JPH0771492B2 - グラム陽性細菌の熱誘導性遺伝子発現方法 - Google Patents

グラム陽性細菌の熱誘導性遺伝子発現方法

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JPH0771492B2
JPH0771492B2 JP60254620A JP25462085A JPH0771492B2 JP H0771492 B2 JPH0771492 B2 JP H0771492B2 JP 60254620 A JP60254620 A JP 60254620A JP 25462085 A JP25462085 A JP 25462085A JP H0771492 B2 JPH0771492 B2 JP H0771492B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は温度変化によるグラム陽性菌の遺伝子発現を誘
導する方法に関する。本発明は又、１つのプラスミドに
クローン化された異種構造遺伝子の温度誘導性の効果的
な発現ができる少なくとも２種類の異なるプラスミドを
含む枯草菌型のグラム陽性菌を供する。
現在まで、多くの著者が論文の中で、多くの種類の原核
細胞及び真核細胞での異種構造遺伝子の発現に関して発
表している。そのようなクローン化された異種構造遺伝
子の発現効率は、多かれ少なかれ重要な多くのパラメー
ターの関数である。それらのパラメーターの中で、外部
モジユレーター、すなわち、クローン化された異種構造
遺伝子の発現が始まる正確な瞬間の選択をさせる化学的
あるいは物理的方法による発現の調節が明らかに最も重
要な因子の１つである。この問題の解決に対する多くの
解答が想像され、そして、これらの可能な解答の１つ
は、なんとかして、特定の温度に到達すると異種構造遺
伝子の発現を開始させるために、温度誘導性の発現を創
り出すことにある。これを行なう各種の方法が、コーエ
ンの米国特許第4374927号明細書に十分開示されてい
る。
しかしながら、そのような調節された温度誘導性の遺伝
子発現は現在までのところ、大腸菌のようなグラム陰性
型の細菌でのみ十分な結果が得られており、グラム陽性
菌では得られていない。
異種構造遺伝子の発現の調節は又はある環境下におい
て、本発明において実現される遺伝的構築によりグラム
陽性菌において実現されうることが見い出された。
それ故、本発明の具体化の１つは、グラム陽性菌におけ
る熱誘導性遺伝子発現の方法に関する。この熱誘導性遺
伝子発現は、少なくとも２種類の異なるプラスミド（こ
れらは遺伝子工学によりつくられ、それぞれ、第１のプ
ラスミドに関しては、グラム陽性菌に適したプロモータ
ーDNAにより発現される異種構造遺伝子のDNA、第２のプ
ラスミドに関しては、その蛋白産物が第１のプラスミド
のプロモーターと相互作用できるリプレツサー遺伝子の
DNA、および温度感受性物質から成る）をグラム陽性菌
に導入することにより実現されることを特徴とする。
温度感受性物質としては、第２のプラスミドに挿入する
ことができる既知の合成あるいは天然に存在するDNAが
用いられる。温度感受性プラスミドとして既に天然に存
在し、その中にその蛋白産物が第１のプラスミドのプロ
モーターと相互作用できるようなリプレッサー遺伝子DN
Aが遺伝子工学により挿入されているプラスミドを、第
２のプラスミドとして用いることにより良好な結果が得
られた。
プロモーターとリプレツサー遺伝子は２つの異なるプラ
スミド上に位置するが、互いに相互作用することが可能
で、むしろ同一のDNA由来である；好ましいDNAとして、
バクテリオフアージ、より正確には溶原性バクテリオフ
アージ、即ち同一の溶原性バクテリオフアージのゲノム
物質が用いられる。
グラム陽性菌として、ストレプトマイセス、コリネバク
テリウム、クロストリジウム、スタフイロコツカス及び
バチルス属が用いられる。枯草菌の菌株で良好な結果が
得られた。
従つて、本発明は、遺伝子工学によりつくられた少なく
とも２種類の異なるプラスミドを含み、第１のプラスミ
ドに関しては、枯草菌の菌株に適したプロモーターDNA
により発現される異種構造遺伝子DNA、第２のプラスミ
ドに関しては、その蛋白産物が、第１のプラスミドのプ
ロモーターDNAと相互作用可能であるリプレツサー遺伝
子DNA及び温度感受性物質から成る新しい枯草菌の菌株
にも関する。
本発明は又後述する新しいプラスミド、新しいプロモー
ター及びリプレツサー遺伝子のDNAを含む。さらに本発
明は又、グラム陽性菌に導入され、かつ、それぞれ、
ａ）枯草菌の溶原性フアージ由来の初期プロモーターDN
Aにより発現される原核細胞あるいは真核細胞の異種構
造遺伝子のDNA、及びｂ）その蛋白産物が第１のプラス
ミドの初期プロモーターDNAと相互作用可能であるリプ
レツサー遺伝子DNAと温度感受性物質、を含む少なくと
も２種類のプラスミドから成る新しいプラスミド−ある
いはベクター系に関する。
本発明は、以後、枯草菌の菌株に関して説明し、異種構
造遺伝子のモデルとしてクロラムフエニコール・アセチ
ル・トランスフエラーゼ（cat−86）遺伝子を選択し
た。しかしながら、本発明は、当業者にとつては、困難
なことなく、他のグラム陽性菌及び／あるいは異なる原
核細胞又は真核細胞に由来する他の異種構造遺伝子で実
行することができる。用いる異種構造遺伝子の特定の性
質によれば、異なる種類の蛋白を合成することができ
る。
本発明の別の具体化は、目的とする解読配列の発現に対
して、目的とする解読配列とオペレーターの両立できる
リプレツサー蛋白をコードするDNA配列に操作しやすく
結合したプロモーター／オペレーターを含むベクター系
を含む簡便な細菌コントロール系に関する。上記オペレ
ーター及び上記リプレツサー蛋白をコードするDNA配列
は、グラム陽性菌起源である。一般的に、オペレーター
とリプレツサー蛋白をコードするDNA配列の両者は同一
のグラム陽性菌起源に由来し、現在までに、両者が枯草
菌の溶原性フアージφ105由来で、特に、この溶原性フ
アージの免疫領域由来のときに最良の結果が得られてい
る。
プロモーターの起源は、発現がおこなわれる特定のグラ
ム陽性菌の宿主で両立できるのであるならば、本発明に
は直接の重要性はない。それ故、オペレーターの由来の
DNAと同一のDNAでも又、他の材料のDNAのプロモーター
でも利用可能である。さらに詳述すれば、グラム陽性菌
及び陰性菌由来のプロモーター、あるいは真核生物由来
のプロモーターでさえ使用可能である。
それ故、このベクター系のプロモーターとして、各種の
材料由来の個々の場合に望むような非常に強い、中位
の、弱い、時には非常に弱い活性をもつたDNAを選択す
ることが可能である。
リプレツサーとそれと同起源のオペレーターの各種の組
合わせが可能であるけれども、現在までのところ、DNA
がグラム陽性菌由来のリプレツサーで、その転写が自身
のプロモーターで自動調節される、即ち、それ自身の転
写を促進するリプレツサーで最良の結果が得られてい
る。
発現させる目的とする解読配列は、原核又は真核生成由
来の、ヒトあるいは動物用薬剤、ワクチン、酵素などの
ような技術分野で興味あるそして価値のある１つあるい
はそれ以上のペプチド又は蛋白をコードするDNAであ
る。
上記の必須要素を加えるならば、本発明の特別な目的に
対して、どのようなベクター系も使用できる。プラスミ
ド工学に基づいたベクター系で良好な結果が得られた。
そのようなプラスミド工学が選択されると、１つの及び
同一のプラスミド上、あるいは異なるプラスミド上で、
そして、少なくとも部分的に宿主菌の染色体上でさえ、
プロモーター／オペレーター、目的とする解読配列及び
リプレツサー蛋白をコードするDNA配列を結合すること
が可能となる。
本発明の例において、発明の目的を示すために２種類の
プラスミドを含む系を、誘導するために熱誘導性の遺伝
子発現を用いた。
実験の部分を簡単に理解するために、次に略語のリスト
と簡潔な要約をあげる。
略語のリスト Ap＝アンピリシン;CAT＝クロラムフエニコール・アセチ
ル・トランスフエラーゼ;Cm＝クロラムフエニコール;EG
TA＝エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエー
テル）N,N,N,N′−四酢酸;Em＝エリスロマイシン;EtBr
＝臭化エチジウム;IPTG＝イソプロピル・β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド;kb＝1000bp（塩基対）;Km＝カナマ
イシン；lacZpo＝lacプロモーター／オペレーター領域;
LB＝ルリア・ブロース;LBG＝グルコースを含むルリア・
ブロース;MCS＝複合クローニング部位;pfu＝プラーク形
成単位;R＝耐性;S＝感受性;Xgal＝５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル・β−Ｄ−ガラクトピラノシド；
〔 〕＝プラスミドの担体の状態を示す。
要約 プロモーターを欠損したクロラムフエニコール（Cm）ア
セチル・トランスフエラーゼ遺伝子（cat−86）を含む
枯草金／大腸菌プラスミドベクターが、pPL603（参照
１）とpUC3（参照２）をその中の唯一のEcoRI部位で結
合することにより構築した。この「プロモーター・プロ
ーブ」ベクターを利用して、Cm耐性の選択により、枯草
