JPH0767689A - 抗ｌｄ７８ポリペプチドモノクローン抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 自己免疫疾患、並びに血球貪食性組織球食作
用に起因する疾患の患部もしくは血液中のＬＤ７８ポリ
ペプチドに結合性を有し、実質的に中和する能力を有す
るモノクローン抗体及び該抗体を分泌するハイブリドー
マを提供する。 【構成】 遺伝子組換え技術を用いて調製されたＬＤ７
８ポリペプチドを免疫抗原として用い、細胞融合法を適
用して所望の抗体を持続産生するハイブリドーマを調製
する。当該ハイブリドーマを適当な方法で培養増殖させ
た後、精製過程を経てＬＤ７８ポリペプチドに対するモ
ノクローン抗体を得る。当該抗体を用いることによって
自己免疫疾患並びに血球貪食性組織球食作用に起因する
疾患の診断法、並びに当該疾患の予防あるいは治療に有
用な薬剤の提供が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫異常及び血球貪食性
組織球食作用(Hemophagocytic Histiocytosis;以下、Ｈ
Ｈと称することがある)等に起因する疾患の診断、予防
もしくは治療に有用な、並びに生化学及び組織学の研究
に有用な新規物質を提供する免疫学的技術に関する。よ
り詳しくは、自己免疫疾患例えば潰瘍性大腸炎やクロー
ン病を初めとする炎症性腸疾患患者の患部及びＨＨに起
因する疾患、例えば血球貪食症候群(Hemophagocytic Sy
ndrome;以下、ＨＳと称することがある)患者の組織中の
細胞もしくは血液中のＬＤ７８ポリペプチドに結合性を
有し、実質的に中和する能力を有するモノクローン抗体
及び該抗体を分泌するハイブリドーマに関する。

【０００２】

【従来技術】ヒトの免疫異常に関わる疾患は、代表例と
して自己免疫疾患等が知られているが、これら自己免疫
疾患も器官特異的なものから非器官特異的なものまで種
々存在する。例えばその中で、潰瘍性大腸炎やクローン
病をはじめとする難治性炎症性腸管障害は近年増加傾向
にあり、その病因解明並びに治療法の開発が急務となっ
ている。

【０００３】また、これら炎症性腸疾患の診断手順は、
例えば潰瘍性大腸炎の場合、厚生省特定疾患・難治性炎
症性腸管障害調査研究班に基づくと、次のようになって
いる。「慢性の粘血・血便などがあり本症が疑われる患
者には、細菌学的・寄生虫学的検査を行なって感染性大
腸炎を除外するとともに、直腸あるいはＳ字結腸内視鏡
検査を行なって本症に特徴的な腸病変を確認する。この
際なるべく生検する。これだけの検査で多くは診断が可
能であるが、さらに注腸Ｘ線検査や、必要に応じては結
腸内視鏡検査などを行なって、腸病変の性質や程度、罹
患範囲などを検査し、同時に他の疾患を除外するこ
と。」

【０００４】しかし、実際にはこれらの手順では診断の
断定は難しく、またこの手順自体も煩雑である。潰瘍性
大腸炎と同様、クローン病の診断手順も、臨床症状、ク
ローン病に特徴的な腸病変の確認(内視鏡、Ｘ線、生
検、切除または剖検材料)および他疾患との鑑別によっ
て行ない、更に病型の判定、全身または局所合併症の有
無の確認を行なうこととなっているが、この場合も手順
に煩雑性を伴い、また診断の断定も困難である。

【０００５】現在、これら炎症性腸疾患の治療法として
は、サラゾピリン、５-アミノサリチル酸、副腎皮質ス
テロイド、アザチオプリン、６-ＭＰ、胸腺摘出術、ト
ラニラスト、７Ｓ-免疫グロブリン大量療法、成分栄
養、ＴＰＮ、シクロスポリンＡ、メトロニダゾールなど
の薬物療法が行なわれているが、これらは根治的治療と
はいえず、むしろ長期連用による重篤な副作用の原因と
もなり、より有効な治療剤の開発が望まれている。

【０００６】一方、血球貪食を伴うhistiocyte(組織球)
の増殖を示す疾患はHistiocytosisとしてまとめられる
ことより、ＨＨと呼ばれている。1979年、Risdallら
は、全身性ウイルス感染時の、血球貪食を伴う異型性の
ない組織球のびまん性増殖をウイルス関連血球貪食症候
群(virus-associated hemophagocytic syndorome;以
下、ＶＡＨＳと称することがある)という疾患単位で報
告した(Risdall,R.J. et al.Cancer,44:993-1002,197
9)。Hemophagocytic syndorome(以下、ＨＳと称するこ
とがある)には、ＶＡＨＳの他にこれまでに、悪性腫瘍
などに伴う反応性のもの(Reactive ＨＳ;ＲＨＳ)と家族
性に発症するもの(Familial Hemophagocytic Lymphohis
tiocytosis;以下、ＦＨＬと称することがある)とが知ら
れている。

