JPH0771508B2 - ポリペプチド及びその製造方法 - Google Patents
ポリペプチド及びその製造方法Info
- Publication number
- JPH0771508B2 JPH0771508B2 JP61310177A JP31017786A JPH0771508B2 JP H0771508 B2 JPH0771508 B2 JP H0771508B2 JP 61310177 A JP61310177 A JP 61310177A JP 31017786 A JP31017786 A JP 31017786A JP H0771508 B2 JPH0771508 B2 JP H0771508B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- hgh
- plasmid
- gene
- somatomedin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はソマトメジン様活性のあるポリペプチド及びこ
のポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドで
形質転換された微生物を用いるその製造方法に関するも
のである。
のポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドで
形質転換された微生物を用いるその製造方法に関するも
のである。
［従来の技術］ ヒトを含む哺乳動物では、骨組織の成長促進に関与する
物質としてソマトメジンＡ、IGF−Ｉ及びIGE−IIなどが
知られている。これらの物質（以下ソマトメジン様活性
物質と云う）は肝組織から放出され、直接に骨細胞に作
用してその増殖を促進する。これらの物質の産生，分泌
は成長ホルモンにより制御されていると考えられている
が、成長ホルモン自体にはソマトメジン様活性は非常に
小さいと云われている。
物質としてソマトメジンＡ、IGF−Ｉ及びIGE−IIなどが
知られている。これらの物質（以下ソマトメジン様活性
物質と云う）は肝組織から放出され、直接に骨細胞に作
用してその増殖を促進する。これらの物質の産生，分泌
は成長ホルモンにより制御されていると考えられている
が、成長ホルモン自体にはソマトメジン様活性は非常に
小さいと云われている。
ソマトメジン様物質は骨組織の成長促進のための医薬と
して有用であるが、その産生，分泌量は極めて微量で、
抽出も簡単でないので、これらを生体から大量に得るこ
とは困難であり、特にヒトの場合には全く不可能であ
る。
して有用であるが、その産生，分泌量は極めて微量で、
抽出も簡単でないので、これらを生体から大量に得るこ
とは困難であり、特にヒトの場合には全く不可能であ
る。
ソマトメジン様物質はポリペプチドであるので、遺伝子
組換の手法により微生物に生産させることも考えられる
が、これらの物質は分子量約7,000の比較的低分子量の
物質であり、微生物菌体内で発現されたとしてもその量
は僅かであり、また菌体内や抽出，精製の過程での消
化，分泌等のためにこれらを効率よく生産させることは
非常に困難である。
組換の手法により微生物に生産させることも考えられる
が、これらの物質は分子量約7,000の比較的低分子量の
物質であり、微生物菌体内で発現されたとしてもその量
は僅かであり、また菌体内や抽出，精製の過程での消
化，分泌等のためにこれらを効率よく生産させることは
非常に困難である。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って遺伝子組換の手法で大量に生産可能なソマトメジ
ン様物質又はソマトメジン様活性を有する物質を得るこ
とは重要な課題である。
ン様物質又はソマトメジン様活性を有する物質を得るこ
とは重要な課題である。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、ヒト成長ホルモン（以下hGHと云う）の
Ｎ−末端よりＣ−末端側へ138番目までのアミノ酸連鎖
を持つポリペプチドにこのソマトメジン様活性のあるこ
と、このポリペプチドは、hGHをコードし、かつ遺伝子
