JPH0770190A - ペプチド - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract
(57)【要約】
【目的】プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
１（ＰＡＩ−１）によるウロキナーゼ型プラスミン−ゲ
ンアクチベーター（ｕＰＡ）の阻害を特異的に阻害する
ペプチドを提供しこれにより脳梗塞等の血栓症、および
血栓溶解剤による再開通後の再閉塞ならびに播種性血管
内凝固症侯群（ＤＩＣ）の予防と治療のための医薬を提
供する。 【構成】上記ＰＡＩ−１阻害作用を示す本発明の化合物
は官能基としてグアニジン基またはアミノ基を含むアミ
ノ酸を少なくとも４個以上有するアミノ酸配列からなる
ペプチド並びにその誘導体及びその塩類である。
１（ＰＡＩ−１）によるウロキナーゼ型プラスミン−ゲ
ンアクチベーター（ｕＰＡ）の阻害を特異的に阻害する
ペプチドを提供しこれにより脳梗塞等の血栓症、および
血栓溶解剤による再開通後の再閉塞ならびに播種性血管
内凝固症侯群（ＤＩＣ）の予防と治療のための医薬を提
供する。 【構成】上記ＰＡＩ−１阻害作用を示す本発明の化合物
は官能基としてグアニジン基またはアミノ基を含むアミ
ノ酸を少なくとも４個以上有するアミノ酸配列からなる
ペプチド並びにその誘導体及びその塩類である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウロキナーゼ等の血栓溶
解酵素を阻害するＰＡＩ−１を特異的に阻害する合成ペ
プチドに関する。
解酵素を阻害するＰＡＩ−１を特異的に阻害する合成ペ
プチドに関する。
【従来の技術】線溶系は様々の生物学的過程、例えば血
管内での血栓溶解、ガン転移、血管新生、炎症あるいは
創傷治癒に重要な役割を演じている。この線溶系因子の
一員であるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ
ー−１（ＰＡＩ−１）は組織型プラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｔＰＡ）並びにウロキナーゼ型プラスミノー
ゲンアクチベータ（ｕＰＡ）の生理的阻害剤であり、線
溶系の最も重要な調節因子である。なお、プラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビター−２（ＰＡＩ−２）も
同様にｕＰＡの一種であるウロキナーゼ（ＵＫ）とｔＰ
Ａに対して阻害活性を有する、しかしながらＰＡＩ−２
による一本鎖ｔＰＡに対する不活性化の速度はＰＡＩ−
１によるものより顕著に低く、このことはＰＡＩ−１の
生理的重要性を強調するものである。ところで、線溶系
酵素阻害剤を阻害して線溶系を活性化する試みは古くか
らある。例えば抗炎症剤等にそのような作用が報告され
ている。しかし、これらの化合物は作用が弱くまた試験
官内では作用するが生体内では作用しない。さらに薬理
作用を示す濃度範囲と毒性を示す濃度範囲の解離がほと
んど無い等の理由により全く実用性はなかった。このよ
うに実用的な線溶系酵素阻害剤についての阻害剤はな
く、従って本発明の課題であるＰＡＩ−１とｕＰＡとの
反応の特異的阻害剤もこれまで報告されていなかった。
ところで近年ＰＡＩ−１とｔＰＡあるいはｕＰＡとの酵
素阻害のカイネテックスが研究されＰＡＩ−１が酵素の
触媒中心に不可逆的に結合する前にｔＰＡあるいはｕＰ
Ａ上の特異的な部位に水素結合によって可逆的に結合す
ることが知られ、本発明者等によってＰＡＩ−１による
ｔＰＡの阻害においてはこの特異的結合部位としてｔＰ
Ａクリングルドメイン２内のアミノ酸配列Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕが関与することが見出され
た（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，Ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ｍａｔ
ｕｄａ，Ｍ．，＆Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ．（１９９２）Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１，２４４−２４８， Ｋａｎｅ
ｋｏ，Ｍ．，Ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，
Ｍ．，＆Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，
１１６０−１１６６）．しかしながら、ＰＡＩ−１のｕ
ＰＡへの結合部位については知られていなかった。ここ
でｕＰＡの分類について述べる。ｕＰＡはウロキナーゼ
型プラスミノーゲンアクチベーターの略称であって一本
鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（以後
ｓｃｕＰＡと定義）、ウロキナーゼ（以後ＵＫと定
義）、低分子ウロキナーゼ（以後ＬＭＷＵＫと定義）に
分類される。ｓｃｕＰＡは酵素活性が無くプラスミン等
によりペプチド結合が切断されてクリングルドメインと
成長因子ドメインを酵素分子内に保有する高分子量ウロ
キナーゼ通称ウロキナーゼ（ＵＫ）を生じる。次にＬＭ
ＷＵＫは、ＵＫの分解が進みクリングルドメインと成長
因子ドメインが酵素分子から除去された形のものでイン
ビトロでの酵素活性はそれ程変らないが生体内において
血栓への集積性がＵＫに比べて悪くなっておりしたがっ
て臨床上はＵＫ並びにｓｃｕＰＡがより重要である。
管内での血栓溶解、ガン転移、血管新生、炎症あるいは
創傷治癒に重要な役割を演じている。この線溶系因子の
一員であるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ
ー−１（ＰＡＩ−１）は組織型プラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｔＰＡ）並びにウロキナーゼ型プラスミノー
ゲンアクチベータ（ｕＰＡ）の生理的阻害剤であり、線
溶系の最も重要な調節因子である。なお、プラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビター−２（ＰＡＩ−２）も
同様にｕＰＡの一種であるウロキナーゼ（ＵＫ）とｔＰ
Ａに対して阻害活性を有する、しかしながらＰＡＩ−２
による一本鎖ｔＰＡに対する不活性化の速度はＰＡＩ−
１によるものより顕著に低く、このことはＰＡＩ−１の
生理的重要性を強調するものである。ところで、線溶系
酵素阻害剤を阻害して線溶系を活性化する試みは古くか
らある。例えば抗炎症剤等にそのような作用が報告され
ている。しかし、これらの化合物は作用が弱くまた試験
官内では作用するが生体内では作用しない。さらに薬理
作用を示す濃度範囲と毒性を示す濃度範囲の解離がほと
んど無い等の理由により全く実用性はなかった。このよ
うに実用的な線溶系酵素阻害剤についての阻害剤はな
く、従って本発明の課題であるＰＡＩ−１とｕＰＡとの
反応の特異的阻害剤もこれまで報告されていなかった。
ところで近年ＰＡＩ−１とｔＰＡあるいはｕＰＡとの酵
素阻害のカイネテックスが研究されＰＡＩ−１が酵素の
触媒中心に不可逆的に結合する前にｔＰＡあるいはｕＰ
Ａ上の特異的な部位に水素結合によって可逆的に結合す
ることが知られ、本発明者等によってＰＡＩ−１による
ｔＰＡの阻害においてはこの特異的結合部位としてｔＰ
Ａクリングルドメイン２内のアミノ酸配列Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕが関与することが見出され
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ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，
１１６０−１１６６）．しかしながら、ＰＡＩ−１のｕ
ＰＡへの結合部位については知られていなかった。ここ
でｕＰＡの分類について述べる。ｕＰＡはウロキナーゼ
型プラスミノーゲンアクチベーターの略称であって一本
鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（以後
ｓｃｕＰＡと定義）、ウロキナーゼ（以後ＵＫと定
義）、低分子ウロキナーゼ（以後ＬＭＷＵＫと定義）に
分類される。ｓｃｕＰＡは酵素活性が無くプラスミン等
によりペプチド結合が切断されてクリングルドメインと
成長因子ドメインを酵素分子内に保有する高分子量ウロ
キナーゼ通称ウロキナーゼ（ＵＫ）を生じる。次にＬＭ
ＷＵＫは、ＵＫの分解が進みクリングルドメインと成長
因子ドメインが酵素分子から除去された形のものでイン
ビトロでの酵素活性はそれ程変らないが生体内において
血栓への集積性がＵＫに比べて悪くなっておりしたがっ
て臨床上はＵＫ並びにｓｃｕＰＡがより重要である。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】近年遺伝子工学の発達
に伴いｔＰＡやｕＰＡを生理的濃度の数千倍の濃度に投
与することによって血栓を短時間に溶解させ、これによ
って患者を心筋梗塞等の重篤な疾患から救命する試みも
すでに現実のものとなっている。しかし同時に、再開通
不整脈や出血にみられるように、このような高投与のも
たらす弊害も問題となってきている。特にｔＰＡあるい
はｕＰＡのいずれの療法においても再開通した症例の数
分の１に再閉塞が見られている。この再閉塞の原因とし
て再開通後のＰＡＩ−１上昇があげられている。このよ
うな再閉塞症例にｔＰＡやｕＰＡを再投与して再閉塞を
防止あるいは治療するのは全身線溶活性化に伴う副作用
の問題もあり危険である。この場合には上昇したＰＡＩ
−１活性をＰＡＩ−１阻害剤によって減少させる等他の
手段によって再閉塞を防ぐのが順当とされる。また、細
菌によって引き起こされる敗血症において、細菌由来の
エンドトキシンは血液中の組織因子（凝固系活性化因
子）並びにＰＡＩ−１を上昇させ、これによって多発性
血栓を体内に生じさせ、いわゆる播種性血管内凝固症侯
群（ＤＩＣ）を惹起する。このようにして形成された血
栓は溶解され難く重篤の虚血性臓器障害を引き起こす。
従ってＰＡＩ−１活性を阻害する事はＤＩＣなどに伴う
重篤な臓器障害に対し予防および治療の両面からみて原
因療法として極めて望ましいと考える。ところで前述し
たようにＰＡＩ−１は生理的血栓溶解剤であるｔＰＡや
ｕＰＡの生理的阻害剤であり血液中に多量に含まれてい