【０００７】ＶＡＨＳは、全身ウイルス感染症に関連し
た血球貪食像を認める良性の全身性組織球増殖性疾患と
されているが、その病態に関しては不明な点が多い。関
連ウイルスとして、ヘルペスウイルス、サイトメガロウ
イルス、ＶＺＶ(varicella zoster virus)、ＥＢ(Epste
in-Barr)ウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデ
ノウイルス等が関与する感染症、その他X-linked lymph
oproliferative syndromeやＡＩＤＳ、骨髄移植、悪性
リンパ腫などの基礎疾患を有する免疫不全状態にある個
体が合併することが知られているが、健康人でも罹患す
る。また、ＶＡＨＳは、発熱、全身性リンパ節腫張、肝
機能異常、汎血球減少等の症状を呈する。ウイルス感染
が引き金となることと考えられており、ＥＢウイルスや
サイトメガロウイルスなどの感染に伴う例が多いが、骨
髄、リンパ節に血球を貪食した異型性のない組織球のび
まん性増殖が認められることにより診断されている。

【０００８】Histiocytosisの臨床症状は、悪性、反応
性を問わず極めて類似しており、その鑑別診断は主に病
理学的に行なわれている。最近ではＨＨの臨床症状とし
て、血清フェリチン(ferritin)が著増することがEzumi
ら(Cancer,61:2071-2076,1988)により明らかにされてい
る。あるいは、新名主ら(臨床血液33(4):545-547,1992)
は、血清ネオプテリン(neopterin)の測定がＨＨの病勢
の指標となることを示唆しているが、明確で早期に診断
できる体外診断薬は現在のところ存在しない。これらＨ
Ｈの組織球賦活化の機序としては、例えばＶＡＨＳの場
合ウイルス感染等により産生された何らかのサイトカイ
ンの関与が推察されているが、詳細は不明である。

【０００９】ところで、ＬＤ７８は、Obaruら(J.Bioche
m 1986;99:885-894)によりヒト扁桃リンパ球をＴＰＡと
ＰＨＡで刺激した際、強く誘導されるｍＲＮＡより調製
されたｃＤＮＡであることが明らかにされているが、こ
れまでそのタンパク質の生理活性について、ヒト造血前
駆細胞の増殖抑制作用(Jpn.J.Cancer Res.1992;83:499-
504)、ラット歯骨細胞分化増強作用(Bone and Mineral
1992;19:215-223)、骨髄細胞増殖抑制作用(Blood 1990;
76:1110-1116)等が報告されてはいるものの、特に疾患
との関連については不明であった。そこで、本発明者ら
はＬＤ７８が純化された経緯より考察し、ＬＤ７８ポリ
ペプチドが炎症性のサイトカインであると考え、炎症が
持続的に生じている疾患すなわち自己免疫疾患等での発
症に関与していると推察し、ＬＤ７８ポリペプチドが自
己免疫疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病を初め
とする炎症性腸疾患に関与していることを発見した。こ
の発見により、生体中のＬＤ７８ポリペプチドを検出す
ることで炎症性腸疾患の早期診断が可能となった。

【００１０】また、ＬＤ７８は、マクロファージの組織
障害性や腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、ガンマインターフェロ
ン(ＩＦＮγ)などのサイトカイン産生を増強させること
が知られている。一方、ＨＨは、mononuclearphagocyte
system(ＭＰＳ)の増殖性疾患であり、その中で血球貪
食症候群(ＨＳ)では、血清ＩＦＮγの上昇が血球減少時
に認められることが報告されている(小池ら、臨床血液,
34(5);557-561,1993)。これらのことより、ＬＤ７８が
ＨＳに関与していると考え、抗ＬＤ７８モノクローン抗
体を用いて、例えば免疫組織化学的に検討したところ、
ＬＤ７８がＨＳに深く関与していることを発見した。こ
の発見により、生体中(組織、血清、血液や骨髄中の細
胞)のLD78ポリペプチドを検出することでＨＳの早期診
断が可能となり、本発明のモノクローン抗体の新たな有
用性が開拓された。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】現行の診断法及び治療
法においては、炎症性腸疾患等の自己免疫疾患あるいは
ＨＨに関わる明確な診断もしくは症状を十分に阻止する
ことはできず、当該疾患の発症頻度は最近１０年間にお
いても減少が観られない。したがって、本発明はこれら
炎症性腸疾患等自己免疫疾患およびＨＨとりわけＨＳの
早期診断あるいは発症に対して極めて高い効果を有する
自己免疫疾患関連疾病の予防、診断及び治療薬を提供す
ることを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は前述した問題点
を解決するもので、本発明者等が自己免疫疾患、特に炎
症性腸疾患、あるいはＨＨ、特にＨＳにおいて直接検出
できる診断薬を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、自己
免疫疾患例えば潰瘍性大腸炎やクローン病の病巣に存在
する物質、または同様にＨＨ例えばＨＳの単球・マクロ
ファージ等が産生する物質すなわちＬＤ７８ポリペプチ
ドを抗原として認識し、このものに特異的に結合するこ
とのできるモノクローン抗体を見出し、本発明に到達し
たものである。すなわち本発明は自己免疫疾患病巣部位
に多く存在する、あるいはＨＨの単球・マクロファージ
等の産生するＬＤ７８ポリペプチドを抗原として認識す
るモノクローン抗体に関するものである。

