JPH0762032B2 - 改良された放射性核種抗体カツプリング - Google Patents

改良された放射性核種抗体カツプリング

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JPH0762032B2
JPH0762032B2 JP62054296A JP5429687A JPH0762032B2 JP H0762032 B2 JPH0762032 B2 JP H0762032B2 JP 62054296 A JP62054296 A JP 62054296A JP 5429687 A JP5429687 A JP 5429687A JP H0762032 B2 JPH0762032 B2 JP H0762032B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の分野 本発明は、放射性ラベルされたタンパク質性物質、その
製造方法及び診断剤及び治療剤としてのそれらの使用に
関する。
放射性ラベルされた化合物は、医学的診断及び治療にお
いて重要な道具である。そのような化合物は、種々の技
法、たとえば静脈血栓の診断、リンパ節の病理学的研究
及び腫瘍の検出、病期及び治療に使用される。多くのこ
れらの化合物は、金属放射性核種、たとえばテクネチウ
ム−99mを使用する。インビボ投与のために放射性核種
を使用する場合、その放射性核種は、目的の器官又は病
巣、たとえば癌部位に局部配置されることが所望され
る。従って、放射性核種は、特定の器官又は組織への選
択的結合性又はそれによる吸収性を提供するために通常
配合される。囲りの又は遠隔の組織に向けられたバック
グラウンド放射線を減じ、投与量を減じ、インビボイメ
ージングのためのバックグラウンドを最少にし、そして
所望しない副作用を最少にするために、前もって選択さ
れた部位に放射性核種を少しづつ向けることができるこ
とに相当の興味がある。最後に、放射性核種が接合され
得る特定のリガンド又は受容体を含む方法が興味の対象
である。
既知の放射性ラベルされた化合物及び他の調製物は、し
ばしば１又はそれよりも多くの明確な欠点を有する。た
とえば、そのような調製物においては、放射性核種と対
象のタンパク質性物質との間の結合が非特異的且つ／又
は不安定であり、そして順に、バックグラウンド放射線
の増加を導びき、調製物の診断的利用性を制限し、そし
て治療効果を制限しながら、目的としない部位への放射
線投与を増大する該調製物の解離をもたらす。
タンパク質−キレート接合体によるタンパク質性物質の
誘導体はより安定している。しかしながら、そのような
タンパク質−キレート誘導体の調製物は、比較的苛酷な
条件、たとえば有機溶媒及び過度のpH及び温度（これら
は部分的変性をもたらすかも知れない）にゆだねる必要
がある。さらに、放射性キレートの存在は、特定のタン
パク質性物質の生物学的活性を激しく変えることができ
る。たとえば、キレートリガンドを通して金属放射性核
種により共有的にラベルされた抗体は、減じられた免疫
反応性（これは組織とのそれらの相互作用の特異性を減
じる）のものである。また、あるキレート接合方法にゆ
だねられたタンパク質は、変性／集合しやすく；そのよ
うな影響は、そのようなタンパク質が循環から除かれる
につれて増大することができ、そして従ってイメージン
グ又は治療のために利用できる放射性核種の量を減少せ
しめることができる。さらに、キレート接合体を使用し
て放射性ラベルされたあるタンパク質性物質は、危険な
ラベルされたタンパク質をさらに使用する患者に免疫反
応を誘導することができる。
〔関連する文献の説明〕
対象の文献は、Steigmanなど.,16 J.Nucl.Med.573（197
5）（摘要）;Pettit,など21 J.Nucl.Med.59（1980）；
及びアメリカ特許第4,424,200号；第4,421,735号；第4,
323,546号；第4,293,537号；及び第4,057,617号を含
む。
〔発明の要約〕
自然状態でジスルフィド（シスチン）結合を含む、金属
放射性核種によりラベルされたタンパク質性物質が提供
され、そしてこれは種々の病的状態の診断及び治療に使
用される。特に、キレート化された、金属放射性核種接
合体のタンパク質性物質が、リンパ節及び静脈結線の診
断及び腫瘍の検出及び病期のために使用される。放射性
核種によりラベルされたタンパク質、特に免疫グロブリ
ンが、腫瘍の放射性治療に使用される。
放射性核種によりラベルされた本発明のタンパク質性物
質は、ジスルフォド還元剤による対象のタンパク質性物
質の処理、次に該還元されたタンパク質性物質（“Ｈ−
処理生成物”）とたとえば99mTc，186Re及び188Re又は
67Cuを含む適切な放射性核種との反応によって形成され
る。Ｈ−処理生成物、たとえば抗体は、放射性核種と特
異的に反応し、放射性核種によりラベルされた安定した
抗体又は放射性ラベルされた他の生成物を形成すること
が見出された。Ｈ−処理生成物は、金属放射性核種との
複合体化の前及び後で種々の方法により安定化され又は
修飾され得る。
〔特定の態様の説明〕
金属放射性核種によりラベルされたタンパク質性物質に
関する、改良された方法及び組成物並びに放射性イメー
ジング及び放射性治療のために、該放射性ラベルされた
タンパク質性物質（放射性ラベルされた生成物）の使用
が提供される。放射性ラベルされた生成物を生成するた
めの方法により形成された安定した中間体がまた、提供
される：投与の十分前で、放射性ラベルされた生成物の