菌のプロモーター活性を示す溶原性フアージφ105のゲ
ノムから、クローン化したSau3A断片を回収した。18個
のプロモーター・プラスミドを温度感受性のレプリコン
pE194に挿入された機能性φ105リプレツサー遺伝子を含
む受容体細胞BD170〔（pCGV28）〕に移した。リプレツ
サー支配のプロモーターは、熱誘導性のCm耐性を与える
能力に基づいて同定した。プロモーターは、φ105リプ
レツサー遺伝子をも含む3.2kbのEcoRI−Ｆ断片の中にあ
る650bpのSau3A断片上に位置する。EcoRI−Ｆのクロー
ン化された部分断片のφ105感染に対する免疫の発現を
試験することにより、リプレツサー遺伝子は、部分的に
プロモーター断片と重複する1.1kbのEcoRI−HindIII断
片であると決定された。
実験操作 1.材料及び方法 ａ） 菌株、プラスミド及び酵素 いくつかの材料からの細菌宿主とプラスミドを表Ｉに掲
載した。この実験中に構築されたプラスミド及び菌株を
表II及びIIIに述べた。
全ての培養は、特定の抗生物質を添加した１％グルコー
スを含むルリア・ブロース（LBG）でおこなつた。枯草
菌の菌株はＭ寒天（参照３）上で保持した。Sau3Aの部
分消化の際に、0.2単位／μgDNAを用い、37℃で４分間
のインキユベーシヨンをおこなつた。
ｂ） DNA調製 ゴールドフアルブにより述べられている方法（参照５）
を改良した方法で、大腸菌（参照４）及び枯草菌から少
量のプラスミドDNAを調製した。大量のプラスミド調製
は、これらの方法をスケールアツプした方法を用いてお
こない、CsCl−EtBr平衡密度精製した。
フアージφ105は、枯草菌168（φ105）株の対数増殖期
（５×107cfu/ml）にマイトマイシンＣ（１μg/ml）を
添加することで誘導した。37℃で３時間振盪後、溶菌液
を遠心した。フアージ懸濁液をポリエチレングリコール
沈澱（参照６）で濃縮し、1/100容のフアージ緩衝液（1
0mM Tris・HCl、pH7.2、10mM MgSO4）に再懸濁した。こ
の懸濁液液は、1011pfu/mlを含んでいた。
37℃、１時間のDNase（50μg/ml）及びRNase（50μg/m
l）の処理後、フアージ懸濁液を２回フエノール抽出と
４回エチルエーテルを抽出した。DNAをエタノールで沈
澱させ、滅菌したガラス棒に巻きつけて回収した。
ｃ） 形質転換 標準のCaCl2法を用いて大腸菌を形質転換した（参照2
2）。枯草菌BD170の感応細胞をダブナウとダビドフーア
ベルソンの方法（参照７）で調製、保存し、1mM EGTA存
在下で形質転換した（参照８）。選択された抗生物質の
濃度は、本明細書中特に記さない限り、カナマイシン10
μg/ml及びクロラムフエニコール15μg/mlであつた。
pE194あるいはその誘導体で形質転換された細胞は、10
μg/mlのエリスロマイシンを含む平板での選択の前に、
0.05μg/mlのエリスロマイシンで１時間誘導した（参照
９）。
ｄ） フアージ感染能の試験 フアージの力価は、指示菌として、枯草菌168株の対数
増殖期の細胞を用いて、ルードベルクの方法（参照10）
で決定した。
形質転換体を1mlのLBGの入つたチユーブの中で個々のコ
ロニーをつることにより、φ105に対する感受性で試験
した。培養液がわずかに濁るまで37℃でチユーブをイン
キユベーシヨンした。白金目を用いて、それぞれの培養
試料をフアージの希釈懸濁液を浸み込ませてあるLBG平
板（５×103pfu/平板）に画線した。33℃で１晩培養し
た後に、プラーク形成を感受性菌で観察した。この方法
で試験したときにφ105感染に免疫を示した菌株をさら
に、対数増殖期の培養液0.3mlとフアージ懸濁液（3.5×
103pfu/ml）0.1mlとすることにより試験した。37℃で15
分間インキユベーシヨンの後、2.5mlの融解した上層寒
天を加え、混合液をLB平板上にまいて、37℃で培養し
た。168株と168（φ105）株の対数増殖期の培養液が両
試験でそれぞれ感受性及び免疫のコントロールとして使
用した。
2.結果 ａ） 枯草菌／大腸菌二機能プロモータープローブベク
ターの構築 4.7kbの枯草菌カナマイシン耐性プラスミドpPL603はpUB
110由来である。これはバチルス・プミルス由来のプロ
モーター配列を上流に唯１ケ所あるEcoRI部位に組込む
ことにより、転写活性を有するようになるカナマイシン
耐性のサイレン遺伝子（cat−86）を含んでいる。cat−
86の解読配列とその５′側EcoRI部位までの隣接領域の
配列は決定されている（参照11及び12）。cat −86の発現は、ほとんどおそらく、翻訳レベルでのC
m誘導性である（参照13）。EcoRIで直線化したpPL603を
EcoRI切断した大腸菌のレプリコンpUC8 ApR（アンピリ
シン耐性）に連結した。大腸菌JM83の形質転換とApR及
びKmRの選択の後、耐性コロニーをXg1平板上に白色コロ
ニーが出現することでチエツクした。これらのコロニー
の中にプラスミドが共に挿入存在しているかは、アガロ
ースゲル電気泳動でさらに確かめることができる。複合
レプリコンの２つの可能な相対的な方向性により規定さ
れるので２つの型の組換え体が得られた。pPGV2と命名
された一方のプラスミド（図１）は、これ以降の研究の
ために選択した。この7.4kbのプラスミドは、大腸菌で
も枯草菌でも複製するが、後者ではカナマイシン耐性遺
伝子のみが発現される。プラスミドは両種で安定的に保
持され、長期間の培養後も欠落は観察されなかつた。pP
GV2をもつ枯草菌細胞は５μg/mlカナマイシンでコロニ
ーの大きさが減少し、10μg/mlで感受性である。pPGV2
のcat−86遺伝子は、SalＩ、SmaＩ及びBamHI部位を１ケ
所ずつ含むpUC8由来の多重クローニング部位配列（MCS
−８）の前に置かれている。後者の部位は、TTG開始コ
ドンの358bp上流に位置し、中間体配列は全ての３種類
の読みとり枠の中に停止コドンを含んでいる。
直接選択によつて、枯草菌でプロモーター活性を示す断
片をクローニングする際に、pPGV2が有効であることは
研究されている。この最後まで、枯草菌168株の染色体D
NAはSau3Aで消化され、BamHI切断のpPGV2に連結され、
枯草菌BD170株の形質転換に用いた。クロラムフエニコ
ール耐性（15μg/ml）の選択で、耐性コロニーが、カナ
マイシン耐性の形質転換体の頻度の１％の頻度で得られ
た。これらのクロラムフエニコール耐性株の組換えプラ
スミドの構造を解析する簡便な方法は、もとの枯草菌プ
ラスミド標品での大腸菌C600r-m-細胞の形質転換と、大
腸菌形質転換体から分離されたプラスミドのHindIII消
化から成る。図２（ｂ及びｃ列）に示すように、小さな
HindIII断片（0.85kb）の大きさの増加が挿入されたプ
ロモーター断片の長さを示している。「材料と方法」に
述べた酵素試験により測定すると、cat−86の発現のレ
ベルは、異なるプロモーター効率を反映する異なる組換
えプラスミドをもつ菌株間でかなり変化した。しかしな
がら、試験した全てのプロモータープラスミドで、CAT
活性はクロラムフエニコール誘導性のままであつた。
ｂ） フアージφ105ゲノムからのプロモーターのクロ
ーニング フアージφ105DNAの転写単位の位置に関するデータは得
られなかつたので、全ゲノムを表わすφ105プロモータ
ーを含むプラスミドの収集をおこなうこととした。精製
したφ105DNAをSau3Aで完全及び部分消化の条件下で消
化した（「材料及び方法」参照）。それぞれの消化産物
をBamHI切断pPGV2に連結した。枯草菌BD170株の形質転
換の後、全体で200以上のCmRコロニーが単離された。そ
れらのうち35個がこれ以降の研究に選ばれた。これらの
プラスミドを表IIに掲載する。pPGV1φからpPGV10φま
でをもつ菌株はでたらめにSauえ3A完全消化の形質転換
体からつり上げた。プラスミドpPGV103φからpPGV139φ
は、より高濃度のクロラムフエニコール（50−100−200
μg/ml）存在下でのSau3A完全消化の形質転換体のレプ
リカ平板法により選択された菌株中に存在している。プ
ラスミドpPGV201φからpPGV200φは、同様にしてSau3A
部分消化の形質転換体から選択した。表IIは、全ての場
合で、CmR表現型が、0.2−3.0kbの範囲の大きさの挿入
を伴つていることを示している。これらのφ105プロモ
ータープラスミドに支配されるCAT活性はベクターpPGV2
で測定した活性の10倍（pPGV208φ）から3000倍（pPGV1
38φ）の範囲の広い増加を示す（表II参照）。
プラスミドpPGV138φは、溶原性フアージSPO2のEcoRI＊
断片の挿入をもつpPL603の誘導体で、強力なプロモータ
ー・プラスミドと考えられているpPL608（参照14）の少
なくとも10倍高いCAT活性を有している。
pPGV138φ挿入の配列データ（示さない）は、HindIII部
位を含む、単一の386bpのSau3A断片から成ることを示し
ている（図2e列参照）。配列内の可能な「−35」及び
「−10」領域の探索は、δ55を含むDNAポリメラーゼに
より認識される活性化されたプロモーターに見い出され
る標準的な配列と相同性を示す、１組の正確に区切られ
た６ヌクレオチド、「５′−TTGTTA−３′」及び「５′
−GATAAT−３′」を示した（参照15）。AUGの翻訳開始