組換の手法でhGHを発現することのできる合成遺伝子と
して知られているDNAセグメントの相当する部分を発現
可能に挿入したプラスミドで形質転換した大腸菌を用い
て発現可能であること、及びこの様なプラスミドは、そ
の３′末端に制限酵素Sa lIの部位を有する前記合成遺
伝子を、hGHの発現可能に含むプラスミドから制限酵素B
gl II及びSal Iによる消化とリンカーを用いる再接着に
よって調製可能であることを発見して本発明を完成し
た。
Ｎ−末端よりＣ−末端側へ138番目までのアミノ酸連鎖
を持つポリペプチドにこのソマトメジン様活性のあるこ
と、このポリペプチドは、hGHをコードし、かつ遺伝子
組換の手法でhGHを発現することのできる合成遺伝子と
して知られているDNAセグメントの相当する部分を発現
可能に挿入したプラスミドで形質転換した大腸菌を用い
て発現可能であること、及びこの様なプラスミドは、そ
の３′末端に制限酵素Sa lIの部位を有する前記合成遺
伝子を、hGHの発現可能に含むプラスミドから制限酵素B
gl II及びSal Iによる消化とリンカーを用いる再接着に
よって調製可能であることを発見して本発明を完成し
た。
即ち本発明はhGHのＮ−末端によりそのＣ−末端側へ138
番目までのアミノ酸連鎖を持つポリペプチド（但しその
Ｎ−末端にメチオニンが付加されていてもよい）を提供
するものである。
番目までのアミノ酸連鎖を持つポリペプチド（但しその
Ｎ−末端にメチオニンが付加されていてもよい）を提供
するものである。
この様なポリペプチドは、式 （以下式−Ｉで云う）で表わされるアミノ酸連鎖からな
るものである（但し、Ｎ末端にメチオニン残基が付加さ
れてよく、かつ本質的にソマトメジン様活性を損わない
程度で多少の変更はあってよい）。
るものである（但し、Ｎ末端にメチオニン残基が付加さ
れてよく、かつ本質的にソマトメジン様活性を損わない
程度で多少の変更はあってよい）。
この様なポリペプチド（以下hGH−ABポリペプチドと云
う）をコードするDNA連鎖を含む合成遺伝子はhGHのAB部
分をコードする遺伝子として知られている（特開昭60−
234584号公報）。この遺伝子はhGH−ABポリペプチドを
コードする次式のDNA連鎖（以下hGH−AB遺伝子と云う）
を含んでいる。
う）をコードするDNA連鎖を含む合成遺伝子はhGHのAB部
分をコードする遺伝子として知られている（特開昭60−
234584号公報）。この遺伝子はhGH−ABポリペプチドを
コードする次式のDNA連鎖（以下hGH−AB遺伝子と云う）
を含んでいる。
このhGH−AB遺伝子は大腸菌中に安定に保持され、かつ
複製可能なプラスミド中に、大腸菌中で発現可能な様に
挿入されることができる。この様にしてhGH−AB遺伝子
の挿入されたプラスミドpAB−１の物理地図を第１図に
示す。
複製可能なプラスミド中に、大腸菌中で発現可能な様に
挿入されることができる。この様にしてhGH−AB遺伝子
の挿入されたプラスミドpAB−１の物理地図を第１図に
示す。
このプラスミドの第１図上、制限酵素Cla I部位から下
流のSal I部位までのDNA配列を第２図に示す。
流のSal I部位までのDNA配列を第２図に示す。
このプラスミドは、例えば特開昭60−234584号公報中で
開示されているpGH−Ｌシリーズのプラスミドから調整
することができる。第３図にこのpGH−Ｌシリーズのプ
ラスミドの物理地図、第４図にhGH遺伝子部分の制限酵
素部位をより詳細に示す。
開示されているpGH−Ｌシリーズのプラスミドから調整
することができる。第３図にこのpGH−Ｌシリーズのプ
ラスミドの物理地図、第４図にhGH遺伝子部分の制限酵
素部位をより詳細に示す。
hGH遺伝子のCla I部位から下流のBgl II部位までのDNA
配列はpAB−１のそれと全く同一である。Bgl II部位か
ら下流のSal I部位まではhGHのＣ部分と呼ばれている部
分をコードし、そのＣ端末のコードに停止コドンが続い
ている。そのDNA配列は下式の通りである。
配列はpAB−１のそれと全く同一である。Bgl II部位か
ら下流のSal I部位まではhGHのＣ部分と呼ばれている部
分をコードし、そのＣ端末のコードに停止コドンが続い
