JPH0771505B2 - Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造法 - Google Patents
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造法Info
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- JPH0771505B2 JPH0771505B2 JP4095417A JP9541792A JPH0771505B2 JP H0771505 B2 JPH0771505 B2 JP H0771505B2 JP 4095417 A JP4095417 A JP 4095417A JP 9541792 A JP9541792 A JP 9541792A JP H0771505 B2 JPH0771505 B2 JP H0771505B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、広範なペプチダーゼお
よびエステラーゼ活性を有するタンパク質分解酵素を用
い、N-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸と
L-フェニルアラニンメチルエステルとを効果的に縮合し
てN-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L
- フェニルアラニンメチルエステルを製造する方法に関
する。
よびエステラーゼ活性を有するタンパク質分解酵素を用
い、N-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸と
L-フェニルアラニンメチルエステルとを効果的に縮合し
てN-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L
- フェニルアラニンメチルエステルを製造する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】フィッタカー（Whittaker ）は、N-ベン
ジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸ジベンジルエ
ステルとL-フェニルアラニンメチルエステルから、アス
パルテームの前駆体であるN-ベンジルオキシカルボニル
- α-L- アスパルチル（β- ベンジルエステル）-L- フ
ェニルアラニンメチルエステルを製造する反応を、パパ
インが効果的に触媒しうることを見出した（国際公開公
報WO 8706268号(1987)参照）。この方法における不利益
な点は、酵素基質として用いられるN-ベンジルオキシカ
ルボニル-L- アスパラギン酸ジベンジルエステルをN-ベ
ンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸とベンジル
アルコールから製造しなければならないということであ
る。それゆえこの方法は複雑である。
ジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸ジベンジルエ
ステルとL-フェニルアラニンメチルエステルから、アス
パルテームの前駆体であるN-ベンジルオキシカルボニル
- α-L- アスパルチル（β- ベンジルエステル）-L- フ
ェニルアラニンメチルエステルを製造する反応を、パパ
インが効果的に触媒しうることを見出した（国際公開公
報WO 8706268号(1987)参照）。この方法における不利益
な点は、酵素基質として用いられるN-ベンジルオキシカ
ルボニル-L- アスパラギン酸ジベンジルエステルをN-ベ
ンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸とベンジル
アルコールから製造しなければならないということであ
る。それゆえこの方法は複雑である。
【０００３】N-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラ
ギン酸をL-フェニルアラニンメチルエステルと縮合さ
せ、アスパルテームの前駆体であるN-ベンジルオキシカ
ルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニンメ
チルエステルを製造する反応は、チェンおよびワン（Ch
en and Wang ）によって記載されている（ジャーナルオ
ブ オーガニック ケミストリー(J.Org.Chem)第52巻、
4589〜4590頁（1988年）参照）。