コドンは、「GATAAT」の16ヌクレオチド下流に見い出さ
れ、Sau3A断片の右端まで通してオープン・リーデイン
グフレームが続いている。
ｃ） φ105ゲノム上のプロモーター断片のマツピング クローン化されたφ105断片の収集の中からリプレツサ
ー支配のプロモーターを検索することは興味深いことで
ある。ハイブリダイゼーシヨンのプローブとして32Pで
標識した断片をニトロセルロースに結合させた分離した
31個の異なるプロモータープラスミドのDNAに対して使
用した。図3Aに示したように、その強さにかなりの差は
あるが、14個のプラスミドが、検出可能なハイブリダイ
ゼーシヨンの兆候を生じた。例えば、強いハイブリダイ
ゼーシヨンはpPGV209φで観察された、その一方、pPGV1
31φで得られたものは非常に弱かつた。続いて同一のフ
イルターが他のφ105断片、フアージゲノムのEcoRＩ−
Ｆに隣接してはいないが（第７参照）、φ105のEcoRＩ
消化のアガロースゲル電気泳動ではＦ断片に最も近く移
動する5.4kbのEcoRＩ−Ｅで検索した。
図3A及び3Bの比較は、（pPGV206φ、pPGV209φ及びpPGV
210φのような）いくつかのプラスミドは、両方のプロ
ーブにハイブリダイズすることを示している。（pPGV7
φ、pPGV10φ、pPGV103φ、pPGV205φ及びpPGV208φの
ような）他のプラスミドが明らかに特異的にEcoRＩ−Ｆ
又はEcoRＩ−Ｅのどちらかとハイブリダイズするので、
この結果は用いたプローブへのほんのわずかの夾雑物に
よるだけでは説明され得ない。いくつかの挿入断片が、
２つ又はそれ以上の元来非連続のSau3A断片を形成した
ということは可能である。さらに挿入断片の大きさを考
慮に入れると、ハイブリダイゼーシヨンのデータは次の
ように要約される（表II参照）：プラスミドpPGV7φ、p
PGV8φ、pPGV9φ、pPGV10φ、pPGV117φ、pPGV205φ、p
PGV208φ及びpPGV209φは、完全ではないにしろ、有力
にEcoRＩ−Ｆ由来のφ105配列を含み、pPGV1φ、pPGV10
3φ、pPGV206φ及びpPGV210φは、ほとんどがEcoRＩ−
Ｅにマツプされる挿入を持つ。
ｄ） pE194へのφ105リプレツサー遺伝子のクローニン
グ 明らかに、φ105リプレツサー支配下にあるプロモータ
ーのさらに決定的な検索は、機能的なリプレツサーを含
む宿主細胞ではcat−86遺伝子の発現が促進されないこ
とに基づくべきである。
それ故、（pUB110の複製起源をもつ）プロモータープラ
スミドと両立できる枯草菌レプリコンにφ105EcoRＩ−
Ｆ断片を挿入した。
エリスロマイシン耐性プラスミドpE194（参照16及び1
7）が、さらにおもしろい性質を有するので選択され
た：これは天然には、複製が温度感受性である（参照1
8）。従つて、非許容温度（45℃）ではリプレツサー遺
伝子を無視することができ、それ故、リプレツサー蛋白
の温度感受性突然変異の効果をマネできる。
枯草菌ではpE194はコピー数が低く、複製機能あるいは
エリスロマイシン耐性遺伝子の外側に存在する特定の制
限酵素の部位が少ないことは（図４）、クローニング・
ベクターとして効果的な使用が妨げられることである。
この問題を克服するために、挿入されたpE194のPstＩ切
断DNAを大腸菌プラスミドpVC4のPstＩ部位に挿入した。
pUC4のPstI部位は、MCS7要素の部分で、２つのSalＩ、B
amHI及びEcoRI部位に対称的に隣接している。
その結果組み込まれたプラスミドpCGV4は、大腸菌と枯
草菌の両方で複製し、PstＩ、SalＩ、BamHI、EcoRIのい
ずれかの端をもつた直線状のpE194DNAの便利な材料とし
て作用する。
pCGV4のpUC4部分をφ105のEcoRI−Ｆ断片に置き換える
ために、プラスミドpHV14/FをEcoRIで消化し、その産物
をEcoRIで切断したPCGV4に連結した。37℃でφ105感染
に対する免疫を40個のEmRの枯草菌BD170の形質転換体に
ついて検索し（「材料及び方法」参照）、１個の免疫コ
ロニーをこの後の解析のために選択した。
この菌株から調製したプラスミドのEcoRI消化は、それ
ぞれが（pCGV4から切り出された）pE194及びφ105−Eco
RI−Ｆに相当する3.7kbと3.2kbの大きさの２つのバンド
を示した。45℃でこの菌株は、エリスロマイシン平板上
で生育しなかつた。これは、pCGV28（図４）と命名され
た、pE194/EcoRI−Ｆ組換えプラスミドが、pE194の温度
感受性という性質を持ち続けていることを示している。
菌株BD170〔pE194〕とBD170〔pCGV28〕を非選択培地
中、28℃、33℃、37℃及び45℃で１晩培養し、得られた
細胞集団についてEmR画分を決定したところ、これはか
なり変化が見られた。結果は両菌株で類似していた:28
℃で培養したものは本質的に100％EmR細胞を含んでい
た、そして33℃では95％、37℃では50％、そして45℃で
は0.1％以下であつた。
ｅ） 負の支配を受けたφ105プロモーターの同定 リプレツサー支配の配列の存在について、φ105プロモ
ーターを含むpPGV2誘導体を検索するために、18個の異
なるプラスミド（表III参照）のそれぞれを個々に、BD1
70〔pCGV28〕株の感応細胞に導入した。それぞれの形質
転換体は、37℃でEm−Km平板上で選択され、次いで33℃
と45℃でのクロラムフエニコール耐性（15μg/ml）の試
験をおこなつた。cat遺伝子の発現がフアージの初期プ
ロモーターの支配下にある菌株の期待される表現型は、
機能しうるリプレツサーがトランス状態で供給される33
℃でクロラムフエニコール感受性（CmS）で、菌株がも
つているプラスミドpCGV28を欠落するためにリプレツサ
ーが働かなくなる45℃ではクロラムフエニコール耐性
（CmR）である。
そのような試験の結果を表IIIに要約した。ほとんどのp
CGVプラスミドは両方の温度で、クロラムフエニコール
耐性となり（図5B参照）、これは、クローン化されプロ
モーターが機能的にリプレツサー非依存性であることを
示している。しかしながら、３種のプラスミド、pPGV9
φ、pPGV10φ及びpPGV209φは、予想された温度誘導性
のクロラムフエニコール耐性の表現型を示した。図5Cに
示したように、BD170〔pCGV28、pPGV10φ〕株のクロラ
ムフエニコール平板上での生育は、33℃で最低限である
が、45℃では正常である。33℃の残りの生育は、この温
度ででさえ部分的なリプレツサープラスミドが欠落する
ことにより説明される（セクシヨンｄ参照）。実際に、
pPGV9φ、pPGV10φあるいは、pPGV209φのいずれかによ
り支配されるcat遺伝子の発現に対するpCGV28の阻害効
果は、選択的圧力がリプレツサープラスミドを保持する
ために加えられると最も著しく見られる。それ故、BD17
0〔pCGV28、pPGV10φ〕株は、37℃でEm−Cm平板上で全
く生育しない（図５）。同様の結果がpPGV9φとpPGV209
φで得られた。他の全てのBD170〔pCGV28〕形質転換体
（表III参照）は、これらの条件下で正常に生育した。
さらに、37℃でCm平板から分離されたBD170〔pCGV28、p
PGV10φ〕の数個の別々のコロニーがエリスロマイシン
耐性に関して試験され、全てが感受性であることが発見
された。逆に言えば、全てのEmRコロニーCmSであつた
（データは示さない）。まとめれば、これらの結果は、
pPGV9φ、pPGV10φ及びpPGV209φにクローン化されたφ
105プロモーター配列のリプレツサー支配の性質につい
ての証拠を与えている。これら３種のプラスミドのだい
たいの挿入の大きさは、それぞれ800;650及び1150bpで
ある（表II参照）。
ｆ） EcoRI−Ｆ制限酵素地図上のφ105初期プロモータ
ー断片の位置 上記（図3A）のように、３個の調節された発現プラスミ
ドのそれぞれにクローン化されたφ105Sau3A断片は、Ec
oRI−Ｆとハイブリダイズする。図２（ｄ列）は、pPGV1
0φが1.2kbと0.3kbの断片を生じるベクターpPGV2に比較
して特別のHind III部を含んでいることを示している。
pPGV9φのHind III消化により同じ1.2kb断片と、加えて
0.45kb断片を生じる（データは示さない）。それ故、両
挿入は、cat−86に最も近い挿入端から約370bpの位置の
HindIII部位で共通の650bpのSau3A断片を分けあつてい
るらしい（図６）。プラスミドpPGV9φはほとんどおそ
らくリプレツサー支配のcat−86発現に明らかに含まれ
ない150bpのSau3A断片をさらに含んでいる。pPGV209φ
のHind IIIのパターン（図2g列）は解釈するのがより困
難である。挿入は、1.3kb、0.4kb及び0.3kbの断片を生
じさせる２ケ所のHind III部位を含んでいる。
φ105EcoRI−Ｆの制限酵素地図をつくるために、断片を
いくつかの酵素で消化される5.9kbのpUC4/Fハイブリツ
ドプラスミドを生じるようにpUC4に組み込んだ。その結
果得られた地図を図7bに示す。隣接したフアージの配列
（左側にEcoRI断片Ｈ及び右側に断片Ｃ）に関する断片
Ｆの方向性は完全なφ105DNAのBglI地図から導き出され