ている。そのDNA配列は下式の通りである。
第５図にpGH−Ｌシリーズのプラスミド、pGH−L9からの
pAB−１の調製を示す。この図に示す様にpAB−１はpGH
−L9を制限酵素Bgl II及びSal Iで二重消化し、必要に
応じてアガロース（アクリルアミド）ゲル電気泳動等で
精製してhGH−AB遺伝子を含む大きなDNA断片とし、これ
を式 で表わされるDNA連鎖からなるリンカーと連結環化して
調製することができる。
pAB−１の調製を示す。この図に示す様にpAB−１はpGH
−L9を制限酵素Bgl II及びSal Iで二重消化し、必要に
応じてアガロース（アクリルアミド）ゲル電気泳動等で
精製してhGH−AB遺伝子を含む大きなDNA断片とし、これ
を式 で表わされるDNA連鎖からなるリンカーと連結環化して
調製することができる。
なおpGH−L9を細胞内に保有する大腸菌,E.コリ（E.col
i）pGH−L9は微工研菌奇第7606号として通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。pGH−L
9は特開昭60−234584号公報に開示されている様に、こ
の寄託菌株を培養し、その菌体から慣用の方法によって
容易に抽出調製することができる。
i）pGH−L9は微工研菌奇第7606号として通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。pGH−L
9は特開昭60−234584号公報に開示されている様に、こ
の寄託菌株を培養し、その菌体から慣用の方法によって
容易に抽出調製することができる。
pAB−１プラスミドはpGH−L9と同様に慣用の方法によっ
て大腸菌に容易に形質転換することができる。pAB−１
はpGH−L9由来のトルプトファン プロモーター・オペ
レーター系を持ち、これが強力にhGH−AB遺伝子の発現
を制御するので、得られた形質転換体は培地中で培養増
殖させ、インドールアクリル酸で誘導することによって
hGH−ABポリペプチドを著量蓄積する。その培養条件，
誘導条件等はE.コリpGH−L9と同様である。
て大腸菌に容易に形質転換することができる。pAB−１
はpGH−L9由来のトルプトファン プロモーター・オペ
レーター系を持ち、これが強力にhGH−AB遺伝子の発現
を制御するので、得られた形質転換体は培地中で培養増
殖させ、インドールアクリル酸で誘導することによって
hGH−ABポリペプチドを著量蓄積する。その培養条件，
誘導条件等はE.コリpGH−L9と同様である。
菌体内に蓄積されたhGH−ABポリペプチドは菌体を溶菌
させたのち、通常の生理活性ポリペプチドの回収及び活
性化法によって分離回収することができる。
させたのち、通常の生理活性ポリペプチドの回収及び活
性化法によって分離回収することができる。
翻訳開始コドンとtrp Ｌ S.D.配列との間の塩基数がp
GH−L9と多少異なるが同様なプラスミドを持つE.コリ
pGH−L8（微工研菌寄第7605号），同−L11（同第7607
号）または同−L13（同第7608号）からも同様な発現系
を構築することができる。
GH−L9と多少異なるが同様なプラスミドを持つE.コリ
pGH−L8（微工研菌寄第7605号），同−L11（同第7607
号）または同−L13（同第7608号）からも同様な発現系
を構築することができる。
［作用］ hGH−ABポリペプチドはヒトを含む哺乳動物の骨組織に
直接働いてその成長を促進する。
直接働いてその成長を促進する。
［実施例］ 以下本発明を実施例で更に詳しく説明する。
なお実施例中で略号で示した試薬は以下の通りである。
標準緩衝液:50mM Tris−塩酸pH7.5 35mM MgCl2 35 mM ２−mercaptoethanol Tris−NaCl:10mM Tris−塩酸緩衝液、 0.14M NaCl、pH8。
TE−蔗糖:25％蔗糖（W/V）、 50mM Tris−塩酸緩衝液、1mM EDTA pH8。
リゾチーム:10mg/mlリゾチーム、 0.25M Tris−塩酸緩衝液、pH8。
0.5M EDTA:pH8。
PNase:0.04M酢酸緩衝液（Ph5）に10mg/mlの濃度に溶か
