JPH0771510B2 - モノクローナル抗体の作成方法 - Google Patents
モノクローナル抗体の作成方法Info
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- JPH0771510B2 JPH0771510B2 JP3350835A JP35083591A JPH0771510B2 JP H0771510 B2 JPH0771510 B2 JP H0771510B2 JP 3350835 A JP3350835 A JP 3350835A JP 35083591 A JP35083591 A JP 35083591A JP H0771510 B2 JPH0771510 B2 JP H0771510B2
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- JP
- Japan
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- lek
- monoclonal antibody
- dhfr
- cells
- antibody
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素
（以下ＤＨＦＲ）のカルボキシル末端に目的化合物を結
合した複合タンパク質を作成し、それを免疫用抗原とし
て用いることを特徴とするモノクローナル抗体の作成方
法に関するものである。本発明の産業上の利用分野とし
ては、臨床検査及び医薬品製造の分野が上げられる。
（以下ＤＨＦＲ）のカルボキシル末端に目的化合物を結
合した複合タンパク質を作成し、それを免疫用抗原とし
て用いることを特徴とするモノクローナル抗体の作成方
法に関するものである。本発明の産業上の利用分野とし
ては、臨床検査及び医薬品製造の分野が上げられる。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在する微量生理活性物質を特
異的に検出し定量する方法として、抗原−抗体反応にお
ける免疫学的分子認識特性と放射性同位元素の放射能ま
たは酵素活性の高感度検出による定量特性を組み合わせ
た放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が知られている。これら免疫測定法は血清など試料
中の測定対象物質を高感度かつ比較的容易に定量できる
ことから、測定対象物質の数が年々増加の一途をたどっ
ており、臨床検査など医療福祉の分野において一つの産
業を形成しつつある。特にＥＩＡはＲＩＡが法的規制の
ある放射性同位元素を用いなければならない不便さがあ
るのに対し、酵素活性を検出手段に用いるため取扱いが
容易であり、最近はＥＩＡによる測定法が普及しつつあ
る。
異的に検出し定量する方法として、抗原−抗体反応にお
ける免疫学的分子認識特性と放射性同位元素の放射能ま
たは酵素活性の高感度検出による定量特性を組み合わせ
た放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が知られている。これら免疫測定法は血清など試料
中の測定対象物質を高感度かつ比較的容易に定量できる
ことから、測定対象物質の数が年々増加の一途をたどっ
ており、臨床検査など医療福祉の分野において一つの産
業を形成しつつある。特にＥＩＡはＲＩＡが法的規制の
ある放射性同位元素を用いなければならない不便さがあ
るのに対し、酵素活性を検出手段に用いるため取扱いが
容易であり、最近はＥＩＡによる測定法が普及しつつあ
る。
【０００３】モノクローナル抗体とは、１個のＢ細胞ま
たは１個の細胞より分裂によって生じた均一な細胞集団
によって産生された抗体であり、抗原分子の特定の抗原
決定基のみを認識する。また、抗体の特異性のみなら
ず、クラス、サブクラス、親和力などの性質も全く均一
な抗体の集団である。従って、モノクローナル抗体の有
効性は、抗体の均一性に求めることができ、この性質を
利用することにより各種の免疫測定を行うときに、抗体
の不均一性に由来する種々の障害を原理的に取り除くこ
とができるという特徴を有する。
たは１個の細胞より分裂によって生じた均一な細胞集団
によって産生された抗体であり、抗原分子の特定の抗原
決定基のみを認識する。また、抗体の特異性のみなら
ず、クラス、サブクラス、親和力などの性質も全く均一
な抗体の集団である。従って、モノクローナル抗体の有
効性は、抗体の均一性に求めることができ、この性質を
利用することにより各種の免疫測定を行うときに、抗体
の不均一性に由来する種々の障害を原理的に取り除くこ
とができるという特徴を有する。
【０００４】モノクローナル抗体を用いた免疫測定法を
確立する場合、測定対象生理活性分子に対して特異的に
結合するモノクローナル抗体を調製しなければならな