【００１３】本発明のモノクローン抗体は、炎症の生じ
ていない正常な組織あるいは細胞では、病巣部位に比べ
てその部位での認識は極端に弱い。自己免疫疾患病巣部
位は、いずれも抗原となり得るが、特に治療および診断
の観点から好ましい病巣部位の抗原としては、腸管リン
パ球、腸管上皮内リンパ球(ＩＥＬ)あるいは関節滑膜リ
ンパ球、甲状腺、末梢血等を挙げることができる。さら
に、本発明のモノクローン抗体は、ＨＨ以外の疾患例え
ば再生不良性貧血(ＡＡ)、慢性骨髄単球性白血病(ＣＭ
ＭｏＬ)、急性骨髄単球性白血病(ＡＭＭｏＬ)、および
特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、鉄欠乏性貧血(Ｉ
ＤＡ)等の骨髄穿刺液組織切片での認識は極端に弱い。
ＨＳ疾患(ＶＡＨＳ,ＲＨＳ,ＦＨＬ)の単球・マクロファ
ージ等が産生するＬＤ７８ポリペプチドは、いずれも抗
原となり得るが、好ましい抗原としては、肝臓、脾臓、
リンパ節、骨髄、末梢血等の単球・マクロファージ等が
産生するＬＤ７８を挙げることができる。

【００１４】本発明のモノクローン抗体は、抗ＬＤ７８
ポリペプチド抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細
胞から産生することができる。この製造方法について更
に詳しく述べると、まず遺伝子組換え技術を用いて作製
した組換えＬＤ７８ポリペプチド(例えば酵母を宿主と
しての組換えタンパク質の生産)を動物に感作する。感
作された動物においても、その種に特異的なＬＤ７８ポ
リペプチドの存在があるため、この１回の感作では、目
的とする抗体を産生する感作細胞を得難い。そこで、本
発明者等はヒトＬＤ７８ポリペプチドと感作される動物
の有するＬＤ７８ポリペプチドと相同性の認められない
２箇所の領域に対するタンパク質を合成し、これらを続
けて動物に感作する。このようにして感作された動物の
脾臓(他に胸腺、末梢リンパ節、末梢血等)より感作細胞
を単離して抗ＬＤ７８ポリペプチド抗体産生細胞を得、
これをミエローマ(Myeloma cell)と融合させ、抗体産生
性融合細胞(Hybridoma)を得る。この融合細胞を複数の
ウェルに分注し、培養し、各ウェルのその上清を酵素抗
体法等の手段により分析し、組換えＬＤ７８ポリペプチ
ドおよび天然型ＬＤ７８ポリペプチドと特異的に結合す
るモノクローン抗体を製造することができる。

【００１５】ところで、このモノクローン抗体は自己免
疫疾患、例えば潰瘍性大腸炎やクローン病あるいはＨＨ
例えばＨＳの進展を測定する反応試薬として用いること
ができるものである。すなわち、この抗体の認識する抗
原のあるものは、その一部が血液中に流出するので、そ
の場合、採取した血清中のその流出抗原をモノクローン
抗体を反応試薬として、例えば酵素、放射性同位元素、
蛍光物質等の標識物質を結合せしめた種々の免疫測定
法、例えば酵素免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)等により定量す
ることにより免疫異常疾患及びＨＨの進展度を測定する
ことができる。このようにして、自己免疫疾患病巣部位
あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質
を抗原として得られる抗体産生細胞である抗ＬＤ７８ポ
リペプチドモノクローン抗体は、その１種または２種以
上を用いることにより自己免疫疾患の反応試薬として使
用される。

【００１６】さらに、この抗体を予防もしくは治療に用
いる場合、以下の機構が考慮され得る。モノクローン抗
体を血管内に投与して病巣部との間に免疫複合体を形成
させる。この複合体はそれ自体で白血球の遊走能があ
り、この複合体により補体が活性化され、それにより多
核白血球(ＰＭＮ)、次いでマクロファージは自らのＦｃ
受容体(Fc Receptor)を介して複合体に結合することに
より貪食機能が活性化される。この複合体を貪食したマ
クロファージがそのまま血中へ流出することにより、病
巣部の退縮が起こり、免疫異常は治癒するものである。
本発明によってもたらされる抗体、もしくは該抗体に由
来しヒトへの投与が可能な形態へ誘導されたキメラ抗体
等のヒト型化抗体を含有するヒト自己免疫疾患あるいは
ＨＨの予防・治療剤においては、有効成分としての当該
抗ＬＤ７８ポリペプチドモノクローン抗体と公知の適当
な賦形剤を組み合わせて予防・治療剤とすることがで
き、液状で使用することもできるし、好適な安定化剤と
共に凍結乾燥して保存することも可能である。

