JPH0764736B2 - ヒト精子不動化抗体結合剤 - Google Patents
ヒト精子不動化抗体結合剤Info
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- JPH0764736B2 JPH0764736B2 JP62235954A JP23595487A JPH0764736B2 JP H0764736 B2 JPH0764736 B2 JP H0764736B2 JP 62235954 A JP62235954 A JP 62235954A JP 23595487 A JP23595487 A JP 23595487A JP H0764736 B2 JPH0764736 B2 JP H0764736B2
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- sperm
- antibody
- human
- wells
- human sperm
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、ヒト精子を不動化する抗体と特異的に結合
する結合剤に関する。この発明の結合剤は、ヒト精子不
動化抗体の検出及び除去に用いることができる。
する結合剤に関する。この発明の結合剤は、ヒト精子不
動化抗体の検出及び除去に用いることができる。
［従来の技術］ 従来より、原因不明不妊婦人の十数％に、精子不動化抗
体の存在が兵庫医科大学産婦人科のグループにより報告
されている（文献：イソジマ・エス、リ・ティ・エス及
びアシタカ・ワイ、“Am.J.Obst.Gynecol.",101:677−6
83（1968）及びイソジマ・エス、ツチヤ・ケイ、コヤマ
・ケイ、タナカ・シー、ナカ・オー及びアダチ・エイ
チ、“Am.J.Obst.Gynec.112:199−207,（1972））。ま
た、同グループによりヒト精子不動化単一クローン抗体
が開発された（特願昭61−153581）。もし、このような
ヒト精子不動化抗体に特異的に結合する結合剤が存在す
れば、それを用いて該抗体を検出したり、あるいは該抗
体を人体から除去して不妊症患者の治療を行なうことが
できる。しかしながら、従来、このようなヒト精子不動
化抗体と特異的に結合する結合剤は知られていない。
体の存在が兵庫医科大学産婦人科のグループにより報告
されている（文献：イソジマ・エス、リ・ティ・エス及
びアシタカ・ワイ、“Am.J.Obst.Gynecol.",101:677−6
83（1968）及びイソジマ・エス、ツチヤ・ケイ、コヤマ
・ケイ、タナカ・シー、ナカ・オー及びアダチ・エイ
チ、“Am.J.Obst.Gynec.112:199−207,（1972））。ま
た、同グループによりヒト精子不動化単一クローン抗体
が開発された（特願昭61−153581）。もし、このような
ヒト精子不動化抗体に特異的に結合する結合剤が存在す
れば、それを用いて該抗体を検出したり、あるいは該抗
体を人体から除去して不妊症患者の治療を行なうことが
できる。しかしながら、従来、このようなヒト精子不動
化抗体と特異的に結合する結合剤は知られていない。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明の目的は、ヒト精子不動化抗体と特異
的に結合する結合剤を提供し、それによって該抗体の検
出及び除去を可能にすることである。
的に結合する結合剤を提供し、それによって該抗体の検
出及び除去を可能にすることである。
［問題点を解決するための手段］ ヒト精子に強い不動化作用及び凝集作用を持つヒト型モ
ノクローナル抗体H6−3C4（兵庫医科大学礒島らによっ
て確立されたもの）の対応抗原が精漿及び射精精子表面
に付着せる糖タンパク質であることが明らかになってき
た為、フレッド・ハチンソン・インスティテユートのハ
コモリらによって発見されているラクトノルヘキサオシ
ルセラミド（ｉ抗原）、ラクトイソオクタオシルセラミ
ド（Ｉ抗原）及びこれらの末端のシアル酸が結合した糖
鎖並びにこれらに関連ある糖鎖に反応するか否かを調べ
た結果、ある条件下で反応することが判明したので、ハ
コモリらによって作製された数種の糖鎖に対するモノク
ローナル抗体及び抗血清と、モノクローナル抗体H63C4
の反応性の性質を比較検討した。
ノクローナル抗体H6−3C4（兵庫医科大学礒島らによっ
て確立されたもの）の対応抗原が精漿及び射精精子表面
に付着せる糖タンパク質であることが明らかになってき
た為、フレッド・ハチンソン・インスティテユートのハ
コモリらによって発見されているラクトノルヘキサオシ
ルセラミド（ｉ抗原）、ラクトイソオクタオシルセラミ
ド（Ｉ抗原）及びこれらの末端のシアル酸が結合した糖
鎖並びにこれらに関連ある糖鎖に反応するか否かを調べ
た結果、ある条件下で反応することが判明したので、ハ
コモリらによって作製された数種の糖鎖に対するモノク
ローナル抗体及び抗血清と、モノクローナル抗体H63C4
の反応性の性質を比較検討した。
すなわち、本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の構
造を有する糖鎖がヒト精子不動化抗体と特異的に結合す
ることを見出しこの発明を完成した。
造を有する糖鎖がヒト精子不動化抗体と特異的に結合す
ることを見出しこの発明を完成した。
すなわち、この発明は、Gal β１→4GlcNAc β１→3Gal