製造を完結することが所望される場合（但し、放射性ラ
ベリング段階を除く）、そのような中間体が有用であ
り、その結果、投与のすぐ前で、放射性ラベリングのみ
が行なわれる必要がある。
金属放射性核種によりラベルされたタンパク質性物質
は、選択されたタンパク質性物質、ジスルフィド還元剤
による該選択されたタンパク質性物質の処理、及びその
後、放射性核種により放射性ラベルされることから形成
されるであろう。
そのタンパク質性物質とは、タンパク質、ポリペプチ
ド、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質
又は同様のものであろう。免疫グロブリン（抗体）、ポ
リクローナル又はモノクローナル抗体のいづれか又はそ
の特異的結合性フラグメントが特に興味の対象でる。タ
ンパク質性物質は、通常、少なくとも1,000MW、より普
通には少なくとも約2,000MW、一般的には約1.6MDalより
も小さく、より普通には約800KDalよりも小さいであろ
う。そのタンパク質性物質は、少なくとも１つの影響さ
れやすいジスルフィド結合を有することによって特徴づ
けられるであろう。“影響されやすい”とは、還元に基
づいて、チオール基が金属放射性核種と結合するために
得られることを意味する。これは、実験的に決定され得
る。
種々の金属が放射性核種として使用され得る。これらの
金属は、銅、たとえば67Cu；テクネチウム、たとえば
99mTc，レニウム、たとえば186Re及び188Reを含み；こ
れらは一般的に、Ｈ処理されたタンパク質性物質と反応
する場合、イオン、たとえば67Cu2+、99mTc＝O3+，
186,188Re＝O2 3+としてＨ処理された生成物と反応する
であろう。
タンパク質性物質は、放射性核種の使用の性質に依存し
て広く異なる。従って、その化合物は、リガンド又は受
容体であることができる。リガンドは、ホルモン、リン
フォカイン、成長因子、等のような種々の化合物、特に
表面膜受容体に結合する化合物（ここで該複合体は、そ
の表面に結合したまま残存し又はエンドサイトーシスさ
れる）を含むことができる。受容体の中には、表面膜受
容体、抗体、酵素、天然に存在する受容体、レクチン及
び同様のものがある。免疫グロブリン又はそれらの同等
物（Fabフラグメント、F(ab′)2、Fv、Ｔ−細胞受容
体、等を含む）が興味の対象である。
一般的に、選択されたタンパク質性物質は、一般的に約
５〜８のpH、典型的には６〜７のpHの水性培地中で、理
論上過剰のジスルフィド還元剤、たとえばジチオトレイ
トール（DTT）により処理され、そしてその反応は、そ
の選択されたタンパク質性物質のすべてが還元剤と反応
するように十分な時間、進められるであろう。通常、そ
の時間は、約15分〜約６時間であり、そして温度は約０
〜50℃、普通約40℃を越えず、そして好ましくは約25℃
であろう。特別な条件は、特定のタンパク質性物質、pH
及び同様のものに従って選択されるであろう。
DTTは、タンパク質性物質の処理のために好ましい試薬
であるが、メルカプタン基又は一対のメルカプタン基を
含む他の還元剤、たとえば水素化ホウ素ナトリウム、ナ
トリウムホスホロチオエート、ジチオエリトリトール
（DTE）、２−メルカプトエタノール、システイン、Ｎ
−アセチルシステイン及びグルタチオンも使用され得
る。
タンパク質性物質のジスルフィドの還元の後、その還元
剤は通常、放射性核種との複合体化を防ぐために、そし
ていづれか反対の生理学的効果を避けるために除去され
るであろう。反応しなかった及び古い還元剤の除去は、
種々のクロマトグラフィー法、たとえばSephadexゲル処
理法、微孔性濾過法、遠心分離法、等を用いて便利且つ
効果的に達成され得る。特別な分離の方法は、本発明に
臨界ではない。
特定の金属に依存して、種々の条件及び技術がＨ処理生
成物のラベリングのための金属放射性核種類を調製する
ために使用されるであろう。テクネチウム類を用意する
ために、ナトリウムペルテクネテートを、通常の条件下
で還元剤、たとえば錫イオン又は亜ジオチン酸の存在す
る溶液中で反応せしめる。好ましくは、弱いキレート剤
を、培地（たとえばタルトレート、グルコヘプトネー
ト、等を含む）中で誘発せしめ、それによって還元され
Tc−99mの不安定な可溶性複合体を形成する。ラベリン
グのためのレニウム類は、95℃で濃塩酸中次亜リン酸を
用いてペルレネートをレニウム（IV）ヘキサクロリドに
還元することによって形成され得る。次に、ヘキサクロ
ロレネートを、室温で酸素を含む90％エチレンジアミン
中でビス（エチレンジアミン）ジオキソレニウム（Ｖ）
に転換する。次に、そのビス（エチレンジアミン）ジオ
キソレニウム（Ｖ）複合体を、蒸発又は再結晶化によっ
て回収し、そしてエチレンジアミンを、加熱しながら真
空下で除去する。選択されたＨ処理生成物を放射性ラベ
ルするために適切な放射性銅を、氷酢酸中に酸化銅（Cu
O）を溶解し、そして酢酸銅を得るために酢酸を蒸発す
ることによって形成することができ、そして次にラジオ
ラベリングのために水に溶解することができる。
金属放射性核種の不安定複合体をまた、Ｈ処理生成物と
の複合体形成のために放射性核種の源として使用するこ
とができる。たとえば、Tc−99mグルコネート、グルコ
ヘプトネート、タルトレート、マロネート、又は同様の
ものを使用することができる。同様に、放射性核種の弱
いキレート複合体、たとえばビス（エチレンジアミン）
塩化第II銅、ビス（アクロ）−エチレンジアミン硫酸銅
又は硝酸銅及び同様のものも使用することができる。
