JPH0768271B2 - ヒトオステオカルシンの製造法 - Google Patents
ヒトオステオカルシンの製造法Info
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- JPH0768271B2 JPH0768271B2 JP1223203A JP22320389A JPH0768271B2 JP H0768271 B2 JPH0768271 B2 JP H0768271B2 JP 1223203 A JP1223203 A JP 1223203A JP 22320389 A JP22320389 A JP 22320389A JP H0768271 B2 JPH0768271 B2 JP H0768271B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
- C07K1/062—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for alpha- or omega-carboxy functions
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明はヒトの骨代謝、および老化の重要な指標となる
ヒトオステオカルシンの製造法に関する。
ヒトオステオカルシンの製造法に関する。
（従来の技術及び発明が解決しよとする課題） オステオカルシン（BGP）は、骨の非コラーゲン性タン
パク質の約15〜20％を占めるビタミンＫ依存性カルシウ
ム結合性タンパクであり、骨形成、骨吸入の双方に密接
に関係していると考えられている［日本骨代謝学会誌
４、56、1986］。Poserらは、ヒトオステオカルシンに
ついて、その１次構造を解析し、ヒトオステオカルシン
は次のアミト酸配列を有する17位がグルタミン酸である
Glu17−オステオカルシンとγ−カルボキシグルタミン
酸であるGla17−オステオカルシンが91:9の割合で存在
する混合物であることを報告した［Poser,J.W.,et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.,255,8685−8691（1980）］。
パク質の約15〜20％を占めるビタミンＫ依存性カルシウ
ム結合性タンパクであり、骨形成、骨吸入の双方に密接
に関係していると考えられている［日本骨代謝学会誌
４、56、1986］。Poserらは、ヒトオステオカルシンに
ついて、その１次構造を解析し、ヒトオステオカルシン
は次のアミト酸配列を有する17位がグルタミン酸である
Glu17−オステオカルシンとγ−カルボキシグルタミン
酸であるGla17−オステオカルシンが91:9の割合で存在
する混合物であることを報告した［Poser,J.W.,et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.,255,8685−8691（1980）］。
（式中、Ｘはγ−カルボキシグルタミン酸残基（Gla）
又はグルタミン酸残基（Glu）を表わす。） しかしながら、これまで既に知られているウシ、メカジ
キ、ネコ、ニワトリ、ラット、ヤギ、ブタ及びラット等
のオステオカルシンは、対応する部位がすべてγ−カル
ボキシグルタミン酸である。この理由として、Poserら
はヒトオステオカルシンの抽出材料として、老人の石灰
化骨を用いたためであり、加齢により17位のグルタミン
酸がγ−カルボキシグルタミン酸に変化すると推定して
いる。
又はグルタミン酸残基（Glu）を表わす。） しかしながら、これまで既に知られているウシ、メカジ
キ、ネコ、ニワトリ、ラット、ヤギ、ブタ及びラット等
のオステオカルシンは、対応する部位がすべてγ−カル
ボキシグルタミン酸である。この理由として、Poserら
はヒトオステオカルシンの抽出材料として、老人の石灰
化骨を用いたためであり、加齢により17位のグルタミン
酸がγ−カルボキシグルタミン酸に変化すると推定して
いる。
このような観点からヒトオステオカルシン測定系を確立
することは、ページェット病、骨転移などの骨疾患診断
に臨床上百有用てあるだけでなく、さらに、ヒトオステ
オカルシンの17位Gla及びGluをそれぞれ個別に認識する
抗体及び抗血清を調製することにより、老化との関連を
調べることができると期待される。
することは、ページェット病、骨転移などの骨疾患診断
に臨床上百有用てあるだけでなく、さらに、ヒトオステ
オカルシンの17位Gla及びGluをそれぞれ個別に認識する
抗体及び抗血清を調製することにより、老化との関連を
調べることができると期待される。
しかしながらGla17ヒトオステオカルシン及びGlu17ヒト
オステオカルシンを分別定量する測定系はもとより、標
準品としてヒトオステオカルシンを用いるヒトオステオ
カルシン測定系は存在しない。これは、特異抗体又は抗
血清作製用として、また、標準品としてのGla17ヒトオ
ステオカルシン、Glu17ヒトオステオカルシンが入手で
きないことにある。
オステオカルシンを分別定量する測定系はもとより、標
準品としてヒトオステオカルシンを用いるヒトオステオ
カルシン測定系は存在しない。これは、特異抗体又は抗
血清作製用として、また、標準品としてのGla17ヒトオ
ステオカルシン、Glu17ヒトオステオカルシンが入手で
きないことにある。
最近本発明者らは、ペプチド合成法においてγ−カルボ
キシグルタミン酸の導入に利用可能な 式 （式中、ｎは０、１又は２を表す） で示される新規なＬ−γ−カルボキシグルタミン酸誘導
体を発明し、特願昭63−54892号（特開平１−228951
号）として出願している。本発明者らは、これを利用し
て17位、21位及び24位にGlaを導入してGla17オステオカ
ルシンを合成し、また21位及び24位にGlaを導入してGlu
17ヒトオステオカルシンを化学合成により製造する方法
につき鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
キシグルタミン酸の導入に利用可能な 式 （式中、ｎは０、１又は２を表す） で示される新規なＬ−γ−カルボキシグルタミン酸誘導
体を発明し、特願昭63−54892号（特開平１−228951
号）として出願している。本発明者らは、これを利用し
て17位、21位及び24位にGlaを導入してGla17オステオカ
ルシンを合成し、また21位及び24位にGlaを導入してGlu
17ヒトオステオカルシンを化学合成により製造する方法