し、100℃で５分間加熱処理する。
し、100℃で５分間加熱処理する。
Lytic Mixture:0.1％非イオン系界面活性剤 （Triton X−100）、 50mM Tris−塩酸緩衝液、 62.5mM EDTA、pH8。
ポリエチレングリコール（PEG）6000:1級の粉末 5M NaCl CsCl:固体。
EB溶液：エチジウムブロマイトを水に対して 4.67mg/mlになるよう溶解して調製。
TE:10mM Tris−塩酸緩衝液、 1mM EDTA、pH7.4。
TE−sarkosyl:10mM Tris−塩酸緩衝液、 1mM EDTA、0.38％Sodium Ｎ−Lauroyl Sarkosinate、pH7.4。
TEN−10mM Tris−塩酸緩衝液、1mM EDTA、 0.1M NaCl、pH7.4。
実施例１ E.コリ pGH−L9（（微工研菌寄第7606号）をPBB倍地
（ペプトン10g,肉エキス10g,NaCl2.5g,酵母エキス2g,水
１,pH7.0）に37℃で通気培養してプラスミドを増幅し
た。菌が２〜５×108/mlまで増殖したところでクロラム
フェニコールを最終濃度約150μg/mlになるように加
え、そのまま37℃で８時間培養した。
（ペプトン10g,肉エキス10g,NaCl2.5g,酵母エキス2g,水
１,pH7.0）に37℃で通気培養してプラスミドを増幅し
た。菌が２〜５×108/mlまで増殖したところでクロラム
フェニコールを最終濃度約150μg/mlになるように加
え、そのまま37℃で８時間培養した。
培養液400mlから集めた菌体（約1g）を約30mlのTris−N
aClに懸濁し、容量40mlの冷却遠心機用遠心管に移し、
7,000rpm、７分間遠心して沈澱させた。10mlのTE−蔗糖
を加えて懸濁し、０℃５分間報知後2mlの0.5mM EDTAを
加え、さらに０℃、10分間置いた。これに16mlのLytic
Mixtureを一気に加え、遠心管を数回反転して全体を
均一にした。そのまま０℃で15分間放置後、０℃で15,0
00〜18,000rpm、30分間遠心した。上清を静かに別の遠
心管に移した。約30mlのcleared lysateが得られた。
aClに懸濁し、容量40mlの冷却遠心機用遠心管に移し、
7,000rpm、７分間遠心して沈澱させた。10mlのTE−蔗糖
を加えて懸濁し、０℃５分間報知後2mlの0.5mM EDTAを
加え、さらに０℃、10分間置いた。これに16mlのLytic
Mixtureを一気に加え、遠心管を数回反転して全体を
均一にした。そのまま０℃で15分間放置後、０℃で15,0
00〜18,000rpm、30分間遠心した。上清を静かに別の遠
心管に移した。約30mlのcleared lysateが得られた。
cleared lysateにその1/10重量のPEG粉末および1/10容
量の5M NaClを加え、マグネチックスターラーで完全に
溶解させた。０℃で１晩放置した後、10,000rpm、10分
間遠心した。沈澱を上清から分離した後、これを3mlのT
Eによく溶かしさらに少量のTEを加えて全体を正確に4.7
6mlにした。これに5.00g CsCl、0.5mlEB溶液を加えよ
く混合した。
量の5M NaClを加え、マグネチックスターラーで完全に
溶解させた。０℃で１晩放置した後、10,000rpm、10分
間遠心した。沈澱を上清から分離した後、これを3mlのT
Eによく溶かしさらに少量のTEを加えて全体を正確に4.7
6mlにした。これに5.00g CsCl、0.5mlEB溶液を加えよ
く混合した。
２容のエタノールを加え、０℃、20分間放置後 10,000
rpmで10分間遠心し、上清をよく除き、沈澱を9mlのTE−
Sarkosylによく溶かし、さらに少量のTE−Sarkosylで9.
52gに調整した。これに10g CsCl、1mlEB溶液を混ぜて
約20℃、36,000 rpmで36時間遠心した。ブラックラン
プ（360nm）照射下プラスミドccDNAバンドを幅狭く回収
した。
rpmで10分間遠心し、上清をよく除き、沈澱を9mlのTE−
Sarkosylによく溶かし、さらに少量のTE−Sarkosylで9.