い。一般に、モノクローナル抗体を作成する場合は、免
疫動物を免疫感作し、抗体を産生するようになった動物
の脾臓細胞を取り出し、これをミエローマ細胞などの試
験管内で培養できる細胞と融合した細胞（ハイブリドー
マ）をつくり、スクリーニングして目的のモノクローナ
ル抗体をつくるハイブリドーマを選び出し、得られたハ
イブリドーマを利用して、目的のモノクローナル抗体の
調製を行う。
確立する場合、測定対象生理活性分子に対して特異的に
結合するモノクローナル抗体を調製しなければならな
い。一般に、モノクローナル抗体を作成する場合は、免
疫動物を免疫感作し、抗体を産生するようになった動物
の脾臓細胞を取り出し、これをミエローマ細胞などの試
験管内で培養できる細胞と融合した細胞（ハイブリドー
マ）をつくり、スクリーニングして目的のモノクローナ
ル抗体をつくるハイブリドーマを選び出し、得られたハ
イブリドーマを利用して、目的のモノクローナル抗体の
調製を行う。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】モノクローナル抗体を
作成する場合、種々の問題点が上げられている。
作成する場合、種々の問題点が上げられている。
【０００６】第１は、分子量数千もしくはそれ以下の化
合物は抗原活性が極めて低いことである。そのため一般
には、目的化合物をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の
高分子担体に化学結合させ、抗原活性を高めた複合体を
調製し、それを利用して免疫感作が行われている。しか
しながら、目的化合物の高分子担体への結合には、グル
タルアルデヒドなどの２価性架橋試薬が用いられ、架橋
反応の効率が低いことの他に、架橋反応の結果、高分子
担体に結合した化合物自身の構造が目的とした構造と異
なる可能性が考えられること、また、高分子担体状の結
合部位が特定できないことなど、原理的に避けることが
困難な問題がある。
合物は抗原活性が極めて低いことである。そのため一般
には、目的化合物をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の
高分子担体に化学結合させ、抗原活性を高めた複合体を
調製し、それを利用して免疫感作が行われている。しか
しながら、目的化合物の高分子担体への結合には、グル
タルアルデヒドなどの２価性架橋試薬が用いられ、架橋
反応の効率が低いことの他に、架橋反応の結果、高分子
担体に結合した化合物自身の構造が目的とした構造と異
なる可能性が考えられること、また、高分子担体状の結
合部位が特定できないことなど、原理的に避けることが
困難な問題がある。
【０００７】第２の問題は、目的のモノクローナルをつ
くる特定のハイブリドーマのスクリーニングが煩雑であ
ることである。とくに、目的化合物を結合する高分子担
体に対しても多くの種類の抗体が作られることから目的
化合物に対するモノクローナル抗体の産生をスクリーニ
ングする場合は、免疫感作に用いられた目的化合物を結
合した高分子複合体を用いることができず、免疫感作用
及び抗体検出用の２種類の異なった抗原を準備しなけれ
ばならない。
くる特定のハイブリドーマのスクリーニングが煩雑であ
ることである。とくに、目的化合物を結合する高分子担
体に対しても多くの種類の抗体が作られることから目的
化合物に対するモノクローナル抗体の産生をスクリーニ
ングする場合は、免疫感作に用いられた目的化合物を結
合した高分子複合体を用いることができず、免疫感作用
及び抗体検出用の２種類の異なった抗原を準備しなけれ
ばならない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を本質的に解消する手段に関して鋭意研究を行い、既
に本発明者らが、枯草菌及び大腸菌の２種類のＤＨＦＲ
を用いて、それぞれのカルボキシ末端に目的化合物を効
果的に結合する方法を種々開発していることに着目し
た。すなわち、目的化合物がＤＨＦＲのカルボキシル末
端側に結合した複合タンパク質を作成し、これを用いて
免疫動物を免疫感作すること、及び、免疫感作した複合
ＤＨＦＲと異なり目的化合物を結合したＤＨＦＲもしく
は高分子担体を利用して行うハイブリドーマのスクリー
ニング方法を考案し、上記問題点を解消できることを示
した。
点を本質的に解消する手段に関して鋭意研究を行い、既
に本発明者らが、枯草菌及び大腸菌の２種類のＤＨＦＲ
を用いて、それぞれのカルボキシ末端に目的化合物を効
果的に結合する方法を種々開発していることに着目し
た。すなわち、目的化合物がＤＨＦＲのカルボキシル末
端側に結合した複合タンパク質を作成し、これを用いて
免疫動物を免疫感作すること、及び、免疫感作した複合
ＤＨＦＲと異なり目的化合物を結合したＤＨＦＲもしく
は高分子担体を利用して行うハイブリドーマのスクリー
ニング方法を考案し、上記問題点を解消できることを示