につき鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
なお、本明細書において使用する略称、略号の意味、意
義は以下の通りである。
義は以下の通りである。
1.アミノ酸について Ala:アラニン、Arg:アルギニン、Asn:アスパラギン、As
p:アスパラギン酸、Cys:システィン、Gla:γ−カルボキ
シグルタミン酸、Gln:グルタミン、Glu:グルタミン酸、
Gly:グリシン、His:ヒスチジン、Ile:イソロイシン、Le
u:ロイシン、Phe:フェニルアラニン:Pro:プロリン、Tr
p:トリプトファン、Tyr:チロシン、Val:バリン。
p:アスパラギン酸、Cys:システィン、Gla:γ−カルボキ
シグルタミン酸、Gln:グルタミン、Glu:グルタミン酸、
Gly:グリシン、His:ヒスチジン、Ile:イソロイシン、Le
u:ロイシン、Phe:フェニルアラニン:Pro:プロリン、Tr
p:トリプトファン、Tyr:チロシン、Val:バリン。
各々、対応するアミノ酸残基を示す場合もある。
2.保護基について Boc:t−ブチルオキシカルボニル、But:t−ブチル、Bzl:
ベンジル、OBzl:ベンジルエステル、OBut:t−ブチルエ
ステル、OcHex:シクロヘキシルエステル、Br−Z:2−ブ
ロモベンジルオキシカルボニル、4CHT3・Bzl:4−メチル
ベンジル、Dnp:ジニトロフェニル、MBzl:メトキシベン
ジル、Cl2Bzl:2,6−ジクロロベンジル、Mtr:4−メトキ
シ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、Mts:メシ
チレン−２−スルホニル、Acm:アセトアミドメチル、To
s:p−トルエンスルホニル、Emoc:9−フルオレニルメチ
オノキシカルボニル。
ベンジル、OBzl:ベンジルエステル、OBut:t−ブチルエ
ステル、OcHex:シクロヘキシルエステル、Br−Z:2−ブ
ロモベンジルオキシカルボニル、4CHT3・Bzl:4−メチル
ベンジル、Dnp:ジニトロフェニル、MBzl:メトキシベン
ジル、Cl2Bzl:2,6−ジクロロベンジル、Mtr:4−メトキ
シ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、Mts:メシ
チレン−２−スルホニル、Acm:アセトアミドメチル、To
s:p−トルエンスルホニル、Emoc:9−フルオレニルメチ
オノキシカルボニル。
3.試薬について DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド、HOBt:1−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール、DTT:ジチオスレイトール、DC
M:ジクロロメタン、DMF:ジメチルホルムアミド、MeOH:
メタノール、DIEA:ジイソプロピルエチルアミン、THF:
テトラヒドロフラン、TFA:トリフルオロ酢酸、HF:フッ
化水素、CH3CN:アセトニトリル、NMP:N−メチルピロリ
ドン、DMSO:ジメチルスルホキシド。
キシベンゾトリアゾール、DTT:ジチオスレイトール、DC
M:ジクロロメタン、DMF:ジメチルホルムアミド、MeOH:
メタノール、DIEA:ジイソプロピルエチルアミン、THF:
テトラヒドロフラン、TFA:トリフルオロ酢酸、HF:フッ
化水素、CH3CN:アセトニトリル、NMP:N−メチルピロリ
ドン、DMSO:ジメチルスルホキシド。
本発明は、ヒトオステオカルシンのペプチド合成法にお
いて、 式 （式中、ｎは０、１又は２を表す） で示される保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸又はそ
の塩を基いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入するこ
とを特徴とするGla17オステオカルシン及びGlu17オステ
オカルシン又はこれらの塩の製造法である。
いて、 式 （式中、ｎは０、１又は２を表す） で示される保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸又はそ
の塩を基いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入するこ
とを特徴とするGla17オステオカルシン及びGlu17オステ
オカルシン又はこれらの塩の製造法である。
ペプチド合成は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本
生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；“蛋白質の化学"4
巻、東京化学同人発行（1977）；及び、泉谷信夫ほか著
“ペプチド合成の基礎と実験“丸善（株）発行（1985）
に記載されている方法に準じて液相法又は固相法で行う
ことができる。本発明のヒトオステオカルシンの合成法
としては、固相法が好ましい。
生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；“蛋白質の化学"4
巻、東京化学同人発行（1977）；及び、泉谷信夫ほか著
“ペプチド合成の基礎と実験“丸善（株）発行（1985）
に記載されている方法に準じて液相法又は固相法で行う
ことができる。本発明のヒトオステオカルシンの合成法
としては、固相法が好ましい。
以下、固相法により本発明のGla17ヒトオステオカルシ
ン及びその塩を合成する場合について説明する。
ン及びその塩を合成する場合について説明する。
まず、目的とするヒトオステオカルシンのＣ末端アミノ
酸、すなわちValを保護アミノ酸として不溶性樹脂に結
合させる。このようなＣ末端保護アミノ酸を不溶性樹脂
に結合させた保護アミノ酸樹脂は市販品を購入して用い
ることも可能である。次いで、ヒトオステオカルシンの
アミノ酸配列によってＣ末端側から保護アミノ酸を順次
結合させ、保護ペプチド樹脂を得る。不溶性樹脂として
は、当該技術分野で知られたもののいずれであってもよ
く、例えば、HFで脱離可能なクロロメチル樹脂、オキシ
メチル樹脂、４−（オキシメチル）フェニルアセタミド
メチル樹脂（以下Pam樹脂と呼ぶ）等が挙げられる。
酸、すなわちValを保護アミノ酸として不溶性樹脂に結
合させる。このようなＣ末端保護アミノ酸を不溶性樹脂
に結合させた保護アミノ酸樹脂は市販品を購入して用い
ることも可能である。次いで、ヒトオステオカルシンの