52gに調整した。これに10g CsCl、1mlEB溶液を混ぜて
約20℃、36,000 rpmで36時間遠心した。ブラックラン
プ（360nm）照射下プラスミドccDNAバンドを幅狭く回収
した。
TENで平衡化したSepharose Cl−48カラム（0.8×20c
m）に、得られたccDNA画分（0.8ml）をそのまま加え、T
ENで自然流出法によりゲル濾過を行った。
m）に、得られたccDNA画分（0.8ml）をそのまま加え、T
ENで自然流出法によりゲル濾過を行った。
波長254nmにおける吸光度でモニターして約5mlのvoid
volume、DNA画分、RNA画分、さらに続いてEBおよびCsCl
が流出した。DNA画分に相当する最初のピークを集めてT
Eに透析してほぼ純粋なpGH−L9プラスミドDNAを得た。
volume、DNA画分、RNA画分、さらに続いてEBおよびCsCl
が流出した。DNA画分に相当する最初のピークを集めてT
Eに透析してほぼ純粋なpGH−L9プラスミドDNAを得た。
pGH−L9 50μｇを20mM Tris HCl（pH7.5）−10mM β
−EtSH−175mM NaCl−10mM MgCl2中Bgl II37.5U,Sal
I175Uを加え、37℃17時間インキュベートし反応停止、
フェノール処理後、DNAをエタノール沈でんさせ、５％
ポリアクリルアミド電気泳動に付した。ゲルから、抽出
を行いhGH−AB部分遺伝子を含む約4.6KbpのDNA断片約20
μｇを得た。
−EtSH−175mM NaCl−10mM MgCl2中Bgl II37.5U,Sal
I175Uを加え、37℃17時間インキュベートし反応停止、
フェノール処理後、DNAをエタノール沈でんさせ、５％
ポリアクリルアミド電気泳動に付した。ゲルから、抽出
を行いhGH−AB部分遺伝子を含む約4.6KbpのDNA断片約20
μｇを得た。
一方 の連鎖からなるBgl II−Sal IリンカーDNA断片を化学合
成した。
成した。
hGH7−AB遺伝子1pmol、リンカーDNA断片10pmolにDNAリ
ガーゼ350U（ベーリンガー・マンハイム）を加えて、20
℃20時間結合反応を行わせた。
ガーゼ350U（ベーリンガー・マンハイム）を加えて、20
℃20時間結合反応を行わせた。
反応停止後、フェノール処理を行い、DNAをエタノール
で沈でんさせた。このうち1/4を用いてE.コリ HB101を
コーエンらの方法で形質転換し、アンピシリン耐性でテ
トラサイクリン感受性を指標にクローニングを行った。
得られた形質転換株、E.コリ HB101 pAB−１をE.コリ
pGH−L9の場合と同様にして培養，溶菌，プラスミド
分離及び精製を行い、pAB−１プラスミド20μｇを得
た。得られたpAB−１プラスミドについてジデオキシ法
によってシーケンシングを行い、これが第１図の物理地
図及び前述した各DNA連鎖部分と一致することを確認し
た。
で沈でんさせた。このうち1/4を用いてE.コリ HB101を
コーエンらの方法で形質転換し、アンピシリン耐性でテ
トラサイクリン感受性を指標にクローニングを行った。
得られた形質転換株、E.コリ HB101 pAB−１をE.コリ
pGH−L9の場合と同様にして培養，溶菌，プラスミド
分離及び精製を行い、pAB−１プラスミド20μｇを得
た。得られたpAB−１プラスミドについてジデオキシ法
によってシーケンシングを行い、これが第１図の物理地
図及び前述した各DNA連鎖部分と一致することを確認し
た。
M9−0.2％ Casamino Acid−0.4％ Glucose−Ap（20
μg/ml）−チアミン（10μg/ml）培地を培地として用
い、対数増殖期の初期にインドールアクリル酸を（40μ
g/ml）になるように加えて、形質転換株E.コリ HB101
pAB−１を23時間通気培養した。
μg/ml）−チアミン（10μg/ml）培地を培地として用
い、対数増殖期の初期にインドールアクリル酸を（40μ
g/ml）になるように加えて、形質転換株E.コリ HB101
pAB−１を23時間通気培養した。
得られた菌体は超音波破砕、遠心分離後、7M尿素を含む
20mM Tris−HCl（pH 7.5）,10mM β−メルカプトエ
タノールロマトグラフィによる精製を行った。
20mM Tris−HCl（pH 7.5）,10mM β−メルカプトエ
タノールロマトグラフィによる精製を行った。
溶出は同一のバッファを用いた。次にDEAE−cellulose
カラムにチャージし、10mM β−メルカプトエタノー
ル、7M尿素を含む20mM Tris−HCl（pH7.5）中、０〜0.