した。
【０００９】即ち、本発明は、抗原性の異なる２種類の
ジヒドロ葉酸還元酵素のそれぞれのカルボキシル末端に
目的の化合物を結合して得られた２種類の複合蛋白質の
うち、一方の複合蛋白質を用いて動物を免疫し、得られ
る免疫細胞と増殖可能な細胞とを融合させ、次いで、他
方の複合蛋白質を用いて前記融合細胞から目的のモノク
ローナル抗体を産生する融合細胞を選出し、得られる融
合細胞からモノクローナル抗体を産生することを特徴と
するモノクローナル抗体の製造方法である。２種類のジ
ヒドロ葉酸還元酵素としては、大腸菌及び枯草菌由来の
ものが挙げられ、増殖可能な細胞としては、マウス骨髄
腫細胞が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
ジヒドロ葉酸還元酵素のそれぞれのカルボキシル末端に
目的の化合物を結合して得られた２種類の複合蛋白質の
うち、一方の複合蛋白質を用いて動物を免疫し、得られ
る免疫細胞と増殖可能な細胞とを融合させ、次いで、他
方の複合蛋白質を用いて前記融合細胞から目的のモノク
ローナル抗体を産生する融合細胞を選出し、得られる融
合細胞からモノクローナル抗体を産生することを特徴と
するモノクローナル抗体の製造方法である。２種類のジ
ヒドロ葉酸還元酵素としては、大腸菌及び枯草菌由来の
ものが挙げられ、増殖可能な細胞としては、マウス骨髄
腫細胞が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明は、（１）目的化合物をカルボキシ
ル末端側に有する複合ＤＨＦＲの作成、及び（２）複合
ＤＨＦＲを用いたモノクローナル抗体の作成により構成
される。
ル末端側に有する複合ＤＨＦＲの作成、及び（２）複合
ＤＨＦＲを用いたモノクローナル抗体の作成により構成
される。
【００１１】目的化合物をカルボキシル末端側に有する
複合ＤＨＦＲの作成は種々の方法で作成できる。
複合ＤＨＦＲの作成は種々の方法で作成できる。
【００１２】目的化合物がペプチドである場合は、遺伝
子工学的に作成することができる。目的ペプチドをカル
ボキシ末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子
工学的手法による作成方法（特許公告平３−６４１１２
号公報、特許公告平３−４９５５９号公報、特許公告平
３−６４１１１号公報）及び目的融合タンパク質の宿主
菌からの精製分離方法（特許公告平３−３３３１５号公
報、特許公告平１−５５５１０８号公報、特許公告平３
−６４６５１７号公報）に関しては、本発明者らによっ
て開発されており、その方法に従うことにより、高度精
製した目的融合タンパク質を入手することができる。な
お、ＤＨＦＲとの融合タンパク質の作成方法は、枯草菌
及び大腸菌由来のＤＨＦＲを用いた方法について公知で
あるが、各種生物由来のＤＨＦＲを用いた場合も可能で
あることを容易に類推することができることから、本発
明は、ＤＨＦＲの起源に限定されない。
子工学的に作成することができる。目的ペプチドをカル
ボキシ末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子
工学的手法による作成方法（特許公告平３−６４１１２
号公報、特許公告平３−４９５５９号公報、特許公告平
３−６４１１１号公報）及び目的融合タンパク質の宿主
菌からの精製分離方法（特許公告平３−３３３１５号公
報、特許公告平１−５５５１０８号公報、特許公告平３
−６４６５１７号公報）に関しては、本発明者らによっ
て開発されており、その方法に従うことにより、高度精
製した目的融合タンパク質を入手することができる。な
お、ＤＨＦＲとの融合タンパク質の作成方法は、枯草菌
及び大腸菌由来のＤＨＦＲを用いた方法について公知で
あるが、各種生物由来のＤＨＦＲを用いた場合も可能で
あることを容易に類推することができることから、本発
明は、ＤＨＦＲの起源に限定されない。
【００１３】融合タンパク質の生成は、目的ペプチドを
暗号化するＤＮＡを合成、もしくは単離し、これを本発
明者らが既に開発している融合タンパク質作成用ベクタ
ーに組み込み、目的融合タンパク質を大腸菌などの宿主
菌体で発現させる。宿主菌体を培養、これから、発現し
た融合タンパク質をＤＨＦＲ活性を目安に高度に精製す
る。目的ペプチドに関しては、大腸菌のＤＨＦＲを用い
た場合、２００アミノ酸程度よりなるプロラクチンとの
融合タンパク質の発現生産に関して成功していることか
ら（特許公開平２−１４２４７９号公報）、任意長さの
ペプチドを用いることができる。
暗号化するＤＮＡを合成、もしくは単離し、これを本発
明者らが既に開発している融合タンパク質作成用ベクタ
ーに組み込み、目的融合タンパク質を大腸菌などの宿主
菌体で発現させる。宿主菌体を培養、これから、発現し
た融合タンパク質をＤＨＦＲ活性を目安に高度に精製す