典型的には、選択されたＨ処理タンパク質性物質又は生
成物は、生理学的に許容できる培地、たとえば水又は適
切な緩衝溶液中に適切な放射線投与レベルを得るための
十分な量の放射性核種をまず、溶解することによって、
選択された金属放射性核種により放射性レベルされ；次
に、適切な緩衝液中選択されたＨ処理生成物が添加され
る。好ましくは、その反応溶液又は緩衝液は、約５〜10
の範囲のpHを有し、そしてその反応は、Ｈ処理生成物の
すべてを金属放射性核種と複合体化するために、十分な
時間、進められるであろう。通常、反応時間は、約30分
〜約６時間であり、そして温度は約０〜約60℃、より普
通には約25℃〜約50℃の範囲である。
Ｈ処理生成物は、放射性ラベリングが必要なまで、貯蔵
のために種々の方法で安定化され得る。たとえば、還元
剤による処理の後、そのＨ処理生成物は、約−10℃以
下、普通約−20℃で脱塩溶液中で冷凍され得る。貯蔵の
ためには、周囲温度又は換算温度で既知技法に従ってＨ
処理生成物を個々の殺菌したバイアル中で凍結乾燥する
ことがより便利であるとわかるであろう。最とも便利に
は、Ｈ処理生成物は、不安定な錯生成剤又はスルホヒド
リル基誘導体化剤のいづれかにより安定化される。次
に、その安定化されたＨ処理生成物は、後での使用のた
めに凍結され、より好ましくは、貯蔵のために無菌状粉
末として凍結乾燥されるであろう。
典型的には、Ｈ処理生成物の金属イオン安定化に関して
は、還元剤と選択されたタンパク質性物質との間の反応
の完結後すぐに、理論的に過剰量の比較的弱い結合性金
属イオンの水溶液又は緩衝液が、添加されるであろう。
好ましくは、使用される金属イオンは亜鉛イオン（Z
n2+）であるが、しかし他の二価又は三価の金属イオ
ン、たとえばカルシウムイオン、マグネシウムイオン及
び同様のものも使用され得る。前記金属イオンの種々の
弱く結合した陰イオン性塩も使用され得る。安定した陰
イオンは、クロリド、ヨーシド、ホスフェート、グリシ
ネート、アセテート、グリコネート、マロネート及び同
様のものを含むことができる。その金属イオン及びカウ
ンターイオンは、生物学的に許容されるべきであり；安
定化されたＨ処理生成物が処理される場合、毒性金属イ
オンは、放射性リベリング及び投与の前、イオン交換樹
脂として使用されるに過ぎない。金属イオン安定性Ｈ処
理生成物は、典型的には、Ｈ処理生成物の放射性ラベリ
ングと同じ方法で、金属放射性核種により放射性ラベル
される。その安定化金属イオンは、使用される特定の放
射性核種との急速な交換のために選択されるであろう。
その安定化金属イオンは、金属放射性核種が該安定化イ
オンよりもＨ処理生成物に一層強く結合するように選択
されるであろう。
他方、Ｈ処理生成物は、スルホヒドリル基誘導体化剤に
よる、ジスルフィド結合へのビス（スルホヒドリル）成
分の再結合によって、不活性化に対して安定化され得
る。好ましくは、そのスルホヒドリル誘導体化剤は、還
元剤による処理に基づいて形成されるスルホヒドリル基
と反応し、そして放射性ラベリングのために除去できる
ように選択される。しかしながら、いくつかの金属放射
性核種、たとえば67Cu2+イオンのためには、放射性ラベ
リングの前、誘導体化された基の除去が不必要であるよ
うに誘導体化剤を選択することが可能である。好ましく
は、スルホヒドリル基は、シアネート（OCN-）イオンを
用いて誘導体化され；他の可能な誘導体化剤は、無水酢
酸、Ｎ−アセチルイミダゾール、無水マレイン酸、無水
琥珀酸、スルフィットイオン、トリニトロベンゾスルホ
ン酸及び同様のものである。
シアネートは、タンパク質のスルホヒドリル基のための
可逆的且つ特異的な変性剤として有用である〔G.R.Star
k,J.Biol.Chem.（1964）239:1411〕。わずかに酸性条件
（約pH6）下で、KNCOは、特別にタンパク質のスルホヒ
ドリル基と反応し、Ｓ−カルバミルシステインを形成す
る。これらの条件下で、アミノ基及びグアニジニル基と
の反応は最少である。Ｓ−カルバミルタンパク質の出発
のスルホヒドリル及びシアネートへの分解は、アルカリ
触媒され、そしてpH8及びそれ以上で容易に起こる。従
って、シアネート保護された、DTT処理抗体は、放射性
核種によるラベリング又は“活性化”の前、アルカリへ
の短時間の暴露によって“活性化”され得、そして放射
性ラベリングは、アルカリ性pHで同時に行なわれ得る。
たとえばTc-99m−タルトレートラベリングは、pH8〜10
で行なわれ、そしてシアネート保護タンパク質が従来の
活性化を伴わないで放射性ラベリング反応に添加され
る。
対象の放射性ラベルされた生成物は、放射性核種が所望
される特定の部位に依存して、リンパシステム又は同様
のシステム中に導入するために、静脈内、動脈内、腹膜
内、腫瘍内、皮下内に注射することによって哺乳類宿主
に投与され得る。一般的に、宿主中に注射されるべき量
は、宿主の大きさに依存して約１〜3000μCi/宿主のkg
であろう。ヒトのためには、その投与量は、普通約10〜
50mCi/70kg宿主であり、より好ましくは約25〜35mCi/70
kg宿主であろう。下等哺乳類、たとえばマウスのための
投与量は、生物分布研究のためには約25〜100μCiであ
り、ところがイメージング研究のためには1000μCiまで
又はそれよりも高い投与量であろう。放射性核種の投与
の後、その目的に依存して、宿主は、検出又は治療のた
めに種々の方法で処理され得る。
次の例は、例示的であって、限定するものではない。
例１ DTT処理されたタンパク質性物質の調製。
a.DTT処理されたモノクローナル抗体の調製。