3MのNaClでグラジエンド溶出を行った。高分子量の不純
物については同一バッファ−中Sephadex Ｇ−75カラム
を用いて除去した。
カラムにチャージし、10mM β−メルカプトエタノー
ル、7M尿素を含む20mM Tris−HCl（pH7.5）中、０〜0.
3MのNaClでグラジエンド溶出を行った。高分子量の不純
物については同一バッファ−中Sephadex Ｇ−75カラム
を用いて除去した。
得られたhGH−ABフラクションは10mM炭酸アンモニウム
溶液に対して透析を行った。各精製ステッフでのSDS−P
AGEによる分析結果を第６図に示す。同図中レーンMrは
分子量マーカー、同１は超音波破砕液、同２は遠心分離
で得られる沈澱物の溶解液、同３はSephadex Ｇ−50カ
ラムクロマトグラフィ後のフラクション、同４はDEAE−
celluloseクロマトグラフィ後のフラクション、同５はS
ephadx Ｇ−75カに溶解し、Sephadex Ｇ−50カラムク
ラム後はフラクションを各々示す。またred＋，−はメ
ルカプトエタノールを含む場合及び含まない場合をそれ
ぞれ示す。
溶液に対して透析を行った。各精製ステッフでのSDS−P
AGEによる分析結果を第６図に示す。同図中レーンMrは
分子量マーカー、同１は超音波破砕液、同２は遠心分離
で得られる沈澱物の溶解液、同３はSephadex Ｇ−50カ
ラムクロマトグラフィ後のフラクション、同４はDEAE−
celluloseクロマトグラフィ後のフラクション、同５はS
ephadx Ｇ−75カに溶解し、Sephadex Ｇ−50カラムク
ラム後はフラクションを各々示す。またred＋，−はメ
ルカプトエタノールを含む場合及び含まない場合をそれ
ぞれ示す。
実施例２ このようにして得られたhGH−ABポリペプチドは若干ラ
ビットから得られる軟骨細胞を用いた35S硫酸塩の取り
込み実験においてソマトメジン類似活性を有することが
わかった。
ビットから得られる軟骨細胞を用いた35S硫酸塩の取り
込み実験においてソマトメジン類似活性を有することが
わかった。
このバイオアッセイに用いた細胞は若干ラビットから得
られる軟骨細胞で、0.3％FCSを含むDulbeco′ｓ modif
ied Eagle′ｓ medium（DMEM）中で24hプレインキュ
ベーションした後、試験サンプルおよび0.5μciのH2 35S
O4を加えてさらに24hインキュベーションを行った。プ
ロテオグリカン合成はプロナーゼＥ処理後、塩化セチル
ピリジニウムで沈澱する物質への35SO4 2-の取り込みを
測定することで行った（表２）。
られる軟骨細胞で、0.3％FCSを含むDulbeco′ｓ modif
ied Eagle′ｓ medium（DMEM）中で24hプレインキュ
ベーションした後、試験サンプルおよび0.5μciのH2 35S
O4を加えてさらに24hインキュベーションを行った。プ
ロテオグリカン合成はプロナーゼＥ処理後、塩化セチル
ピリジニウムで沈澱する物質への35SO4 2-の取り込みを
測定することで行った（表２）。
［発明の効果］ hGH−ABポリペプチドはこれまでのソマトメジン類似活
性を有する物質などの場合と異なり発現率も高く抽出・
精製も容易にかつ効率よく行え、骨の成長促進剤として
の幅広い応用が可能となる。
性を有する物質などの場合と異なり発現率も高く抽出・
精製も容易にかつ効率よく行え、骨の成長促進剤として
の幅広い応用が可能となる。
第１図は本発明の骨組織の成長促進剤の有効成分である
hGH−ABポリペプチドを調製するために使用できるプラ
スミドの物理地図を、第２図はこのプラスミドのhGH−A
B遺伝子の両末端部分の塩基配列を、第３図は第１図の
プラスミドを調整するための原料となるプラスミドの物
理地図を、第４図はこの原料プラスミドのhGH遺伝子を
それぞれ示す図であり、第５図は本発明の方法による第
１図のプラスミドの調整を説明する図であり、第６図は
hGH−ABポリペプチドのSDSポリアクリルアミド電気泳動
パターンを示す図である。
hGH−ABポリペプチドを調製するために使用できるプラ
スミドの物理地図を、第２図はこのプラスミドのhGH−A
B遺伝子の両末端部分の塩基配列を、第３図は第１図の
プラスミドを調整するための原料となるプラスミドの物
理地図を、第４図はこの原料プラスミドのhGH遺伝子を
それぞれ示す図であり、第５図は本発明の方法による第
１図のプラスミドの調整を説明する図であり、第６図は
hGH−ABポリペプチドのSDSポリアクリルアミド電気泳動
パターンを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】式 で表わされるアミノ酸連鎖（ただし、Ｎ末端にメチオニ
ン残基が付加されて良い）を持ちソマトメジン様活性を
有するポリペプチド。 - 【請求項２】式 で表わされるDNA配列を有する遺伝子セグメントを発現
可能に保有するプラスミドで形質転換された細菌を栄養
培地に培養してこの遺伝子を発現させ、その遺伝し産物
である、式 で表わされるアミノ酸連鎖（ただし、Ｎ末端にメチオニ
ン残基が付加されて良い）を持ちソマトメジン様活性を
有するポリペプチドを採取することを特徴とするポリペ
プチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61310177A JPH0771508B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | ポリペプチド及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61310177A JPH0771508B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | ポリペプチド及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63167798A JPS63167798A (ja) | 1988-07-11 |