た。図7Aは、電気泳動的に分離された精製EcoRI−Ｆの
示された酵素による消化産物への32P標識のpPGV10φの
ハイブリダイゼーシヨンの結果を示している。相同性が
大きな1950bpのEcoRI−BglI断片及び大きなEcoRI−SmaI
断片で検出された。Hind III及びBglIによる消化は、11
00及び850bpの相同な断片を生じ、RsaIは2000及び800bp
のハイブリダイズする断片を生じた。これらの結果か
ら、初期プロモーター断片は、EcoRI−Ｆの左端から1.1
kbの左側のHind III部位と右側から150bp離れたところ
に位置するRsaI部位を重複することが明らかである。pP
GV10φの1.2kbのHind III断片のRsaIによる消化は、プ
ロモーター断片の方向性が左から右であること、つま
り、Hind III部位の左側約280bpに始まり、RsaI部位か
ら約230bpで終わることを示した（図7B）。32 P標識のpPGV209φを用いた同一フイルターの検索は、
ハイブリダイズする断片の同一のパターンを生じた（デ
ータは示さない）。このこと故に、（おそらくEcoRI−
Ｆから生じることはできない挿入中の第２のHind III部
位の存在により証明されたように）pPGV209φはφ105ゲ
ノムのどこにでも由来する付加的な配列を含んでいなけ
ればならないが、このプラスミド内のプロモーター領域
はおそらくpPGV10φのものと同一である。
これらの発見から、EcoRI−Ｆ内のより詳細なφ105リプ
レツサー遺伝子の地図をつくることができる。プラスミ
ドpUC4/FをHind IIIで消化し、得られた２個の断片を別
々に、Hind III消化のpPGV2の中に、小さな0.85kbのベ
クター断片の置換によりクローン化した。組換え体の１
つの型は、EcoRI−Ｆの内部1.9kbのHind III断片を含
み、他の型は、pUC4について中あるいは間に挿入される
EcoRI−Hind III両者の外部断片（1.1及び0.2kb）を含
んでいた。枯草菌BD170株の形質転換後、φ105感染試験
を形質転換体の両方の型についておこなつた（「材料及
び方法」参照）。この試験は、内部Hind III断片を含む
細胞はφ105に感受性のままであつたが、一方、クロー
ン化された外部断片の組合わせは宿主細胞に免疫を有し
ていたことを示している。0.2kbのEcoRI−Hind III断片
がおそらく非常に小さく、機能のあるリプレツサー蛋白
を暗号化できないので、φ105リプレツサー遺伝子は、
左側のEcoRI−Hind III断片内に残つていると結論した
（図7B）。
枯草菌の溶原性フアージφ105から分離された免疫リプ
レツサー遺伝子のヌクレオチド配列と突然変異分析を次
に示す。
ｇ） φ105リプレツサーを２つの重複遺伝子のプロモ
ーターに近接することによりコード φ105のEcoRI断片Ｆの左側の部分、さらに特定すれば、
1100bpのEcoRI−Hind III断片（図11）は、ほとんどお
そらく、枯草菌のクローニングベクターに挿入される
と、φ105感染に対する免疫を与える能力により、リプ
レツサー機能をコードする。フアージゲノムのこの領域
のヌクレオチド配列を決定するために、3.2kbのφ105Ec
oRI−Ｆ断片と隣接する0.9kbのEcoRI−Ｈ断片をそれぞ
れ大腸菌のレプリコンpUC4にクローン化し、それぞれプ
ラスミドpUC4/F及びpUC4/Hを得た。リプレツサー領域の
詳細な制限酵素地図を採用したマキサム−ギルバートの
シークエンシングの方法とともに図11に示した。EcoRI
−ＨのRsaI部位からHind III部位へひろがる1306bpの部
分の両方の鎖が完全に塩基配列を決定された。EcoRI−
Ｆの最も左のRsaIからEcoRI−ＨのPstI部位までをさら
にプラスミドpCGV14DNAを用いてシークエンシングをお
こないEcoRI断片両方の隣接部分を決定した。長さで300
ヌクレオチドを越えるオープン・リーデイング・フレー
ムについて配列が解析された。図11でORF1とORF2と命名
された２つの部分的に重複したオープンリーデイングフ
レームが発見された。両者とも従来からのφ105の地図
では右から左への方向性をもつている。ORF1−ORF2遺伝
子のヌクレオチド及びそこから考えられるアミノ酸の配
列を図12に示す。ORF2がEcoRI部位を含み、それ故、完
全には、EcoRI−Hind III断片内に含まれないので、こ
の段階でのORF1は、おそらくリプレツサー機能をコード
する候補であると思われる。しかし、ポリペプチドのＣ
末端部分がリプレツサー活性をもつ可能性が残されてい
るので、それ故、ORF2は明確には除外されない。
図11及び12は、両方の暗号配列の機能的な分離に便利な
RvuII部位の位置を示している：この部位は停止コドン
又はORF1から十分に下流であり、一方、ORF2のＮ−末端
から14番目のコドンの内側に存在する。それ故、740bp
のPvuII−Hind III断片についてリプレツサー活性を試
験することにした。唯１ケ所Hind IIIとPvu IIの部位を
含む枯草菌ベクターpPL703を両酵素で消化し、Hind III
とPvu IIで消化したpUC4/Fに連結した。続いて、非常に
多くのカナマイシン耐性の枯草菌形質転換体に対し、φ
105感受性の試験がおこなわれた。850bpのHind III−Pv
u IIのベクター断片にORF1を含むHind III−Pvu II断片
を置き換えた組換え体プラスミド（pCGV23と命名され
た；図13B参照）を含む細胞にのみφ105の超感染に対す
る免疫があることが発見された。この発見は、ORF1がリ
プレツサーをコードしていることを確実に示している。
ORF1のすぐ直前は５′−AAAGGAG−３′という配列で、
枯草菌の16S rRNAの３′末端と補足しあう7bpを示し、
故に強いリボソームの結合部位をあらわしている。枯草
菌におけるATG以外の開始コドンの頻繁な使用という観
点では、リプレツサーの翻訳を開始するのに役立つ２つ
の可能な候補がある：即ち、＋１の位置のGTGコドンと
＋10の位置の枠の中のATGコドンである。今のところこ
の２つの可能性を区別することはできない。これらのコ
ドンと上記の定められたシヤイン−ダルガノ配列の間の
それぞれの距離は、４塩基と13塩基である。一方、枯草
菌遺伝子では、平均して８から９ヌクレオチドの間隔が
発見されている。それ故、φ105のリプレツサーの単量
体は、計算された分子量16745ダルトンもしくは16387ダ
ルトンの146又は143アミノ酸から成る。これらの数値
は、φ105を感染後の枯草菌のミニセルでのポリペプチ
ドの合成パターンを試験することにより得られた結果と
もつともな範囲で一致している。その合成がクロラムフ
エニコール処理により阻害されなかつた初期ポリペプチ
ドの１つは、SDS−アクリルアミドゲル電気泳動で、外
見上分子量18000を示した。それ故これがこのリプレツ
サー遺伝子の産物をあらわすのかもしれない。
ORF2の翻訳はおそらくリプレツサーの142番目と143番目
の３つ組に重複しているATGコドンから開始する。ORF2
の遺伝子産物（157アミノ酸）の機能は知られていない
が、その発現は明らかに、リプレツサーのそれと強固に
結びついて調節されている。この種の翻訳の重複は全く
普通ではないが、決して独特なものではない。
ｈ） リプレツサー−ORF2遺伝子の５′上流支配領域の
欠損分析 φ105のリプレツサー遺伝子の構造部分を決めるため
に、５′隣接DNA中のリプレツサー−ORF2転写単位に対
する支配信号を同定することは興味深いことである。プ
ラスミドpCGV14（図13A）は、pE194cop−６にクローン
化された2.3kbのφ105PstI断片から成る。これは1kb以
上の上流配列をもつ完全なORF1を含み、期待されるよう
にφ105感染に対して免疫を有している。
pC6V14では、ORF1の272bp上流のHind III部位が唯一で
ある。この部位から始まり、ORF1の最初の方へ進んでい
く一連の欠損をつくるために、Hind IIIで直線化したpC
GV14DNAを次のようにBa131ヌクレアーゼで処理した：緩
衝液0.1ml中の約８μｇのDNAを１単位のBa131で30℃で
消化した。2.5、５、7.5、12.5及び15分後に画分を取り
出し、消化の程度をアガロースゲル電気泳動でモニター
した。続いて、適当な画分を集め、フエノール抽出及び
エタノール沈澱をおこない、DNAポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片で処理した。得られた平滑末端をもつ断片を、
枯草菌BR151株の形質転換前に、0.5mMスペルミジン存在
下、T4DNAリガーゼを用いて自己連結した。エリスロマ
イシン耐性の形質転換体個々についてフアージφ105の
感染性を試験し、そのプラスミドの内容が、BclIとPstI
による消化を用いて、欠損の程度をだいたい決めるため
に解析された。続いて、いくつかのpCGV14△プラスミド
の欠失の終点がヌクレオチドレベルで決定された。
結果として、Hind III部位から両方向に広がり、100bp
以下から2000bp以上の大きさの範囲をもつ欠失を有した
pCGV14の変異体（pCGV14△…）の収集が得られた。この
収集の中で、２種類の表現型があらわれた：いくつかの