リン酸緩衝溶液（PBS;0.05Mのホスフェート、0.15Mの塩
化ナトリウム、pH7.5）2.5ml中マウスモノクローナル抗
体25mgの溶液に、PBS中、DTTの比較的濃溶液を添加し、
1mMの最終DTT濃度にした。得られた溶液を、室温で30分
間、攪拌した。
全反応混合物を、PBSにより前もって平衡化されたSepha
dex G−25（1.5cm×5.0cmのプラスチックカラム、PBSに
より溶離される）上で精製し、そして1.2mlの画分を集
めた。0.1よりも大きな吸光度（280nm）を有する脱塩さ
れた画分を、一緒にし、小さなバイアル中にアリコート
し、そして−20℃ですぐに凍結した。HPLCによるその反
応混合物の分析（例８）は、プールされた画分中にモノ
マー抗体のみの存在、及び従って集合の不在性を示し
た。
b.DTT処理されたヒト血清アルビミンの調製。
ヒト血清アルブミン（HSA）6.0mg及びリン酸緩衝溶液
（PBS;0.05M（50mM）のリン酸ナトリウム;0.15Mの塩化
ナトリウム;pH7.5）1.2mlの溶液に、DTTの比較的濃溶液
を添加し、1mMの最終DTT濃度にした。室温で15分間、攪
拌した後、その反応混合物を、例1aに要約された方法に
従って、Sephadex G−25カラムから溶離することによっ
て脱塩した。そのタンパク質含有性画分をプールし、小
さなバイアル中にアリコートし、そして−20℃で凍結せ
しめた。
DTT処理されたタンパク質性物質を貯蔵するためのもう
１つの方法は、下記に述べられている。
例２ DTT処理されたタンパク質性物質の放射性ラベリング。
a.Tc-99m−タルトレートによるDTT処理されたモノクロ
ーナル抗体のラベリング。
Tc-99m−タルトレートの溶液を、SnCl2100μｇ（約0.43
μモル）、酒石酸二ナトリウム75mg（約0.32mモル）及
びナトリウム（Tc-99m）ペルテクネテート3.2mCi中に、
９％エタノールを含むカズ抜きされた蒸留水1.1mlを添
加することによって調製した。この混合物を、15分間、
水浴中で50℃で加熱した。冷却した後、別の容器中に、
Tc-99m−タルトレート100μｌ、0.2Mのリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH8.0）200μｌ及び例１におけるようにして
調製され、そして使用するすぐ前に融解された、DTT処
理された抗体100μｇを混合した。その溶液の合計体積
を、0.15Mの塩化ナトリウムの水溶液により0.5mlに調整
し、そして50℃で60分間、インキュベートした。得られ
た溶液のHPLC分析（例８）は、モノマー抗体の存在を示
し、そして集合がラベリング法によって引き起こされな
かったことを指摘した。
例７の方法に従っての反応生成物の分析は、84％のTc-9
9mが抗体に結合されたことを示した。類似する実験を、
抗体をDTT処理しないで行ない；その反応生成物の分析
は、18％のみのTc-99mが抗体に結合されたことを示し
た。
b.DTT処理された抗体のTc-99mグルコヘプトネートによ
るラベリング。
この実験を、GlucoscanTMキット（New England Nuclea
r、ケンブリッヂ、マサチューセッツ）を用いて行なっ
た。GlucoscanTMバイアルを、ナトリウム（Tc-99m）ペ
ルテクネテート3mCi及び十分な0.15M塩化ナトリウム水
溶液により再構成し、1.0mlの最終体積を得た。そのバ
イアルを室温で15分間、保持した。別々に、0.2Mのリン
酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）200μｌ、上記で調製され
たTc-99m−グルコヘプトネート溶液100μｌ及び例１に
おけるようにして調製された、DTT処理された抗体100μ
ｇを混合した。その合計体積を、0.15Mの塩化ナトリウ
ム溶液により0.5mlに調整し、そして50℃で60分間、イ
ンキュベートした。EPLC分析は、モノマー抗体のみの存
在を示した。例７の方法に従ってのその反応生成物の分
析は、95％のTc-99mが抗体に結合されたことを示した。
DTTにより処理されなかったが、しかし同じTc-99mグル
コペプトネートラベリング法にゆだねられた抗体は、抗
体への６％のみのTc-99mの結合をもたらした。
c.DTT処理されたHSAの放射性ラベリング。
バイアル中に、例2aに従って調製されたTc-99mタルトレ
ート溶液100μｌを、例1bの方法に従って調製された、D
TT処理されたHSA100μｇ及び0.2Mのリン酸ナトリウム緩
衝液（pH8.0）200μｌと共に混合した。その溶液の合計
体積を、0.15Mの塩化ナトリウム水溶液により0.5mlに調
整し、そして50℃で60分間、インキュベートした。例７
の方法に従ってのその反応生成物の分析は、89％のTc-9
9mがHSAに結合されたことを示した。
例３ 放射性ラベルされたDTT処理抗体の安定性。
DTT処理された抗体を、例１の方法に従って調製し、そ
して例2aの方法に従ってTc-99mタルトレートによりラベ
ルした。例７の方法に従ってのその反応生成物の分析
は、95％のTc-99mがこの方法によって抗体に結合された
ことを示した。ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTP
A）を、ラベルされた抗体の溶液に添加し、2mg/mlの最
終濃度にした。従って、DTPA、（すなわちテクネチウム
の有効なキレート剤）は、過剰に存在した。その得られ