β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glc（ただし、Galは
ガラクトース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンGlc
はグルコースを示し、末端のGalはシアル化されていて
もよい）の構造を含む物質から成るヒト精子不動化抗体
結合結合剤を提供する。なお、この発明は、上記抗ヒト
精子不動化ヒト型モノクローナル抗体が開発されたため
に可能となったものである。
β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glc（ただし、Galは
ガラクトース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンGlc
はグルコースを示し、末端のGalはシアル化されていて
もよい）の構造を含む物質から成るヒト精子不動化抗体
結合結合剤を提供する。なお、この発明は、上記抗ヒト
精子不動化ヒト型モノクローナル抗体が開発されたため
に可能となったものである。
［発明の効果］ この発明により、ヒト精子不動化抗体と特異的に結合す
る結合剤が提供された。この結合剤を用いて、周知の酸
素免疫分析、放射免疫分析又は競合的阻害分析法等によ
りヒト精子不動化抗体を検出することができる。また、
この発明の結合剤を適当な担体に固定し、そこにヒト精
子不動化抗体が原因の不妊症患者の血液を流通させるこ
とによって患者の体内から精子不動化抗体を除去するこ
とができ、それによって不妊症の治療が可能になる。
る結合剤が提供された。この結合剤を用いて、周知の酸
素免疫分析、放射免疫分析又は競合的阻害分析法等によ
りヒト精子不動化抗体を検出することができる。また、
この発明の結合剤を適当な担体に固定し、そこにヒト精
子不動化抗体が原因の不妊症患者の血液を流通させるこ
とによって患者の体内から精子不動化抗体を除去するこ
とができ、それによって不妊症の治療が可能になる。
［発明の具体的説明］ 上述のように、この発明の結合剤はGal β１→4GlcNAc
β１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glc−の
構造を含む。末端のGalはシアル化されていてもされて
いなくてもよい。シアル化されている場合、結合するシ
アル酸の種類や個数に限定はない。
β１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glc−の
構造を含む。末端のGalはシアル化されていてもされて
いなくてもよい。シアル化されている場合、結合するシ
アル酸の種類や個数に限定はない。
後述の実施例で明らかになるように、ヒト精子不動化抗
体は上記構造を認識するので、この発明の結合剤は、上
記構造を含むものであればよく、上記構造にいかなる構
造、例えば他の糖鎖、脂質、タンパク質、ペプチド等が
結合したものであってもよく、また、人工又は天然のポ
リマーやガラス等の担体に結合されていてもよい。さら
に、上記構造中の糖に、ヒト精子不動化抗体との結合に
影響を与えない置換基が導入されていてもよく、このよ
うな置換体も上記構造式に包含されるものとする。
体は上記構造を認識するので、この発明の結合剤は、上
記構造を含むものであればよく、上記構造にいかなる構
造、例えば他の糖鎖、脂質、タンパク質、ペプチド等が
結合したものであってもよく、また、人工又は天然のポ
リマーやガラス等の担体に結合されていてもよい。さら
に、上記構造中の糖に、ヒト精子不動化抗体との結合に
影響を与えない置換基が導入されていてもよく、このよ
うな置換体も上記構造式に包含されるものとする。
この発明の結合剤は、当業者によって容易に化学合成す
ることができ、例えば、ニーマン・エイチ、ワタナベ・
ケイ、ハコモリ・エス、チャイルズ・アール・エイ及び
フェイジ・ティー、“Biochem.Biophys.Res.Commun.81:
1286,1978）に記載されている。
ることができ、例えば、ニーマン・エイチ、ワタナベ・
ケイ、ハコモリ・エス、チャイルズ・アール・エイ及び
フェイジ・ティー、“Biochem.Biophys.Res.Commun.81:
1286,1978）に記載されている。
次に、この発明の結合剤の使用方法を説明する。上述の
ように、この発明の結合剤はヒト精子不動化抗体を検出
するための検出試薬として、また、該抗体を除去するた
めの結合剤として用いることができる。抗体に対する抗
原又はハプテンを利用してその抗体を検出、定量する方
法は免疫分析の分野において周知であり、例えば周知の
酵素免疫分析や放射免疫分析により行なうことができ
る。例えば、この発明の結合剤を適当な担体に固定化
し、これと検体とを接触させた後、適当な酵素や放射性
同位体で標識した抗ヒト免疫グロブリンを反応させてそ
の標識を検出することにより、ヒト精子不動化抗体が検
出、定量することができる。また、この発明の結合剤を
担体に固定化し、この固定化結合剤上に患者の血液を流
通させて血液中の精子不動化抗体を固定化結合剤に結合
させることによって患者の体内から精子不動化抗体を除
去することができる。なお、この発明の結合剤の担体へ
の結合は当業者が容易に行なうことができる。
ように、この発明の結合剤はヒト精子不動化抗体を検出
するための検出試薬として、また、該抗体を除去するた
めの結合剤として用いることができる。抗体に対する抗
原又はハプテンを利用してその抗体を検出、定量する方
法は免疫分析の分野において周知であり、例えば周知の