て、これら酵素による血栓溶解を妨げている。従ってこ
れら酵素阻害剤の働きにきっ抗する物質すなわちＰＡＩ
−１阻害剤の投与は間接的に血液中のｔＰＡやｕＰＡの
濃度を上昇させることになり、これは間接的にしかもよ
りマイルドな血栓溶解作用を発揮することになる。この
ようなＰＡＩ−１の阻害剤は、より一層の安全性が要求
される脳梗塞等の他の血栓症に対する予防あるいは治療
の可能性を開くものである。さらにＰＡＩ−１は様々の
生理的役割を演じているがまだ未解明の研究課題も多
い。従ってＰＡＩ−１阻害剤はＰＡＩ−１研究のための
新たなツールとして役立てることができる。さらに血液
中のＰＡＩ−１あるいはｕＰＡの診断に役立てることも
できる。しかもＰＡＩ−１阻害剤が低分子であったなら
遺伝子工学的手法によらずに生産可能であり、また遺伝
子工学的手法による場合には大腸菌等を用いて、高分子
の酵素蛋白質と比べて、より一層安価に大量に生産可能
である。以上のような理由により、本発明ではＰＡＩ−
１によるｕＰＡ阻害の可逆的な低分子阻害剤を見出すこ
とを課題とする。
に伴いｔＰＡやｕＰＡを生理的濃度の数千倍の濃度に投
与することによって血栓を短時間に溶解させ、これによ
って患者を心筋梗塞等の重篤な疾患から救命する試みも
すでに現実のものとなっている。しかし同時に、再開通
不整脈や出血にみられるように、このような高投与のも
たらす弊害も問題となってきている。特にｔＰＡあるい
はｕＰＡのいずれの療法においても再開通した症例の数
分の１に再閉塞が見られている。この再閉塞の原因とし
て再開通後のＰＡＩ−１上昇があげられている。このよ
うな再閉塞症例にｔＰＡやｕＰＡを再投与して再閉塞を
防止あるいは治療するのは全身線溶活性化に伴う副作用
の問題もあり危険である。この場合には上昇したＰＡＩ
−１活性をＰＡＩ−１阻害剤によって減少させる等他の
手段によって再閉塞を防ぐのが順当とされる。また、細
菌によって引き起こされる敗血症において、細菌由来の
エンドトキシンは血液中の組織因子（凝固系活性化因
子）並びにＰＡＩ−１を上昇させ、これによって多発性
血栓を体内に生じさせ、いわゆる播種性血管内凝固症侯
群（ＤＩＣ）を惹起する。このようにして形成された血
栓は溶解され難く重篤の虚血性臓器障害を引き起こす。
従ってＰＡＩ−１活性を阻害する事はＤＩＣなどに伴う
重篤な臓器障害に対し予防および治療の両面からみて原
因療法として極めて望ましいと考える。ところで前述し
たようにＰＡＩ−１は生理的血栓溶解剤であるｔＰＡや
ｕＰＡの生理的阻害剤であり血液中に多量に含まれてい
て、これら酵素による血栓溶解を妨げている。従ってこ
れら酵素阻害剤の働きにきっ抗する物質すなわちＰＡＩ
−１阻害剤の投与は間接的に血液中のｔＰＡやｕＰＡの
濃度を上昇させることになり、これは間接的にしかもよ
りマイルドな血栓溶解作用を発揮することになる。この
ようなＰＡＩ−１の阻害剤は、より一層の安全性が要求
される脳梗塞等の他の血栓症に対する予防あるいは治療
の可能性を開くものである。さらにＰＡＩ−１は様々の
生理的役割を演じているがまだ未解明の研究課題も多
い。従ってＰＡＩ−１阻害剤はＰＡＩ−１研究のための
新たなツールとして役立てることができる。さらに血液
中のＰＡＩ−１あるいはｕＰＡの診断に役立てることも
できる。しかもＰＡＩ−１阻害剤が低分子であったなら
遺伝子工学的手法によらずに生産可能であり、また遺伝
子工学的手法による場合には大腸菌等を用いて、高分子
の酵素蛋白質と比べて、より一層安価に大量に生産可能
である。以上のような理由により、本発明ではＰＡＩ−
１によるｕＰＡ阻害の可逆的な低分子阻害剤を見出すこ
とを課題とする。
【０００３】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
本発明者等はＨＩＢＩＯ−ＰＲＯＳＩＳＴＭ（日立ソフ
トウエアーエンジニアリング社製）を用いて各種のペプ
チドを合成し鋭意研究努力した結果、ＵＫのクリングル
ドメイン中のアミノ酸配列をもとにして合成されたペプ
チドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ
ｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒおよびＵＫの触媒ドメイン
中のアミノ酸配列をもとにして合成されたペプチドＵ３
７３，Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐ
ｒｏ ＴｒｐがＰＡＩ−１のＵＫへの結合を阻害し両者
による複合体形成のＫａｓｓｏｃ（Ｍ−１ｓ−１×１０
−６）速度を約１／１０低下させ、しかもＵ１０７とＵ
３７３の作用は相乗的な効果を有し両者併用の場合には
複合体形成のＫａｓｓｏｃ（Ｍ−１ｓ−１×１０−６）
速度を約１／１００に低下させることを見出し本研究を
完成させた。一方ｕＰＡの他のアミノ酸配列に基づいて
合成されたペプチドＵ９９，ＨｉｓＡｓｎ Ｔｙｒ Ｃ
ｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐはそのような作
用が認められず、ペプチドＵ１０３ Ａｒｇ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇには
弱い阻害作用が認められた。従って本発明は、ペプチド
Ｕ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒおよびペプチドＵ３７３，Ｉｌ
ｅ Ｖａｌ ＳｅｒＴｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＡｓｐＬｙｓ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ
ＳｅｒＨｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐであ
る。加えて本発明のペプチド化合物はペプチド配列内に
多くのアミノ基が含まれているにも拘らず線溶活性を阻
害することは無いという当初に予想されなかった良好な
性質を有していた。従って、ペプチドＵ１０７，Ａｓｎ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ
Ｔｙｒの単独あるいはペプチドＵ３７３，Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ ＳｅｒＴｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＡｓｐＬｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐの単独、ある
いはペプチドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒとペプチドＵ３７
３，Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｔｒｐの両者を含有する医薬をｔＰＡあるいはｕＰ
Ａのいずれかによる心筋梗塞患者の治療時に投与するこ
とによって再開通後のＰＡＩ−１活性上昇を抑え、本作
用によって再閉塞を防止または治療することができる。
さらにペプチドＵ１０７またはＵ３７３の単独または両
者を含有する医薬を、重症感染症の患者に投与すること
によって、血液中でのＰＡＩ−１活性の上昇を防ぎ、本
作用によって、細菌由来エンドトキシンに起因して生じ
る血栓の自然溶解を容易にしこれによって播種性血管内
凝固症侯群（ＤＩＣ）に伴う虚血性臓器障害の発症を予
防または治療することができる。さらにペプチドＵ１０
７またはＵ３７３の単独または両者を含有する医薬を、
出血の危険性が高くてｔＰＡあるいはｕＰＡを投与でき
ない心筋梗塞患者あるいは、同様に一般的に出血の危険
性が高いとされる脳梗塞患者に投与して、間接的にしか
も前記と比べてよりマイルドに血栓溶解作用を生じさせ
ることによって、これらの疾患の予防と治療に用いるこ
とができる。なおペプチドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ ＴｒｐＣｙｓ Ｔｙｒの代り
に、ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ
ｏ、ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ、ペプチドＡｓｎＡｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓおよびペプチドＡｒｇ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ等も弱いながら上記ペプチドＵ１０７と同様のＰＡ
Ｉ−１阻害活性を有しているので本発明に含まれる。こ
れらのＰＡＩ−１阻害活性を有するペプチドの共通点
は、Ａｒｇ等およびＬｙｓ等に見られるグアニジン基お
よびアミノ基等の官能基の合計が４個以上であることで
ある。従って、官能基がグアニジン基またはアミノ基で
あるアミノ酸の少なくとも４個以上を有するアミノ酸配
列からなるペプチドも当然に本ＰＡＩ−１阻害活性を有
し本発明に含まれる。グアニジン基、アミノ基は周知の
ようにそれぞれ下記のような官能基を呼称するものであ
る。 ＮＨ２（ＣＮＨ）ＮＨ− ＮＨ２− グアニジン基 アミノ基 アミノ酸配列の長さは４〜２８個好ましくは６〜２６個
である。またこれらのアミノ酸配列を中心としてアミノ
基、カルボキシル基並びにグアニジン基等を保護した誘
導体、塩酸、義酸、乳酸、酢酸等との塩類も含まれる。
また上記ペプチドを含む上記目的の医薬、診断薬、試薬
は安定性向上等の目的で賦形剤を用いることができる。
ペプチドＵ１０７Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓＴｙｒ及びペプチドＵ３７３Ｉｌ
ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒ
ｐを医薬として用いる場合その投与量はそれぞれ１ｍｇ
〜５ｇ好ましくは１０〜５００ｍｇの範囲で単独あるい
は併用により用いる。
本発明者等はＨＩＢＩＯ−ＰＲＯＳＩＳＴＭ（日立ソフ
トウエアーエンジニアリング社製）を用いて各種のペプ
チドを合成し鋭意研究努力した結果、ＵＫのクリングル
ドメイン中のアミノ酸配列をもとにして合成されたペプ
チドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ
ｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒおよびＵＫの触媒ドメイン