た溶液を水浴中で50℃で60分間、加熱した後、例７に従
っての分析は、初めから結合されているTc-99mの97％が
DTPAによる処理の後、結合したままで残存したことを示
した。
例４ 亜鉛イオンにより安定化されたDTT処理抗体（Zn-DTT処
理抗体）の調製。
a.過剰の亜鉛イオンの除去を伴わないで。
DTTにより処理された抗体を、例１の方法に従って調製
した。但し、最終調製物を凍結しなかった。塩化亜鉛
（ZnCl2）の水溶液を、すぐDTT処理抗体の溶液に添加
し、0.1mMの最終亜鉛イオン濃度を有する溶液を得た。
その溶液を、さらに使用するまで室温で貯蔵した。
b.過剰の亜鉛イオンの除去。
例１の方法に従った。但し、塩化亜鉛の水溶液を、元の
反応混合物に添加し、0.1mMの最終亜鉛イオン濃度を得
た。その得られた溶液を、前もってPBAにより平衡化さ
れたSephadex G-25カラム上で脱塩した。抗体を含む画
分を、室温で貯蔵した。
c.対照抗体。
例4bの方法の後、亜鉛イオンによってのみ処理された抗
体を特徴づけるために、DTTの除去を行なった。
例５ 亜鉛イオンにより安定化された抗体の放射性ラベリン
グ。
処理されていない抗体、DTT処理された抗体（例１）、Z
n-DTT処理された抗体（例４）、脱塩された、Zn-DTT処
理された抗体（例4b）及び対照抗体（例4c）の溶液のそ
れぞれを、例2aの方法に従ってTc-99mタルトレートによ
りそれぞれ放射性ラベルした。このラベリング法は、個
々の溶液の調製の後、すぐ行なわれた。第２シリーズの
放射性ラベリング実験を、24時間室温で５つの溶液のそ
れぞれの貯蔵の後、行なった。10の溶液のそれぞれを、
結合されたTc-99mの％のために例６の方法に従って分析
した；その結果は第１表に示される。
例６ 放射性ラベリング度の分析。
薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて、タンパク質
放射性ラベリング度を決定した。シリカゲル含浸された
グラスファイバーシートを、Gelman Sciences Inc.,Ann
Arbor,ミシガンから得、そして製造説明書に従って活
性化した。その放射性ラベリング反応混合物の２〜５μ
ｌアリコートを、スポットし、そしてTLCストリップ
を、0.65Mの酢酸アンモニウム、25％メタノール中で、
展開せしめた。そのTLCストップを半分に切り、そして
それぞれ半分を、適切な放射性核種のために調整された
放射能カウンターにより計数した。タンパク質及びタン
パク質結合放射能は、原点で残り、そして非タンパク質
放射能は、溶媒面を移動する。タンパク質の放射性ラベ
リング度を、次の式を用いて計算した： これらの結果から、いくつかの観察が行なわれ得る。抗
体のDTT処理は、TC-99mとの放射性ラベリング度をひじ
ょうに高める。しかしながら、DTT処理された抗体溶液
が24時間、室温で保持される場合、結合されるTc-99m度
は、処理されていない抗体に結合されるTc-99m度よりも
高くなる。これは、DTT処理が抗体中のジスルフィド結
合を減じ、ビス（スルホヒドリル）成分（室温で24時間
内に元のジスルフィド結合を形成するために再結合す
る）を産生するという仮説を示し、そして支持する。
Zn-DTT処理された抗体の調製後放射性ラベリングの効率
は、本質的に、Zn2+添加しないのでラベリングの効率と
同じである。しかしながら、亜鉛イオンによる付加処理
は、スルホヒドリル基の酸化を効果的に妨げ、従って、
DTT処理された抗体を安定化し、そして臨床的に所望さ
れる場合、放射性ラベリングのために本発明の方法及び
組成物の使用を促進する。その放射性ラベリング効率
は、Zn-DTT処理された抗体が過剰の亜鉛イオンを除去す
るために脱塩化されてもいずれにせよ、使用される亜鉛
イオン濃度で本質的に同じである。DTT処理を伴わない
での亜鉛イオンによる抗体の処理は、実際に、放射性ラ
ベリング効率を低下せしめる。
例７ 集合の高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）分析。
サイズ排除HPLCを、東洋ソーダTSK 3000カラム、7.5mm
×30cm（Kratos,Inc.,Ramsey,NJから入手できる）を用
いて行なった。そのカラムを、1.0ml/分で0.15Mの塩化
ナトリウムを含む0.2Mのリン酸ナトリウム溶液（pH7.
0）により溶離した。カラム溶離剤を、直線UV検出器及
び直線放射能検出器の両者を用いて、モニターした。そ
のカラムを、適切なタンパク質分子量標準を用いて調整
し、そしてその対照は、放射性ラベリングする前の研究
下のタンパク質であった。
例８ シアネートイオンによりDTT処理された抗体の誘導体
化。
DTT処理された抗体（25mg）を、例１の方法に従って用
意した。但し、その反応混合物を、0.05Mのリン酸ナト
リウム、0.15Mの塩化ナトリウム溶液（pH6.0）により前
もって平衡化されたSephadex G-25上で精製した。クロ
マトグラフィー処理後、すぐに、シアン化カリウム5mg/
ml水溶液60μｌを添加し、そしてpHを、1Mの酢酸の添加
によって6.0に維持した。30分後、その溶液を、PBSによ
り前もって平衡化されたSephadex G-25上で脱塩した。
タンパク質を含む画分を集め、約10mg/mlに濃縮し、そ
して４℃で貯蔵した。シアネート保護の抗体を、例2aの
方法に従って、Tc-99m−タルトレートによりラベルす
る。
例９ Tc-99mによりラベルされた“Ｈ−処理生成物”のヒトFM