酵素免疫分析や放射免疫分析により行なうことができ
る。例えば、この発明の結合剤を適当な担体に固定化
し、これと検体とを接触させた後、適当な酵素や放射性
同位体で標識した抗ヒト免疫グロブリンを反応させてそ
の標識を検出することにより、ヒト精子不動化抗体が検
出、定量することができる。また、この発明の結合剤を
担体に固定化し、この固定化結合剤上に患者の血液を流
通させて血液中の精子不動化抗体を固定化結合剤に結合
させることによって患者の体内から精子不動化抗体を除
去することができる。なお、この発明の結合剤の担体へ
の結合は当業者が容易に行なうことができる。
［発明の実施例］ I.ヒト精子不動化ヒト型単一クローン抗体の調製リンパ
球の採取 強い精子不動化及び精子凝集抗体を有する、15年以上不
妊の39歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通常の
医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中に高
力価の精子不動化及び精子凝集抗体が存在することを除
き、他に合理的な不妊の原因は発見されなかった。彼女
の血清中の抗体力価は、精子不動化価がSI50として45.0
（礒島と香山、Quantitative estimation of sperm imm
obilizing antibody in the sera of woman with steri
lity of unknown etiology:the 50％ sperm immobiliza
tion unit（SI50）.In Recent Advances in Human Repr
oduction（Campos daPaz,.A.,Drill,V.A.,Hyashi,H.,Re
drigues,W.and Schally,A.V.eds）,pp10−15,ExcerptaM
edica,Amsterdam; 1976）、精子凝集値が1:32希釈（Fri
berg,J.（1974）.A simple and sensitive micromethod
for demonstration of sperm−agglutinating activit
y in serum frominfertile men and women.Acta Obste
t.Gynecol.Scand.Suppl.36:21−29）であった。末梢血
リンパ球は、フィコール−コンレー密度勾配遠心により
単離した。
球の採取 強い精子不動化及び精子凝集抗体を有する、15年以上不
妊の39歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通常の
医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中に高
力価の精子不動化及び精子凝集抗体が存在することを除
き、他に合理的な不妊の原因は発見されなかった。彼女
の血清中の抗体力価は、精子不動化価がSI50として45.0
（礒島と香山、Quantitative estimation of sperm imm
obilizing antibody in the sera of woman with steri
lity of unknown etiology:the 50％ sperm immobiliza
tion unit（SI50）.In Recent Advances in Human Repr
oduction（Campos daPaz,.A.,Drill,V.A.,Hyashi,H.,Re
drigues,W.and Schally,A.V.eds）,pp10−15,ExcerptaM
edica,Amsterdam; 1976）、精子凝集値が1:32希釈（Fri
berg,J.（1974）.A simple and sensitive micromethod
for demonstration of sperm−agglutinating activit
y in serum frominfertile men and women.Acta Obste
t.Gynecol.Scand.Suppl.36:21−29）であった。末梢血
リンパ球は、フィコール−コンレー密度勾配遠心により
単離した。
リンパ球の刺激 PWMレクチン（終濃度1:100、米国ギブコ社製）と10％ウ
シ胎児血清（FCS）とを含む15mlのRPMI 1640培地に、採
取したリンパ球1.0x107個と、健常人からの洗浄した精
子5x106個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレ
ート（米国コーニング社製、コーニング−25820）の15
のウェルに分注し、５％ CO2インキュベーター中で37℃
で５日間培養した。培養後、個々のウェルから採取され
た刺激されたリンパ球をプールし、２回洗い、10mlのRP
MI 1640培地中に懸濁した。この刺激操作後、トリパン
ブルー染色法により調べたところ、58％のリンパ球が生
存していた。
シ胎児血清（FCS）とを含む15mlのRPMI 1640培地に、採
取したリンパ球1.0x107個と、健常人からの洗浄した精
子5x106個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレ
ート（米国コーニング社製、コーニング−25820）の15
のウェルに分注し、５％ CO2インキュベーター中で37℃
で５日間培養した。培養後、個々のウェルから採取され
