JPH0765996B2 - 血液のインターフェロン−γ産生能測定方法 - Google Patents

血液のインターフェロン−γ産生能測定方法

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JPH0765996B2 JP59280697A JP28069784A JPH0765996B2 JP H0765996 B2 JPH0765996 B2 JP H0765996B2 JP 59280697 A JP59280697 A JP 59280697A JP 28069784 A JP28069784 A JP 28069784A JP H0765996 B2 JPH0765996 B2 JP H0765996B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液のインターフェロン−γ産生能を測定す
る方法に関する。
近年、採血した血液中に存在する酵素またはその代謝産
物などを測定する臨床化学的検査方法が広く行なわれる
ようになってきた。
血液中の一成分であるインターフェロン−γも、その抗
ウィルス性、抗腫瘍性などから検査項目に加えることが
考えられている。しかしながら、実際には、血液中に含
まれているインターフェロン−γが微量であることなど
から今だ実現していない。
そこで、本発明者は、採血した血液に含まれるインター
フェロン−γを直接測定するのではなく、採血した血液
のインターフェロン−γ産生能を測定することに着目し
鋭意研究した。
血液は、赤血球、白血球、血小板などの有形成分が液体
成分である血漿中に浮遊液を形成しているものであり、
血液１mm3中には、通常、赤血球が男性の場合5.4×106
個、女性の場合4.8×106個、白血球が成人の場合7,400
個、血小板が300,000個含まれている。
インターフェロン−γは白血球により産生されることが
知られている。
従来、ヒト血液からインターフェロン−γを産生するに
は、血液から分離した白血球を用いている。例えば、Y.
K.YIP et al.,Infection and Immunity,Vol.34,No.1,13
1-139（1981）、Tadashi KASAHARA et al.,The Journal
of Immunology,Vol.130,No.4,1784-1789（1983）など
の記載からも明らかなように、血液から他の成分を除去
し、白血球を採取して、この白血球からインターフェロ
ン−γを産生させている。
しかしながら、これらの方法を詳細に検討したところ、
血液からの白血球の回収率が30〜50％程度と低いばかり
でなく、その分離操作により白血球がダメージを受け、
その生残率を40〜60％に低下させ、結果として、血液か
らの白血球の有効回収率が約10〜30％にも低下し、更に
は、採取した白血球からのインターフェロン−γ産生量
が一定しないなどの理由により、血液からのインターフ
ェロン−γ産生能を推定することはきわめて困難である
ことが判明した。
本発明者は、採血した血液を用いてインターフェロン−
γ産生能を測定すべく研究を続けたところ、全血を抗凝
血剤及びミトーゲンと接触せしめ、容器中でインキュベ
ートし、生成したインターフェロン−γを測定すること
により、その血液のインターフェロン−γ産生能がきわ
めて容易に安定して測定できることを見いだし、本発明
を完成した。
更に、詳細に検討を加えたところ、ミトーゲンを全血ml
当り10〜10,000μｇの範囲で接触せしめるのが好適であ
ることが判明した。
本発明で、全血とは、採血した血液、またはその血液か
ら液体成分の血漿を除去して得られる全有形成分を他の
液体、例えば生理食塩水、緩衝液、栄養培地などに浮遊
させた液をいう。
抗凝血剤としては、全血の凝固を防止でき、かつインタ
ーフェロン−γの産生、測定に悪影響のないものであれ