アミノ酸配列によってＣ末端側から保護アミノ酸を順次
結合させ、保護ペプチド樹脂を得る。不溶性樹脂として
は、当該技術分野で知られたもののいずれであってもよ
く、例えば、HFで脱離可能なクロロメチル樹脂、オキシ
メチル樹脂、４−（オキシメチル）フェニルアセタミド
メチル樹脂（以下Pam樹脂と呼ぶ）等が挙げられる。
「保護アミノ酸」とは、官能基を公知の方法により保護
したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されて
いる。本発明のヒトオステオカルシンを合成する場合に
は、以下に示す保護アミノ酸のいずれかを選択するのが
好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はBo
c又はFmocである。Argのグアニジノ基の保護基は、To
s、NO2、Ntrである。Asp、Gluのカルボキシル基の保護
基は、OBzl、OBut、OcHexである。Cysのメルカプト基の
保護基は4CH3・Bzl、MBzl、Acmである。Hisのイミダゾ
リル基の保護基はTos、Dnp、Fmocである。Trpのインド
リル保護基は、HCOか、あるいは保護しなくてもよい。T
yrの水酸基の保護基は、Br−Ｚ、Cl2・Bzl、Bzl、Butで
あるか、あるいは保護しなくてもよい。
したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されて
いる。本発明のヒトオステオカルシンを合成する場合に
は、以下に示す保護アミノ酸のいずれかを選択するのが
好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はBo
c又はFmocである。Argのグアニジノ基の保護基は、To
s、NO2、Ntrである。Asp、Gluのカルボキシル基の保護
基は、OBzl、OBut、OcHexである。Cysのメルカプト基の
保護基は4CH3・Bzl、MBzl、Acmである。Hisのイミダゾ
リル基の保護基はTos、Dnp、Fmocである。Trpのインド
リル保護基は、HCOか、あるいは保護しなくてもよい。T
yrの水酸基の保護基は、Br−Ｚ、Cl2・Bzl、Bzl、Butで
あるか、あるいは保護しなくてもよい。
各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適切なものを選
択する必要がある。
択する必要がある。
Glaヒトオステオカルシンにおける17位、21位及び24位
のGla及びGluヒトオステオカルシンにおける21位及び24
位のGlaは、前記式（II）の保護Glaとして導入すること
ができる。この保護Glaの合成は、特願昭63−54892号
（特開平１−228951号）に記載の次の方法により行うこ
とができる。
のGla及びGluヒトオステオカルシンにおける21位及び24
位のGlaは、前記式（II）の保護Glaとして導入すること
ができる。この保護Glaの合成は、特願昭63−54892号
（特開平１−228951号）に記載の次の方法により行うこ
とができる。
（上記反応式中、Bocはｔ−ブチルオキシカルボニル
基、Bzlはベンジル基、Tsはトシル基、Etはエチル基を
表わし、ｎは０、１又は２を表わす） すなわち先ず、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルセリン
（IV）とハロゲン化ベンジルとを反応させてベンジルエ
ステル（Ｖ）を合成し（工程ａ）、次にこれをｐ−トル
エンスルホニルクロリドと反応させてエステル誘導体
（VI）とし（工程ｂ）、これにジエチルアミン等の塩基
を作用させてＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニルデヒドロ
アラニンベンジルエステル（VII）を合成する（工程
ｃ）。
基、Bzlはベンジル基、Tsはトシル基、Etはエチル基を
表わし、ｎは０、１又は２を表わす） すなわち先ず、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルセリン
（IV）とハロゲン化ベンジルとを反応させてベンジルエ
ステル（Ｖ）を合成し（工程ａ）、次にこれをｐ−トル
エンスルホニルクロリドと反応させてエステル誘導体
（VI）とし（工程ｂ）、これにジエチルアミン等の塩基
を作用させてＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニルデヒドロ
アラニンベンジルエステル（VII）を合成する（工程
ｃ）。
一方、マロン酸ジメチル（VIII）をエステル交換してマ
ロン酸ジシクロアルキルエステル（IX）を生成させる
（工程ｄ）。この化合物（IX）を、塩基として水素化ナ
トリウムの存在下で、工程ｃで得られた化合物（VIII）
と反応させて化合物（Ｘ）を合成する（工程ｅ）。更に
これを還元して、目的とするγ−カルボキシグルタミン
酸誘導体（XI）を製造する（工程ｆ）。所望の場合は、
この得られた化合物（XI）を、キニーネ等の光学分割剤
を用いたジアステレオマー塩法によって光学分割して式
（XI）の光学活性体（Ｌ体）（XII）を製造する（工程
ｇ）。
ロン酸ジシクロアルキルエステル（IX）を生成させる
（工程ｄ）。この化合物（IX）を、塩基として水素化ナ
トリウムの存在下で、工程ｃで得られた化合物（VIII）
と反応させて化合物（Ｘ）を合成する（工程ｅ）。更に
これを還元して、目的とするγ−カルボキシグルタミン
酸誘導体（XI）を製造する（工程ｆ）。所望の場合は、
この得られた化合物（XI）を、キニーネ等の光学分割剤
を用いたジアステレオマー塩法によって光学分割して式
（XI）の光学活性体（Ｌ体）（XII）を製造する（工程
ｇ）。
前記工程ａは、ｔ−ブチルオキシカルボニルセリン（I
V）のアセトン溶液に、ベンジルプロミド及びトリエチ
ルアミン等の塩基を添加し、室温〜100℃、好ましくは4
0℃〜70℃の温度で、５時間以上、好ましくは20〜60時
間加熱還流することによって実施することができる。反
応終了後、生成物をエーテルによって抽出し、溶媒を減
圧留去すると化合物（Ｖ）が得られる。
V）のアセトン溶液に、ベンジルプロミド及びトリエチ
ルアミン等の塩基を添加し、室温〜100℃、好ましくは4
0℃〜70℃の温度で、５時間以上、好ましくは20〜60時
間加熱還流することによって実施することができる。反
応終了後、生成物をエーテルによって抽出し、溶媒を減
圧留去すると化合物（Ｖ）が得られる。
工程ｂは、工程ａで得られた化合物（Ｖ）をピリジン等