ギン酸をL-フェニルアラニンメチルエステルと縮合さ
せ、アスパルテームの前駆体であるN-ベンジルオキシカ
ルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニンメ
チルエステルを製造する反応は、チェンおよびワン（Ch
en and Wang ）によって記載されている（ジャーナルオ
ブ オーガニック ケミストリー(J.Org.Chem)第52巻、
4589〜4590頁（1988年）参照）。
【０００４】しかしながら、両者を溶媒に単に懸濁させ
て縮合させるこの方法では収率は低く（70％）、より多
量の酵素およびより長い反応時間（72時間）が要求され
る。さらに、パパインによりN-ベンジルオキシカルボニ
ル- α-L- アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルを製造するさいには、生成物が塊状に蓄積さ
れ、さらにパパインによって容易に加水分解されて望ま
しくない副生成物であるＮ−ベンジルオキシカルボニル
- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニンを生じる。
て縮合させるこの方法では収率は低く（70％）、より多
量の酵素およびより長い反応時間（72時間）が要求され
る。さらに、パパインによりN-ベンジルオキシカルボニ
ル- α-L- アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルを製造するさいには、生成物が塊状に蓄積さ
れ、さらにパパインによって容易に加水分解されて望ま
しくない副生成物であるＮ−ベンジルオキシカルボニル
- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニンを生じる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、本発明の目
的は、反応時間を短縮でき、収率を向上でき、また塊の
形成を防止でき、えられる生成物を反応混合物から簡単
な抽出方法により部分的に精製された形態で回収するこ
とができるような、N-ベンジルオキシカルボニル- α-L
- アスパルチル-L- フェニルアラニンメチルエステルの
製造法を提供することである。
的は、反応時間を短縮でき、収率を向上でき、また塊の
形成を防止でき、えられる生成物を反応混合物から簡単
な抽出方法により部分的に精製された形態で回収するこ
とができるような、N-ベンジルオキシカルボニル- α-L
- アスパルチル-L- フェニルアラニンメチルエステルの
製造法を提供することである。
【０００６】前記目的を達成するために酵素的なペプチ
ド合成におけるパパインの使用を研究するうち、本発明
者らは、分散剤としてグリセロールを添加した酢酸エチ
ルとクエン酸カリウム緩衝液などの水性緩衝液を含有す
る二相系でN-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギ
ン酸をL-フェニルアラニンメチルエステルと反応させる
反応をパパインなどのタンパク質分解酵素が効果的に触
媒しうることを見出した。この反応により、N-ベンジル
オキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルア
ラニンメチルエステルを、簡単な抽出方法によって部分
的に精製された形態で、高い収率で回収できる。本発明
の方法を成功に導いた重要な点は、反応混合物中の粘性
な凝集体の形成に起因する従来の方法における重大な問
題を克服したことである。
ド合成におけるパパインの使用を研究するうち、本発明
者らは、分散剤としてグリセロールを添加した酢酸エチ
ルとクエン酸カリウム緩衝液などの水性緩衝液を含有す
る二相系でN-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギ
ン酸をL-フェニルアラニンメチルエステルと反応させる
反応をパパインなどのタンパク質分解酵素が効果的に触
媒しうることを見出した。この反応により、N-ベンジル
オキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルア
ラニンメチルエステルを、簡単な抽出方法によって部分
的に精製された形態で、高い収率で回収できる。本発明
の方法を成功に導いた重要な点は、反応混合物中の粘性
な凝集体の形成に起因する従来の方法における重大な問
題を克服したことである。
【０００７】すなわち本発明はグリセロールを分散剤に