【００１７】

【本発明の作用並びに効果】抗自己免疫疾患病巣部位あ
るいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質に
対する抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞から
得られ、自己免疫疾患病巣部位あるいはＨＨの単球・マ
クロファージ等が産生する物質を特異的に認識する本発
明のモノクローン抗体は、正常な血管は認識せず、自己
免疫疾患病巣、例えば潰瘍性大腸炎やクローン病の病巣
部の腸管粘膜層またはＩＥＬ(粘膜上皮細胞間リンパ球)
あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質
を認識し、これらに特異的に結合することができるもの
である。従ってこのモノクローン抗体に標識物質を結合
せしめて血管内に投与し、自己免疫疾患の部位、あるい
はＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質、それ
ら疾患の進展度を予測することが可能であり、また、血
液中に流出されるＬＤ７８ポリペプチドを測定する体外
診断薬としても利用できる。さらに、該モノクローン抗
体と病巣部との間の免疫複合体は、それ自体、マクロフ
ァージの動員効果、ひいてはマクロファージの貪食機能
の活性化を促し、炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾
患の治療に有効なものである。なお、本発明で提供され
るモノクローン抗体を産生する代表的なハイブリドーマ
は工業技術院生命工学工業技術研究所(生工研)に受託番
号第１３５７２号(ＦＥＲＭ Ｐ-１３５７２)として寄
託されている。

【００１８】本発明によってもたらされるモノクローン
抗体は、自己免疫疾患特に潰瘍性大腸炎やクローン病を
初めとする炎症性腸疾患並びにＨＨの免疫組織学的鑑別
あるいは血液診断等に特に有用である。また、自己免疫
疾患の予防および治療への応用可能な抗体である。

【００１９】以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明
するが、本発明は何等これらに限定されるものではな
い。

【００２０】

【実施例】

試験例 (潰瘍性大腸炎モデルマウス由来腸間膜リンパ球中での
ＬＤ７８の検出)６〜１０週令のBALB/cマウスに５％デ
キストラン硫酸塩水溶液(ＤＳＳ)を自由飲水投与し、潰
瘍性大腸炎モデルマウスを作出した(Gastroenterology,
1990,98:694-702)。ＤＳＳ投与後、２日毎に８日目まで
のモデルマウスの腸管膜リンパ節リンパ球を採取し、Ｒ
ＮＡをグアニジウムチオシアネート法(Molecular Cloni
ng,1989:7.18-7.22)により調製した。調製したＲＮＡを
基に、ＲＴ-ＰＣＲ法(PCRProtocols,1990:21-27)にてマ
ウスＬＤ７８の検出を行なった。その結果、２日目から
マウスＬＤ７８の発現が確認され、その発現量は病変の
進行と共に増加していた。このことより、ＬＤ７８の発
現が潰瘍性大腸炎を初めとする各種自己免疫疾患に関与
していることが解明された。

【００２１】上記ＲＴ-ＰＣＲ法に使用したプライマー
の塩基配列(サワディーテクノロジー社製)は以下に示
す。 sense primer; 5'-TGGTCGACATCATGAAGGTCTCCACCACTG-3' antisense primer; 5'-TCGTCGACTCTCAGGCATTCAGTTCCAGGT-3'

【００２２】実施例１ (モノクローン抗体の調製) 抗原の調製 (1) 組換えＬＤ７８ポリペプチドの調製 特開平３−２２８６８３「生理活性ペプチドＬＤ７８
α、ＬＤ７８βおよびその製法、これに用いる組換えプ
ラスミド」の明細書中に記載された方法により調製し
た。以下に、簡単にその調製法を記載する。

【００２３】ヒトＬＤ７８α遺伝子およびＬＤ７８β遺
伝子を組み込んだプラスミドを構築した。続いて、この
プラスミドにより形質転換された組換え酵母を培養する
ことにより、目的とする組換えＬＤ７８α及びＬＤ７８
βポリペプチドを大量に製造する方法を確立した。すな
わち、形質転換酵母を酢酸アンモニウムの存在下で培養
し、培養後、その培養上清中に分泌されたＬＤ７８α及
びＬＤ７８βポリペプチドが集積される。そこで、酵母
菌培養上清を分画分子量10,000の限外濾過膜(ミリポア
社)を用いてＬＤ７８ポリペプチドの濃縮・回収を行なっ
た。更に、陰イオン交換カラム(ファルマシア社)を用い
て精製した後、凍結乾燥を行ない、目的の組換えＬＤ７
８ポリペプチドを得た。これを免疫用抗原及びアッセイ
用抗原として用いた。

【００２４】(2) 合成ペプチドの作製 ＬＤ７８αのアミノ酸配列第１３〜３３番目に対応する
合成ペプチド(ＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥ
ＴＳＳ；ＬＤ−１)および第５０〜７０番目に対応する
合成ペプチド(ＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ
ＬＳＡ；ＬＤ−２)を免疫抗原及びアッセイ用抗原とし
て使用した。