X-Met II腫瘍細胞への結合。
DTT処理及び続いてTc-99mラベリングが目標とする抗原
を結合するために抗体成分に対して有する効果を、細胞
結合アッセィによって評価した。そのアッセィは、T.Li
ndmo、など.,J.of Immunol.Meth.（1984）72:77〜89に
よって記載されているアッセィの変形であった。放射性
ラベルされた9.2.27抗−黒色腫抗体を、過剰抗原の状態
を表わすように予定された、固定された濃度のヒトFMX-
Met II黒色腫腫瘍細胞と共に２時間、インキュベートし
た。その腫瘍細胞への放射性ラベルされた抗体の非特異
的結合のための対照として、腫瘍細胞を、200倍過剰の
放射性ラベルされていない同じ特異的の抗体の存在下で
少なくとも１時間、プレインキュベートした。目標細胞
及び放射性ラベルされた抗体のインキュベーションの
後、放射能のレベルを、γウェルカウンターにより定量
した。この方法における9.2.27モノクローナル抗体の分
析は、約76％の目標細胞への抗原特異性結合を示し、そ
して４％よりも少ない非特異性結合成分を示した。
本発明の組成物及び方法を用いることによって、それら
の本来の状態でジスルフィド結合を含むタンパク質性物
質を急速に放射性ラベルすることができ、インビボで使
用するために放射性核種により置換された試薬を提供す
ることができる。その試薬は、純粋形及び良好な収率で
提供され得る。放射性ラベリングは、タンパク質性物質
が変性も集合もしない温和な条件下で効果的に行なわれ
る。さらに、DTTにより処理することによって提供され
た反応性タンパク質性物質は、周囲温度で長期貯蔵のた
めに安定化され得、そして次に、必要な場合、投与のす
ぐ前で放射性ラベルされ得る。従って、低レベルの放射
能のみが非特異的に指図され、そして結合されるであろ
う目的の部位に放射性核種を安全に向けることができ
る。本発明の組成物及び方法は、そのようにラベルされ
たタンパク質性物質の生物学的活性に対する効果を最少
にしながら、対象の生理学的特性を有する、安定に放射
性ラベルされたタンパク質性組成物を提供する。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができることは当業者
に明らかである。従って、その説明及び例は、本発明の
範囲を限定するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−203919（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−26485（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−120850（ＪＰ，Ａ) 「生化学辞典」（1984）東京化学同人 Ｐ．568 「ジスルフィド結合」「ジスル フィド交換」の項

Claims (70)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】直接的な放射性核種ラベリングのために適
    切な、ジスルフィドー結合含有タンパク質性リガンド又
    はレセプターの安定化されたタンパク質性誘導体であっ
    て、前記ジスルフィドー結合含有タンパク質性リガンド
    又はレセプターがジスルフィドー還元剤により処理され
    ており、そして前記放射性核種が99mTc、186Re、188Re
    又は67Cuであることを特徴とする誘導体。
  2. 【請求項２】二価又は三価のカチオンとの反応により安
    定化されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の誘導体。
  3. 【請求項３】前記カチオンがMg2+、Ca2+又はZn2+である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の誘導体。
  4. 【請求項４】スルフヒドリル基誘導体化剤との反応によ
    り安定化されることを特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の誘導体。
  5. 【請求項５】前記スルフヒドリル基誘導体化剤がシアン
    化物であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の誘導体。
  6. 【請求項６】凍結により安定化されることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の誘導体。
  7. 【請求項７】凍結乾燥物であることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の誘導体。
  8. 【請求項８】凍結乾燥物であることを特徴とする特許請
    求の範囲第２項記載の誘導体。
  9. 【請求項９】凍結乾燥物であることを特徴とする特許請
    求の範囲第３項記載の誘導体。
  10. 【請求項１０】凍結乾燥物であることを特徴とする特許
    請求の範囲第６項記載の誘導体。
  11. 【請求項１１】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第１項記載の誘導体。
  12. 【請求項１２】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第２項記載の誘導体。
  13. 【請求項１３】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第３項記載の誘導体。