用いることにより、生成物の拡散と加水分解の問題を克
服できる。しかも収率を向上することができ、酵素、緩
衝液、有機溶剤の用量をすべて減少できるもので、生成
物の濃度が前記チェンおよびワンの方法では１日で17.5
mMにしか到達できなかったのに対し、本発明によれば36
0mM に到達できるようになった。
用いることにより、生成物の拡散と加水分解の問題を克
服できる。しかも収率を向上することができ、酵素、緩
衝液、有機溶剤の用量をすべて減少できるもので、生成
物の濃度が前記チェンおよびワンの方法では１日で17.5
mMにしか到達できなかったのに対し、本発明によれば36
0mM に到達できるようになった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はN-ベ
ンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸とL-フェニ
ルアラニンメチルエステルとを、タンパク質分解酵素の
存在下、水性緩衝液／酢酸エチル二相系で、分散剤とし
てグリセロールを添加し、ｐＨ3.0 〜7.5 および温度25
〜49℃にて縮合することを特徴とするN-ベンジルオキシ
カルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニン
メチルエステルの製造法に関する。
ンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸とL-フェニ
ルアラニンメチルエステルとを、タンパク質分解酵素の
存在下、水性緩衝液／酢酸エチル二相系で、分散剤とし
てグリセロールを添加し、ｐＨ3.0 〜7.5 および温度25
〜49℃にて縮合することを特徴とするN-ベンジルオキシ
カルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニン
メチルエステルの製造法に関する。
【０００９】
【実施例】本発明においてタンパク質分解酵素として
は、ペプチド合成能力を備えていればとくに限定されな
いが、たとえばトリプシン、ブロメリン、パパインなど
があげられ、なかでもパパインが好ましい。
は、ペプチド合成能力を備えていればとくに限定されな
いが、たとえばトリプシン、ブロメリン、パパインなど
があげられ、なかでもパパインが好ましい。
【００１０】水性緩衝液としてはｐＨ値を維持するもの
であればとくに限定されないが、リン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、クエン酸緩衝液などがあげられ、なかでもｐＨ３
〜7.5 のクエン酸ナトリウム緩衝液およびｐＨ３〜６の
クエン酸カリウム緩衝液が好ましい。
であればとくに限定されないが、リン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、クエン酸緩衝液などがあげられ、なかでもｐＨ３
〜7.5 のクエン酸ナトリウム緩衝液およびｐＨ３〜６の
クエン酸カリウム緩衝液が好ましい。
【００１１】本発明の方法は、たとえばつぎのようにし
て実施することができる。まず、タンパク質分解酵素を
水性緩衝液によく懸濁させ、その懸濁液をグリセロール
と混合する（Ａ液）。このばあい、タンパク質分解酵素
は水性緩衝液１mlに対して0.25〜0.6 ｇ、好ましくは0.
4 〜0.5 ｇ使用し、グリセロールは水性緩衝液１mlに対
して0.5 〜５ml、好ましくは１〜２ml使用する。一方、
L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩およびトリエ
チルアミンを酢酸エチルに加えて20〜30℃にて20〜30分
間混合し、さらにN-ベンジルオキシカルボニル-L- アス
パラギン酸を加えて10〜20分間撹拌する（Ｂ液）。この
ばあい、酢酸エチルは前記水性緩衝液１mlに対して25〜
250ml 、好ましくは50〜150ml 使用し、さらに、酢酸エ
チル１mlに対してL-フェニルアラニンメチルエステル塩
酸塩は0.16〜1.6 ミリモル、好ましくは0.26〜0.8 ミリ
モル、トリエチルアミンは0.16〜1.6 ミリモル、好まし
くは0.26〜0.8 ミリモル、およびN-ベンジルオキシカル
ボニル-L- アスパラギン酸は0.08〜0.8 ミリモル、好ま
しくは0.13〜0.4 ミリモル使用する。
て実施することができる。まず、タンパク質分解酵素を
水性緩衝液によく懸濁させ、その懸濁液をグリセロール
と混合する（Ａ液）。このばあい、タンパク質分解酵素
は水性緩衝液１mlに対して0.25〜0.6 ｇ、好ましくは0.