pCGV14△プラスミドは、親のpCGV14の重感染免疫という
表現型をもつたままであつたが、一方、大多数では失わ
れていた。ORF1のＮ末端でBclIのうしろにひろがる欠失
をもつた全てのプラスミドは、後者の範疇に分類され、
これは完全なORF1が重感染免疫にとつて十分なだけでな
く必要であることを示している。さらに、pCGV14△15及
びpCGV14△82のようないくつかの欠失プラスミドは、こ
のBclI部位を含んだままで、φ105感受性細胞を生じ
た。配列分析は（図12）、pCGV14△15がGTGの上流36ヌ
クレオチドを保持していること及びpCGV14△82が−26で
終わることを示した。２種の免疫を与えられたプラスミ
ド、pCGV14△１とpCGV14△８の欠失の終点は、それぞれ
−109と−182に位置している。これらの結果は明らか
に、GTGの上流−109と−36の間の領域が多数コピープラ
スミドからでさえ、重感染免疫の発現に必要であること
を示している。リプレツサーORF2転写単位のプロモータ
ーがこの領域に含まれているらしい。図12は、ちようど
17bpで分けられている２つの６ヌクレオチド、５′−TT
GTAT−３′及び５′−TATAAT−３′の存在を示してい
る。これらの配列とδ55依存性プロモーターのコンセン
サス配列との間の相同性という点で、これらは、枯草菌
RNAポリメラーゼの主たる機能型の「−35」及び「−1
0」の認識部位として作用するらしい。これは、リプレ
ツサーがおそらく感染後発現される最初のフアージの遺
伝子の１つで、それ故、その転写が完全に宿主の機構に
依存するという考えと一致する。
これらのプロモーター因子は、他のいくつかの枯草菌遺
伝子に共通の性質である、非常にATが豊富な領域（−15
0と−90の間で76％）で生じていることはさらに注目さ
れる。
ｉ） φ105リプレツサーのポリペプチド：性質と既知
のリプレツサーとの比較 ヌクレオチド配列から予想されるφ105リプレツサーとO
RF2のコドン使用頻度とアミノ酸組成を表Ｖに示した。
次に、GTGコドンを仮に翻訳の開始とすると、完全なリ
プレツサーのポリペプチドの末端はイソロイシンという
ことになる（図12）。リプレツサーは、システインある
いはトリプトフアンを含まないが、グルタミン酸を多く
含む（20残基）。そのpHは酸性残基（アスパラギン酸＋
グルタミン酸＝27）と塩基性残基（アルギニン＋ヒスチ
ジン＋リジン＝26）の合計から中性付近のようである。
ポリペプチドの最も著しい総括的な性質は、水療法のプ
ロフイールに示したように（図14）、明確な親水性であ
る。非常に親水性な領域は、10から19、36から41、71か
ら100及び130から146の残基にひろがつている。一方、
疎水性領域は残基１から５及び51から64に見られるだけ
である。明らかに、この性質はリプレツサー蛋白が細胞
質に存在していることを反映している。
ポリペプチドのどの領域がDNA結合に関連するのかを明
らかにするために、大腸菌やネズミチフス菌（サルモネ
ラチフイムリウム）のようなグラム陰性菌で機能する他
のいくつかのリプレツサーのアミノ酸配列との比較を広
い範囲でおこなつた。これらには、λcIリプレツサー、
λcro蛋白、フアージP22c2リプレツサー、lacリプレツ
サー、galリプレツサー、及びlexＡ遺伝子産物が含まれ
ていた。それぞれの組の配列の最も有望な配列が、カネ
ヒサにより修正されたニードルマン−ブンシユのアルゴ
リズムを用いて得られた。
表VIは、それぞれの組の比較の結果を要約している、φ
105と他のどのリプレツサーとの間において、１次構造
レベルでの全体的な相同性は、lexA蛋白で得られた同一
残基の最も高い割合で18％以下という低いものである。
しかしながら、図５は、φ105リプレツサーとフアージP
22c2リプレツサーのＮ末端領域にある意味をもつ局所的
な相同性が存在していることを示している。全部で57の
比較した位置で、17の相同性が切れ目を導入する必要な
しに発見されている。これは、フアージφ105が２つの
免疫領域を含んでいるという新事実に関連している。お
そらくこの配列の遺伝子は、フアージP22のimmC領域に
相当し、もう一方のφ105の領域（EcoRI−Ｂ断片に所在
する）は、P22のmnt/ant（又はimmＩ）領域に類似して
いる。
次の比較段階は全ての既知のリプレツサーが、結合する
特異的なオペレーター配列に関係なく、α−ヘリツクス
−折り返し−α−ヘリツクスの配置を示す隣接する20残
基のストレツチを含んでいるという十分に記録された観
察に基づいている。この３次元構造要素は、DNAラセン
の主溝と相互作用するのに必須である。このDNA結合領
域の配列をもつた他の多くのリプレツサーの中での非常
に重要な位置において、配列が両立できる領域につい
て、φ105の配列が試験された。結果として、20（グル
タミン酸）から39（アルギニン）の位置の領域が最もそ
れらしい候補である。図16に、この領域が他の７つのリ
プレツサーのものと並べられている。最も重量な位置
は、それぞれアラミン、グリシン及び２つの疎水性アミ
ノ酸をもつ５番、９番、15番及び18番である。φ105の
配列はこれらの位置のうち３ケ所で十分適合する、一
方、位置９では、しかしながら、γδ−リゾルベースの
その位置にも見られるアスパラギンをもつている。さら
に、疎水性残基が４番、８番及び19番の位置に存在して
いる。試験したφ105配列は又、これらの位置のうち２
ケ所で一致する（４番目のロイシンと８番目のアラニ
ン）、そして19番のグルタミン酸は又、P22c2リプレツ
サーに存在する。最後に親水性残基は、位置１から３、
６から７、11から14及び16から17に存在している。ま
た、φ105配列は、これらの11の位置のうち９ケ所で親
水性の側鎖を示す。
しかし、リプレツサーに支配されるφ105のプロモータ
ー−オプレーター部位が、リプレツサーの暗号配列のす
ぐ上流の662bpのBclI断片（図11）の中に存在している
ことは注意すべきである（７）。このプロモーターは左
から右の転写方向を示し、それ故、φ105リプレツサー
についてλRRと等価であると位相的に考えられている。
さらに、このプロモーターは、プラスミドpPGV10φのca
t−86遺伝子の前に挿入されている。そのような雑種形
成を用いると、pCGV14やその欠失誘電体のようなこの研
究中に構築された異なるリプレツサープラスミドをもつ
た形質転換された枯草菌（pPGV10φ）の菌株のクロラム
フエニコール耐性を試験することにより、もつと直接的
にリプレツサー機能を評価することができる。完全な相
互関係が、重感染免疫表現型と、２重形質転換体のクロ
ラムフエニコール感受性をもたらすcat−86遺伝子の発
現の阻害との間に発現された。一方、φ105感受性の表
現型は、通常、EmRCmRh細胞を生じるcat−86の発現の保
持に付随する。
しかし、λの免疫領域又はフアージP22のimmＣ領域比較
してφ105免疫領域の組織には明らかに違いがある。第
１に、グラム陰性菌のものとは異なりφ105リプレツサ
ーは、翻訳のときに重複するシストロンの対の部分を形
成する。ORF2の発現がリプレツサーの発現と非常に強く
調和されている理由と同様にその機能は、今までのとこ
ろ答のない興味をそそる問題である。
第２に、上記の目標プロモーター−オペレーター部位の
初期のマツピングデータは、それがHind III部位の右側
に存在していることを示している（図11）。そしてそれ
故、少なくとも272bpリプレツサーの開始コドンから離
れていることを示している。λ及びP22において、PR−O
R信号はリプレツサーの暗号配列にすぐ隣接している。
これらの結果は、さらに、図12の「TATAAT」の６ヌクレ
オチドのおそらく数10bp下流に始まるφ105リプレツサ
ーの転写は強力なリボソーム結合部位を含む少なくとも
50塩基の未翻訳部分を含むことを提示している。さら
に、これは、PRMプロモーターの転写がATGコドンで開始
されるλcI及びたつた４個の５′−未翻訳ヌクレオチド
を含むP22c2メインテナンスRNAとは異なる。
比較研究により、20から39番の位置に広がるφ105リプ
レツサーポリペプチド内のDNA結合領域が同定された。
現在は、相当するDNA配列の標的突然変異誘発によるこ
の役割を試験することも可能である。
ｊ） φ105リプレツサーは自分自身の転写を促進する λPL/PRリプレツサー因子に基づく発現系の１つの重要
な解釈は、λリプレツサーが自身のプロモーター（PRM
又は「保守」プロモーター）に結合し、その結果このプ
ロモーターからの転写を促進するという事実である。そ
れ故、φ105リプレツサーが同様の方法でそのプロモー
ターと相互作用するかどうか試験することはおもしろ
い。図11及び12は、中央のBcII断片が実際に２つのプロ
モーター：（ｉ）リプレツサーにより負の支配を受け、
φ105地図で左から右へ方向性をもつ初期プロモーター
と（ii）もう一方の端で、右から左への方向性をもつリ
プレツサーそれ自身の（「保守」）プロモーターを含む
ことを示している。これら２つのプロモーターの空間的
分離という点で、同じ機構が適用されるかは明らかでは
ない。
プラスミドpPGV10φ（上を見よ）では、このBclＩ（又
はSau3A）断片は、cat−86の発現が初期プロモーターに
より支配されるように、左から右の方向性でcat−86遺
伝子の上流に挿入されている。