る。目的ペプチドに関しては、大腸菌のＤＨＦＲを用い
た場合、２００アミノ酸程度よりなるプロラクチンとの
融合タンパク質の発現生産に関して成功していることか
ら（特許公開平２−１４２４７９号公報）、任意長さの
ペプチドを用いることができる。
【００１４】目的化合物が上記に述べた方法で作成でき
ない場合は、ＤＨＦＲのカルボキシル末端にシスティン
残基を導入したＤＨＦＲ（平成３年１１月２６日特許出
願「新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子」）を利用することにより達成できる。
ない場合は、ＤＨＦＲのカルボキシル末端にシスティン
残基を導入したＤＨＦＲ（平成３年１１月２６日特許出
願「新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子」）を利用することにより達成できる。
【００１５】この目的に利用されるＤＨＦＲは、その酵
素タンパク質のカルボキシ末端側にシステイン残基をカ
ルボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るアミノ
酸配列が導入された構造をとる。このＤＨＦＲ中のカル
ボキシ末端のメルカプト基の反応性は高く、中性（ｐＨ
７．０）、室温（１５〜３０℃）での、５，５′‐ジチ
オビス（２‐ニトロ安息香酸）を用いたチオール‐ジス
ルフィド交換反応では迅速に反応し約数分でその反応を
完結することが既に示されている（平成３年１１月２６
日特許出願「新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子」）。従って、目的化合物のチ
オール誘導体を作成した場合、チオール‐ジスルフィド
交換反応を利用することにより、目的化合物をＤＨＦＲ
のカルボキシル末端に結合することが可能である。
素タンパク質のカルボキシ末端側にシステイン残基をカ
ルボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るアミノ
酸配列が導入された構造をとる。このＤＨＦＲ中のカル
ボキシ末端のメルカプト基の反応性は高く、中性（ｐＨ
７．０）、室温（１５〜３０℃）での、５，５′‐ジチ
オビス（２‐ニトロ安息香酸）を用いたチオール‐ジス
ルフィド交換反応では迅速に反応し約数分でその反応を
完結することが既に示されている（平成３年１１月２６
日特許出願「新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子」）。従って、目的化合物のチ
オール誘導体を作成した場合、チオール‐ジスルフィド
交換反応を利用することにより、目的化合物をＤＨＦＲ
のカルボキシル末端に結合することが可能である。
【００１６】更に、チオール（ＳＨ基）の特異的反応と
しては、この他に（Ｉ）金属イオン及び有機水銀化合物
との反応、（ＩＩ）アルキル化反応などが知られており
（参考文献として、例えば「ＳＨ基の化学修飾」石黒正
恒著、学会出版センター、１９７８年）そのような反応
を利用することにより、目的化合物のそれぞれの反応用
誘導体をＤＨＦＲのカルボキシル末端に結合することが
可能である。
しては、この他に（Ｉ）金属イオン及び有機水銀化合物
との反応、（ＩＩ）アルキル化反応などが知られており
（参考文献として、例えば「ＳＨ基の化学修飾」石黒正
恒著、学会出版センター、１９７８年）そのような反応
を利用することにより、目的化合物のそれぞれの反応用
誘導体をＤＨＦＲのカルボキシル末端に結合することが
可能である。
【００１７】上記に述べた方法により作成した複合タン
パク質を用いた免疫動物の免疫感作は、通常に行われる
免疫感作の方法を用いて行うことができる。すなわち、
融合タンパク質をアジュバンドと混合し、日をおいて数
回に分けて注射した後、採血し、血液中から抗体を分離
し、その抗体価を調べることにより行うとができる。
パク質を用いた免疫動物の免疫感作は、通常に行われる
免疫感作の方法を用いて行うことができる。すなわち、
融合タンパク質をアジュバンドと混合し、日をおいて数
回に分けて注射した後、採血し、血液中から抗体を分離
し、その抗体価を調べることにより行うとができる。
【００１８】目的化合物をカルボキシ末端側に有する複
合ＤＨＦＲを免疫感作用抗原として用いることの利点と
しては、ＤＨＦＲ酵素活性を利用することにより高度
に精製することができ、不純物に由来する不用な抗体の
産生誘導を抑えることができる。複合タンパク質が均
一である。化合物の一部がＤＨＦＲのカルボキシ末端
に結合している以外は、その他の構造は目的の構造であ
る。ＤＨＦＲが細菌由来であり、免疫動物との類縁性
が非常に離れていることから、抗体産生に増強効果が期
待できる。などが上げられる。
合ＤＨＦＲを免疫感作用抗原として用いることの利点と
しては、ＤＨＦＲ酵素活性を利用することにより高度