中のアミノ酸配列をもとにして合成されたペプチドＵ３
７３，Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐ
ｒｏ ＴｒｐがＰＡＩ−１のＵＫへの結合を阻害し両者
による複合体形成のＫａｓｓｏｃ（Ｍ−１ｓ−１×１０
−６）速度を約１／１０低下させ、しかもＵ１０７とＵ
３７３の作用は相乗的な効果を有し両者併用の場合には
複合体形成のＫａｓｓｏｃ（Ｍ−１ｓ−１×１０−６）
速度を約１／１００に低下させることを見出し本研究を
完成させた。一方ｕＰＡの他のアミノ酸配列に基づいて
合成されたペプチドＵ９９，ＨｉｓＡｓｎ Ｔｙｒ Ｃ
ｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐはそのような作
用が認められず、ペプチドＵ１０３ Ａｒｇ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇには
弱い阻害作用が認められた。従って本発明は、ペプチド
Ｕ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒおよびペプチドＵ３７３，Ｉｌ
ｅ Ｖａｌ ＳｅｒＴｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＡｓｐＬｙｓ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ
ＳｅｒＨｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐであ
る。加えて本発明のペプチド化合物はペプチド配列内に
多くのアミノ基が含まれているにも拘らず線溶活性を阻
害することは無いという当初に予想されなかった良好な
性質を有していた。従って、ペプチドＵ１０７，Ａｓｎ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ
Ｔｙｒの単独あるいはペプチドＵ３７３，Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ ＳｅｒＴｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＡｓｐＬｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐの単独、ある
いはペプチドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒとペプチドＵ３７
３，Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｔｒｐの両者を含有する医薬をｔＰＡあるいはｕＰ
Ａのいずれかによる心筋梗塞患者の治療時に投与するこ
とによって再開通後のＰＡＩ−１活性上昇を抑え、本作
用によって再閉塞を防止または治療することができる。
さらにペプチドＵ１０７またはＵ３７３の単独または両
者を含有する医薬を、重症感染症の患者に投与すること
によって、血液中でのＰＡＩ−１活性の上昇を防ぎ、本
作用によって、細菌由来エンドトキシンに起因して生じ
る血栓の自然溶解を容易にしこれによって播種性血管内
凝固症侯群（ＤＩＣ）に伴う虚血性臓器障害の発症を予
防または治療することができる。さらにペプチドＵ１０
７またはＵ３７３の単独または両者を含有する医薬を、
出血の危険性が高くてｔＰＡあるいはｕＰＡを投与でき
ない心筋梗塞患者あるいは、同様に一般的に出血の危険
性が高いとされる脳梗塞患者に投与して、間接的にしか
も前記と比べてよりマイルドに血栓溶解作用を生じさせ
ることによって、これらの疾患の予防と治療に用いるこ
とができる。なおペプチドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ ＴｒｐＣｙｓ Ｔｙｒの代り
に、ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒ
ｏ、ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ、ペプチドＡｓｎＡｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓおよびペプチドＡｒｇ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ等も弱いながら上記ペプチドＵ１０７と同様のＰＡ
Ｉ−１阻害活性を有しているので本発明に含まれる。こ
れらのＰＡＩ−１阻害活性を有するペプチドの共通点
は、Ａｒｇ等およびＬｙｓ等に見られるグアニジン基お
よびアミノ基等の官能基の合計が４個以上であることで
ある。従って、官能基がグアニジン基またはアミノ基で
あるアミノ酸の少なくとも４個以上を有するアミノ酸配
列からなるペプチドも当然に本ＰＡＩ−１阻害活性を有
し本発明に含まれる。グアニジン基、アミノ基は周知の
ようにそれぞれ下記のような官能基を呼称するものであ
る。 ＮＨ２（ＣＮＨ）ＮＨ− ＮＨ２− グアニジン基 アミノ基 アミノ酸配列の長さは４〜２８個好ましくは６〜２６個
である。またこれらのアミノ酸配列を中心としてアミノ
基、カルボキシル基並びにグアニジン基等を保護した誘
導体、塩酸、義酸、乳酸、酢酸等との塩類も含まれる。
また上記ペプチドを含む上記目的の医薬、診断薬、試薬
は安定性向上等の目的で賦形剤を用いることができる。
ペプチドＵ１０７Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓＴｙｒ及びペプチドＵ３７３Ｉｌ
ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒ
ｐを医薬として用いる場合その投与量はそれぞれ１ｍｇ
〜５ｇ好ましくは１０〜５００ｍｇの範囲で単独あるい
は併用により用いる。
【０００４】
【作用】ペプチドＵ１０７、Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒはＰＡＩ−１
に結合して２本鎖の高分子ウロキナーゼＵＫへの結合を
阻害するが一方の一本鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕＰＡ）あ
るいは低分子ウロキナーゼに対して阻害を示さないかま
たは阻害が弱い、一方ペプチドＵ３７３、ＩｌｅＶａｌ
Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ａｌａ ＬｅｕＬｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ＡｒｇＶａｌ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ ＴｒｐはＰＡＩ−１
上のペプチドＵ１０７、Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓＴｙｒと別な部位に結合す
るが、この場合低分子ウロキナーゼに対しても２本鎖高
分子ウロキナーゼに対しても結合を阻害し、ＰＡＩ−１
の作用を阻害して線溶活性を亢進する。
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ ＴｙｒはＰＡＩ−１
に結合して２本鎖の高分子ウロキナーゼＵＫへの結合を
阻害するが一方の一本鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕＰＡ）あ
るいは低分子ウロキナーゼに対して阻害を示さないかま
たは阻害が弱い、一方ペプチドＵ３７３、ＩｌｅＶａｌ
Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ａｌａ ＬｅｕＬｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ＡｒｇＶａｌ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ ＴｒｐはＰＡＩ−１
上のペプチドＵ１０７、Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓＴｙｒと別な部位に結合す
るが、この場合低分子ウロキナーゼに対しても２本鎖高
分子ウロキナーゼに対しても結合を阻害し、ＰＡＩ−１
の作用を阻害して線溶活性を亢進する。
【０００５】実施例１ ペプチドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒはペプチド合成機モデ
ル４３０Ａ（アプライドバイオシステム社）を用いて合
成された。Ｃｙｓ残基はアセトアミドメチル化によって
保護された。逆相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれの
ペプチド調整品は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一
であることを示した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを
７．０〜８．０に調整して実験に用いた。
Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒはペプチド合成機モデ
ル４３０Ａ（アプライドバイオシステム社）を用いて合
成された。Ｃｙｓ残基はアセトアミドメチル化によって
保護された。逆相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれの
ペプチド調整品は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一
であることを示した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを
７．０〜８．０に調整して実験に用いた。
【０００６】実施例２ Ｕ３７３，Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａ
ｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｔｒｐはペプチド合成機モデル４３０Ａ（ア
プライドバイオシステム社）を用いて合成された。Ｃｙ
ｓ残基はアセトアミドメチル化によって保護された。逆
相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれのペプチド調整品
は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一であることを示