【００２５】上記ペプチドの化学合成にはＡＢＩ430Ａ
ペプチドシンセサイザー(アプライドバイオシステム社)
のＭＡＰＳ(４−ｂｒａｎｃｈ)法を用いた。その結果、
粗生成物が得られ、ＴＦＭＳＡ法によりレジンからペプ
チドを切り出した後、逆相高速液体クロマトグラフィー
(逆相ＨＰＬＣ)による精製を行なった。逆相ＨＰＬＣに
よる精製を３回繰り返し、得られたピーク画分を集め、
アミノ酸分析を行なった結果、ＬＤ７８αのアミノ酸組
成と一致したことより、所望の上記配列を有するＬＤ７
８の合成ペプチドと断定した。得られた合成ペプチド
(ＬＤ−１，ＬＤ−２)を凍結乾燥し、免疫用抗原及びア
ッセイ用抗原として用いた。

【００２６】(3) マウスの免疫感作 一例として、前記で調製した組換えＬＤ７８ポリペプチ
ド及び合成ペプチドによる免疫感作を以下に示す。

【００２７】４〜８週齢のC3H/HeNマウス群を使用し
た。初免疫感作は腹腔内経路でフロイント完全アジュバ
ント存在下で組換えＬＤ７８ポリペプチド２０μｇを１
回接種した後、３週後に腹腔内経路で合成ペプチド２０
μｇをフロイント不完全アジュバント存在下で１回免疫
する。その２週後にフロイント不完全アジュバント存在
下で腹腔内経路で合成ペプチド２０μｇを免疫した。そ
の２週後に静脈内経路で合成ペプチド２０μｇを接種し
た。

【００２８】(4) 細胞融合及びハイブリドーマの培養 最終免疫の３日後に、常法によりマウスから脾臓細胞を
採取した。脾臓細胞をミエローマ細胞p3X63Ag8-U1と細
胞数５対１の割合で混合して、遠心処理(1,200r.p.m./
５分)して上清を除き、沈澱した細胞塊を充分ほぐした
後、攪はんしながら、１mlの混合液(ポリエチレングリ
コール-4000(２g),ＭＥＭ(２ml),ジメチルスルホキシ
ド)を加えた。５分間３７℃にてインキュベートした
後、液の全量が５０mlになるようにゆっくりとＭＥＭを
加えた。遠心分離後(900r.p.m./５分)、上清を除き、ゆ
るやかに細胞をほぐした。これに正常培地(RPMI-1640培
地に牛胎児血清１０％を加えたもの)１００mlを加え、
メスピペットを用いてゆるやかに細胞を懸濁した。

【００２９】懸濁液を２４穴の培養プレートに分注し
(１ml/穴)５％の炭酸ガスを含む培養器中で、温度３７
℃で２４時間培養した。次に、１ml/穴のＨＡＴ培地(正
常培地にヒポキサンチン(１×10^-4Ｍ),チミジン(1.5×1
0^-3Ｍ)及びアミノプテリン(４×10^-7Ｍ))を加え、さら
に２４時間培養した。その後、２日間、２４時間毎に、
１mlの培養上清を同量のＨＴ培地(ＨＡＴ培地からアミ
ノプテリンを除く)と交換し、前記と同様にして１０〜
１４日間培養した。

【００３０】コロニー状に生育した融合細胞(約300個)
の認められたそれぞれの穴について、１mlの培養上清を
同量のＨＴ培地と交換し、その後、２日間、２４時間毎
に、同様の交換を行なった。ＨＴ培地で３〜４日培養し
た後、培養上清の一部を採り、以下に述べるスクリーニ
ング法にて目的のハイブリドーマを選別した。

【００３１】(5) ハイブリドーマのスクリーニング 目的のハイブリドーマの選別には下記のＥＩＡ法、ウエ
スタン・ブロット法を組み合わせて行なった。

【００３２】 ＥＩＡ法 ９６穴のマイクロテストプレートに前記のごとく作製し
た合成ペプチド抗原、もしくは精製組換えポリペプチド
(蛋白質濃度２μg/ ml)を１００μl/穴で加え、４℃で
一晩インキュベートすることにより固相化した。さら
に、１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)溶液１５０μlを
加え、同様にインキュベートしてマスキングを行なっ
た。このようにして作製した抗原固相化プレートに細胞
融合法によって得られたハイブリドーマおよびクローニ
ング後のハイブリドーマの培養上清を加えて、４℃で
１.５時間インキュベート後、０.１％Tween20/ＰＢＳで
３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブ
リン抗体溶液(カッペル社製、5,000倍希釈)を１００μl
/穴加えた。４℃で１時間インキュベート後、０.１％Tw
een20/ＰＢＳにて５回洗浄し、その後ＴＭＢＺ基質溶液
を加え、常法により発色させ、その吸光度を波長４５０
nmにて測定した。こうして組換えヒトＬＤ７８ポリペプ
チドもしくは合成ペプチドと強く反応するハイブリドー
マクローンを選択した。