た刺激されたリンパ球をプールし、２回洗い、10mlのRP
MI 1640培地中に懸濁した。この刺激操作後、トリパン
ブルー染色法により調べたところ、58％のリンパ球が生
存していた。
細胞融合 繁田らの方法（Sperm−immobilizing monoclonal antib
ody to human seminal plasma antigens.Clin.Exp.Immu
nol.42:458−462（1980））に従い、分子量の1000のポ
リエチレングリコールの存在下で、先に得られた刺激さ
れた生きているリンパ球5.3x106個と、同数のマウスミ
エローマ細胞（P3−NS−1/1.Ag.4: NS−１）とを融合し
た。100μｌの融合細胞を96個のウェルのそれぞれに入
れ、５％ CO2インキュベーター中で37℃で培養した。96
個のウェルのうち27個にはウェル当たり１×105個のリ
ンパ球のみを収容し、他の69個のウェルにはウェル当た
り４×104個のリンパ球と、支持細胞層として6x105個の
マウス胸腺細胞を収容した。培養24時間後に培地をHAT
選択培地に変え、培養12、19、及び23日後に個々のウェ
ルの上清を後述するサンドイッチ酵素免疫分析法により
試験してヒト免疫グロブリンを産生しているかどうか調
べた。培養23日後では、支持細胞層を用いない27ウェル
のうち14ウェルで、支持細胞層を用いた69ウェルのうち
44ウェルで細胞の増殖が認められた。
ody to human seminal plasma antigens.Clin.Exp.Immu
nol.42:458−462（1980））に従い、分子量の1000のポ
リエチレングリコールの存在下で、先に得られた刺激さ
れた生きているリンパ球5.3x106個と、同数のマウスミ
エローマ細胞（P3−NS−1/1.Ag.4: NS−１）とを融合し
た。100μｌの融合細胞を96個のウェルのそれぞれに入
れ、５％ CO2インキュベーター中で37℃で培養した。96
個のウェルのうち27個にはウェル当たり１×105個のリ
ンパ球のみを収容し、他の69個のウェルにはウェル当た
り４×104個のリンパ球と、支持細胞層として6x105個の
マウス胸腺細胞を収容した。培養24時間後に培地をHAT
選択培地に変え、培養12、19、及び23日後に個々のウェ
ルの上清を後述するサンドイッチ酵素免疫分析法により
試験してヒト免疫グロブリンを産生しているかどうか調
べた。培養23日後では、支持細胞層を用いない27ウェル
のうち14ウェルで、支持細胞層を用いた69ウェルのうち
44ウェルで細胞の増殖が認められた。
酵素免疫分析によるヒト免疫グロブリンの検出 サンドイッチ酵素免疫分析に用いる全ての結合剤は米国
キャペルラボラトリーズ製のものであった。ポリビニル
プレート（米国、ファルコン−3912）の96個のウェル
を、0.05M重炭酸緩衝液（pH9.6）中ウサギ抗ヒト免疫グ
ロブリン（IgG＋IgA＋IgM）抗血清IgG分画（タンパク濃
度0.8μg/100μl/ウェル）でコーティングし、４℃で一
夜培養した。プレートの未結合領域は１％ウシ血清アル
ブミン（BSA）と５％正常ウマ血清とを含む0.15Mリン酸
緩衝液（pH7.4）（ブロッキング溶液）をウェルに入れ
て室温で１時間インキュベートすることによってブロッ
クした。0.05％のTween20を含むリン酸緩衝液でウェル
を洗った後、50μｌの培養上清を加え、室温で２時間培
養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清から作られたＦ
（ab′）２をパーオキシダーゼで標識したものをブロッ
キング溶液で1:4000に希釈したものを50μｌをウェルに
加えた。室温で１時間インキュベートした後プレートを
洗い、0.005％ H2O2を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.
0）中オルソフェニレンジアミン（和光純薬工業社製）
を終濃度0.02％となるように加えた。反応は50μｌの10
％ H2SO4を加えることによって停止し、マイクロプレー
ト光度計（MTP 12,コロナ電機社製）で測定した。その
結果、増殖が認められた上記58ウェルのうち、22ウェル
からヒト免疫グロブリンが検出された。
キャペルラボラトリーズ製のものであった。ポリビニル
プレート（米国、ファルコン−3912）の96個のウェル
を、0.05M重炭酸緩衝液（pH9.6）中ウサギ抗ヒト免疫グ
ロブリン（IgG＋IgA＋IgM）抗血清IgG分画（タンパク濃
度0.8μg/100μl/ウェル）でコーティングし、４℃で一
夜培養した。プレートの未結合領域は１％ウシ血清アル
ブミン（BSA）と５％正常ウマ血清とを含む0.15Mリン酸
緩衝液（pH7.4）（ブロッキング溶液）をウェルに入れ
て室温で１時間インキュベートすることによってブロッ
クした。0.05％のTween20を含むリン酸緩衝液でウェル
を洗った後、50μｌの培養上清を加え、室温で２時間培
養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清から作られたＦ
（ab′）２をパーオキシダーゼで標識したものをブロッ
キング溶液で1:4000に希釈したものを50μｌをウェルに
加えた。室温で１時間インキュベートした後プレートを
洗い、0.005％ H2O2を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.