した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを７．０〜８．０
に調整して実験に用いた。
Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａ
ｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｔｒｐはペプチド合成機モデル４３０Ａ（ア
プライドバイオシステム社）を用いて合成された。Ｃｙ
ｓ残基はアセトアミドメチル化によって保護された。逆
相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれのペプチド調整品
は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一であることを示
した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを７．０〜８．０
に調整して実験に用いた。
【０００７】実施例３ ペプチドＵ９９ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａ
ｒｇ Ａｓｎ ＰｒｏＡｓｐはペプチド合成機モデル４
３０Ａ（アプライドバイオシステム社）を用いて合成さ
れた。Ｃｙｓ残基はアセトアミドメチル化によって保護
された。逆相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれのペプ
チド調整品は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一であ
ることを示した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを７．
０〜８．０に調整して実験に用いた。
ｒｇ Ａｓｎ ＰｒｏＡｓｐはペプチド合成機モデル４
３０Ａ（アプライドバイオシステム社）を用いて合成さ
れた。Ｃｙｓ残基はアセトアミドメチル化によって保護
された。逆相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれのペプ
チド調整品は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一であ
ることを示した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを７．
０〜８．０に調整して実験に用いた。
【０００８】実施例４ ペプチドＵ１０７，Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓＴｙｒはペプチド合成機モデル
４３０Ａ（アプライドバイオシステム社）を用いて合成
された。Ｃｙｓ残基はアセトアミドメチル化によって保
護された。逆相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれのペ
プチド調整品は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一で
あることを示した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを
７．０〜８．０に調整して実験に用いた。
Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＣｙｓＴｙｒはペプチド合成機モデル
４３０Ａ（アプライドバイオシステム社）を用いて合成
された。Ｃｙｓ残基はアセトアミドメチル化によって保
護された。逆相ＨＰＬＣによって精製後、それぞれのペ
プチド調整品は逆相ＨＰＬＣによる分析によって均一で
あることを示した。トリス塩酸緩衝液に溶解後ｐＨを
７．０〜８．０に調整して実験に用いた。
【０００９】実施例５ ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ、ペ
プチドＡｓｎ ＡｒｇＡｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒ
ｐ、ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ ＡｒｇＰｒｏ
Ｔｒｐ ＣｙｓおよびペプチドＡｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏは
ペプチド合成機モデル４３０Ａ（アプライドバイオシス
テム社）を用いて合成された。Ｃｙｓ残基はアセトアミ
ドメチル化によって保護された。逆相ＨＰＬＣによって
精製後、それぞれのペプチド調整品は逆相ＨＰＬＣによ
る分析によって均一であることを示した。トリス塩酸緩
衝液に溶解後ｐＨを７．０〜８．０に調整して実験に用
いた。
プチドＡｓｎ ＡｒｇＡｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒ
ｐ、ペプチドＡｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ ＡｒｇＰｒｏ
Ｔｒｐ ＣｙｓおよびペプチドＡｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏは
ペプチド合成機モデル４３０Ａ（アプライドバイオシス
テム社）を用いて合成された。Ｃｙｓ残基はアセトアミ
ドメチル化によって保護された。逆相ＨＰＬＣによって
精製後、それぞれのペプチド調整品は逆相ＨＰＬＣによ
る分析によって均一であることを示した。トリス塩酸緩
衝液に溶解後ｐＨを７．０〜８．０に調整して実験に用
いた。
【００１０】実施例６ 材料及び試薬 （１）試薬 使用した全化学試薬は最も高度の分析用品質であって市
販のものである。 ＤＦＰ：ジイソプロピルフルオロフォスフェート、トリ
ス塩酸、牛血清アルブミン（ＢＳＡ），ツイーン８０及
びフォルボール１３−ミリステート１３−酢酸はシグマ
社から購入した。リン酸ナトリウムは生化学工業から、
ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳはＰＩＥＲＣＥＳから、子牛血清
と細胞培養試薬はＧＩＢＵＣＯから、細胞培養用プラス
チック容器はＣＯＲＮＩＮＧから購入した。 （２）蛋白質 Ｎ−末端アミノ酸配列はシークエンサーモデル９００Ａ
（アプライドバイオシステム）上で配列決定された。Ｐ
ＡＩ−１は培養ヒトＨＴ１０８０細胞のコンディション
培地から分離した。そして坂田等（Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｒｏ，Ａ．，＆Ｍａ
ｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３，１９６０−１９６９．，Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｏ，Ａ．，Ｍｏ
ｒｉ，Ｋ．，＆ Ｍａｔｕｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ ７
７，１９４９−１９５７．）に示したようにして活性化
した。ＰＡＩ−１は金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，Ｓａ
ｋａｔａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，＆ Ｍｉｍｕ
ｒｏ，Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１，
２４４−２４８）が述べたようにしてＩＯＤＯ−ＢＥＡ
ＤＳを用いてＮａ［１２５Ｉ］（２５７５Ｃｉ／ｍ ｍ
ｏｌ，デュポン−ニュ−イングランドニュクレアー社）
で標識した。標識ＰＡＩ−１は１．８４×１０９ｃｐｍ
／ｍｇの特異的放射活性を持たせた。ＵＫと一本鎖ウロ
キナーゼ（ｓｃｕＰＡ）は持田製薬（東京、日本）から
寄付された。低分子ウロキナーゼ（ＬＭＷＵＫ）はＰＲ
ＯＴＯＧＥＮ（スイス）から購入された。 （３）ウロキナーゼに対するモノクローナル抗体 ＢＡＬＢ／ｃマウスが精製ヒトＵＫで免疫され、ヒトＵ
Ｋに対するマウスモノクローナル抗体が選択されそして
坂田等（Ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏ
ｒｏｒｏ，Ａ．，＆ Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８
８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９６０−１９
６９．，Ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，
Ｔ．，Ｎｏｒｏ，Ａ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，＆ Ｍａｔｕ
ｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ ７７，１９４９−１９５７．）
が述べたようにして 体（ＭｏＡｂｓ）はマウス腹水から先に三室等（Ｍｉｍ
ｕｒｏ，Ｊ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｙ．，Ｓｕｍｉ，Ｙ．，Ａ
ｏｋｉ，Ｎ．（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ６９，４４６−
４５３）、ワカバヤシ等（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，
Ｋ．，ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｎ．（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１１０９７−１
１１０５）が述べたようにプロテインＡ−結合セファロ
ースを用いて分離された。ＭｏＡｂｓはウエスタンブロ
ッテイングによってＵＫ機能ドメインへの結合が分析さ
れた。ＵＫが還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分離された。電気泳動後、資料はニトロセルロ
ース膜に移され適当なＭｏＡｂとともにインキュベート
された。結合抗体は三室（Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ．，Ｋｏｉ
ｋｅ，Ｙ．，Ｓｕｍｉ，Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｎ．（１９８