| JPH0771508B2 true JPH0771508B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=18002099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61310177A Expired - Lifetime JPH0771508B2 (ja) | 1986-12-29 | 1986-12-29 | ポリペプチド及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0771508B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341012C (en) * | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| JPS60234584A (ja) * | 1984-05-09 | 1985-11-21 | Morio Ikehara | 組換プラスミド |
-
1986
- 1986-12-29 JP JP61310177A patent/JPH0771508B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63167798A (ja) | 1988-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4745069A (en) | Cloning vectors for expression of exogenous protein | |
| CA1231068A (en) | Cloning vectors for expression of exogenous protein | |
| JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
| JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| JPS60149397A (ja) | インタフエロンの製造方法 | |
| JPS61219395A (ja) | ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途 | |
| KR950001992B1 (ko) | 배양된 세포내에서 바쿨로바이러스 벡터를 이용한 펩타이드의 제조방법 | |
| EP0111389A2 (en) | Substantially pure porcine growth hormone, DNA sequences therefor, and expression vehicles and transfected microorganisms for the production of porcine growth hormone | |
| CN116102663B (zh) | 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用 | |
| CN116120467B (zh) | 含有猴痘病毒e8l抗原的融合蛋白及其制备方法 | |
| EP0147178A2 (en) | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria | |
| AU669713B2 (en) | Constitutive and inducible epidermal vector systems | |
| US5015574A (en) | DNA sequence involved in gene expression and protein secretion, expression-secretion vector including the DNA sequence and the method of producing proteins by using the expression-secretion vector | |
| JPS62278986A (ja) | ハイブリツドポリペプチド | |
| JP2904490B2 (ja) | 組換えポリペプチドの製法 | |
| JPS61501428A (ja) | インタ−ロイキン−２を酵母内で発現するベクタ−、形質転換された酵母及びインタ−ロイキン−２の製造法 | |
| JPH0771508B2 (ja) | ポリペプチド及びその製造方法 | |
| JPH0816120B2 (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチド | |
| JP2549504B2 (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| JPH04502260A (ja) | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ | |
| Ko et al. | Plasmid-directed synthesis of genuine adenovirus 2 early-region 1A and 1B proteins in Escherichia coli | |
| CN116240182B (zh) | 荧光素酶信号肽的应用及含有荧光素酶信号肽的融合蛋白及其制备方法 | |
| Hansen et al. | New approaches to therapy and diagnosis of diabetes | |
| CN115947860B (zh) | 一种重组人促卵泡生成素Fc融合蛋白及制备方法 | |
| CN116768979B (zh) | 一种重组人促卵泡生成素CTP-Fc融合蛋白及制备方法 |