0）中オルソフェニレンジアミン（和光純薬工業社製）
を終濃度0.02％となるように加えた。反応は50μｌの10
％ H2SO4を加えることによって停止し、マイクロプレー
ト光度計（MTP 12,コロナ電機社製）で測定した。その
結果、増殖が認められた上記58ウェルのうち、22ウェル
からヒト免疫グロブリンが検出された。
酵素免疫分析による抗精子抗体の検出 96ウェルのポリビニルプレート（ファルコン−3912）を
洗浄したヒト精子でコーティングした。コーティング
は、50μｌの精子懸濁液（６×106/ml）を個々のウェル
に加え、室温で空気乾燥することによって行なった。プ
レートは使用時まで４℃で貯蔵した。１％ BSAと２％正
常ウマ血清とを含むリン酸緩衝液を個々のウェルに加
え、室温で１時間保持してウェルのタンパク結合領域を
ブロックした。リン酸緩衝液で洗った後、50μｌの培養
上寄与を精子でコートされたウェルに加え、室温で１時
間インキュベートした。その後、先に述べた免疫グロブ
リンの検出と全く同様にして抗ヒト精子抗体を検出し
た。その結果、ヒト免疫グロブリンが検出された22ウェ
ルのうち１つのウェルから抗ヒト精子精子抗体が検出さ
れた。この抗体をH6−3C4抗体と命名した。
洗浄したヒト精子でコーティングした。コーティング
は、50μｌの精子懸濁液（６×106/ml）を個々のウェル
に加え、室温で空気乾燥することによって行なった。プ
レートは使用時まで４℃で貯蔵した。１％ BSAと２％正
常ウマ血清とを含むリン酸緩衝液を個々のウェルに加
え、室温で１時間保持してウェルのタンパク結合領域を
ブロックした。リン酸緩衝液で洗った後、50μｌの培養
上寄与を精子でコートされたウェルに加え、室温で１時
間インキュベートした。その後、先に述べた免疫グロブ
リンの検出と全く同様にして抗ヒト精子抗体を検出し
た。その結果、ヒト免疫グロブリンが検出された22ウェ
ルのうち１つのウェルから抗ヒト精子精子抗体が検出さ
れた。この抗体をH6−3C4抗体と命名した。
また、同じウェルの上清中には礒島等の微量精子不動変
試験（イソジマ・エス及びコウヤマ・ケイ、“Microtec
hnique of spermimmobilization test" In Immunology
of Reproduction（Bratanov Kら編）、pp.215−219,Bul
garian Academy of Science,Sofia,1979）によって精子
不動化抗体活性も認められた。
試験（イソジマ・エス及びコウヤマ・ケイ、“Microtec
hnique of spermimmobilization test" In Immunology
of Reproduction（Bratanov Kら編）、pp.215−219,Bul
garian Academy of Science,Sofia,1979）によって精子
不動化抗体活性も認められた。
抗ヒト精子抗体産生細胞のクローニング 抗ヒト精子抗体が検出されたウェル中のハイブリドーマ
を、15％ FCSを含むRPMI 1640培地中で6x105/ウェルの
マウス胸腺細胞と共に37℃で５％ CO2インキュベート中
で培養した。培養は、96ウェルコーニングプラスチック
プレートの第１列の８つのウェルに約1x103ハイブリド
ーマ／ウェルの濃度に上記培養液を入れ、１列ごとに1:
2に段階希釈して行なった。従って最後の列は1:211に希
釈された。培養17日後、96ウェルのうち４つのウェルで
細胞の増殖が認められ、そのうちの２つで強い精子不動
変抗体が検出された。そのうちの１つのウェルからハイ
ブリドーマを採取し、先に行なったのと全く同様にして
第２回目のクローニングを行なった。その結果、96のウ
ェルのうち46のウェルで細胞の増殖が認められ、そのう
ちの42のウェルで精子不動化抗体の産生が認められた。
42のウェルのうち、精子不動化抗体価の最も高かったウ
ェルからハイブリドーマを採取し、第３回目のクローニ
ングを同様にして行なった。その結果、96のウェルのう
ち56のウェルで細胞の増殖が認められ、56のウェルの全
てで強い精子不動化抗体が検出された。これらのウェル
のうちの１つを取り、以下の実験に用いた。なお、この
ハイブリドーマは兵庫医科大学において２年間安定に培
養されている。
を、15％ FCSを含むRPMI 1640培地中で6x105/ウェルの
マウス胸腺細胞と共に37℃で５％ CO2インキュベート中
で培養した。培養は、96ウェルコーニングプラスチック
プレートの第１列の８つのウェルに約1x103ハイブリド
ーマ／ウェルの濃度に上記培養液を入れ、１列ごとに1:
2に段階希釈して行なった。従って最後の列は1:211に希
釈された。培養17日後、96ウェルのうち４つのウェルで
細胞の増殖が認められ、そのうちの２つで強い精子不動
変抗体が検出された。そのうちの１つのウェルからハイ
ブリドーマを採取し、先に行なったのと全く同様にして
第２回目のクローニングを行なった。その結果、96のウ
ェルのうち46のウェルで細胞の増殖が認められ、そのう
ちの42のウェルで精子不動化抗体の産生が認められた。
42のウェルのうち、精子不動化抗体価の最も高かったウ
ェルからハイブリドーマを採取し、第３回目のクローニ
ングを同様にして行なった。その結果、96のウェルのう
ち56のウェルで細胞の増殖が認められ、56のウェルの全
てで強い精子不動化抗体が検出された。これらのウェル
のうちの１つを取り、以下の実験に用いた。なお、この
ハイブリドーマは兵庫医科大学において２年間安定に培
養されている。
このハイブリドーマを24ウェルのプラスチックプレート
（コーニング−25820）に移し37℃で５％ CO2インキュ
ベート中で培養した。細胞が増殖した後、培養物を組織
培養フラスコ（コーニング−25100と25110）に広げて培
養した。この培養物からヒト精子不動化ヒト単一クロー
ン抗体を採取した。
（コーニング−25820）に移し37℃で５％ CO2インキュ
ベート中で培養した。細胞が増殖した後、培養物を組織
培養フラスコ（コーニング−25100と25110）に広げて培
養した。この培養物からヒト精子不動化ヒト単一クロー
ン抗体を採取した。
抗体吸収試験 このヒト精子不動化ヒト単一クローン抗体の特異性を調
べるために抗体吸収試験を行なった。抗体吸収試験は、
種々の組織抽出液（ホモジネート上清）、体液、種々の
動物の精子を免疫吸収体として用いてこのハイブリドー
マの培養上清を吸収し、残遊する抗体活性を精子不動化
試験により求めることによって行なった。正常ヒト血清
の10％生理食塩水溶液で適当に希釈した培養上清10μｌ
を、100μｌの段階希釈した免疫吸収体と混合し、この
混合物を４℃で一液インキュベートした。試験の前に予
め培養上清の抗体活性をSI50値で約10単位に調節した。
インキュベート後、上清を遠心分離し（9500g,30分）、
精子不動化値を調べた。ヒト精液（HAS）、ヒト母乳（H
M）及び正常ヒト血清（NHS）は硫酸アンモニウムで沈殿
させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。精
嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結乾
燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水に
溶解した。動物の精子は３回生理食塩水で洗った後免疫
吸収試験に用いた。結果を第１表に示す。
べるために抗体吸収試験を行なった。抗体吸収試験は、
種々の組織抽出液（ホモジネート上清）、体液、種々の
動物の精子を免疫吸収体として用いてこのハイブリドー
マの培養上清を吸収し、残遊する抗体活性を精子不動化
試験により求めることによって行なった。正常ヒト血清
の10％生理食塩水溶液で適当に希釈した培養上清10μｌ
を、100μｌの段階希釈した免疫吸収体と混合し、この
混合物を４℃で一液インキュベートした。試験の前に予
め培養上清の抗体活性をSI50値で約10単位に調節した。
インキュベート後、上清を遠心分離し（9500g,30分）、
精子不動化値を調べた。ヒト精液（HAS）、ヒト母乳（H
M）及び正常ヒト血清（NHS）は硫酸アンモニウムで沈殿
させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。精
嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結乾
燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水に
溶解した。動物の精子は３回生理食塩水で洗った後免疫
吸収試験に用いた。結果を第１表に示す。
第 １ 表 H6−3C4単一クローン抗体の特性 免疫グロブリンクラス IgM（λ） 生物学的活性 精子不動化 ＋ （5000 SI50） 精子凝集 ＋ （1:1600 希釈） ヒト組織に対する特異性 射精精子 ＋ 精液 ＋ 母乳タンパク質 − 血清タンパク質 − 睾丸 − 精巣上体 定かでない 精嚢貯蔵液 ＋ 前立腺 ± 肝臓 − 脾臓 − 脳 − Ｂ型赤血球 − 白血球 − 無精子症患者精漿 ＋ 精嚢腺分泌液 ＋ これらの結果から、上記ヒト精子不動化ヒト単一クロー