７）Ｂｌｏｏｄ ６９，４４６−４５３）、ワカバヤシ
（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｎ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６１，１１０９７−１１１０５）が述べたよう
に酵素結合抗マウスＩｇＧ抗体で検出された。ウエスタ
ンブロッテイングによって、ＭｏＡｂＪＴＵは触媒ドメ
インを含むＵＫＢ−鎖に結合する、そしてＭｏＡｂＪＴ
Ｕ−Ａ３は生長因子ドメインとクリングルドメインを含
むＵＫＡ鎖に結合する。 （４）クリングルドメインを含むＮ−末端ＵＫフラグメ
ントの分離 ＵＫ７６０μｇがプラスミン存在下（７０μｇ／ｍｌ）
リン酸緩衝液を含む生食の８００μｌ中で３７℃１２０
分間インキュベートされた。プラスミンによる制限蛋白
分解はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断され、ＬＭＷＵＫ
と生長因子とクリングルドメインを含むＵＫのＮ末端断
片を確認した。反応液はプラスミンを除去するためアプ
ロチニンの存在下（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下にリジン
結合スファロースカラムにかけられた。未結合分画はＬ
ＭＷＵＫと未切断ＵＫ（ＪＴＵ−Ｃ３はＵＫの触媒ドメ
インに結合する）を除去するためモノクローナル抗体Ｊ
ＴＵ−Ｃ３結合セファロースカラムにかけられた。未結
合分画が集められＳＤＳ−ＰＡＧＥとＭｏＡｂＪＴＵ−
Ａ３を用いるウエスタンブロッテイングによって分析さ
れた。
販のものである。 ＤＦＰ：ジイソプロピルフルオロフォスフェート、トリ
ス塩酸、牛血清アルブミン（ＢＳＡ），ツイーン８０及
びフォルボール１３−ミリステート１３−酢酸はシグマ
社から購入した。リン酸ナトリウムは生化学工業から、
ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳはＰＩＥＲＣＥＳから、子牛血清
と細胞培養試薬はＧＩＢＵＣＯから、細胞培養用プラス
チック容器はＣＯＲＮＩＮＧから購入した。 （２）蛋白質 Ｎ−末端アミノ酸配列はシークエンサーモデル９００Ａ
（アプライドバイオシステム）上で配列決定された。Ｐ
ＡＩ−１は培養ヒトＨＴ１０８０細胞のコンディション
培地から分離した。そして坂田等（Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｒｏ，Ａ．，＆Ｍａ
ｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３，１９６０−１９６９．，Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｏ，Ａ．，Ｍｏ
ｒｉ，Ｋ．，＆ Ｍａｔｕｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ ７
７，１９４９−１９５７．）に示したようにして活性化
した。ＰＡＩ−１は金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，Ｓａ
ｋａｔａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，＆ Ｍｉｍｕ
ｒｏ，Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１，
２４４−２４８）が述べたようにしてＩＯＤＯ−ＢＥＡ
ＤＳを用いてＮａ［１２５Ｉ］（２５７５Ｃｉ／ｍ ｍ
ｏｌ，デュポン−ニュ−イングランドニュクレアー社）
で標識した。標識ＰＡＩ−１は１．８４×１０９ｃｐｍ
／ｍｇの特異的放射活性を持たせた。ＵＫと一本鎖ウロ
キナーゼ（ｓｃｕＰＡ）は持田製薬（東京、日本）から
寄付された。低分子ウロキナーゼ（ＬＭＷＵＫ）はＰＲ
ＯＴＯＧＥＮ（スイス）から購入された。 （３）ウロキナーゼに対するモノクローナル抗体 ＢＡＬＢ／ｃマウスが精製ヒトＵＫで免疫され、ヒトＵ
Ｋに対するマウスモノクローナル抗体が選択されそして
坂田等（Ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏ
ｒｏｒｏ，Ａ．，＆ Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８
８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９６０−１９
６９．，Ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，
Ｔ．，Ｎｏｒｏ，Ａ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，＆ Ｍａｔｕ
ｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ ７７，１９４９−１９５７．）
が述べたようにして 体（ＭｏＡｂｓ）はマウス腹水から先に三室等（Ｍｉｍ
ｕｒｏ，Ｊ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｙ．，Ｓｕｍｉ，Ｙ．，Ａ
ｏｋｉ，Ｎ．（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ６９，４４６−
４５３）、ワカバヤシ等（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，
Ｋ．，ｓａｋａｔａ，Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｎ．（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１１０９７−１
１１０５）が述べたようにプロテインＡ−結合セファロ
ースを用いて分離された。ＭｏＡｂｓはウエスタンブロ
ッテイングによってＵＫ機能ドメインへの結合が分析さ
れた。ＵＫが還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分離された。電気泳動後、資料はニトロセルロ
ース膜に移され適当なＭｏＡｂとともにインキュベート
された。結合抗体は三室（Ｍｉｍｕｒｏ，Ｊ．，Ｋｏｉ
ｋｅ，Ｙ．，Ｓｕｍｉ，Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｎ．（１９８
７）Ｂｌｏｏｄ ６９，４４６−４５３）、ワカバヤシ
（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｎ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６１，１１０９７−１１１０５）が述べたよう
に酵素結合抗マウスＩｇＧ抗体で検出された。ウエスタ
ンブロッテイングによって、ＭｏＡｂＪＴＵは触媒ドメ
インを含むＵＫＢ−鎖に結合する、そしてＭｏＡｂＪＴ
Ｕ−Ａ３は生長因子ドメインとクリングルドメインを含
むＵＫＡ鎖に結合する。 （４）クリングルドメインを含むＮ−末端ＵＫフラグメ
ントの分離 ＵＫ７６０μｇがプラスミン存在下（７０μｇ／ｍｌ）
リン酸緩衝液を含む生食の８００μｌ中で３７℃１２０
分間インキュベートされた。プラスミンによる制限蛋白
分解はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断され、ＬＭＷＵＫ
と生長因子とクリングルドメインを含むＵＫのＮ末端断
片を確認した。反応液はプラスミンを除去するためアプ
ロチニンの存在下（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下にリジン
結合スファロースカラムにかけられた。未結合分画はＬ
ＭＷＵＫと未切断ＵＫ（ＪＴＵ−Ｃ３はＵＫの触媒ドメ
インに結合する）を除去するためモノクローナル抗体Ｊ
ＴＵ−Ｃ３結合セファロースカラムにかけられた。未結
合分画が集められＳＤＳ−ＰＡＧＥとＭｏＡｂＪＴＵ−
Ａ３を用いるウエスタンブロッテイングによって分析さ
れた。
【０００１１】実施例７ＰＡＩ−１の合成ペプチドへの結合部位 平底マイクロタイタープレート（９６穴、ポリスチレ
ン）がＵＫのＮ末端断片整（１μｇ／ｍｌ）を含む１０
０μｌのリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ＰＨ７．４）中で４℃で１６時
間コートされた。ＢＳＡ（３％）でブロックし、ツイー
ン８０（０．０１％）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）そして
ポリエチレングリコール６０００（４％、Ｗ／Ｖ）を含
むリン酸緩衝液（結合緩衝液）で３回洗浄後、プレート
は結合緩衝液中で［１２５Ｉ］−ＰＡＩ−１の各種濃度
の存在下でインキュベートされた。結合緩衝液中で３回
洗浄後、各々の穴中の放射活性がガンマカウンター（ア
ローカ、東京、日本）を用いて測定された。解離定数は
金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｍ．，＆ Ｓａｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７
８，１１６０−１１６６）の方法によるスカッチャード
分析後計算された（図１）。つまり図１はＵＫの変り
に、ＵＫのＮ末端断片を用いるところのＰＡＩ−１阻害
剤のスクリーニング系の確立を確認した結果である。こ
うして得られたスクリーニング系を用いて、次にＵＫの
Ｎ末端断片へのＰＡＩ−１結合が合成ペプチドの存在下
で研究された（図２）。本実験においてＵ１０７が強い
結合阻害を示し、Ｕ１０３も弱い阻害作用を示したがＵ
３７３とＵ９９は阻害を示さなかった。このことはＵ１
０７とＵ１０３がＰＡＩ−１によるＵＫの阻害を阻害
し、その阻害部位はＰＡＩ−１の上のどこかとＵＫのＮ
末端断片部分にあることを示す。
ン）がＵＫのＮ末端断片整（１μｇ／ｍｌ）を含む１０
０μｌのリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ＰＨ７．４）中で４℃で１６時
間コートされた。ＢＳＡ（３％）でブロックし、ツイー
ン８０（０．０１％）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）そして
ポリエチレングリコール６０００（４％、Ｗ／Ｖ）を含
むリン酸緩衝液（結合緩衝液）で３回洗浄後、プレート
は結合緩衝液中で［１２５Ｉ］−ＰＡＩ−１の各種濃度
の存在下でインキュベートされた。結合緩衝液中で３回
