−AGは、ガス
クロマトグラフイー法による測定では、被検液の前処理
と1,5−AGのラベル化が必要である。そのため分析に長
時間を要し、多数の被検液の測定は困難であり、臨床的
な定量法としては問題があった。またPRODを用いた1,5
−AGの比色法でも複雑な前処理を必要とし臨床的な測定
法としては問題が残る。またグルコースおよび1,5−AG
は臨床的意義が異なるマーカーであり、糖尿病の診断お
よび治療効果の判定に有用であり両者を同時に測定すれ
ば更に厳密な判定が可能である。しかし、両者を簡便に
同時測定した例はない。

〈問題点を解決するための手段〉従来から、グルコースを主とする糖類を酸化する酵素と
してPRODが知られている。

最近、この酵素が無水環状糖アルコールである1,5−AG
をも酸化することが見い出され、1,5−AGの比色定量法
が開発された。この方法では血中の糖類を完全に除去す
ることによって1,5−AGのみを定量している。

本発明者らは上記知見を積極的に活用し、グルコースお
よび1,5−AGを同時定量する方法を種種検討した。

PRODは酵素としての基質特異性が低く、種種の糖類と反
応することが知られており、例えばＤ−キシロース、Ｌ
−ソルボース、Ｄ−グルコノラクトン等とも反応する
（酵素ハンドブツク、P66、朝倉書店）。

そのため体液中のグルコース及び1,5−AGのみを検出す
る事は難かしく、又、体液成分をそれぞれ単離すること
は非常に困難であり容易ではない。

ところが、種々検討の結果、血中等の体液中のグルコー
ス及び1,5−AGを測定する場合、カラムを用いてグルコ
ース及び1,5−AGを分離しこれをPRODを用いたバイオセ
ンサーにより定量した場合、他の糖類が共存していて
も、グルコースと1,5−AGを定量的に精度よく検出する
ことができることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、体液試料中のグルコースおよび1,5−A
Gをカラムで分離後PRODを用いたバイオセンサーにより
定量することを特徴とするグルコース及び1,5−AGの同
時測定法に関するものである。

ところで血糖値即ち血中グルコース値は測定時の状態で
変化するため、比較的安定している空腹時血糖値を指標
にし、正常人で100mg/dl即ち1mg/ml以下であり、糖尿病
ではこの濃度以上に上がることが知られている。また、
1,5−AG値は状態による変化が少なく、正常人で20〜50
μg/mlであり、糖尿病では10μg/ml以下に下がると云わ
れている。この両者を同時に測定するには検出器のダイ
ナミツクレンジが1000〜10000倍を必要とし、比色等の
測定法では不可能である。しかし、本発明によるPRODを
用いたバイオセンサーでは広いダイナミツクレンジを有
し、両者を同時に測定することができる。即ち、本発明
は特定の分離方法と特定のバイオセンサーの持つ広いダ
イナミツクレンジと特異性を巧みに組合せることにより
完成したものである。

本発明で使用するグルコース及び1,5−AGを分離するカ
ラムはバイオセンサーの検出に影響を及ぼさない溶媒系
又はバイオセンサーの検出に影響を及ぼさない溶媒系に
変更可能な溶媒系で用いられる糖分離用カラムを用いる
ことができる。糖分離用カラムにおいて、分子サイズ分
離、イオン排除分離、配位子交換分離、分配分離等の原
理に基づいて分離されるが、その組合せにより更に分離
を良くすることも可能である。この本発明で用いるカラ
ムとしては種々のものが使用できるが、好ましいものと
しては、配位子交換の原理に基づいた陰イオン交換カラ
ムが挙げられ、具体的にはダイオネツクス社製HPIC−AS
6、AS7、日立製作所製^#3013−Ｎ等が挙げられる。

移動相（溶媒系）としては水系が好ましいが、バイオセ
ンサーの酵素PRODを失活させないものであればアルコー
ル、アセトニトリル等の有機溶媒を含んだ系でも使用す
ることができる。また分離の条件ではPRODが失活するも
のでも、カラム分離の後に酵素反応の条件に変更できる
ものであれば使用可能である。例えばHPIC−AS6（ダイ
オネツクス社製カラム）では分離時には移動相（溶媒
系）としてアルカリ水溶液を使用するが、その後酸にて
中和する事によりバイオセンサーにてグルコース及び1,
5−AGの検出が可能となる。

本発明で用いるバイオセンサーとしては、例えばPROD固
定化膜を過酸化水素検出電極表面に装着したフローセル
型検出器が挙げられ、これは、グルコースあるいは1,5
−AGは酸素の存在下にPRODにより酸化され、その時発生
する過酸化水素を過酸化水素検出電極により定量するセ
ンサーである。PROD固定化膜は一般的に行われている膜
固定化法により製造でき、この膜固定化法としては吸着
法、架橋法、共有結合法のいずれの方法も採用できる
が、過酸化水素の透過性の良い膜を得る方法を採用する
のが望ましい。例えば膜透過性の良いトリアセチルセル
ロース膜に酵素を固定化する方法は電気化学協会編「新
しい電気化学」（培風館）P248に記載されており、この
ように過酸化水素の透過性の良い膜は公知の方法により
簡単につくることができる。得られたPROD膜を電極表面
に装着するにはナイロンネツト等で押える方法、あるい
は透析膜のように基質透過性の良い膜で包み込む方法等
が用いられる。