の溶媒に溶解し、これにｐ−トルエンスルホニルクロリ
ドを加えて−20℃〜40℃、好ましくは−10℃〜10℃の温
度で、0.5〜20時間、好ましくは２〜８時間攪拌するこ
とによって実施することができる。反応終了後、生成混
合物に冷水を加えて攪拌し、生じた結晶を濾取すると化
合物（VI）が得られる。
の溶媒に溶解し、これにｐ−トルエンスルホニルクロリ
ドを加えて−20℃〜40℃、好ましくは−10℃〜10℃の温
度で、0.5〜20時間、好ましくは２〜８時間攪拌するこ
とによって実施することができる。反応終了後、生成混
合物に冷水を加えて攪拌し、生じた結晶を濾取すると化
合物（VI）が得られる。
工程ｃは、得られた化合物（VI）を酢酸エチル／ジエチ
ルエーテルエ混合溶液に溶解し、これにジエチルアミン
等の塩基を加え、−20℃〜40℃、好ましくは０℃〜30℃
の温度で、0.5〜20時間、好ましくは２〜６時間攪拌す
ることによって実施することができる。反応終了後、反
応液を濾過し、溶媒を減圧留去すると化合物（VII）が
得られる。
ルエーテルエ混合溶液に溶解し、これにジエチルアミン
等の塩基を加え、−20℃〜40℃、好ましくは０℃〜30℃
の温度で、0.5〜20時間、好ましくは２〜６時間攪拌す
ることによって実施することができる。反応終了後、反
応液を濾過し、溶媒を減圧留去すると化合物（VII）が
得られる。
工程ｄは、マロン酸ジメチル（VII）のトルエン溶液
に、シクロアルカノールおよびｐ−トルエンスルホン酸
のような触媒を加えて、50〜200℃、好ましくは90〜120
℃の温度で、生成するメタノールを留去しながら５時間
以上、好ましくは20〜60時間加熱攪拌することによって
実施することができる。反応終了後、生成物を炭酸水素
ナトリウム溶液で洗浄し、溶媒を減圧留去した後に、蒸
留によって化合物（IX）が得られる。
に、シクロアルカノールおよびｐ−トルエンスルホン酸
のような触媒を加えて、50〜200℃、好ましくは90〜120
℃の温度で、生成するメタノールを留去しながら５時間
以上、好ましくは20〜60時間加熱攪拌することによって
実施することができる。反応終了後、生成物を炭酸水素
ナトリウム溶液で洗浄し、溶媒を減圧留去した後に、蒸
留によって化合物（IX）が得られる。
工程ｅは、水素化ナトリウムをTHF等の溶媒に懸濁した
溶液に化合物（IX）を添加し、−40〜70℃、好ましくは
−10〜40℃の温度で0.1〜10時間、好ましくは0.5〜２時
間攪拌し、続いて化合物（VII）を同じ溶媒に溶解した
溶液を滴下し、−40〜70℃、好ましくは−10〜25℃の温
度で0.1〜20時間、好ましくは0.5〜10時間攪拌すること
によって実施することができる。ここで用いることので
きる溶媒としては、THFの他には、トルエン、エチルエ
ーテル、ジオキサン等を挙げることができる。反応終了
後、抽出、カラムクロマトグラフィー等のような通常の
単離精製操作によって化合物（Ｘ）が得られる。
溶液に化合物（IX）を添加し、−40〜70℃、好ましくは
−10〜40℃の温度で0.1〜10時間、好ましくは0.5〜２時
間攪拌し、続いて化合物（VII）を同じ溶媒に溶解した
溶液を滴下し、−40〜70℃、好ましくは−10〜25℃の温
度で0.1〜20時間、好ましくは0.5〜10時間攪拌すること
によって実施することができる。ここで用いることので
きる溶媒としては、THFの他には、トルエン、エチルエ
ーテル、ジオキサン等を挙げることができる。反応終了
後、抽出、カラムクロマトグラフィー等のような通常の
単離精製操作によって化合物（Ｘ）が得られる。
工程ｆは、得られた化合物（Ｘ）を触媒の存在下、０〜
80℃、好ましくは10〜40℃の温度で0.1〜20時間、好ま
しくは0.5〜10時間還元することによって実施すること
ができる。ここで用いることのできる還元触媒として
は、パラジウム−炭素、白金−炭素等を挙げることがで
きる。反応終了後、溶媒を減圧留去すると化合物（XI）
が得られる。
80℃、好ましくは10〜40℃の温度で0.1〜20時間、好ま
しくは0.5〜10時間還元することによって実施すること
ができる。ここで用いることのできる還元触媒として
は、パラジウム−炭素、白金−炭素等を挙げることがで
きる。反応終了後、溶媒を減圧留去すると化合物（XI）
が得られる。
工程ｇは、化合物（XI）を酢酸エチルに溶解し、これ
に、光学分割試薬を添加した後に、取、メタノールに
よる再結晶を繰り返すことによって実施することができ
る。ここで用いることのできる光学分割試薬としては、
キニーネ、プルシン、シンコニジン、シンコニン等のよ
うなアルカロイド類、（Ｒ）−（＋）−１−フェネチル
アミン、（Ｓ）−（−）−１−フェネチルアミン、
（Ｒ）−（＋）−１−（１−ナフチル）エチルアミン、
（Ｓ）−（−）−１−（１−ナフチル）エチルアミン等
のようなアミン類、チロシンヒドラジド等のようなヒド
ラジド類等を挙げることができる。反応後、生成物を脱
塩してｎ−ヘキサンによって結晶化した後に取する
と、化合物（XI）の光学活性体（Ｌ体）（XII）が得ら
れる。
に、光学分割試薬を添加した後に、取、メタノールに
よる再結晶を繰り返すことによって実施することができ
る。ここで用いることのできる光学分割試薬としては、
キニーネ、プルシン、シンコニジン、シンコニン等のよ
うなアルカロイド類、（Ｒ）−（＋）−１−フェネチル
アミン、（Ｓ）−（−）−１−フェネチルアミン、
（Ｒ）−（＋）−１−（１−ナフチル）エチルアミン、
（Ｓ）−（−）−１−（１−ナフチル）エチルアミン等
のようなアミン類、チロシンヒドラジド等のようなヒド
ラジド類等を挙げることができる。反応後、生成物を脱
塩してｎ−ヘキサンによって結晶化した後に取する
と、化合物（XI）の光学活性体（Ｌ体）（XII）が得ら
れる。
保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、DCC
法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カ
ルボニルイミダゾール法、DCC−HOBt法、ジフェニルホ
スホリルアジド法等にて行うことができるが、DCC法、D
CC−HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。これらの縮合
反応は、通常、DCM、DMF、NMP、クロロホルム、DMSO、
ベンゼン等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行う