  14. 【請求項１４】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第６項記載の誘導体。
  15. 【請求項１５】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第７項記載の誘導体。
  16. 【請求項１６】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第８項記載の誘導体。
  17. 【請求項１７】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第９項記載の誘導体。
  18. 【請求項１８】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤から開放されていることを特徴とする特許請求の
    範囲第10項記載の誘導体。
  19. 【請求項１９】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載の誘導体。
  20. 【請求項２０】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第２項記載の誘導体。
  21. 【請求項２１】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第３項記載の誘導体。
  22. 【請求項２２】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第４項記載の誘導体。
  23. 【請求項２３】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第５項記載の誘導体。
  24. 【請求項２４】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第６項記載の誘導体。
  25. 【請求項２５】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第７項記載の誘導体。
  26. 【請求項２６】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第８項記載の誘導体。
  27. 【請求項２７】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第９項記載の誘導体。
  28. 【請求項２８】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第10項記載の誘導体。
  29. 【請求項２９】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第11項記載の誘導体。
  30. 【請求項３０】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第12項記載の誘導体。
  31. 【請求項３１】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第13項記載の誘導体。
  32. 【請求項３２】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第14項記載の誘導体。
  33. 【請求項３３】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第15項記載の誘導体。
  34. 【請求項３４】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第16項記載の誘導体。
  35. 【請求項３５】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第17項記載の誘導体。
  36. 【請求項３６】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第18項記載の誘導体。
  37. 【請求項３７】直接的な放射性核種ラベリングのために
    適切な、ジスルフィドー結合含有タンパク質性リガンド
    又はレセプターの安定化されたタンパク質性誘導体を含
    んで成るキットであって、前記ジスルフィドー結合含有
    タンパク質性リガンド又はレセプターがジスルフィドー
    還元剤により処理されており、そして前記放射性核種が
    99mTc、186Re、188Re又は67Cuであり、そして前記誘導
    体が無菌性であることを特徴とするキット。
  38. 【請求項３８】前記誘導体が凍結乾燥物であることを特
    徴とする特許請求の範囲第37項記載のキット。
  39. 【請求項３９】前記誘導体が使用された及び未反応のス
    ルフヒドリル還元剤から開放されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第37項記載のキット。
  40. 【請求項４０】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントであることを
    特徴とする特許請求の範囲第37項記載のキット。
  41. 【請求項４１】直接的な放射性核種ラベリングのために
    適切な、ジスルフィドー結合含有タンパク質性リガンド
    又はレセプターの安定化されたタンパク質性誘導体の調