【００３３】 ウエスタン・ブロッティング法 組換えＬＤ７８ポリペプチド或いは天然型ＬＤ７８(HTL
V-1感染Ｔ細胞株の培養上清より精製したもの；精製法
は組換えＬＤ７８ポリペプチド精製法と同様)を２０％
のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動
し、ゲル中のＬＤ７８ポリペプチドをニトロセルロース
膜上に移行させ、膜を０.４〜０.５cm幅に切断した。各
細片をハイブリドーマ培養上清液に浸し、一晩インキュ
ベートした。その後、細片をＰＢＳで３回洗浄した後、
ビオチン標識抗マウスＩｇＧ(TAGO社製)の１:７５０希
釈液中で２時間保温した。細片をＰＢＳで３回洗浄後、
西洋わさびペルオキシダーゼを結合させたアビジン(シ
グマ社製)(１:1000希釈)に浸し、１時間保温した。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、4-クロロ-1-ナフトールを用いる発色
試薬(Bio-Rad社製)で発色させ、ＬＤ７８ポリペプチド
の発色バンドを示すハイブリドーマを選びクローニング
した。クローニング後のハイブリドーマクローンについ
ても同様の手法で選別した。上記の選別方法によって所
望のモノクローン抗体を産生するハイブリドーマ(λ７
８δ)株が得られた。

【００３４】(6) λ７８δ株によるモノクローン抗体の
製造 プリスタン処理した８週齢のBALB/c*C3H/HeN F1雌マウ
スに前記実施例で得られたハイブリドーマλ７８δ株の
５×10⁶個/匹を各々のマウスの腹腔内に投与した。10〜
21日目後に、腹水癌が誘発された。マウスから腹水を採
り、3000r.p.m./５分の遠心処理により固形成分を除去
した後、アフィゲルプロテインＡ ＭＡＰＳ-IIキット(B
io-Rad社製)を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーにて精製した。

【００３５】実施例２ (λ７８δ抗体の性状解析) (1)抗体の特性 得られた抗体λ７８δのアイソタイプ、サブクラスの決
定は各種抗マウスイムノグロブリンサブクラス抗体を吸
着させたマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で同定
することができ、その結果ＩｇＧ1,κであることが判明
した。また、ゲル電気泳動、並びに等電点電気泳動によ
る解析の結果、分子量約１５万ダルトン、等電点(ｐＩ)
は６.７であることが判った。

【００３６】(2) 合成ペプチドとの反応性 得られた抗体の反応性を各種合成ペプチド、ＬＤ−１及
びＬＤ−２の合成ペプチドを使用して確認した。方法は
前述したハイブリドーマのスクリーニングの(1)ＥＩＡ
法の項に示した。図１に示すように、λ７８δ抗体は、
ＬＤ-１ペプチドとは反応しないが、ＬＤ−２ペプチド
と強く反応する抗体であることが示された。

【００３７】(3) 天然型ＬＤ７８及び組換えＬＤ７８ポ
リペプチドとの結合特性(ウエスタン・ブロッティング
法) λ７８δ抗体の天然型及び組換えＬＤ７８ポリペプチド
との反応性を調べる為に、ウエスタン・ブロッティング
を行なった。方法は前述したハイブリドーマのスクリー
ニングのウエスタン・ブロッティング法の項に準じ
た。Ａのストリップは陽性コントロールとして組換えＬ
Ｄ７８免疫ヤギ抗血清を用いたが、この部分にＬＤ７８
のバンドが観察された。Ｂのストリップは、組換えＬＤ
７８及び天然型ＬＤ７８ポリペプチドと結合し、ＬＤ７
８ポリペプチドの生理活性を阻害する能力を有するλ７
８δモノクローン抗体を用いている。これにより、本発
明に基づくλ７８δ抗体は、明確に天然型及び組換えＬ
Ｄ７８ポリペプチドを認識していることが判明した(図
２)。

【００３８】実施例３ (潰瘍性大腸炎患者生検サンプルのλ７８δ抗体による
免疫組織染色)潰瘍性大腸炎患者患部組織(滋賀医科大学
第二内科より入手)を内視鏡的生検後、λ７８δ抗体を
用いて免疫組織染色を行なった。生検組織をホルムアル
デヒドで固定した後、パラフィン包埋した。ミクロトー
ムにより、包埋した組織を薄切し、次に示す方法にて免
疫組織染色を行なった。λ７８δ抗体を１μg/ml濃度に
て、３７℃、１時間インキュベートした後、PBS-Tween2
0溶液にて３回洗浄した。続いて、第二抗体として５０
０倍希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体(DAKO社
製,Code No.;E354)と３７℃、１時間インキュベートし
た。その後、PBS-Tween20溶液にて３回洗浄した後、１
０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビ
ジン(DAKO社製;Code No.P397)と３７℃、１時間インキ
ュベートした。その後、発色基質ＡＥＣ(DAKO社製,Code
No.;K697)にて組織切片を染色した。