「保守」プロモーターが転写的にcat−86遺伝子を活性
化できるかを試験するために、「保守」プロモーターが
cat−86遺伝子のすぐ上流にくるように逆向きにBclＩ断
片を挿入した。
得られたプラスミド、pPGV17φはクロラムフエニルコー
ル耐性（15μg/ml）ではなく、これは、φ105「保守」
プロモーターはその暗号配列が裂かれると、活性がなく
なることを示している。しかしながら、活性リプレツサ
ーが同一細胞に、プラスミドpCGV14を用いた形質転換に
より導入されると、得られる２重形質転換体BR151（pPG
V17φ、pCGV14）は、EmRCmR表現型を示した。明らかに
これはリプレツサー蛋白が自身の遺伝子のプロモーター
を活性化するのに必要であることを示している。
ｋ） 枯草菌における高レベルに調節された遺伝子発現
のためのハイブリツドプロモーター・オペレーターの構
築 １） pPGV301の構築 熱誘導性の遺伝子発現系の２つの必須の組成物、即ちφ
105のリプレツサー及びオペレーターの断片を明らかに
するために、系の効率を改良するように努めねばならな
い。実際、pPGV10φの650bpのSau3A断片に伴う弱いプロ
モーター活性のために、誘導状態における（即ち、リプ
レツサーのない状態で）どの外来遺伝子の発現レベルも
低く、従つて、実際上はこの系の利用は限られる。この
系は、pPGV10φの650bpのSau3A断片に存在するオペレー
ター部位の調節機能をもつ他の、非常に強いプロモータ
ー活性を組合わせることにより改良されるべきである。
事実、プロモータープラスミドの収集にはすでにそのよ
うな強力なプロモーターが含まれている：これは、プラ
スミドpPGV138φ（第 頁参照）に存在し、pOGV10φ
（表II）よりも少なくとも100倍高いCAT活性をもつてい
る。従つて、プラスミドpPGV138φは、ハイブリツドプ
ロモーター・オペレーターの構築のための開始物質とし
て使用した。この終りまでに、pPGV10φのオペレーター
部位が分離され、pPGV138φの強力プロモーターとcat−
86の試験遺伝子の間に挿入した。どの平滑末端断片の挿
入もできるSmaＩ部位が１ケ所得られた。
650bpのSau3A断片内のオペレーター領域の位置をより詳
細に決めるための第１段階として、pPGV10φから300bp
のHindIII断片（図６）を削除したときの効果を試験し
た。得られた欠失変異体、pPGV10φΔ８は親のプラスミ
ドの全ての性質を残しており、これは、必須の調節因子
が右側の370bpのHindIII−Sau3A部分の中に所在してい
ることを示している。この領域の配列が決められ（図
８）そして、231bpのRsaＩ−HaeIII断片が可能な方向両
方でpPGV138φのSmaＩ部位に挿入するために選択した。
ここから２個の新しい誘導体プラスミドpPGV301（正方
向にオペレーターをもつている；図９参照）とpPGV326
（逆方向をもつている）を得た。これらのプラスミド
は、pPGV138φと共に、機能するリプレツサーの有無で
枯草菌細胞に導入した。
２） cat−86発現試験 ハイブリツド・プロモーター・オペレーター因子が、試
験遺伝子cat−86の高レベルのリプレツサーにより調節
される発現を できるかどうかを見極めるために、リプ
レツサーが存在するときとしないときのpPGV301をもつ
た枯草菌の株の（ペトリ皿上での）クロラムフエニコー
ル耐性レベルを試験した。コントロールとして、（オペ
レーターなしの）pPGV138φと（異なる方向でオペレー
ターをもつ）pPGV326を用いた。
機能するリプレツサー源として、EmRプラスミドpCGV14
が用いられた。リプレツサーはエリスロマイシン耐性を
選択することで保持する。
それ故、次のプラスミドをもつ枯草菌BR151株が抗生物
質平板に画線された（図10）： １）pPGV138φ、２）pPGV301、３）pPGV326、４）pPGV1
38φ及びpCGV14、５）pPGV301及びpCGV14、６）pPGV326
及びpCGV14。
これらの生育試験から、次の重要な結論が引き出され
る： −pPGV301はリプレツサーなしでpPGV138φと同程度のca
t−86の発現レベルを支配する；それ故、正方向のオペ
レーターの挿入はプロモーター活性に影響を及ぼさな
い。
−リプレツサーが（EmRプラスミドpCGV14に）導入され
ると、pPGV301のクロラムフエニルコール耐性は著しく
減少する（50μg/ml以上から15μg/ml以下へ）、一方pP
GV138φの場合は影響されない。
−オペレーター断片は異なる方向性では機能しない；こ
の場合、リプレツサーの有無にかかわらず、cat−86の
わずかな発現がみられる：これは、２つのプロモーター
（即ち、pPGV138φの強力プロモーターと弱いオペレー
ターに伴うプロモーター）の反対の性質によるものらし
い。
抗生物質生育試験は、具体化され、酵素的なCAT活性測
定により定量した。表IVは、少なくとも25倍の誘導がpP
GV301を用いて得られることを示している。この数字
は、cat−86の遺伝子発現への重なる翻訳の制約のため
にほとんど確実に実際より低く見積られている。実際
に、これらの試験は、mRNA翻訳の誘導に関して、５μg/
mlクロラムフエニコールを用いておこなわれた、そし
て、これは、リプレツサーなしの状態でつくられる大量
のmRNAを十分に誘導するには不充分であろう。さらにCA
T試験は、（pCGV14をもつ場合ともたない場合のpPGV326
を比較して）逆方向性のとき、オペレーターをもつてい
るときでさえある程度の抑制があることを示した。
上記の結果より、pPGV301が枯草菌の効率的な発現ベク
ターであると結論した。さらに図９は、ハイブリツドプ
ロモーター・オペレーター因子が（例えば、PstI又はSa
lIとEcoRI消化を用いると）容易にpPGV301から切り出さ
れ、別の遺伝的背景に挿入されることを示している。言
い換えれば、「簡便」である。
討論及び他の遺伝子発現系との比較 グラム陽性菌に対する、一般的に応用できる、誘電性の
遺伝子発現系について述べた。この系における非常に重
要な要素、リプレツサーとそれと同起源のオペレーター
は、枯草菌個有の溶原性バクテリオフアージに由来す
る。それらの相互作用は、オペレーターの下流に置かれ
た遺伝子の発現の転写の阻害をおこす。そのような転写
（又は抑制）の負のコントロールは今までのところグラ
ム陰性菌でのみ発現されており、枯草菌のようなグラム
陽性菌ではまだである。後者の生物においては、新しい
δ因子（ロジツクとペロー、1981年）をもつたコアRNA
ポリメラーゼの協同作用による正の転写コントロールが
調節では唯一知られた型である。
この遺伝子発現系がいくつかの珍しい性質を示し、類似
の遺伝子発現系に、例えば、グラム陰性菌（参照25）及
びグラム陽性菌（参照26）に有利な因子を与えることが
信じられている。まず第１に、オペレーターが分離され
て、その機能性を残したまま別の関係のないプロモータ
ーに融合される、即ちハイブリツドプロモーター・オペ
レーターの構築は、リプレツサーにより効率的に支配さ
れたままである（例:pPGV138φ）。この系はそれ故、プ
ロモーターの選択に関して大きな柔軟性がある。プロモ
ーターとして、枯草菌で機能するどのDNA配列でも、そ
の天然の起源に関係なしに用いることができる。プロモ
ーターは、どんな種類の転写効率をも示すことができ
る。実際に、（Vegプロモーター；参照15あるいは、大
腸菌フアージT5の初期プロモーターのような）非常に強
いプロモーターが使用でき、極めて高レベルの遺伝子発
現が得られた。同一DNAあるいは他の起源のDNAのプロモ
ーターが使用できるというような柔軟性は、λPL及びPR
プロモーターに基づく大腸菌ベクターでは、この場合に
はオペレーターが通常自分自身のプロモーターと共に用
いられているために、示されていなかつた。ヤニスラと
ヘンナー（1984年）は最近、大腸菌のlacオペレーター
・リプレツサーの組合せを用いた、枯草菌の調節可能な
発現系について述べている。これらの研究者は、又、転
写のコントロール要素としてハイブリツドプロモーター
オペレーターを使用している。しかしながら、彼らの系
とここに述べられている系との重要な差違は、リプレツ
サーの合成が支配される様式に関連する。彼らは、lac
リプレツサーを発現するのに枯草菌プロモーター（pen
Ｐ）を用いている。一方、本系では、φ105リプレツサ
ーが自身のプロモーターを使つて発現されている。これ
は非常に強いプロモーターがオペレーターに融合される
ときに、十分な抑制が得られるという問題に関して重要
である。
実際に、φ105リプレツサーは、λリプレツサーで同様
にした場合よりもそれ自身の転写を促進する（自己によ
る正の調節）ことが示された。これは、（例えば、直列
に並んだ多くのオペレーターに結合することにより）非
常に強いプロモーターを抑制するのに必要な細胞内で高
レベルのリプレツサーの合成を確かなものとする。
それ故、非常に効率の良い、十分に支配できるグラム陽
性宿主の発現系を得るためには、グラム陽性起源の調節
因子（オペレーター−リプレツサー）を用いることの方
が有利である。
第１のプラスミドpPGV10φ及び第２のプラスミドpCGV28
から成る枯草菌の菌株は名称BD170〔pPGV10φ、pCGV2
8〕としてN.C.I.B.に寄託された（1984年９月７日N.C.