    製方法であって、ここで前記ジスルフィドー結合含有タ
    ンパク質性リガンド又はレセプターがジスルフィドー還
    元剤により処理されており、そして前記放射性核種が
    99mTc、186Re、188Re又は67Cuであることを特徴とし： 少なくとも１つのジスルフィドー結合を還元するために
    ジスルフィドー還元剤とジスルフィドー結合含有タンパ
    ク質性リガンド又はレセプターとを反応せしめ；そして 前記誘導体を安定化することを含んで成る方法。
  42. 【請求項４２】前記誘導体を、二価又は三価の金属カチ
    オンとの反応により安定化する特許請求の範囲第41項記
    載の方法。
  43. 【請求項４３】前記カチオンがMg2+、Ca2+又はZn2+であ
    る特許請求の範囲第42項記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記誘導体がスルフヒドリル基誘導体化
    剤との反応により安定化される特許請求の範囲第41項記
    載の方法。
  45. 【請求項４５】前記スルフヒドリル基誘導体化剤がシア
    ン化物である特許請求の範囲第44項記載の方法。
  46. 【請求項４６】前記誘導体が凍結することによって安定
    化される特許請求の範囲第41項記載の方法。
  47. 【請求項４７】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤を除去する段階をさらに含んで成る特許請求の範
    囲第41項記載の方法。
  48. 【請求項４８】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤を除去する段階をさらに含んで成る特許請求の範
    囲第42項記載の方法。
  49. 【請求項４９】使用された及び未反応のスルフヒドリル
    還元剤を除去する段階をさらに含んで成る特許請求の範
    囲第43項記載の方法。
  50. 【請求項５０】前記誘導体を凍結乾燥する段階をさらに
    含んで成る特許請求の範囲第41項記載の方法。
  51. 【請求項５１】前記誘導体を凍結乾燥する段階をさらに
    含んで成る特許請求の範囲第42項記載の方法。
  52. 【請求項５２】前記誘導体を凍結乾燥する段階をさらに
    含んで成る特許請求の範囲第43項記載の方法。
  53. 【請求項５３】前記誘導体を凍結乾燥する段階をさらに
    含んで成る特許請求の範囲第47項記載の方法。
  54. 【請求項５４】前記誘導体を凍結乾燥する段階をさらに
    含んで成る特許請求の範囲第48項記載の方法。
  55. 【請求項５５】前記誘導体を凍結乾燥する段階をさらに
    含んで成る特許請求の範囲第49項記載の方法。
  56. 【請求項５６】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第41項記載の方法。
  57. 【請求項５７】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第42項記載の方法。
  58. 【請求項５８】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第43項記載の方法。
  59. 【請求項５９】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第44項記載の方法。
  60. 【請求項６０】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第45項記載の方法。
  61. 【請求項６１】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第46項記載の方法。
  62. 【請求項６２】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第47項記載の方法。
  63. 【請求項６３】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第48項記載の方法。
  64. 【請求項６４】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第49項記載の方法。
  65. 【請求項６５】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第50項記載の方法。
  66. 【請求項６６】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第51項記載の方法。
  67. 【請求項６７】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第52項記載の方法。
  68. 【請求項６８】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第53項記載の方法。
  69. 【請求項６９】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第54項記載の方法。
  70. 【請求項７０】前記タンパク質性リガンド又はレセプタ
    ーが抗体又はその特異的結合フラグメントである特許請
    求の範囲第55項記載の方法。
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