【００３９】その結果、図３に示すように、λ７８δ抗
体は潰瘍性大腸炎患者患部凍結組織切片中の腸間リンパ
球、腸管上皮内リンパ球(ＩＥＬ)等との反応性を示し
た。図(図面代用写真)中、白枠矢印で示される部分が染
色された反応部位である。一方、同患者中の非患部にお
いてはλ７８δ抗体との反応は認められなかった。この
点からも、明らかにＬＤ７８が潰瘍性大腸炎を初めとす
る炎症性腸疾患を含む各種自己免疫疾患に関与している
ことが、実際のヒト患者の組織を用いて、本発明の抗体
を用いることによって初めて解明された。

【００４０】実施例４ (潰瘍性大腸炎およびクローン病患者末梢血血清中のＬ
Ｄ７８ポリペプチドの検出)潰瘍性大腸炎及びクローン
病患者末梢血血清(滋賀医科大学第二内科より入手)及び
健常人末梢血血清をλ７８δ抗体を用いて、血清中のＬ
Ｄ７８ポリペプチドの検出を行なった。血清サンプルを
リン酸緩衝液(ＰＢＳ)にて５倍〜５０倍に希釈したもの
をニトロセルロース膜上にスロットブロットあるいはド
ットブロットした。フィルターを風乾後、１％ＢＳＡ/
ＰＢＳ中で、３７℃で１時間インキュベートする。その
後、λ７８δ抗体をＰＢＳで５０μg/mlに調製した溶液
中で、３７℃で、１時間インキュベートした。０.１％
Tween20／ＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識
抗マウス免疫グロブリン抗体溶液(カッペル社製、3000
倍希釈)中で、３７℃、１時間インキュベートした。そ
の後０.１％ Tween20／ＰＢＳで５回洗浄し、その後、
ＤＡＢ基質溶液を加え、常法により発色させた(図４)。
その結果、健常人末梢血血清中では、いずれのサンプル
もＬＤ７８ポリペプチドが検出されなかったのに対し
て、潰瘍性大腸炎及びクローン病患者血清中では全ての
サンプルにおいてＬＤ７８ポリペプチドが検出された。
この点より、自己免疫疾患例えば潰瘍性大腸炎やクロー
ン病患者の末梢血血清中のＬＤ７８ポリペプチドを検出
することで、これら疾患の診断を行なえ得ることが、本
発明により初めて明らかにされた。

【００４１】実施例５ (ＨＳ患者骨髄穿刺液組織切片サンプルのλ７８δ抗体
による免疫組織染色)ＶＡＨＳ、ＲＨＳ、ＦＨＬ、Ａ
Ａ、ＣＭＭｏＬ、ＡＭＭｏＬ、ＩＴＰ、ＩＤＡの患者骨
髄穿刺液組織切片を用い、実施例３において記載した方
法により、免疫染色を行なった(図５並びに図６)。ま
た、ＲＨＳでは上記の組織切片の他に剖検で得られた
肝、脾、リンパ節、骨髄も同様に染色した。その結果、
ＡＡ、ＣＭＭｏＬ、ＡＭＭｏＬ、ＩＴＰ、ＩＤＡの患者
サンプルの単球、芽球ではほとんど染色されなかったの
に対し、各ＨＳ患者サンプルでは単球、マクロファージ
及び大型の単球様細胞等が強く染色された。また、ＲＨ
Ｓの肝及びリンパ節では、類洞部(sinusoid)に著明なマ
クロファージの浸潤を認め、これも強く染色された。図
(図面代用写真５、６)中、白枠矢印で示される部分が染
色された反応部位である。一方、同患者中の非患部にお
いてはλ７８δ抗体との反応は認められなかった。これ
らの点より、明らかに、各種ＨＳを初めとするＨＨ疾患
において、血球貪食やサイトカイン異常高値に単球、マ
クロファージ等の細胞自身の産生するＬＤ７８が関与し
ていることが、実際のヒト患者の組織を用い、本発明の
抗体を用いることで初めて解明された。

【００４２】以上のように、λ７８δ抗体を各種自己免
疫疾患あるいはＨＨの診断に応用することが可能である
ことが判った。診断法としては、例えばフローサイトメ
トリー法、ウェスタン・ブロット法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ
法、患者組織を用いての免疫染色法であるhisto-in sit
u hybridization法等が好適に適用される。

【００４３】実施例６ (生理活性阻害効果測定法)３.５cmのシャーレ(ファルコ
ン社)で、ヒト骨髄単核細胞[Blood,Vol 76,501-507(199
0)]３×１０⁵個を、１.２％メチルセルロース及び１０
％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ(Iscove's modified Dulbe
cco's medium)培地(GIBCO社)(６０μg/mlカナマイシ
ン、２ mmol/L Ｌ-グルタミン、５０μmol ２ーメルカプ
トエタノール、２ ng/ml ヒトインターロイキン３含有)
中で、５％ ＣＯ₂の存在下、１０日間培養すると、約４
００個のコロニーが形成される。この系に、１００ng/m
lの天然型もしくは組換えＬＤ７８ポリペプチドを添加
して培養する。その際、更にλ７８δ抗体を添加してお
く。