I.B.番号第12014号受領）。この寄託は、ブタペスト条
約の資格のもとでなされた。第１プラスミドがpPGV301
で、第２プラスミドがpCGV14の第２の枯草菌の菌株も
又、本発明の目的全てを示すために、BR151〔pPGV301、
pCGV14〕という名称でN.C.I.B.に寄託された（N.C.I.B.
番号第121170号）。
図の説明 図１ プロモーター検索プラスミドpPGV2の構造 Ａ制限酵素地図。バチルス・プミルス由来の配列が、ca
t−86暗号領域（参照11）の位置を示す矢印と共に、中
抜CAT比活性は、５μg/mlクロラムフエニコール存在下
で生育した対数増殖期後期の枯草菌（pUB110及びpPL603
を含む株は除く）について測定算出した。1ml培養ペレ
ツトを0.25M Tris HCl pH7.8、0.05M EDTA0.15mlに再懸
濁し、100μｇの卵白リゾチームを添加した。懸濁液を3
7℃で15分間保温し、エタノール／ドライアイスに浸し
て凍結した。室温で融解後、溶菌細胞を遠心し、上清を
0.25M TrisHCl、pH7.8で適当に希釈した。フエニルメチ
ルスルフオニル・フルオリドを終濃度0.5mMまで加え、
抽出液５μを0.25M Tris HCl、pH7.8中（総量30μ
）、16nmoleのアセチル補酵素Ａと4nmoleの14C標識の
クロラムフエニコールと共に37℃で30分間保温した。ク
ロラムフエニコールとそのアセチル化誘導体を反応系か
ら0.2mlのエチルアセテートで抽出し、クロロホルム：
メタノール（95:5）の中、シリカゲルシートのクロマト
グラフイーで分離した。基質のアセチル化のパーセンテ
ージは、クロマトグラムの放射線活性のあるスポツトを
切り出し、液体シニチレーシヨン計数管によるカウント
により測定した。測定中に基質の30％以上がアセチル化
しないように適当な抽出液の希釈が用いられた。抽出液
の蛋白濃度はローリーらの方法（1951年）により測定し
た。
b:参照14 c:インサートは少なくとも１つのHind III部位を含む。
N.D.測定せず。
きの箱で示されている。拡大は、pUC8由来の多重クロー
ニング部位（MCS8）因子（参照２）に存在する制限酵素
部位を示す。
B.表示酵素によるpPGV2の消化後の断片のアガロースゲ
ルの解析。ｍ列はサイズマーカーとして用いたλDNAのP
stI消化。Hind III断片の大きさが示されている。
図２、組換えプロモータープラスミド中の挿入断片の大
きさの決定。
いくつかの適切な例のみが示されている。完全な結果は
表IIに要約されている。大腸菌C600細胞が個々のCmR枯
草菌形質転換体のプラスミドDNAを用いて形質転換され
た。大腸菌から精製されたプラスミドDNAはHind IIIで
消化された。
Laue C、ベクターpPGV2（図1Bのlaue Cを見よ）;laue b
からｃ、pPGV11c及びpPGV33cに挿入された染色体のSau3
A断片;laue dからｇ、pPGV10φ、pPGV138φ、pPGV205φ
及びpPGV209φそれぞれに挿入されたフアージφ105のSa
u3A断片。laue mについては図1Bを見よ。
図３、φ105のEcoRI−Ｆ断片（Ａ）及びEcoRI−Ｅ断片
（Ｂ）とのφ105プロモータープラスミドのハイブリダ
イゼーシヨン。
表示プラスミドのDNA（５ないし10μｇ）を変性し、ニ
トロセルロースに結合させて、ニツクトランスレーシヨ
ンをした32P標識のφ105のEcoRI断片にハイブリダイゼ
ーシヨンをおこなつた。正の対照としてフアージφ105D
NAが用いられ、一方、ベクタープラスミドpPGV2及び２
個の染色体プロモータープラスミド（pPGV9c及びpPGV11
cが負の対照として含まれた。前についているpPGV（表I
I及びIIIを見よ）は使われなかつた（２φ＝pPGV2φ
等）。
ハイブリダイゼーシヨンのプローブとして使われた個々
のφ105−EcoRI断片は、アガロースゲル電気泳動及び引
き続いた電気的溶出により精製された。標準条件がニト
ロセルロースへのDNAの移行、32P標識DNAの調製及びハ
イブリダイゼーシヨンに対して用いられた。
図４、リプレツサープラスミドpCGV28の構築の概要。
pE194の地図は（参照20）から。pHV14/Fは（参照19）に
述べられている。pCGV4及びpCGV28で、太線はpE194配列
をあらわしている。pCGV28のEvoRI−Ｆ断片（２重線）
の方向性は、XbaI−Hind III消化により決定された。
図５、（Ａ）ベクターpPGV2、（Ｂ）プロモータープラ
スミドpPGV129φ及び（ｃ）プロモータープラスミドpPG
V10φで形質転換された菌株BD170〔pCGV28〕のCm平板
（15μg/ml）上33℃と45℃及びEm＋Cm平板上37℃での生
育。
それぞれのプロモータープラスミドの形質転換に対し
て、37℃でエリスロマイシンとカナマイシンの平板上で
選択された４個の非依存性のコロニーが試験された。
図６、pPGV10φのプロモーター−cat−86領域の構造。
pPGV2のBamHI部位に挿入されたプロモーターのSau3A断
片が示されている。距離はbp（塩基対）である。
図７、φ105リプレツサー遺伝子と初期プロモーターのS
au3A断片の地図上の位置。
A.左側：表示酵素によるφ105断片EcoRI−Ｆの消化後の
断片のゲル電気泳動パターン。
右側:32P標識したpPGV10φを用いたハイブリダイゼーシ
ヨン後のオートラジオグラム。
B.リプレツサー遺伝子（c105）とpPGV10φプロモーター
PE断片の位置を示す断片EcoRI−Ｆの地図。矢印は、プ
ロモーターからの転写の方向を示す。書かれている制限
酵素部位以外に、断片Ｆは又、BstEII、HpaI及びPstI部
位を１ケ所ずつ含む。
C.φ105のEcoRI制限酵素地図（参照21）。
断片の長さはkb（キロベース）である。
図８、オペレーターを含むHindIII−Sau3A（BclI）断片
のヌクレオチド配列。
pPGV138φのsmaI部位にクローニングされたオペレータ
ー断片を明確にあらわしているRsaI及びHaeIII部位が示
されている。推定上の「−35」及び「−10」の６ヌクレ
オチドは箱で囲まれている。シヤイン−ダルガノ配列
（S.D.）は下線で示され、そして推定される暗号領域の
開始及びＮ末端のアミノ酸が示されている。
図９、pPGV301のハイブリツドプロモーターオペレータ
ーcat−86領域の構造。
図10、抗生物質耐性平板試験。
機能リプレツサーを含むプラスミドpCGV14は、pE194cop
−６に挿入されたφ105の2.3kbのPstI断片Ｉから成る
（ダーゼら。（1985年）、Mol.Gen.Genet.第200巻、490
から492ページ）。それぞれの表示菌株の形質転換体の
単一コロニーが画線された。
左側、リプレツサーなし；右側、リプレツサーあり。
ｃ、 Ｄ、pPGV301;Cm、クロラムフエニコール;E、エリスロマ
イシンをそれぞれ示す。濃度はμg/mlで示されている。
（≡pTGV138φ::o）。
図11、φ105リプレツサー領域の地図上の位置と配列決
定の手順。
上は、EcoRI断片Ｈ及びＦを含むゲノムの約70から75％
の長さのφ105DNAの部分の制限酵素地図を示す。PstI断
片Ｉの位置も又示されている。白抜き棒はリプレツサー
（ｃφ105）の地図上の位置を示す。黒棒は、初期プロ
モーターのBclI断片（Ｐ）の位置を示す。下は、リプレ
ツサー領域の詳細な制限酵素地図を示す。２個のORFの
位置と方向が制限酵素地図の下に示されている。矢印は
５′末端ラベルによる配列を示す。破線は３′末端ラベ
ルにより生じた配列を示す。距離はbpで示されてい。E
1、EcoRI;E2、EcoRII（BstNI）;E5、EcoRV;F、HinfI;
H、HindIII;P、PvuII;R、RsaI;S、Sau3Aをそれぞれ示
す。
図12、φ105リプレツサー（ORF1）−ORF2遺伝子及びそ
の隣接領域のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配
列。
有意なDNA鎖を示すために、図12は逆方向で配列が示さ
れている。リプレツサーの暗号配列の272bp上流のHindI
II部位からφ105EcoRI−Ｈ断片の中のRsaI部位まで広が
つている。ヌクレオチドの番号は、GTGコドン（＋１）
から始まる。アミノ酸は右側に番号がつけられている。
４個のpCGV14Δ…変異体の欠失の終点が示されている。
プロモーター「−35」及び「−10」領域は箱で囲まれ、
シヤイン−ダルガノ配列は下線で示されている。ORF1中
のダツシユは推定されるDNA結合領域を示す。
図13、A.プラスミドpCGV14の環状地図。
pE194cop−６（太線）に関してφ105のPstI断片Ｉの方
向性（細線）は、XbaIとPruIIによる消化で決定され
た。斜線矢印で示された位置がORF1である。EmRはエリ
スロマイシン耐性を示す。
B.pCGV23の環状地図。
このプラスミドは850bpのベクターのHindIII−PruII断
片の740bpのORF1に含まれるφ105のHindIII−PruII断片
との置換によるpPL703由来のものである。KmR、カナマ
イシン耐性；cat−86、バチルス・プミルス由来のクロ
ラムフエニコール耐性遺伝子。
図14、ホツプとウツド（31）の方法（実線）及びケイト
とドウリトル（32）の方法（破線）によるφ105リプレ
ツサーの水和性のプロフイール。
数値は７残基の可動部分の平均を用いて得られた。親水
性領域は中央線の上に見られ、疎水性領域は下に見られ
る。
図15、φ105リプレツサー（上）とサルモネラチフイム
リウムのフアージP22のc2リプレツサー（下）のＮ末端
アミノ酸配列の整合。
アミノ酸について１文字の表記法が使用されている。φ
105リプレツサーの残基番号は図２と同一である。P22c2