が、DCM、DMF又はこれらの混合溶媒中で行うのが好まし
い。α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、TFA/DC
M、HCl/ジオキサン、ピペリジン/DMF等が用いられ、該
保護基の種類により適宜選択する。また、合成の各段階
における縮合反応の進行の程度はE.カイザーらの方法
［Anal.Biochem.,34,595（1970）］（ニンヒドリン反応
法）等によって検査される。
法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カ
ルボニルイミダゾール法、DCC−HOBt法、ジフェニルホ
スホリルアジド法等にて行うことができるが、DCC法、D
CC−HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。これらの縮合
反応は、通常、DCM、DMF、NMP、クロロホルム、DMSO、
ベンゼン等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行う
が、DCM、DMF又はこれらの混合溶媒中で行うのが好まし
い。α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、TFA/DC
M、HCl/ジオキサン、ピペリジン/DMF等が用いられ、該
保護基の種類により適宜選択する。また、合成の各段階
における縮合反応の進行の程度はE.カイザーらの方法
［Anal.Biochem.,34,595（1970）］（ニンヒドリン反応
法）等によって検査される。
以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペ
プチド樹脂を得るがその具体的な例を以下に示す。
プチド樹脂を得るがその具体的な例を以下に示す。
保護ペプチド樹脂は、ペプチド樹脂から脱離させ、更に
各アミノ酸の側鎖保護基を脱離させる試薬、例えば、H
F、TFA等で処理すること（最終脱保護反応）により、Cy
sのメルカプト基が遊離したペプチドとして得られる。
各アミノ酸の側鎖保護基を脱離させる試薬、例えば、H
F、TFA等で処理すること（最終脱保護反応）により、Cy
sのメルカプト基が遊離したペプチドとして得られる。
このペプチドを緩衡溶液中で酸化し、分子内ジスルフィ
ド結合を形成させることにより、粗ヒトオステオカルシ
ンを得ることができる。すなわち、Cysのメルカプト基
遊離の粗ヒトオステオカルシンを10-3〜10-7mol/、好
ましくは10-4〜10-5mol/の濃度になるように緩衡液に
溶解し、pHを6.0〜8.5、好ましくはpH7.0〜8.0に調製
後、４〜50℃、好ましくは４℃〜室温で４時間〜30時間
攪拌することにより粗ヒトオステオカルシンを得ること
ができる。この反応に用いられる緩衡液は公知のもの
で、例えば、酢酸アンモニウム、Tris・HCl等が挙げら
れる。また本反応促進剤としてフェリシアン酸塩（フェ
リシアン化カリウムなど）を加えることができる。
ド結合を形成させることにより、粗ヒトオステオカルシ
ンを得ることができる。すなわち、Cysのメルカプト基
遊離の粗ヒトオステオカルシンを10-3〜10-7mol/、好
ましくは10-4〜10-5mol/の濃度になるように緩衡液に
溶解し、pHを6.0〜8.5、好ましくはpH7.0〜8.0に調製
後、４〜50℃、好ましくは４℃〜室温で４時間〜30時間
攪拌することにより粗ヒトオステオカルシンを得ること
ができる。この反応に用いられる緩衡液は公知のもの
で、例えば、酢酸アンモニウム、Tris・HCl等が挙げら
れる。また本反応促進剤としてフェリシアン酸塩（フェ
リシアン化カリウムなど）を加えることができる。
このようにして得られたペプチドは、ペプチド製造の常
套的手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフ
ィー（ゲル過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電
気泳動、向流分配等により単離精製することができる
が、逆相高速クロマトグラフィー（逆相HPLC）による方
法がもっとも効果的である。
套的手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフ
ィー（ゲル過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電
気泳動、向流分配等により単離精製することができる
が、逆相高速クロマトグラフィー（逆相HPLC）による方
法がもっとも効果的である。
（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例により制限されるものではない。
明はこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１ 次式 で示されるGla17ヒトオステオカルシンの合成 （１）Boc−Val−Pamへの48位Proの導入 １）脱保護及び中和 Boc−Val−Pam（0.67mmol/g）0.746gをDCMで２回洗浄し
た。この樹脂に33％TFA溶液（溶媒;DCM）8mlを加えて80
秒間攪拌後、過した。更に50％TFA溶液（溶媒;DCM）8
mlを加え、18.5分間攪拌後過してBoc基を脱離させ
た。得られた樹脂を下記の溶媒で順次処理し、各々の処
理後に過した。
た。この樹脂に33％TFA溶液（溶媒;DCM）8mlを加えて80
秒間攪拌後、過した。更に50％TFA溶液（溶媒;DCM）8
mlを加え、18.5分間攪拌後過してBoc基を脱離させ
た。得られた樹脂を下記の溶媒で順次処理し、各々の処
理後に過した。
DCM（３回、各30秒） 10％DIEA/DMF（２回、各１分） DMF（５回、各30秒） ２）Boc−Pro対称酸無水物の調製 Boc−Pro2mmlをDCM3mlに溶解後、これに0.5M DCC溶液
（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間化反応させ、対称酸無
水物を形成させた。副生するジシクロヘキシルウレアを
別して除いた後、4mlのDMFを加え、つづいて反応液中
のDCMを留去した。
（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間化反応させ、対称酸無
水物を形成させた。副生するジシクロヘキシルウレアを
別して除いた後、4mlのDMFを加え、つづいて反応液中
のDCMを留去した。