洗浄後、各々の穴中の放射活性がガンマカウンター（ア
ローカ、東京、日本）を用いて測定された。解離定数は
金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｍ．，＆ Ｓａｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７
８，１１６０−１１６６）の方法によるスカッチャード
分析後計算された（図１）。つまり図１はＵＫの変り
に、ＵＫのＮ末端断片を用いるところのＰＡＩ−１阻害
剤のスクリーニング系の確立を確認した結果である。こ
うして得られたスクリーニング系を用いて、次にＵＫの
Ｎ末端断片へのＰＡＩ−１結合が合成ペプチドの存在下
で研究された（図２）。本実験においてＵ１０７が強い
結合阻害を示し、Ｕ１０３も弱い阻害作用を示したがＵ
３７３とＵ９９は阻害を示さなかった。このことはＵ１
０７とＵ１０３がＰＡＩ−１によるＵＫの阻害を阻害
し、その阻害部位はＰＡＩ−１の上のどこかとＵＫのＮ
末端断片部分にあることを示す。
【００１２】実施例８ＰＡＩ−１の合成ペプチドへの結合 ＰＡＩ−１のＵＫ Ｎ−末端フラグメントと合成ペプチ
ドへの結合分析 平底マイクロタイタープレート（９６穴、ポリスチレ
ン）がペプチドの１０μｇ／ｍｌを含む１００μｌのリ
ン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ
Ｎａｃｌ、ｐＨ７．４）中で４℃で１６時間コートされ
た。ＢＳＡ（３％）でブロックし、ツイーン８０（０．
０１％）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）そしてポリエチレン
グリコール６０００（４％、Ｗ／Ｖ）を含むリン酸緩衝
液（結合緩衝液）で３回洗浄後、プレートは結合緩衝液
中で［１２５Ｉ］−ＰＡＩ−１の各種濃度の存在下でイ
ンキュベートされた。結合緩衝液中で３回洗浄後、各々
の穴中の放射活性がガンマカウンター（アローカ、東
京、日本）を用いて測定された。解離定数は金子等（Ｋ
ａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，＆Ｓａ
ｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７８，１１６０−１
１６６）の方法によってスカッチャード分析後計算され
た。図３及び図４に示されたように、ペプチドＵ１０
３、Ｕ１０７及びＵ３７３が濃度依存性にＰＡＩ−１と
結合した。一方Ｕ９９はＰＡＩ−１と結合しなかった。
これらの結果はペプチドＵ１０３とＵ１０７のグループ
とペプチドＵ３７３とはそのＰＡＩ−１上の結合部位は
異なるがいずれもＰＡＩ−１と結合しＰＡＩ−１を阻害
するペプチドであり、一方実施例７においても本実施例
８においても作用の認められなかったＵ９９はＰＡＩ−
１を阻害しないことが示される。上記実験における解離
定数は表１に示したようにＵ１０３，Ｕ１０７，Ｕ３７
３がＰＡＩ−１に対してそれぞれ３．２５±２．９２，
０．４８７±０．１０，７８．１±４．６０ｎＭのＫｄ
であった。
ドへの結合分析 平底マイクロタイタープレート（９６穴、ポリスチレ
ン）がペプチドの１０μｇ／ｍｌを含む１００μｌのリ
ン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ
Ｎａｃｌ、ｐＨ７．４）中で４℃で１６時間コートされ
た。ＢＳＡ（３％）でブロックし、ツイーン８０（０．
０１％）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）そしてポリエチレン
グリコール６０００（４％、Ｗ／Ｖ）を含むリン酸緩衝
液（結合緩衝液）で３回洗浄後、プレートは結合緩衝液
中で［１２５Ｉ］−ＰＡＩ−１の各種濃度の存在下でイ
ンキュベートされた。結合緩衝液中で３回洗浄後、各々
の穴中の放射活性がガンマカウンター（アローカ、東
京、日本）を用いて測定された。解離定数は金子等（Ｋ
ａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，＆Ｓａ
ｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７８，１１６０−１
１６６）の方法によってスカッチャード分析後計算され
た。図３及び図４に示されたように、ペプチドＵ１０
３、Ｕ１０７及びＵ３７３が濃度依存性にＰＡＩ−１と
結合した。一方Ｕ９９はＰＡＩ−１と結合しなかった。
これらの結果はペプチドＵ１０３とＵ１０７のグループ
とペプチドＵ３７３とはそのＰＡＩ−１上の結合部位は
異なるがいずれもＰＡＩ−１と結合しＰＡＩ−１を阻害
するペプチドであり、一方実施例７においても本実施例
８においても作用の認められなかったＵ９９はＰＡＩ−
１を阻害しないことが示される。上記実験における解離
定数は表１に示したようにＵ１０３，Ｕ１０７，Ｕ３７
３がＰＡＩ−１に対してそれぞれ３．２５±２．９２，
０．４８７±０．１０，７８．１±４．６０ｎＭのＫｄ
であった。
【００１３】実施例９ＵＫ／ＰＡＩ−１複合体形成における合成ペプチドの効
果 ＵＫ（１ｎＭ）およびＰＡＩ−１（１ｎＭ）がＴＢＳ／
ツイーン中の合成ペプチドの各種濃度の存在下又は非存
在下で３７度でインキュベートされた。反応は１０ｍＭ
ｐ−ＡＰＭＳＦの添加によって停止された。ＵＫ／ＰＡ
Ｉ−１複合体の濃度はＰＡＩ−１に対するモノクローナ
ル抗体を用いる酵素免疫分析と坂田等（Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｒｏ，Ａ．，＆Ｍａ
ｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３，１９６０−１９６９、Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｏ，Ａ．，Ｍｏ
ｒｉ，Ｋ．，＆ Ｍａｔｕｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ ７
７，１９４９−１９５７．）が述べたＵＫに対する精製
ポリクローナル抗体への親和性によって測定された。２
次速度定数はヘックマン等（Ｈｅｋｍａｎ，Ｋ．Ｍ．＆
Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６２，１９９
−２１０）、金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，Ｓａｋａｔ
ａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，＆Ｍｉｍｕｒｏ，
Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１，２４４
−２４８、Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｍ．，＆Ｓａｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７８，
１１６０−１１６６）が述べた偽一次反応速度定数下で
計算された。ＵＫそしてＰＡＩ−１の等モル潅度が３７
℃で１００μＭペプチドの存在あるいは非存在下で各種
時間インキュベートされた。１０ｍＭｐ−ＡＰＭＳＦの
添加によって反応の停止後、ＵＫ／ＰＡＩ−１複合体濃
度が上記されたようにして決定された。合成基質Ｓ−２
４４４（カビ、ストックフォルム、スエーデン）がペプ
チドの阻害効果を確認するためペプチドの存在あるいは
非存在下でＰＡＩ−１によるＵＫの水解活性の阻害を記
録するために用いられた。ＵＫ（５ｎＭ）、がペプチド
の各種濃度の存在または非存在下でＰＡＩ−１（２．５
ｎＭ）とともに３７℃１０分間インキュベートされた。
ＵＫの残存活性がＳ−２４４４水解速度を測定すること
によって定量された。図５に示すように、ＰＡＩ−１に
よるＵＫの阻害が、Ｕ１０７、Ｕ３７３およびＵ１０３
によって阻害され、その作用はＵ１０７およびＵ３７３
が強く一方Ｕ１０３が弱い阻害であることを示す。
果 ＵＫ（１ｎＭ）およびＰＡＩ−１（１ｎＭ）がＴＢＳ／
ツイーン中の合成ペプチドの各種濃度の存在下又は非存
在下で３７度でインキュベートされた。反応は１０ｍＭ
ｐ−ＡＰＭＳＦの添加によって停止された。ＵＫ／ＰＡ
Ｉ−１複合体の濃度はＰＡＩ−１に対するモノクローナ
ル抗体を用いる酵素免疫分析と坂田等（Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｒｏ，Ａ．，＆Ｍａ
ｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３，１９６０−１９６９、Ｓａｋａｔａ，
Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｏ，Ａ．，Ｍｏ
ｒｉ，Ｋ．，＆ Ｍａｔｕｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ ７
７，１９４９−１９５７．）が述べたＵＫに対する精製
ポリクローナル抗体への親和性によって測定された。２
次速度定数はヘックマン等（Ｈｅｋｍａｎ，Ｋ．Ｍ．＆
Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６２，１９９
−２１０）、金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，Ｓａｋａｔ
ａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，＆Ｍｉｍｕｒｏ，
Ｊ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１，２４４
−２４８、Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｍ．，＆Ｓａｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７８，
１１６０−１１６６）が述べた偽一次反応速度定数下で
計算された。ＵＫそしてＰＡＩ−１の等モル潅度が３７
℃で１００μＭペプチドの存在あるいは非存在下で各種
時間インキュベートされた。１０ｍＭｐ−ＡＰＭＳＦの
添加によって反応の停止後、ＵＫ／ＰＡＩ−１複合体濃
度が上記されたようにして決定された。合成基質Ｓ−２
４４４（カビ、ストックフォルム、スエーデン）がペプ
チドの阻害効果を確認するためペプチドの存在あるいは
非存在下でＰＡＩ−１によるＵＫの水解活性の阻害を記
録するために用いられた。ＵＫ（５ｎＭ）、がペプチド