ばよく、例えば、ヘパリン、ACD、CPDなどが適宜使用さ
れる。
また、本発明に使用されるミトーゲンは、全血からイン
ターフェロン−γを誘導産生しうる、例えば、フィトヘ
マグルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウィードミト
ーゲン、スタフィロコッカスエンテロトキシン（SE
A）、リポポリサッカリド、エンドトキシン、β−グル
カン、アラビノガラクタンなどの多糖類、シュードモナ
ス属、コリネバクテリウム属などの細菌などが適宜使用
される。
なかでも、フィトヘマグルチニンは、比較的短時間、通
常10〜30時間程度で高活性のインターフェロン−γを誘
導産生しうることを見いだした。
ミトーゲンの使用量としては、全血ml当り10〜10,000μ
ｇの範囲が好適である。
また、必要ならば、ウィルス、核酸などのインターフェ
ロン−α誘導剤を共存させて、インターフェロン−γの
産生量を高めたり、インターフェロン−γとともにイン
ターフェロン−αを同時に産生させることも自由であ
る。
全血を抗凝血剤及びミトーゲンと接触せしめ、容器中で
インキュベートするときは、全血に抗凝血剤及びミトー
ゲンを接触せしめて容器中でインターフェロン−γの産
生ができればよく、その操作手順としては、例えば、予
め所定の抗凝血剤及びミトーゲンを入れた容器中に適量
の全血を加えてインキュベートしてもよく、また、抗凝
血剤と全血との混合液を容器に入れ、これにミトーゲン
を加えてインキュベートしてもよい。また、必要なら
ば、インキュベートに際して、全血、抗凝血剤、ミトー
ゲンとともに例えば、生理食塩水、等張緩衝液、栄養培
地などを共存せしめてもよい。
使用される容器としては、その形状、容量の大小を問わ
ず、フラスコ、試験管、アンプル、マイクロプレートウ
ェルなど適宜選択できる。
インキュベート条件としては、インターフェロン−γが
産生できる条件であればよく、例えば30〜40℃に10〜90
時間程度保てばよい。
このようにしてインキュベートしインターフェロン−γ
を産生した全血は、そのままで、または必要により生理
食塩水、等張の緩衝液などで適宜希釈した後、遠心分離
または過などの分離操作により血球などの有形成分を
除去した上清または液がインターフェロン−γの測定
に供される。
インターフェロン−γの測定方法は、用いた全血からの
インターフェロン−γ産生量が測定できる方法であれば
よく、例えば、バイオ アッセイ法（Bio Assay）、放
射免疫測定法（Radio Immuno Assay）、酵素免疫測定法
（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）などの方法が
適宜採用できる。
近年、測定が簡便であり、迅速であり、安全性の高い測
定法として酵素免疫測定法が開発されている。酵素免疫
測定法の場合には、インターフェロン−γが抗原として
測定できる方法であればよく、例えば、二抗体サンドイ
ッチ法、変法二抗体サンドイッチ法などが適宜選択でき
る。
このようにして測定されるインターフェロン−γ産生能
は、採血した個人の臨床化学検査に充分応用できること
が判明した。
また、本発明の方法によって、癌患者から採血した血液
のインターフェロン−γ産生能が、健常者のそれと比較
してきわめて低いことも判明した。
以下、実験で本発明を説明する。
実験１ インターフェロン−γ産生能に及ぼす血液の処
理の有無の影響 インターフェロン−γ産生能に及ぼす血液の処理の有無
の影響を調べた。使用した血液は、健常者３名から採血
したヘパリン加新鮮血を用いた。
処理血液としては、血液を遠心分離し液体成分血漿を除
去して得られる全有形成分をRPMI1640培地で血液と同濃
度に浮遊させた血漿除去浮遊液、及び血液を常法に従っ
て0.75％塩化アンモニウム含有トリス塩酸緩衝液（pH7.