３）縮合反応 ２）で調製したBoc−Pro対称酸無水物のDMF溶液を１）
で調製したVal−Pamに加え、室温で18分間反応させた。
反応終了後DCMで５回洗浄した。
で調製したVal−Pamに加え、室温で18分間反応させた。
反応終了後DCMで５回洗浄した。
（２）47〜１位の各アミノ酸の導入 （１）と同様にして、Boc−Pro−Val−Pamに、Gla17ヒ
トオステオカルシンの47位から１位までの各構成アミノ
酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリングさせた。
表１に各反応段階で用いた保護アミノ酸、合成方法等を
示す。
トオステオカルシンの47位から１位までの各構成アミノ
酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリングさせた。
表１に各反応段階で用いた保護アミノ酸、合成方法等を
示す。
表中、合成サイクルに関し、方法、方法、方法は
それぞれ次の手順で脱保護、中和及び縮合反応を行うこ
とを意味する。
それぞれ次の手順で脱保護、中和及び縮合反応を行うこ
とを意味する。
＜方法＞ １）33％TFA（溶媒;DCM）による脱保護80秒 ２）50％TFA（溶媒;DCM）による脱保護18.5分 ３）DCM洗浄３回、各30秒 ４）10％DIEA/DMFによる中和２回各１分 ５）DMF洗浄５回、各30秒 ６）縮合反応18分 ７）DCM洗浄５回、各30秒 ＜方法＞ １）〜５）方法に同じ ６）縮合反応26分 ７）方法に同じ ＜方法＞ １）〜５）方法に同じ ６）縮合反応42分 ７）DMF洗浄３回、各30秒 ８）10％DIEA/DMFによる中和45秒 ９）DMF洗浄30秒 10）DCM洗浄３回、各30秒 11）縮合反応42分 12）DMF洗浄30秒 13）DCM洗浄５回、各30秒 また、表中、対称酸無水物又はHOBtエステルの合成に関
し、方法、方法、方法、方法、方法はそれぞ
れ次の手順により対称酸無水物又はHOBtエステルの合成
を行うことを意味する。
し、方法、方法、方法、方法、方法はそれぞ
れ次の手順により対称酸無水物又はHOBtエステルの合成
を行うことを意味する。
＜方法＞ Boc−アミノ酸2mmolをDCM3mlに溶解後、これに0.5M DC
C溶液（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間反応させ、対称酸
無水物を形成させた。副生するジシクロヘキシルウレア
を別して除いた後、4mlのDMFを加え、つづいて反応液
中のDCMを留去した。
C溶液（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間反応させ、対称酸
無水物を形成させた。副生するジシクロヘキシルウレア
を別して除いた後、4mlのDMFを加え、つづいて反応液
中のDCMを留去した。
＜方法＞ Boc−アミノ酸2mmlをDCM3mlに溶解後、これに0.5M DCC
溶液（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間反応させ、対称酸
無水物を形成させた。副生するジシクロヘキシルウレア
を別して除いた後、1mlのDMFを加え、つづいて反応液
中をDCMを留去した。
溶液（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間反応させ、対称酸
無水物を形成させた。副生するジシクロヘキシルウレア
を別して除いた後、1mlのDMFを加え、つづいて反応液
中をDCMを留去した。
＜方法＞ Boc−アミノ酸2mmolをDMF0.3ml、DCM2.5mlに溶解後、こ
れに0.5MDCC溶液（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間反応さ
せ、対称酸無水物を形成させた。副生するジシクロヘキ
シルウレアを別して除いた後、4mlのDMFを加え、つづ
いて反応液中のDCMを留去した。
れに0.5MDCC溶液（溶媒;DCM）2mlを加え、８分間反応さ
せ、対称酸無水物を形成させた。副生するジシクロヘキ
シルウレアを別して除いた後、4mlのDMFを加え、つづ
いて反応液中のDCMを留去した。
＜方法＞ Boc−アミノ酸2mmolに0.5M HOBt4ml及びDCM0.3mlを加
え溶解後、これに0.5M DCC溶液（溶媒;DCM）4mlを加
え、33分間反応させ、HOBtエステルを形成させた。副生
するジシクロヘキシルウレアを別して除いた後、反応
液中のDCM3mlを留去した。本操作によるHOBtエステルの
調製は１残基につき２回行った。
え溶解後、これに0.5M DCC溶液（溶媒;DCM）4mlを加
え、33分間反応させ、HOBtエステルを形成させた。副生
するジシクロヘキシルウレアを別して除いた後、反応
液中のDCM3mlを留去した。本操作によるHOBtエステルの
調製は１残基につき２回行った。
＜方法＞ Boc−アミノ酸2mmolに0.5M HOBt4ml及びDCM1.5mlを加
え溶解後、これに0.5MDCC溶液（溶媒;DCM）4mlを加え、
33分間反応させ、HOBtエステルを形成させた。副生する
ジシクロフキシルウレアを別して除いた後、反応液中
のDCM3mlを留去した。本操作によるHOBtエステルの調製
は１残基につき２回行った。
え溶解後、これに0.5MDCC溶液（溶媒;DCM）4mlを加え、
33分間反応させ、HOBtエステルを形成させた。副生する
ジシクロフキシルウレアを別して除いた後、反応液中
のDCM3mlを留去した。本操作によるHOBtエステルの調製
は１残基につき２回行った。
１位のアミノ酸導入後、この樹脂ペプチドに33％TFA溶
液（溶媒;DCM）20mlを加え、80秒間攪拌後、過した。
更に50％TFA溶液（溶媒;DCM）20mlを加え、18.5分間攪
拌後、過してBoc基を脱離させた。得られた樹脂を下
記の溶媒で順次処理し、各々の処理後に過した。
液（溶媒;DCM）20mlを加え、80秒間攪拌後、過した。
更に50％TFA溶液（溶媒;DCM）20mlを加え、18.5分間攪
拌後、過してBoc基を脱離させた。得られた樹脂を下
記の溶媒で順次処理し、各々の処理後に過した。
DCM（３回、各30秒） 10％DIEA/DCM（２回、各１分） DCM（５回、各30秒） 次に、本樹脂ペプチドを一昼夜減圧乾燥して乾燥樹脂ペ
プチドを得た。
プチドを得た。
（３）HFによる分解 乾燥した樹脂ペルチドの一部（815mg）を秤量し、HF分