ン抗体の対応抗原は、男性副性器より分泌され精子に付
着するいわゆる精子被覆抗原（sperm coating antige
n）であると判定される。
ン抗体の対応抗原は、男性副性器より分泌され精子に付
着するいわゆる精子被覆抗原（sperm coating antige
n）であると判定される。
また、上記単一クローン抗体の種特異性（精子に対する
反応性）は以下の通りである。
反応性）は以下の通りである。
ブタ ± ウシ − ヤギ − ウサギ − ハムスター − ラット − H6−3C4抗体の対応抗原が精子付着抗原で、精漿中にも
存在することが明らかとなったので、精漿を用いてH6−
3C4対応抗原の性状分析を行なった。抗原活性は精漿の1
00％飽和硫安沈殿分画に存在し、セファクリルＳ−300
（商品名）によるゲルろ過では分子量670kd以上の高分
子分画に溶出されたが、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動では分子量約20kd付近に泳動された。
存在することが明らかとなったので、精漿を用いてH6−
3C4対応抗原の性状分析を行なった。抗原活性は精漿の1
00％飽和硫安沈殿分画に存在し、セファクリルＳ−300
（商品名）によるゲルろ過では分子量670kd以上の高分
子分画に溶出されたが、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動では分子量約20kd付近に泳動された。
セファクリルＳ−300ゲルろ過分画により部分精製したH
6−3C4対応精漿抗原分画を用いてその抗原エピトープの
性状を分析した。抗原活性は熱処理（100℃、30分）に
抵抗を示したが、過ヨウ素酸処理により抗原性が減少し
た。また、タンパク質分解酵素処理に対してはプロナー
ゼ、パパイン処理でわずかに抗原性が減少したもののト
リプシン、α−キモトリプシン、ペプシン処理に対して
は抵抗性を示した。以上の結果を第２表にまとめて示
す。
6−3C4対応精漿抗原分画を用いてその抗原エピトープの
性状を分析した。抗原活性は熱処理（100℃、30分）に
抵抗を示したが、過ヨウ素酸処理により抗原性が減少し
た。また、タンパク質分解酵素処理に対してはプロナー
ゼ、パパイン処理でわずかに抗原性が減少したもののト
リプシン、α−キモトリプシン、ペプシン処理に対して
は抵抗性を示した。以上の結果を第２表にまとめて示
す。
この結果、H6−3C4対応抗原の抗原エピトープ形成に糖
鎖の関与を強く示すものである。
鎖の関与を強く示すものである。
第 ２ 表 H6−3C4抗体の対応抗原の性質 分子量：セファクリルＳ−300（商品名）ゲルろ過 670 kd SDS−PAGE:約20kd 各種抗原処理に対する抗原の感受性 熱処理 − 過ヨウ素酸 ＋ 蛋白分解酵素 プロナーゼ ± パパイン ± トリプシン − α−キモトリプシン − ペプシン − II.ヒト精子不動化抗体と糖鎖との結合 糖脂質の合成 下記第３表に示す種々の糖脂質を合成した。
ラクトネオテトラオシルセラミド及びそのシアル化誘導
体は、ワタナベ・ケイ、ポウェル・エム・イー及びハコ
モリ・エス、“J.Biol.Chem.",254:8223,1979に記載さ
れた方法により合成した。ラクトノルヘキサオシルセラ
ミド及びそのシアリル２→３誘導体は、ニーマン・エイ
チ、ワタナベ・ケイ、ハコモリ・エス、チャイルズ・ア
ール・エイ及びフェイジ・ティー、“Biochem.Biophys.
Res.Commun.81:1286,1978に記載された方法により合成
した。シアリル２→２ラクトノルヘキサオシルセラミド
は上記ワタナベらの文献に記載された方法により合成し
た。ラクトイソオクタオシルセラミド及びそのシアル化
誘導体はワタナベ・ケイ、ハコモリ・エス、チャイルズ
・アール・エイ及びフェイジ・ティ、“J.Biol.Chem"25
4:3221,1979及びオカダ・ワイ、カンナギ・アール、レ
ベッリー・エス・ビー及びハコモリ・エス、“J.Immuno
l." 133:835,1984に記載された方法により、ヒト及びウ
シ赤血球から調製した。
体は、ワタナベ・ケイ、ポウェル・エム・イー及びハコ
モリ・エス、“J.Biol.Chem.",254:8223,1979に記載さ
れた方法により合成した。ラクトノルヘキサオシルセラ
ミド及びそのシアリル２→３誘導体は、ニーマン・エイ
チ、ワタナベ・ケイ、ハコモリ・エス、チャイルズ・ア
ール・エイ及びフェイジ・ティー、“Biochem.Biophys.