の各種濃度の存在または非存在下でＰＡＩ−１（２．５
ｎＭ）とともに３７℃１０分間インキュベートされた。
ＵＫの残存活性がＳ−２４４４水解速度を測定すること
によって定量された。図５に示すように、ＰＡＩ−１に
よるＵＫの阻害が、Ｕ１０７、Ｕ３７３およびＵ１０３
によって阻害され、その作用はＵ１０７およびＵ３７３
が強く一方Ｕ１０３が弱い阻害であることを示す。
【００１４】実施例１０ＬＭＷＵＫ／ＰＡＩ−１複合体形成における合成ペプチ
ドの効果 ＬＭＷＵＫ（１ｎＭ）そしてＰＡＩ−１（１ｎＭ）がＴ
ＢＳ／ツイーン中の合成ペプチドの各種濃度の存在下又
は非存在下で３７度でインキュベートされた。反応は１
０ｍＭｐ−ＡＰＭＳＦの添加によって停止された。ＬＭ
ＷＵＫ／ＰＡＩ−１複合体の濃度はＰＡＩ−１に対する
モノクローナル抗体を用いる酵素免疫分析と坂田等（Ｓ
ａｋａｔａ，Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｒｏ，
Ａ．，＆Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９６０−１９６９、Ｓａｋａ
ｔａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｏ，
Ａ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，＆Ｍａｔｕｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏ
ｄ ７７，１９４９−１９５７．）が述べたＬＭＷＵＫ
に対する精製ポリクローナル抗体への親和性よって測定
された。２次速度定数はヘックマン等（Ｈｅｋｍａｎ，
Ｋ．Ｍ．＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．（１９８
８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６
２，１９９−２１０）、ウィットベル等（Ｗｉｔｔｗｅ
ｒ，Ａ，Ｊ．，＆Ｓａｎｚｏ，Ｍ．Ａ．（１９９０）Ｔ
ｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｓ．６４，２７０−２７
５）、金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄ
ａ，Ｍ．，＆Ｓａｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７
８，１１６０−１１６６）が述べた偽一次反応速度定数
下で計算された。ＬＭＷＵＫとＰＡＩ−１の等モル濃度
が３７℃で１００μＭペプチドの存在あるいは非存在下
で各種期間インキュベートされた。１０ｍＭｐ−ＡＰＭ
ＳＦの添加によって反応の停止後、ＬＭＷＵＫ／ＰＡＩ
−１複合体濃度が上記されたようにして決定された。合
成基質Ｓ−２４４４（カビ、ストックフォルム、スエー
デン）がペプチドの阻害効果を確認するためペプチドの
存在あるいは非存在下でＰＡＩ−１によるＬＭＷＵＫの
水解活性の阻害を記録するために用いられた。ＬＭＷＵ
Ｋ（５ｎＭ）がペプチドの各種濃度の存在または非存在
下でＰＡＩ−１（２．５ｎＭ）とともに３７℃１０分間
インキュベートされた。ＬＭＷＵＫの残存活性がＳ−２
４４４水解速度を測定することによって定量された。結
果は図６に示したようにＵ３７３のみがＰＡＩ−１によ
るＬＭＷＵＫの阻害を阻害した。しかしながらＬＭＷＵ
ＫはＵＫの分解産物であって生理的にはＰＡＩ−１によ
るＵＫの阻害が重要であり、本結果はペプチドＵ３７３
と、ペプチドＵ１０３とＵ１０７のグループの作用部位
が異なることを意味している。
ドの効果 ＬＭＷＵＫ（１ｎＭ）そしてＰＡＩ−１（１ｎＭ）がＴ
ＢＳ／ツイーン中の合成ペプチドの各種濃度の存在下又
は非存在下で３７度でインキュベートされた。反応は１
０ｍＭｐ−ＡＰＭＳＦの添加によって停止された。ＬＭ
ＷＵＫ／ＰＡＩ−１複合体の濃度はＰＡＩ−１に対する
モノクローナル抗体を用いる酵素免疫分析と坂田等（Ｓ
ａｋａｔａ，Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｎｏｒｏｒｏ，
Ａ．，＆Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９６０−１９６９、Ｓａｋａ
ｔａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｎｏｒｏ，
Ａ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，＆Ｍａｔｕｄａ，Ｍ．Ｂｌｏｏ
ｄ ７７，１９４９−１９５７．）が述べたＬＭＷＵＫ
に対する精製ポリクローナル抗体への親和性よって測定
された。２次速度定数はヘックマン等（Ｈｅｋｍａｎ，
Ｋ．Ｍ．＆ Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ，Ｄ．Ｊ．（１９８
８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６
２，１９９−２１０）、ウィットベル等（Ｗｉｔｔｗｅ
ｒ，Ａ，Ｊ．，＆Ｓａｎｚｏ，Ｍ．Ａ．（１９９０）Ｔ
ｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｓ．６４，２７０−２７
５）、金子等（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ，Ｊ．，Ｍａｔｓｕｄ
ａ，Ｍ．，＆Ｓａｋａｔａ，Ｙ．（１９９１）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．１７
８，１１６０−１１６６）が述べた偽一次反応速度定数
下で計算された。ＬＭＷＵＫとＰＡＩ−１の等モル濃度
が３７℃で１００μＭペプチドの存在あるいは非存在下
で各種期間インキュベートされた。１０ｍＭｐ−ＡＰＭ
ＳＦの添加によって反応の停止後、ＬＭＷＵＫ／ＰＡＩ
−１複合体濃度が上記されたようにして決定された。合
成基質Ｓ−２４４４（カビ、ストックフォルム、スエー
デン）がペプチドの阻害効果を確認するためペプチドの
存在あるいは非存在下でＰＡＩ−１によるＬＭＷＵＫの
水解活性の阻害を記録するために用いられた。ＬＭＷＵ
Ｋ（５ｎＭ）がペプチドの各種濃度の存在または非存在
下でＰＡＩ−１（２．５ｎＭ）とともに３７℃１０分間
インキュベートされた。ＬＭＷＵＫの残存活性がＳ−２
４４４水解速度を測定することによって定量された。結
果は図６に示したようにＵ３７３のみがＰＡＩ−１によ
るＬＭＷＵＫの阻害を阻害した。しかしながらＬＭＷＵ
ＫはＵＫの分解産物であって生理的にはＰＡＩ−１によ
るＵＫの阻害が重要であり、本結果はペプチドＵ３７３
と、ペプチドＵ１０３とＵ１０７のグループの作用部位
が異なることを意味している。
【００１５】実施例１１実施例９及び１０の方法に従って実験を行なった結果の
２次反応速度定数 １００μＭＵ１０７，１００μＭＵ３７３あるいはＵ１
０７並びにＵ３７３両者を各１００μＭ存在下あるいは
非存在下でＵＫとＰＡＩ−１あるいはＬＭＷＵＫとＰＡ
Ｉ−１の不活性化における２次速度定数を求めた。表２
に示すように、ＵＫとＰＡＩ−１の場合Ｕ１０７並びＵ
３７３両者とも非存在に比較して速度定数の約１／１０
の低下が観察され、さらにＵ１０７とＵ３７３の併存に
よって相乗的に速度定数が低下し約１／１００になっ
た。一方ＬＭＷＵＫとＰＡＩ−１の場合にはＵ１０７の
添加によって速度定数の低下が見られずＵ３７３の添加
でのみ見られ、Ｕ１０７並びにＵ３７３両者の併存によ
ってもＵ３７３単独の効果しか示さなかった。上述した
ようにＬＭＷＵＫはＵＫの分解産物であるので医薬とし
ての治療効果を考える場合にはＵＫとＰＡＩ−１との反
応の阻害がより重要であり、ＬＭＷＵＫとＰＡＩ−１の
反応阻害は前者における相乗効果の理由検討の意味を有
するものである。つまりＵ３７３とＵ１０７及びＵ１０
３の作用部位が異なっていることを示す。
２次反応速度定数 １００μＭＵ１０７，１００μＭＵ３７３あるいはＵ１
０７並びにＵ３７３両者を各１００μＭ存在下あるいは
非存在下でＵＫとＰＡＩ−１あるいはＬＭＷＵＫとＰＡ
Ｉ−１の不活性化における２次速度定数を求めた。表２
に示すように、ＵＫとＰＡＩ−１の場合Ｕ１０７並びＵ
３７３両者とも非存在に比較して速度定数の約１／１０
の低下が観察され、さらにＵ１０７とＵ３７３の併存に
よって相乗的に速度定数が低下し約１／１００になっ
た。一方ＬＭＷＵＫとＰＡＩ−１の場合にはＵ１０７の
添加によって速度定数の低下が見られずＵ３７３の添加
でのみ見られ、Ｕ１０７並びにＵ３７３両者の併存によ
ってもＵ３７３単独の効果しか示さなかった。上述した
ようにＬＭＷＵＫはＵＫの分解産物であるので医薬とし
ての治療効果を考える場合にはＵＫとＰＡＩ−１との反
応の阻害がより重要であり、ＬＭＷＵＫとＰＡＩ−１の
反応阻害は前者における相乗効果の理由検討の意味を有
するものである。つまりＵ３７３とＵ１０７及びＵ１０
３の作用部位が異なっていることを示す。
【００１６】
【発明の効果】本発明の化合物はｕＰＡと併用すること
によりＰＡＩ−１の阻害からｕＰＡを守る役目を充分に
果しうる最初に報告される化合物である。本発明のペプ
チド化合物の使用により脳梗塞等の血栓症の予防と治
療、および血栓溶解剤による再開通後の再閉塞の予防と
治療ならびに播種性血管内凝固症侯群（ＤＩＣ）等に伴
う臓器障害の予防と治療のための医薬、さらには血液中
のｕＰＡやＰＡＩ−１の診断薬、あるいは上記疾患のお
よびＰＡＩ−１研究のための試薬として用いることがで
きる。
によりＰＡＩ−１の阻害からｕＰＡを守る役目を充分に
果しうる最初に報告される化合物である。本発明のペプ
チド化合物の使用により脳梗塞等の血栓症の予防と治
療、および血栓溶解剤による再開通後の再閉塞の予防と
治療ならびに播種性血管内凝固症侯群（ＤＩＣ）等に伴
う臓器障害の予防と治療のための医薬、さらには血液中
のｕＰＡやＰＡＩ−１の診断薬、あるいは上記疾患のお
よびＰＡＩ−１研究のための試薬として用いることがで
きる。
【図１】ＵＫのＮ末端断片への［１２５Ｉ］ＰＡＩ−１
の結合を示す。四角で囲まれた部分はスカッチャード分
析の結果を示す。他の挿入図はＵＫのモノクローナル抗
体ＭｏＡｂＪＴＵ−Ａ３（１）とクリングルドメインを
含有する分子量２１、０００のＵＫ断片（２）とのウエ
スタンブロッティングとＳＤＳ電気泳動の結果を示す。
の結合を示す。四角で囲まれた部分はスカッチャード分
析の結果を示す。他の挿入図はＵＫのモノクローナル抗
体ＭｏＡｂＪＴＵ−Ａ３（１）とクリングルドメインを