4 〜0.5 ｇ使用し、グリセロールは水性緩衝液１mlに対
して0.5 〜５ml、好ましくは１〜２ml使用する。一方、
L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩およびトリエ
チルアミンを酢酸エチルに加えて20〜30℃にて20〜30分
間混合し、さらにN-ベンジルオキシカルボニル-L- アス
パラギン酸を加えて10〜20分間撹拌する（Ｂ液）。この
ばあい、酢酸エチルは前記水性緩衝液１mlに対して25〜
250ml 、好ましくは50〜150ml 使用し、さらに、酢酸エ
チル１mlに対してL-フェニルアラニンメチルエステル塩
酸塩は0.16〜1.6 ミリモル、好ましくは0.26〜0.8 ミリ
モル、トリエチルアミンは0.16〜1.6 ミリモル、好まし
くは0.26〜0.8 ミリモル、およびN-ベンジルオキシカル
ボニル-L- アスパラギン酸は0.08〜0.8 ミリモル、好ま
しくは0.13〜0.4 ミリモル使用する。
【００１２】タンパク質分解酵素の使用量は、N-ベンジ
ルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸40ミリモルに対
し0.5 〜10ｇ、好ましくは0.8 〜1.2 ｇとなる。
ルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸40ミリモルに対
し0.5 〜10ｇ、好ましくは0.8 〜1.2 ｇとなる。
【００１３】ひきつづきＢ液をＡ液に加え、10〜60℃、
好ましくは25〜49℃にて５〜72時間、好ましくは20〜30
時間撹拌し反応させでN-ベンジルオキシカルボニル- α
-L-アスパルチル-L- フェニルアラニンメチルエステル
を形成させる。
好ましくは25〜49℃にて５〜72時間、好ましくは20〜30
時間撹拌し反応させでN-ベンジルオキシカルボニル- α
-L-アスパルチル-L- フェニルアラニンメチルエステル
を形成させる。
【００１４】本反応においては分散剤としてグリセロー
ルを用いることが特徴であり、グリセロール以外の分散
剤を用いたばあいは、目的物の収率が著しく低下する。
ルを用いることが特徴であり、グリセロール以外の分散
剤を用いたばあいは、目的物の収率が著しく低下する。
【００１５】さらに、本発明においてはえられたN-ベン
ジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニ
ルアラニンメチルエステルを、ｐＨ４〜９、好ましくは
ｐＨ６〜７、５〜50mMのリン酸カリウム緩衝液、ひきつ
づき塩化水素酸を用いて抽出することにより回収する。
このばあい、用いる抽出液の量はN-ベンジルオキシカル
ボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニンメチ
ルエステル１ｇに対して、いずれも20〜100ml 、好まし
くは40〜60mlである。
ジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニ
ルアラニンメチルエステルを、ｐＨ４〜９、好ましくは
ｐＨ６〜７、５〜50mMのリン酸カリウム緩衝液、ひきつ
づき塩化水素酸を用いて抽出することにより回収する。
このばあい、用いる抽出液の量はN-ベンジルオキシカル
ボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルアラニンメチ
ルエステル１ｇに対して、いずれも20〜100ml 、好まし
くは40〜60mlである。
【００１６】つぎに本発明の利点、特徴および方法を以
下に示した実施例により詳細に説明するが、本発明はも
とよりかかる実施例にのみ限定されるものではない。
下に示した実施例により詳細に説明するが、本発明はも
とよりかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【００１７】実施例１ パパイン（１ｇ、ジェイ・イー シーベル サン社 (J.
E.Siebel Son′s Co.)（米国）製）を3.0 Ｍのクエン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ5.1 ）２mlによく懸濁させ、その
懸濁液を２mlのグリセロールと混合した。80ミリモルの
L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩および80ミリ
モルのトリエチルアミンを100ml の酢酸エチルに加え、
25℃にて40分間混合したのち、40ミリモルのN-ベンジル
オキシカルボニル-L- アスパラギン酸を加えて20分間撹
拌した。溶解性のL-フェニルアラニンメチルエステルお
よびN-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸な
らびに不溶性のトリエチルアミン塩酸塩を含有する酢酸
エチル混合物全体を、ひきつづきパパインの懸濁液に添
加した。反応混合物を25℃にて22時間撹拌したのち、20
0ml の酢酸エチルを加えて55℃にて15分間撹拌し、濾過
した。HPLC分析により測定したところ、濾液中のN-ベン
ジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニ
ルアラニンメチルエステルの収率は、N-ベンジオキシカ
ルボニル-L-アスパラギン酸の最初の量に対して計算す
ると85％であった。酢酸エチル溶液はそののち0.01Ｍの
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）150ml で２度、さら
に0.3Ｎの塩化水素酸150ml で２度抽出した。最終的な
有機層を10ｇの無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、さ
らに蒸発および真空乾燥して17.4ｇの部分的に精製され
たN-ベンジルオキシカルボニル- α- L-アスパルチル-L
- フェニルアラニンメチルエステルをえた。
E.Siebel Son′s Co.)（米国）製）を3.0 Ｍのクエン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ5.1 ）２mlによく懸濁させ、その
懸濁液を２mlのグリセロールと混合した。80ミリモルの
L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩および80ミリ