2）で処理し、赤血球を溶血させ、遠心分離して採取さ
れる赤血球を除去した有形成分をRPMI1640培地で血液と
同濃度に浮遊させた塩化アンモニウム処理液を用いた。
血液または処理血液1mlをプラスチック製試験管にと
り、これにフィトヘマグルチニン−Ｐを０、50、500μ
ｇ含む生理食塩水0.1mlずつを加え、37℃で24時間イン
キュベートした。次いで、遠心分離して得られる上清を
用いて、血液1ml当りのインターフェロン−γ活性を測
定し、血液のインターフェロン−γ産生能とした。
インターフェロン−γの活性は、ヒトインターフェロン
−γの放射免疫測定用キット（英国、セルテック社製
造、商品名GAMMA INTERFERON IRMA KIT）を用いて測定
した。
結果は、第１表に示す。
第１表の結果から明らかなように、血液または血液中の
全有形成分を含んだ血漿除去浮遊液の場合がインターフ
ェロン−γ産生能が高く、その値が安定していることに
より、インターフェロン−γ産生能測定用試料として好
適である。赤血球を溶血除去した塩化アンモニウム処理
浮遊液の場合には、インターフェロン−γ産生能が低
く、その値も一定しないことが判明した。
実験２ インターフェロン−γ産生能に及ぼすミトーゲ
ン量の影響 インターフェロン−γ産生能に及ぼすミトーゲン量の影
響を調べた。使用した血液は、健常者３名、癌患者（肝
癌、胃癌患者各１名）から採取したヘパリン加新鮮血を
用いた。実験１の方法に従って、血液1mlを試験管にと
り、これにミトーゲンとしてフィトヘマグルチニン−Ｐ
を０、１、10、100、1,000、10,000μｇ含む生理食塩水
0.1mlずつを加え、インキュベートした後、血液1ml当り
のインターフェロン−γ活性を測定し、血液のインター
フェロン−γ産生能とした。
なお、血液1ml当りフィトヘマグルチニン−P100,000μ
ｇ添加の実験をしようとしたが、これを満足するだけの
溶解がむずかしく、実施が困難であった。
結果は第２表に示す。
第２表の結果から明らかなように、ミトーゲン量は血液
ml当り10〜10,000μｇが好適である。
なお、癌患者から採血した血液のインターフェロン−γ
産生能は、健常者のそれと比較してきわめて低いことが
判明した。また、健常者、癌患者各20名から採血し、同
様に血液ml当り100μｇのミトーゲンを使用してインタ
ーフェロン−γ産生能を測定したところ、健常者、癌患
者のそれは、それぞれ420±100、10±10単位を示した。
このことは、採血した血液のインターフェロン−γ産生
能を測定することにより、癌の早期発見に使用しうるも
のである。
以下、２〜３の実施例を述べる。
実施例1. 健常者（男、28才）から採血したヘパリン加新鮮血1ml
をプラスチック製試験管にとり、これにフィトヘマグル
チニン−P250μｇを加え、37℃で24時間インキュベート
し、次いで遠心分離して得られる上清中のインターフェ
ロン−γ活性を実験１と同様に放射免疫測定用キットで
測定した。
血液1ml当りのインターフェロン−γ産生能は、約420単
位であった。
実施例2. 健常者（女、33才）から採血したヘパリン加新鮮血1ml
に、コンカナバリンA500μｇを加え、37℃で64時間イン
キュベートし、次いで、実施例１と同様にしてインター
フェロン−γ産生能を測定した。産生能は血液ml当り約
380単位であった。
実施例3. 健常者（男、61才）から採血したヘパリン加新鮮血を遠
心分離して血漿を除去し、得られる全有形成分を生理食
塩水にて遠心洗浄し、次いで、この全有形成分を血液と
同濃度になるようにRPMI1640培地にて浮遊液とした。
この浮遊液1mlをプラスチック製試験管にとり、これに
ポークウィードミトーゲン300μｇを加え、37℃で48時
間インキュベートし、この標品中のインターフェロン−
γ活性を二抗体サンドイッチ法による酵素免疫測定法で
測定した。
血液1ml当りのインターフェロン−γ産生能は、約200単
位であった。なお、酵素免疫測定法による測定値は、放
射免疫測定法のそれとよく一致した。
実施例4. 肺癌患者（男、68才）から採血したヘパリン加新鮮血を
用いて、実施例１と同様に処理してインターフェロン−
γ産生能を測定したところ、約20単位であった。
実施例5. 子宮癌患者（女、55才）から採血したヘパリン加新鮮血
を用いて、実施例１と同様に処理してインターフェロン
−γ産生能を測定したところ、約10単位であった。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】全血を抗凝血剤及びミトーゲンと接触せし
    め、容器中でインキュベートし、生成したインターフェ
    ロン−γを測定することを特徴とする血液のインターフ
    ェロン−γ産生能測定方法。
  2. 【請求項２】ミトーゲンが全血ml当り10〜10,000μｇの
    範囲であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
    に記載する血液のインターフェロン−γ産生能測定方
    法。
  3. 【請求項３】ミトーゲンがフィトヘマグルチニンである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項または第
    （２）項記載の血液のインターフェロン−γの産生能測
    定方法。
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JPS5521723A (en) * 1978-08-02 1980-02-16 Techno Benchiyaa Kk Preparation of alphatized noodle using micro-wave heating
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JPS59122446A (ja) * 1982-12-28 1984-07-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd γ−インタ−フエロン関連ペプチド

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