解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール2mlを
加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。攪拌子を入れた
前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研究所製）に取り
付け、ドライアイス−エタノール浴中に置き、HF18mlを
反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において１
時間、０℃で攪拌した。減圧下にHFを徐々に留去した。
３時間後、反応容器を取りはずし、無水ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
無水ジエチルエーテルで洗浄した。30％酢酸50ml中に樹
脂ペプチド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解
した。これを、塩交換の目的で予め酢酸型に置換し、Do
wex1×２イオン交換樹脂カラムを通した。素通り画分に
水を加えて酢酸濃度を1Nに調節した後、凍結乾燥して還
元型粗Gla17ヒトオステオカルシン475mgを得た。
解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール2mlを
加え、一夜放置し、樹脂を膨潤させた。攪拌子を入れた
前記反応容器をHF分解装置（ペプチド研究所製）に取り
付け、ドライアイス−エタノール浴中に置き、HF18mlを
反応容器中に導入した。この混合物を氷浴中において１
時間、０℃で攪拌した。減圧下にHFを徐々に留去した。
３時間後、反応容器を取りはずし、無水ジエチルエーテ
ルを用いて反応容器から樹脂ペプチド分解物を取出し、
無水ジエチルエーテルで洗浄した。30％酢酸50ml中に樹
脂ペプチド分解物を加え、脱保護されたペプチドを溶解
した。これを、塩交換の目的で予め酢酸型に置換し、Do
wex1×２イオン交換樹脂カラムを通した。素通り画分に
水を加えて酢酸濃度を1Nに調節した後、凍結乾燥して還
元型粗Gla17ヒトオステオカルシン475mgを得た。
（４）空気酸化によりジスルフィド結合の形成 （３）で得られた還元型粗ヒトオステオカルシンのう
ち、287mgを0.1M酢酸アンモニウム溶液（pH8.5）に溶解
し、100当量のDTTを加え、40℃で５時間還元した。この
還元操作で、メルカプト基の酸化によって生成する可能
性がある二量体が単量体にもどる。
ち、287mgを0.1M酢酸アンモニウム溶液（pH8.5）に溶解
し、100当量のDTTを加え、40℃で５時間還元した。この
還元操作で、メルカプト基の酸化によって生成する可能
性がある二量体が単量体にもどる。
この反応液に酢酸を加え、pHT4.0に調節後、遠心した。
上清を除去した後、沈殿物に30％酢酸を加え再溶解し
た。つづいてセファデックスG25（ファルマシア社製）
を用いたゲルクロマトグラフィーによりDTT及び塩を除
去した。次に還元型粗Gla17ヒトオステオカルシンを含
む画分を、0.1M酢酸アンモニウム溶液（pH7.5）にpHを
一定に保ちながら徐々に滴下した。このときのペプチド
濃度は約1.5×10-6Mとした。室温で15日間攪拌してジス
ルフィド結合を形成させた後、この反応液をオクタデシ
ルシリカを充填したカラム（ODSカラム、φ２×30cm）
に吸着させ、0.1％TFAで洗浄後、60％アセトニトリル溶
液でペプチドを溶出した。アセトニトリルを減圧留去
後、凍結乾燥して粗Gla17ヒトオステオカルシンを得
た。ジスルフィド形成反応は5,5′−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）を用いる公知のエルマンテストにて追
跡し、最終的に得られた反応物は95％の酸化率であっ
た。
上清を除去した後、沈殿物に30％酢酸を加え再溶解し
た。つづいてセファデックスG25（ファルマシア社製）
を用いたゲルクロマトグラフィーによりDTT及び塩を除
去した。次に還元型粗Gla17ヒトオステオカルシンを含
む画分を、0.1M酢酸アンモニウム溶液（pH7.5）にpHを
一定に保ちながら徐々に滴下した。このときのペプチド
濃度は約1.5×10-6Mとした。室温で15日間攪拌してジス
ルフィド結合を形成させた後、この反応液をオクタデシ
ルシリカを充填したカラム（ODSカラム、φ２×30cm）
に吸着させ、0.1％TFAで洗浄後、60％アセトニトリル溶
液でペプチドを溶出した。アセトニトリルを減圧留去
後、凍結乾燥して粗Gla17ヒトオステオカルシンを得
た。ジスルフィド形成反応は5,5′−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）を用いる公知のエルマンテストにて追
跡し、最終的に得られた反応物は95％の酸化率であっ
た。
（５）逆相HPLCによるGla17ヒトオステオカルシンの精
製 （４）で得られた粗Gla17ヒトオステオカルシンを30％
酢酸に溶解（10mg/ml）し、高速液体クロマトグラフィ
ーアイソクラティック溶出法により精製した。カラムは
YMC−Ｄ（ワイ・エム・シィ社製、φ２×30cm）を用
い、溶離液はＡ液として水（100）−10％TEA（１）、Ｂ
液として水（40）−アセトニトリル（60）−10％TEA
（１）を用い、Ａ（48）−Ｂ（52）の条件下で溶出させ
た。ここで、（ ）内は溶媒の体積比である。Gla17ヒ
トオステオカルシンに相当する画分を分取し、凍結乾燥
して白色粉末を得た。
製 （４）で得られた粗Gla17ヒトオステオカルシンを30％
酢酸に溶解（10mg/ml）し、高速液体クロマトグラフィ
ーアイソクラティック溶出法により精製した。カラムは
YMC−Ｄ（ワイ・エム・シィ社製、φ２×30cm）を用
い、溶離液はＡ液として水（100）−10％TEA（１）、Ｂ
液として水（40）−アセトニトリル（60）−10％TEA
（１）を用い、Ａ（48）−Ｂ（52）の条件下で溶出させ
た。ここで、（ ）内は溶媒の体積比である。Gla17ヒ
トオステオカルシンに相当する画分を分取し、凍結乾燥
して白色粉末を得た。
さらに上記の白色粉末を30％酢酸に溶解（10mg/ml）
し、前記と同様にして再精製した。溶出液はA/B＝51/49
を用いた。Gla17ヒトオステオカルシンに相当する画分
を分取し、凍結乾燥して白色粉末を得た。
し、前記と同様にして再精製した。溶出液はA/B＝51/49
を用いた。Gla17ヒトオステオカルシンに相当する画分