また、本発明で用いるバイオセンサーとしては、水不溶
性の粒状担体に酵素を固定化し小カラムに充填し小カラ
ムの後に配置した過酸化水素検出電極により生成してく
る過酸化水素を検出する型式もあり、膜型式と同様にグ
ルコース及び1,5−AGの定量が可能である。更には、過
酸化水素検出電極としては、生成する過酸化水素を検出
する過酸化水素電極や電気化学検出器を用いるのが最適
であるが、酵素酸化の際に消費される酸素を酸素電極を
用いて定量する事も可能である。また酵素酸化生成した
過酸化水素を他の化合物例えばフエロシアン化カリウム
をフエリシアン化カリウムに変換し電気化学検出器で測
定することも可能である。

本発明で用いられるPRODはIUPAC−ICBの名命法委員会で
EC1,1,3,10あるいはEC1,1,3,11と分類し得るものであれ
ば特に制限はなく、例えばポリポラスオブツサス（Poly
−porus obtusus）ATCC26733の産生するものがあげられ
る。

また、この酵素の比活性は高いほど定量にとって良好な
ことは云うまでもないことであるが、必ずしも最高純度
のものを要求するものではない。

本発明において定量しようとする被検液は1,5−AGとグ
ルコースを定量したいものなら制限はなく、一般的に体
液と呼ばれている血漿、血清、尿、髄液等があげられ
る。また、体液中に共存するタンパク質を除タンパクし
た試料も用いられる。除タンパクの方法は過塩素酸、ト
リフロロ酢酸等の酸を用いた方法、塩化バリウム、水酸
化バリウム等の塩やアルカリを用いた方法、またアルコ
ール等の有機溶剤を用いた方法、あるいはカラムによる
分離があり、いずれの方法を採用しても良いが、1,5−A
Gとグルコースのカラム分離及び酵素反応に障害のない
方法を採用すべきである。また、除タンパクの後必要に
応じてpHの調整を行うこともできる。

本発明方法において、体液試料はそのままあるいは必要
により希釈後、又、必要により除タンパクを行なったの
ちカラムを通し（この場合、流量は通常0.1〜2cc/分程
度とするのが好ましい）、次いでこれをバイオセンサー
に接触させる。カラム流出液のバイオセンサーに接触さ
せる際の温度は20〜40℃位であることが好ましく、又、
pHは５〜８位が好ましく、より好ましくは５〜７位であ
る。

〈実施例〉実施例１測定装置は通常の高速液体クロマトグラフイー装置で、
0.1N−NaOH水溶液を流速0.5ml/minでカラムに通した。
カラムにはHPIC−AS6（ダイオネツクス社製4.6mmφ×25
0mm）を用いた。カラム流出液は0.1ml/minの流速で供給
される0.4N−H₃PO₄水溶液とミキシングジヨイントを通
じて混合され、ミキシングコイル（0.5mmφ×10m）にて
完全に混合されpHは5.7となった。その後この混合液流
をフローセル（容量100μｌ）にセツトしたバイオセン
サーに接触させ、1,5−AGおよびグルコースの量を、発
生した過酸化水素の量により定量した。

バイオセンサーは、過酸化水素電極〔（株）エイブル社
製〕の表面（5mmφ）に同じ大きさのPROD固定化膜をナ
イロンネツトで装着して使用した。PROD固定化膜は以下
の方法により作製した。

即ち、PROD（宝酒造（株）製5.2U/mg）10mgと牛血清ア
ルブミン（シグマ社製）6mgを1/15Mリン酸緩衝液（pH7.
2）0.6mlに溶解し、１％グルタルアルデヒド水溶液0.2m
lを加え、混合する。混合後直ちにニトロセルロース膜
（25mmφ孔径３μｍ）２枚の上にゆっくり滴下し、全体
が均一になる様に広げて４℃で一夜風乾して得た。

上記系において、先ず、カラムの前に設けたインジエク
ターより1,5−AGとグルコースの標準液を50μｌ注入
し、バイオセンサーにより検出し、1.5−AGとグルコー
スの検量線を作製した。その結果を第１図に示した。別
に、糖尿病患者及び正常人の血漿200μｌに60％過塩素
酸水溶液15μｌを加えて振とうの後、3000rpm×15分の
遠心分離を行い除タンパクした。その上清150μｌに40
％水酸化ナトリウム10μｌを加えたものをサンプルとし
た。このサンプルを検量線を作成した場合と同様に57μ
ｌ（血清分として50μｌ）上記系のインジエクターに注
入し、バイオセンサーにより検出し、その面積値から検
量線を用いて定量した。その結果を表−１に示す。

実施例２実施例１において、NaOH水溶液として0.05N−NaOH水溶
液を流速0.5ml/minでカラムに通し又、H₃PO₄水溶液とし
て0.2N−H₃PO₄水溶液を流速0.1ml/minで供給し、カラム
に^#3013−Ｎ（日立製作所製、40φ×150mm）を用い、そ
れ以外は実施例１と同様にして測定を行った。その結果
を実施例１と合わせて表−１に示す。

〈発明の効果〉本発明によれば糖尿病のマーカーであるグルコースと1,
5−AGを同時に測定することが出来、両方に指標により
糖尿病の診断を容易に行なうことが出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の検量線を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】体液試料中のグルコース及び1,5−アンヒ
ドログルシトールをカラムにて分離後ピラノースオキシ
ダーゼを用いたバイオセンサーにより定量することを特
徴とするグルコース及び1,5−アンヒドログルシトール
の同時測定法。