リプレツサーでＮ末端のメチオニンが脱フオルミル化し
ているが、翻訳後に除去されない（23）。故に、番号は
この残基から始まる。同一残基を示す位置は箱で囲まれ
ている。
機能的に保存されている置換をもつた位置は垂直に結ば
れた線で示されている。
図16、λｃＩ及びλcroのα２−回転−α３配置に相当
する領域でのいくつかのリプレツサー間のアミノ酸配列
の相同性（１文字表示）。
φ105リプレツサーを除いて、データは（30）からうつ
した。それぞれのポリペプチドの中のアミノ酸の位置は
その配列の下に示されている。重要な位置（５、９、15
及び18番目の残基）が箱で囲まれている。
参照 （１）D.M.ウイリアムス、E.J.デユバルとP.S.ロベツ
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クロラムフエニコール誘導性の遺伝子発現。ジーン、第
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ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、第152巻（1982
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ンとD.サヴア：枯草菌バクテリオフアージφ105DNAの制
限酵素解析。ジヤーナル・オブ・ジエネテイカル・マイ
クロバイオロジー、第130巻（1984年）2165から2167ペ
ージ。
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よる大腸菌の形質転換における非染色体性の抗生物質耐
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ー・オブ・サイエンスオブ・USA、第69巻（1972年）211
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（23）J.−I.フロツク：枯草菌の溶原性バクテリオフア
ージφ105の欠失変異体。Mol.Gen.Genet.第155巻（1977
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草菌への枯草菌DNAの遺伝的に活性のある断片の分子ク
ローニングとベクタープラスミドpUB110の性質。プロシ
ーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・USA、第75巻（1978年）、1423から1
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（25）E.レマウト、P.スタンセンとW.フイールス：大腸
菌フアージラムダのPLプロモーターに支配される高効率
発現のプラスミドベクター。ジーン、第15巻（1981年）
38から44ページ。
（26）D.G.ヤンスラとD.J.ハンナー：枯草菌における遺
伝子発現をコントロールするための大腸菌lacリプレツ
サーとオペレーターの利用。プロミーデイングス・オブ
・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
USA、第81巻（1984年）439から443ページ。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドpPGV2の構造を示す。 図２は、組換えプラスミド中の挿入断片の大きさを示
す。 図３は、φ105プロモータープラスミドのハイブリダイ
ゼーシヨンを示す。 図４は、プラスミドpCGV28の構築の手順を示す。 図５はBD170〔pCGV28〕株の生育を示す。 図６は、pPGV10φのプロモーター及びcat−86領域の構
造を示す。 図７は、φ105リプレツサー遺伝子と初期プロモーター
断片の地図上の位置を示す。 図８は、オペレーターを含む断片のヌクレオチド配列を
示す。 図９は、pPGV301のプロモーター・オペレーターとcat−
86の構造を示す。 図10は、抗生物質耐性試験を示す。 図11は、φ105リプレツサーの地図上の位置とシークエ
ンシング法を示す。 図12は、φ105ORF1−ORF2のヌクレオチド及びアミノ酸
配列を示す。 図13AはプラスミドpCGV14の環状地図を示す。 図13BはプラスミドpCGV23の環状地図を示す。 図14は、φ105リプレツサーの水和性を示す。 図15は、φ105リプレツサーとP22c2リプレツサーのＮ末
端アミノ酸の整合性を示す。 図16は、各種リプレツサー間のアミノ酸配列の相同性を
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125）

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グラム陽性菌の熱誘導性遺伝子発現方法に
    おいて、この熱誘導性遺伝子発現は、少なくとも２種類
    の異なるプラスミド（ただしこれらのプラスミドは遺伝
    子工学で作られたものである。）をグラム陽性菌に挿入
    することにより行われ、ここで上記プラスミドの少なく
    とも一つ（第１のプラスミド）は、グラム陽性菌で複製
    できる溶原性バクテリオファージ由来のプロモーターの
    DNAにより発現される異種構造遺伝子DNAを含み、上記プ
    ラスミドの他の少なくとも一つは、その蛋白生成物が上
    記第１のプラスミドに存するプロモーターDNAと相互作
    用できるところのリプレッサー遺伝子のDNA（ただし該
    リプレッサー遺伝子のDNAは、グラム陽性菌で複製でき
    る溶原性バクテリオファージ由来である。）及び温度感
    受性DNA材料を含む、上記方法。
  2. 【請求項２】グラム陽性菌は枯草菌の菌株である、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】プロモーターDNA及びリプレッサー遺伝子D
    NAが同一DNAに由来する、特許請求の範囲第１項又は第
    ２項記載の方法。
  4. 【請求項４】プロモーター及びリプレッサー遺伝子の由
    来するDNAが溶原性バクテリオファージのゲノムDNAであ
    る、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】温度感受性DNA材料は合成又は天然に存在
    するDNAである、特許請求の範囲第１項から第４項のい
    ずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】グラム陽性菌で複製できる溶原性バクテリ
    オファージ由来の初期プロモーターのDNAであって、こ
    のプロモーターは同一の溶原性バクテリオファージ由来
    のリプレッサー遺伝子DNAにより負のコントロールを受
    けることを特徴とする、上記DNA。
  7. 【請求項７】バクテリオファージφ105に由来する、特
    許請求の範囲第６項に記載の初期プロモーター及びリプ
    レッサー遺伝子のDNA。
  8. 【請求項８】少なくとも２個のプラスミドから成る、グ
    ラム陽性菌に包含させるためのプラスミド又はベクター
    組成物であって、 上記プラスミドの少なくとも一つ（第１のプラスミド）
    は、枯草菌の溶原性ファージ由来の初期プロモーターDN
    Aにより発現される原核細胞又は真核細胞の異種構造遺
    伝子のDNAを含み、また、 上記プラスミドの他の少なくとも一つは、その蛋白生成
    物が第１のプラスミドに存する初期プロモーターのDNA
    と相互作用できるところのリプレッサー遺伝子のDNA
    （ただし該リプレッサー遺伝子のDNAは、グラム陽性菌
    で複製できる溶原性バクテリオファージ由来である。）
    及び温度感受性DNAを含む、上記プラスミド又はベクタ
    ー組成物。
  9. 【請求項９】温度感受性DNAは温度感受性プラスミドで
    ある、特許請求の範囲第８項記載のプラスミド又はベク
    ター組成物。
  10. 【請求項１０】２個のプラスミドから成るプラスミド組
    成物を含む枯草菌（Bacillus subtilis）であって、 一方のプラスミド（第１のプラスミド）は、該枯草菌の
    溶原性ファージ由来の初期プロモーターのDNAにより発
    現される原核細胞又は真核細胞の異種構造遺伝子のDNA
    を含み、 他方のプラスミドは、その蛋白生成物が第１のプラスミ
    ドに存する初期プロモーターのDNAと相互作用できると
    ころのリプレッサー遺伝子のDNA、及び温度感受性DNAを
    含む、上記枯草菌。
  11. 【請求項１１】目的の解読配列に操作しやすく結合した
    プロモーター／オペレーター及びオペレーターに対する
    リプレッサー蛋白をコードするDNA配列を含む、目的解
    読配列の発現用の簡便な細菌の制御系であって、上記オ
    ペレーター及び上記のリプレッサー蛋白をコードするDN
    A配列は、同一のグラム陽性菌起源であることを特徴と
    する、上記制御系。
  12. 【請求項１２】オペレーター及びリプレッサー蛋白をコ
    ードするDNA配列が同一のグラム陽性菌起源である、特
    許請求の範囲第11項記載の簡便な細菌制御系。
  13. 【請求項１３】オペレーター及びリプレッサー蛋白をコ
    ードするDNA配列が枯草菌の溶原性ファージφ105起源で
    ある、特許請求の範囲第12項記載の簡便な細菌制御系。
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JPS61173783A (ja) 1986-08-05
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