含有する分子量２１、０００のＵＫ断片（２）とのウエ
スタンブロッティングとＳＤＳ電気泳動の結果を示す。
【図２】各種合成ペプチド存在下におけるＵＫのＮ末端
断片への［１２５Ｉ］ＰＡＩ−１の結合を示す。 ○：Ｕ９９（９９−１０６＊） Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔ
ｙｒ Ｃｙｓ ＡｒｇＡｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ ●：Ｕ１０３（１０３−１１０）Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ □：Ｕ１０７（１０７−１１４）Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ ▲黒四角▼：Ｕ３７３（３７３−３９８）Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＊：（）内の数値は、数値で示されたＵＫのＮ末端から
のアミノ酸配列番号のアミノ酸配列に一致するアミノ酸
配列であることを示す。
断片への［１２５Ｉ］ＰＡＩ−１の結合を示す。 ○：Ｕ９９（９９−１０６＊） Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｔ
ｙｒ Ｃｙｓ ＡｒｇＡｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ ●：Ｕ１０３（１０３−１１０）Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ □：Ｕ１０７（１０７−１１４）Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒ
ｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ ▲黒四角▼：Ｕ３７３（３７３−３９８）Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐ ＊：（）内の数値は、数値で示されたＵＫのＮ末端から
のアミノ酸配列番号のアミノ酸配列に一致するアミノ酸
配列であることを示す。
【図３】各種合成ペプチドへの［１２５Ｉ］ＰＡＩ−１
の結合を示す。 ○：Ｕ９９ ●：Ｕ１０３ □：Ｕ１０７
の結合を示す。 ○：Ｕ９９ ●：Ｕ１０３ □：Ｕ１０７
【図４】各種合成ペプチドへの［１２５Ｉ］ＰＡＩ−１
の結合を示す。 △：Ｕ３７３ ●：Ｕ９９
の結合を示す。 △：Ｕ３７３ ●：Ｕ９９
【図５】ＵＫ／ＰＡＩ−１複合体形成における合成ペプ
チドの効果 □：Ｕ１０７ ○：Ｕ９９ △：Ｕ３７３ ▲黒四角▼Ｕ１８０（１８０−１８
７）ＨＲＧＧＳＶＴＹ ●：Ｕ１０３
チドの効果 □：Ｕ１０７ ○：Ｕ９９ △：Ｕ３７３ ▲黒四角▼Ｕ１８０（１８０−１８
７）ＨＲＧＧＳＶＴＹ ●：Ｕ１０３
【図６】ＵＫ／ＰＡＩ−１複合体形成における合成ペプ
チドの効果 □：Ｕ１０７ ○：Ｕ９９ △：Ｕ３７３ ▲黒四角▼Ｕ１８０ ●：Ｕ１０３
チドの効果 □：Ｕ１０７ ○：Ｕ９９ △：Ｕ３７３ ▲黒四角▼Ｕ１８０ ●：Ｕ１０３
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三室 淳 栃木県宇都宮市豊郷台２−82−６ (72)発明者 金子 宗聖 大阪府茨木市桑田町２−１−216 (72)発明者 村上 敏信 東京都日野市多摩平３−18−４ (72)発明者 松田 道男 栃木県宇都宮市緑５−21−１
Claims (10)
- 【請求項１】官能基としてグアニジン基またはアミノ基
を含むアミノ酸を少なくとも４個以上有するアミノ酸配
列からなることを特徴とするペプチド。 - 【請求項２】次のアミノ酸配列を有することを特徴とす
る請求項１記載のペプチド， Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｃ
ｙｓ Ｔｙｒ - 【請求項３】次のアミノ酸配列を有することを特徴とす
る請求項１記載のペプチド， Ｉｌｅ Ｖａｌ ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇ
ｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ｔｒｐ - 【請求項４】プラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ターによるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベー
タの阻害を阻害することを特徴とする請求項１記載のペ
プチド。 - 【請求項５】化合物を基材に付着させ非特異的吸着を阻
止する処置を行なった後放射線標識プラスミノーゲンア
クチベーターインヒビターの結合頻度を観察することに
よりプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター阻害
剤をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニン
グ方法。 - 【請求項６】基材がマイクロタイタープレートである請
求項５記載のスクリーニング方法。 - 【請求項７】プラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ターによるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベー
タの阻害を阻害することを特徴とする請求項１記載のペ
プチドの塩類。 - 【請求項８】脳梗塞等の血栓症、および血栓溶解剤によ
る再開通後の再閉塞ならびに重症感染症患者における播
種性血管内凝固症侯群（ＤＩＣ）に伴う臓器障害の予防
と治療に用いられることを特徴とする請求項１記載のア
ミノ酸配列を有するペプチドを含有する医薬。 - 【請求項９】脳梗塞等の血栓症、および血栓溶解剤によ
る再開通後の再閉塞ならびに播種性血管内凝固症侯群
（ＤＩＣ）等の疾患およびブラスミノーゲンアクチベー
ターインヒビター研究のための薬理学的試薬に用いられ
ることを特徴とする請求項１記載のアミノ酸配列を有す
るペプチド。 - 【請求項１０】請求項１記載のアミノ酸配列を有するペ
プチドを含有する血液中のウロキナーゼ型プラスミノー
ゲンアクチベーターやプラスミノーゲンアクチベーター
インヒビターのための診断薬
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4250364A JPH0770190A (ja) | 1992-08-05 | 1992-08-05 | ペプチド |
| PCT/JP1993/001103 WO1994003488A1 (fr) | 1992-08-05 | 1993-08-05 | Nouveau peptide |
| AU47606/93A AU4760693A (en) | 1992-08-05 | 1993-08-05 | Novel peptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4250364A JPH0770190A (ja) | 1992-08-05 | 1992-08-05 | ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0770190A true JPH0770190A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=17206827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4250364A Pending JPH0770190A (ja) | 1992-08-05 | 1992-08-05 | ペプチド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0770190A (ja) |
| AU (1) | AU4760693A (ja) |
| WO (1) | WO1994003488A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021014419A (ja) * | 2019-07-11 | 2021-02-12 | 公立大学法人福井県立大学 | サバ由来のペプチドを有効成分とするｐａｉ−１阻害剤及び組成物 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116143868B (zh) * | 2023-01-10 | 2025-10-21 | 合肥工业大学 | 一种能够增强咸味的多肽及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8630721D0 (en) * | 1986-12-23 | 1987-02-04 | Unilever Plc | Cosmetic compositions |
| JP2668726B2 (ja) * | 1989-02-08 | 1997-10-27 | 雪印乳業株式会社 | 細胞親和性の高い化学修飾ラクトフェリンの調製方法 |
| JP3009255B2 (ja) * | 1991-08-01 | 2000-02-14 | 株式会社日立製作所 | 給油式スクリュー圧縮機の吸込み絞り弁 |
-
1992
- 1992-08-05 JP JP4250364A patent/JPH0770190A/ja active Pending
-
1993
- 1993-08-05 WO PCT/JP1993/001103 patent/WO1994003488A1/ja not_active Ceased
- 1993-08-05 AU AU47606/93A patent/AU4760693A/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021014419A (ja) * | 2019-07-11 | 2021-02-12 | 公立大学法人福井県立大学 | サバ由来のペプチドを有効成分とするｐａｉ−１阻害剤及び組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1994003488A1 (fr) | 1994-02-17 |
| AU4760693A (en) | 1994-03-03 |
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