モルのトリエチルアミンを100ml の酢酸エチルに加え、
25℃にて40分間混合したのち、40ミリモルのN-ベンジル
オキシカルボニル-L- アスパラギン酸を加えて20分間撹
拌した。溶解性のL-フェニルアラニンメチルエステルお
よびN-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸な
らびに不溶性のトリエチルアミン塩酸塩を含有する酢酸
エチル混合物全体を、ひきつづきパパインの懸濁液に添
加した。反応混合物を25℃にて22時間撹拌したのち、20
0ml の酢酸エチルを加えて55℃にて15分間撹拌し、濾過
した。HPLC分析により測定したところ、濾液中のN-ベン
ジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニ
ルアラニンメチルエステルの収率は、N-ベンジオキシカ
ルボニル-L-アスパラギン酸の最初の量に対して計算す
ると85％であった。酢酸エチル溶液はそののち0.01Ｍの
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）150ml で２度、さら
に0.3Ｎの塩化水素酸150ml で２度抽出した。最終的な
有機層を10ｇの無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、さ
らに蒸発および真空乾燥して17.4ｇの部分的に精製され
たN-ベンジルオキシカルボニル- α- L-アスパルチル-L
- フェニルアラニンメチルエステルをえた。
【００１８】実施例２ N-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸とL-フ
ェニルアラニンメチルエステル塩酸塩とトリエチルアミ
ンのモル比が４：６：６であり、縮合反応のための反応
時間が48時間であること以外は実施例１の方法を繰返し
た。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル
-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は80％であ
った。
ェニルアラニンメチルエステル塩酸塩とトリエチルアミ
ンのモル比が４：６：６であり、縮合反応のための反応
時間が48時間であること以外は実施例１の方法を繰返し
た。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル
-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は80％であ
った。
【００１９】実施例３ パパイン（１ｇ、メルク社(Merck Co.（ドイツ）製）を
3.0 Ｍのクエン酸カリウム緩衝液（ｐＨ5.1 ）２mlによ
く懸濁させ、その懸濁液を２mlのグリセロールと混合し
た。50ミリモルのL-フェニルアラニンメチルエステル塩
酸塩および50ミリモルのトリエチルアミンを100ml の酢
酸エチルに加え、25℃にて40分間混合したのち、20ミリ
モルのN-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸
を加えて20分間撹拌した。溶解性のL-フェニルアラニン
メチルエステルおよびN-ベンジルオキシカルボニル- L-
アスパラギン酸ならびに不溶性のトリエチルアミン塩酸
塩を含有する酢酸エチル混合物全体を、ひきつづきパパ
インの懸濁液に添加した。反応混合物を25℃にて28時間
撹拌した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパ
ルチル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は73
％であった。
3.0 Ｍのクエン酸カリウム緩衝液（ｐＨ5.1 ）２mlによ
く懸濁させ、その懸濁液を２mlのグリセロールと混合し
た。50ミリモルのL-フェニルアラニンメチルエステル塩
酸塩および50ミリモルのトリエチルアミンを100ml の酢
酸エチルに加え、25℃にて40分間混合したのち、20ミリ
モルのN-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパラギン酸
を加えて20分間撹拌した。溶解性のL-フェニルアラニン
メチルエステルおよびN-ベンジルオキシカルボニル- L-
アスパラギン酸ならびに不溶性のトリエチルアミン塩酸
塩を含有する酢酸エチル混合物全体を、ひきつづきパパ
インの懸濁液に添加した。反応混合物を25℃にて28時間
撹拌した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパ
ルチル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は73
％であった。
【００２０】実施例４ 15ｇのパパイン、４mlのクエン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
5.1 ）および12mlのグリセロールを用い、縮合反応を49
℃、５時間にて行なったこと以外は実施例３の方法を繰
返した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパル
チル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は81％
であった。
5.1 ）および12mlのグリセロールを用い、縮合反応を49
℃、５時間にて行なったこと以外は実施例３の方法を繰
返した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパル
チル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は81％
であった。
【００２１】実施例５ クエン酸カリウム緩衝液のｐＨが3.0 、縮合反応を25
℃、23時間にて行なったこと以外は実施例３の方法を繰
返した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパル
チル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は74％
であった。
℃、23時間にて行なったこと以外は実施例３の方法を繰
返した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパル
チル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は74％
であった。
【００２２】実施例６ 3.0 Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ3.0 ）を用い
たこと以外は、実施例１の方法を繰返した。N-ベンジル
オキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルア
ラニンメチルエステルの収率は81％であった。
たこと以外は、実施例１の方法を繰返した。N-ベンジル
オキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルア
ラニンメチルエステルの収率は81％であった。
【００２３】実施例７ 3.0 Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.5 ）を用い
たこと以外は、実施例１の方法を繰返した。N-ベンジル
オキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルア
ラニンメチルエステルの収率は80％であった。
たこと以外は、実施例１の方法を繰返した。N-ベンジル
オキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L- フェニルア
ラニンメチルエステルの収率は80％であった。
【００２４】比較例１ グリセロールを添加せずに実施例１の方法を繰返した。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの収率は１９．
２％であった。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの収率は１９．
２％であった。
【００２５】比較例２ ２ｍｌのＰＰＧ−１０２５（ポリプロピレングリコール
−１０２５、メルク社（ドイツ）製）を分散剤として添
加し、比較例１の方法を繰返した。Ｎ−ベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルの収率は１１．８％であった。
−１０２５、メルク社（ドイツ）製）を分散剤として添
加し、比較例１の方法を繰返した。Ｎ−ベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルの収率は１１．８％であった。
【００２６】比較例３ ２ｍｌのスパン８０を分散剤として添加し、比較例１の
方法を繰返した。Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルの収率は５．６％であった。
方法を繰返した。Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルの収率は５．６％であった。
【００２７】実施例11 １mlのグリセロールを用いたこと以外は実施例１の方法
を繰返した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アス
パルチル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は
80.4％であった。
を繰返した。N-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アス
パルチル-L- フェニルアラニンメチルエステルの収率は
80.4％であった。
【００２８】これらの実施例より、本発明の方法によれ
ば高収率のＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを短
い反応時間でえることができる。また、比較例１、２お
よび３より、分散剤はグリセロールでなければならず、
他種の分散剤を用いたばあいは収率が低下することが示
された。
ば高収率のＮ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを短
い反応時間でえることができる。また、比較例１、２お
よび３より、分散剤はグリセロールでなければならず、
他種の分散剤を用いたばあいは収率が低下することが示
された。
【００２９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、短い反応時間で
高収率にN-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパル
チル-L- フェニルアラニンメチルエステルをえることが
でき、また、これを簡単な抽出方法で部分的に純化され
たものとしてえることができる。
高収率にN-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパル
チル-L- フェニルアラニンメチルエステルをえることが
でき、また、これを簡単な抽出方法で部分的に純化され
たものとしてえることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フェイリン ズォン 台湾、タイペイ、チャンシン ストリート 81 デベロップメント センター フォ ー バイオテクノロジー内 (72)発明者 ウンシェー ファン 台湾、タイペイ、チャンシン ストリート 81 デベロップメント センター フォ ー バイオテクノロジー内 (72)発明者 シン ツァイ 台湾、タイペイ、チャンシン ストリート 81 デベロップメント センター フォ ー バイオテクノロジー内 (56)参考文献 特開 平２−79993（ＪＰ，Ａ) ＡＲＣＨＩＶＥＳ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥ ＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＹＳＩ ＣＳ，250 〜２！（1986−11−１），Ｐ. 280−285
Claims (9)
- 【請求項１】 N-ベンジルオキシカルボニル-L- アスパ
ラギン酸とL-フェニルアラニンメチルエステルとを、タ
ンパク質分解酵素の存在下、水性緩衝液／酢酸エチル二
相系で、分散剤としてグリセロールを添加し、ｐＨ3.0
〜7.5 および温度25〜49℃にて縮合することを特徴とす
るN-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L