Res.Commun.81:1286,1978に記載された方法により合成
した。シアリル２→２ラクトノルヘキサオシルセラミド
は上記ワタナベらの文献に記載された方法により合成し
た。ラクトイソオクタオシルセラミド及びそのシアル化
誘導体はワタナベ・ケイ、ハコモリ・エス、チャイルズ
・アール・エイ及びフェイジ・ティ、“J.Biol.Chem"25
4:3221,1979及びオカダ・ワイ、カンナギ・アール、レ
ベッリー・エス・ビー及びハコモリ・エス、“J.Immuno
l." 133:835,1984に記載された方法により、ヒト及びウ
シ赤血球から調製した。
糖脂質とヒト精子不動化抗体との結合試験 上記ヒト精子不動化抗体と上記各種糖脂質との結合性を
試験した。結果を下記第４表に示す。
試験した。結果を下記第４表に示す。
第４表より、上記ヒト精子不動化抗体は、糖脂質ｉ（Ga
l β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal
β１→4Glc−セラミド）及びその末端のGalがシアル化
されたものに特異的に結合することがわかる。また、上
記糖脂質ｉにフコースが結合して糖鎖骨格がねじれたも
の（糖脂質H2及びLex）とは結合しないことから、ヒト
精子不動化抗体は、上記糖鎖構造を特異的に認識してい
ることがわかる。さらに、糖脂質ｉと結合することが知
られているDench血清は末端のGalがシアル化されたもの
とは結合しないことから、上記ヒト精子不動化抗体は、
末端のシアル酸の結合の有無に影響されない、ｉ分子上
の深部のエピトープ、すなわち、Gal β１→4GlcNAcβ
１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glcの構造
を横から見渡す方向より認識しており、これがエピトー
プの最小構成単位であることがわかる。
l β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal
β１→4Glc−セラミド）及びその末端のGalがシアル化
されたものに特異的に結合することがわかる。また、上
記糖脂質ｉにフコースが結合して糖鎖骨格がねじれたも
の（糖脂質H2及びLex）とは結合しないことから、ヒト
精子不動化抗体は、上記糖鎖構造を特異的に認識してい
ることがわかる。さらに、糖脂質ｉと結合することが知
られているDench血清は末端のGalがシアル化されたもの
とは結合しないことから、上記ヒト精子不動化抗体は、
末端のシアル酸の結合の有無に影響されない、ｉ分子上
の深部のエピトープ、すなわち、Gal β１→4GlcNAcβ
１→3Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glcの構造
を横から見渡す方向より認識しており、これがエピトー
プの最小構成単位であることがわかる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 15/12 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｚ 7433−4Ｃ (72)発明者 礒島 晋三 兵庫県西宮市武庫川町１番１号 兵庫医科 大学内 (72)発明者 箱守 仙一郎 アメリカ合衆国ワシントン州98119・シア トル・エリオット・アベニュー・ウェス ト・201・スート・305 ザ・バイオメンブ レン・インスティテユート内 (72)発明者 辻 芳之 兵庫県西宮市武庫川町１番１号 兵庫医科 大学内 (56)参考文献 特開 昭63−8400（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】Gal β１→4GlcNAcβ１→3Gal β１→4Glc
NAcβ１→3Gal β１→4Glc−（ただし、Galはガラクト
ース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミンGlcはグルコ
ースを示し、末端のGalはシアル化されていてもよい）
の構造を含む物質から成るヒト精子不動化抗体結合剤。 - 【請求項２】末端のGalが2,3−ジシアル化されている特
許請求の範囲第１項記載の結合剤。 - 【請求項３】末端のGalが2,6−ジシアル化されている特
許請求の範囲第１項記載の結合剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62235954A JPH0764736B2 (ja) | 1987-09-19 | 1987-09-19 | ヒト精子不動化抗体結合剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62235954A JPH0764736B2 (ja) | 1987-09-19 | 1987-09-19 | ヒト精子不動化抗体結合剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6479120A JPS6479120A (en) | 1989-03-24 |
| JPH0764736B2 true JPH0764736B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=16993672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62235954A Expired - Lifetime JPH0764736B2 (ja) | 1987-09-19 | 1987-09-19 | ヒト精子不動化抗体結合剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0764736B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101916959B1 (ko) * | 2015-07-13 | 2018-11-08 | 김동구 | 정자의 성 감별용 항체 및 이의 용도 |
-
1987
- 1987-09-19 JP JP62235954A patent/JPH0764736B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6479120A (en) | 1989-03-24 |
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