【００４４】その結果を表１に示す。培養１０日目に形
成される顆粒球マクロファージのコロニーを計測する
と、１００ng/ml以上のＬＤ７８を添加した場合は、Ｌ
Ｄ７８無添加に比べて、コロニー数の顕著な抑制が観察
される(Jpn.J.Cancer Res.,83,499-504,1992)。一方、
λ７８δ抗体及びＬＤ７８を添加した場合は、ＬＤ７８
による骨髄単核細胞の顆粒球、マクロファージのコロニ
ー形成の減少は認められない。従って、λ７８δ抗体に
はＬＤ７８の生理活性を阻害する特性を有していること
が示された。

【００４５】

【表１】

【００４６】以上のように、λ７８δ抗体の有する生体
中で自己免疫疾患に起因しているＬＤ７８ポリペプチド
の生理活性を阻害する作用により、自己免疫疾患の治療
の可能性が示される。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：マウス 配列 TGG TCG ACA TCA TGA AGG TCT CCA CCA CTG 30

【００４８】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：マウス 配列 TCG TCG ACT CTC AGG CAT TCA GTT CCA GGT 30

【００４９】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：中間部フラグメント 起源 生物名：ヒト(ＬＤ７８ポリペプチド) 配列 Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr 15 20 25 Phe Glu Thr Ser Ser 30

【００５０】

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：中間部フラグメント 起源 生物名：ヒト(ＬＤ７８ポリペプチド) 配列 Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp 50 55 60 65 Leu Glu Leu Ser Ala 70

【００５１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明によるモノクローン抗体(λ７８δ抗
体)の性状解析に用いた合成ペプチド(ＬＤ-１,ＬＤ-２)
との反応性を示す図である。

【図２】 本発明によるモノクローン抗体(λ７８δ抗
体)の天然型および組換えＬＤ７８ポリペプチドとの反
応性を示す図である。各抗体の初期濃度は５０μg/mlで
ある。

【図３】 本発明によるモノクローン抗体(λ７８δ抗
体)の潰瘍性大腸炎患者生検サンプルとの反応性を示す
生物の形態図(図面代用写真)である。

【図４】 本発明によるモノクローン抗体(λ７８δ抗
体)の潰瘍性大腸炎及びクローン病末梢血サンプルとの
反応性を示す図である。

【図５】 本発明によるモノクローン抗体(λ７８δ抗
体)のＶＡＨＳおよびＦＨＬ患者生検サンプルとの反応
性を示す生物の形態図(図面代用写真)である。

【図６】 本発明によるモノクローン抗体(λ７８δ抗
体)のＲＨＳ患者生検サンプルとの反応性を示す生物の
形態図(図面代用写真)である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/564 Ｚ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＬＤ７８ポリペプチドで免疫したマウス
   脾臓細胞とマウスミエローマとのハイブリドーマによっ
   て生産され、ＬＤ７８ポリペプチドまたはその断片に結
   合性を有するモノクローン抗体。
2. 【請求項２】 受託番号第１３５７２号(ＦＥＲＭ Ｐ-
   １３５７２)として工業技術院生命工学工業技術研究所
   に寄託されたハイブリドーマが産生する抗体である請求
   項１記載のモノクローン抗体。
3. 【請求項３】 ＬＤ７８ポリペプチドまたはその断片に
   結合性を有するモノクローン抗体を利用するヒト自己免
   疫疾患の診断方法。
4. 【請求項４】 ヒト自己免疫疾患が潰瘍性大腸炎および
   クローン病より選ばれる難治性炎症性腸管障害である請
   求項３記載のヒト自己免疫疾患の診断方法。
5. 【請求項５】 ＬＤ７８ポリペプチドまたはその断片に
   結合性を有するモノクローン抗体を利用する血球貪食性
   組織球食作用(Hemophagocytic Histiocytosis;以下、Ｈ
   Ｈと称することがある)に起因する疾患の診断方法。
6. 【請求項６】 血球貪食性組織球食作用に起因する疾患
   が血球貪食症候群(Hemophagocytic syndorome;以下、Ｈ
   Ｓと称することがある)である請求項５記載の診断方
   法。
7. 【請求項７】 ＬＤ７８ポリペプチドまたはその断片に
   結合性を有するモノクローン抗体またはそのヒト型化抗
   体もしくはその断片を含有するヒト自己免疫疾患予防・
   治療剤。
8. 【請求項８】 ヒト自己免疫疾患が潰瘍性大腸炎および
   クローン病より選ばれる難治性炎症性腸管障害である請
   求項７記載のヒト自己免疫疾患予防・治療剤。