を分取し、凍結乾燥して白色粉末を得た。
再精製して得た白色粉末をさらに30％酢酸に溶解し（10
mg/ml）、再精製と同一条件にて再々精製した。Gla17と
ヒトオステオカルシンに相当する画分を分取し、凍結乾
燥して白色粉末を得た。本品を30％酢酸に溶解し、セフ
ァデックスG25ゲルクロマトグラフィーにより脱塩した
後、Gla17ヒトオステオカルシン画分に水を加えて酢酸
濃度を1Nに調節し、凍結乾燥して目的とするGla17ヒト
オステオカルシン6.6mgを得た。
mg/ml）、再精製と同一条件にて再々精製した。Gla17と
ヒトオステオカルシンに相当する画分を分取し、凍結乾
燥して白色粉末を得た。本品を30％酢酸に溶解し、セフ
ァデックスG25ゲルクロマトグラフィーにより脱塩した
後、Gla17ヒトオステオカルシン画分に水を加えて酢酸
濃度を1Nに調節し、凍結乾燥して目的とするGla17ヒト
オステオカルシン6.6mgを得た。
（６）精製Gla17ヒトオステオカルシンの構造確認と純
度検定。
度検定。
精製Gla17ヒトオステオカルシンのアミノ酸分析値を表
２に示す。
２に示す。
本品100μｇを１％NH4HCO3に溶解し、1/10当量のトリプ
シン−TRCK（ワーシントン社製）を加え、25℃で２時間
消化した。本消化物を下記測定条件の逆相HPLCにて分
析した結果、クロマトグラム上18.9分、47.6分、及び6
6.8分に３本の主要ピークを認め、かつアミノ酸分及びF
ab質量分析の結果からそれぞれGla17ヒトオステオカル
シンの45−49位、20−43位及び１−19位に相当するペプ
チドであることが判明した。
シン−TRCK（ワーシントン社製）を加え、25℃で２時間
消化した。本消化物を下記測定条件の逆相HPLCにて分
析した結果、クロマトグラム上18.9分、47.6分、及び6
6.8分に３本の主要ピークを認め、かつアミノ酸分及びF
ab質量分析の結果からそれぞれGla17ヒトオステオカル
シンの45−49位、20−43位及び１−19位に相当するペプ
チドであることが判明した。
測定条件 カラム;YMC−Ｒ（φ4.6×250mm） 流速;1ml/min 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFC＝40:60:1） 濃度勾配;A/B＝80/20（０分）→45/55（70分）→0/100
（70分）→0/100（73分） 測定波長;220nm 一方、精製Gla17ヒトオステオカルシンを下記の測定条
件の逆相HPLCで純度検定した。
（70分）→0/100（73分） 測定波長;220nm 一方、精製Gla17ヒトオステオカルシンを下記の測定条
件の逆相HPLCで純度検定した。
測定条件 カラム;YMC−Ｒ（φ4.6×250mm） 流速;1ml/min 溶離液;A液（水：アセトニトリル:10％TFA＝100:0:1） Ｂ液（水：アセトニトリル:10％TFA＝40:60:1） 濃度勾配;A/B＝100/0（０分）→100/0（５分）→0/100
（35分）→0/100（40分） 測定波長;220nm その結果、保持時間30.7分にペルチドに基づく単一の強
い吸収を深め、これが本発明のGla17ヒトオステオカル
シンであった。
（35分）→0/100（40分） 測定波長;220nm その結果、保持時間30.7分にペルチドに基づく単一の強
い吸収を深め、これが本発明のGla17ヒトオステオカル
シンであった。
実施例２ 次式 で示されるGlu17ヒトオステオカルシンの合成 17位のアミノ酸の導入において、Boc−Gla（OcHex）２
を用いるかわりに、Boc−Glu（OBzl）を用いた以外は、
実施例１と同様の条件にて固相合成を行い、保護ペプチ
ド樹脂を得た。保護ペプチド樹脂の一部（500mg）を実
施例１と同様にしてHF分解した。得られた還元型粗Glu
17ヒトオステオカルシンを実施例１と同様の方法で酸
化、精製し、Glu17ヒトオステオカルシン3.2mgを得た。
を用いるかわりに、Boc−Glu（OBzl）を用いた以外は、
実施例１と同様の条件にて固相合成を行い、保護ペプチ
ド樹脂を得た。保護ペプチド樹脂の一部（500mg）を実
施例１と同様にしてHF分解した。得られた還元型粗Glu
17ヒトオステオカルシンを実施例１と同様の方法で酸
化、精製し、Glu17ヒトオステオカルシン3.2mgを得た。
［発明の効果］ 本発明の方法によれば、Gla17ヒトオステオカルシン及
びGlu17ヒスオステオカルシンにおいて、Glaの導入が容
易となり、化学合成が可能になった。
びGlu17ヒスオステオカルシンにおいて、Glaの導入が容
易となり、化学合成が可能になった。
Claims (1)
- 【請求項１】ヒトオステオカルシンのペプチド合成法に
おいて、 式 （式中、ｎは０、１又は２を表す） で示される保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸又はそ
の塩を用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入するこ
とを特徴とするGla17ヒトオステオカルシン及びGlu17ヒ
トオステオカルシン又はこれらの塩の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1223203A JPH0768271B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | ヒトオステオカルシンの製造法 |
| EP90116754A EP0418617B1 (en) | 1989-08-31 | 1990-08-31 | Method for preparing human osteocalcin |
| DE69014042T DE69014042T2 (de) | 1989-08-31 | 1990-08-31 | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Osteocalcin. |
| US07/575,639 US5164483A (en) | 1989-08-31 | 1990-08-31 | Y-carboxyglutamate derivative, method for preparing the same and method for preparing human osteocalcin using the same |
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