- フェニルアラニンメチルエステルの製造法。 - 【請求項２】 タンパク質分解酵素がパパインである請
求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 水性緩衝液がクエン酸塩緩衝液である請
求項１記載の製造法。 - 【請求項４】 クエン酸塩緩衝液がクエン酸ナトリウム
緩衝液である請求項３記載の製造法。 - 【請求項５】 クエン酸塩緩衝液がクエン酸カリウム緩
衝液である請求項３記載の製造法。 - 【請求項６】 クエン酸ナトリウム緩衝液のｐＨが３〜
7.5 である請求項４記載の製造法。 - 【請求項７】 クエン酸カリウム緩衝液のｐＨが３〜６
である請求項５記載の製造法。 - 【請求項８】 さらに、溶媒としてリン酸カリウム緩衝
液および塩化水素酸を連続して用いて抽出することによ
りN-ベンジルオキシカルボニル- α-L- アスパルチル-L
- フェニルアラニンメチルエステルを回収することを特
徴とする請求項１記載の製造法。 - 【請求項９】 リン酸カリウム緩衝液のｐＨが６〜７で
あり、濃度が50mMである請求項８記載の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/727,696 US5279946A (en) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | Process for the preparation of N-benzyloxycarbonyl-alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester |
| JP4095417A JPH0771505B2 (ja) | 1991-07-10 | 1992-04-15 | Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/727,696 US5279946A (en) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | Process for the preparation of N-benzyloxycarbonyl-alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester |
| JP4095417A JPH0771505B2 (ja) | 1991-07-10 | 1992-04-15 | Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05284991A JPH05284991A (ja) | 1993-11-02 |
| JPH0771505B2 true JPH0771505B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=26436655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4095417A Expired - Lifetime JPH0771505B2 (ja) | 1991-07-10 | 1992-04-15 | Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5279946A (ja) |
| JP (1) | JPH0771505B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9400092A (nl) * | 1994-01-20 | 1995-09-01 | Holland Sweetener Co | Enzymatische koppeling van L-fenylalaninemethylester en N-benzyloxycarbonyl-asparaginezuur. |
| EP0768384B1 (en) * | 1995-10-11 | 2001-06-13 | Holland Sweetener Company V.o.F. | Improved enzymatic coupling reaction of N-protected-L-aspartic acid and phenylalanine methyl ester |
| DE69613305T2 (de) * | 1995-10-11 | 2002-05-02 | Holland Sweetener Co. V.O.F., Maastricht | Verbesserte enzymatische Kupplungsreaktion von N-geschützte L-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4116768A (en) * | 1975-04-29 | 1978-09-26 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| US4935355A (en) * | 1986-04-15 | 1990-06-19 | Synthetech, Inc. | Preparation of dipeptides |
| JPH0279993A (ja) * | 1987-12-11 | 1990-03-20 | Fan Shun Mou Ii Yuu Shen Kun Tsu | Ｌ，ｌ−ジペプチドアスパルテームの製法 |
-
1991
- 1991-07-10 US US07/727,696 patent/US5279946A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-04-15 JP JP4095417A patent/JPH0771505B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＡＲＣＨＩＶＥＳＯＦＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤＢＩＯＰＨＹＳＩＣＳ，２５０〜２！（１９８６−１１−１），Ｐ．２８０−２８５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5279946A (en) | 1994-01-18 |
| JPH05284991A (ja) | 1993-11-02 |
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