に精製することができ、不純物に由来する不用な抗体の
産生誘導を抑えることができる。複合タンパク質が均
一である。化合物の一部がＤＨＦＲのカルボキシ末端
に結合している以外は、その他の構造は目的の構造であ
る。ＤＨＦＲが細菌由来であり、免疫動物との類縁性
が非常に離れていることから、抗体産生に増強効果が期
待できる。などが上げられる。
【００１９】本発明の実施例では、アミノ酸５残基から
なり種間の特異性がないため抗原活性が極めて弱いロイ
シンエンケファリン（ＬＥＫ）をとりあげ、ＬＥＫ換算
として１．４μｇのごく少量で有効に免疫感作が行われ
ることを示し、本発明が優れていることを示している。
以下に、ＬＥＫを例にとり、本発明のモノクローナル抗
体の作成手順を説明する。ＬＥＫ以外の化合物がカルボ
キシル末端に結合したＤＨＦＲを用いる場合も全く同様
の作成手順を適用できる。
なり種間の特異性がないため抗原活性が極めて弱いロイ
シンエンケファリン（ＬＥＫ）をとりあげ、ＬＥＫ換算
として１．４μｇのごく少量で有効に免疫感作が行われ
ることを示し、本発明が優れていることを示している。
以下に、ＬＥＫを例にとり、本発明のモノクローナル抗
体の作成手順を説明する。ＬＥＫ以外の化合物がカルボ
キシル末端に結合したＤＨＦＲを用いる場合も全く同様
の作成手順を適用できる。
【００２０】免疫感作は、枯草菌由来のＤＨＦＲのカル
ボキシ末端にＬＥＫを連結させた融合タンパク質（ｂｓ
ＤＨＦＲ−ＬＥＫ）を調製し、これを免疫感作用実験動
物としてもちいたＢＡＬＢ／ｃメスマウスにｂｓＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫを0.5 mg/mlの濃度になるように生理食塩水
で希釈した後、等容量の完全フロイントアジュバンド
（１回目）もしくは不完全フロイントアジュバント（２
及び３回目）と混合し、マウス腹腔内に３週間ごと３回
投与することにより行った。最終注射後１４日目には有
効な抗体産生が観察される。
ボキシ末端にＬＥＫを連結させた融合タンパク質（ｂｓ
ＤＨＦＲ−ＬＥＫ）を調製し、これを免疫感作用実験動
物としてもちいたＢＡＬＢ／ｃメスマウスにｂｓＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫを0.5 mg/mlの濃度になるように生理食塩水
で希釈した後、等容量の完全フロイントアジュバンド
（１回目）もしくは不完全フロイントアジュバント（２
及び３回目）と混合し、マウス腹腔内に３週間ごと３回
投与することにより行った。最終注射後１４日目には有
効な抗体産生が観察される。
【００２１】抗体産生は、マウス尾静脈から採血し、血
清を分離し、これを固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により力価を測定することにより行うことができる。本
実施例では、以下の方法を用いたが、ＥＬＩＳＡの方法
およびそれに用いられるＬＥＫを固定化したタンパク質
によって本発明は制限されない。
清を分離し、これを固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により力価を測定することにより行うことができる。本
実施例では、以下の方法を用いたが、ＥＬＩＳＡの方法
およびそれに用いられるＬＥＫを固定化したタンパク質
によって本発明は制限されない。
【００２２】力価測定用高分子結合抗原としては、大腸
菌由来のＤＨＦＲのカルボキシル末端にＬＥＫを連結さ
せた融合タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫ）を用いる
ことができる。ｂｓ−ＤＨＦＲとｅｃ−ＤＨＦＲの抗原
性は互いに異なり、ｂｓ−ＤＨＦＲを免疫感作して作ら
れる抗体はｅｃ−ＤＨＦＲを認識できないことから、Ｌ
ＥＫ部分に対してのみの抗体を特異的に検出できる。
菌由来のＤＨＦＲのカルボキシル末端にＬＥＫを連結さ
せた融合タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫ）を用いる
ことができる。ｂｓ−ＤＨＦＲとｅｃ−ＤＨＦＲの抗原
性は互いに異なり、ｂｓ−ＤＨＦＲを免疫感作して作ら
れる抗体はｅｃ−ＤＨＦＲを認識できないことから、Ｌ
ＥＫ部分に対してのみの抗体を特異的に検出できる。
【００２３】ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫを免疫感作した時の
ＬＥＫ抗体の力価測定を以下の方法で行う。ｅｃＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫを、0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液 pH9.5で 1
-10μg/mlの濃度に希釈する。これを、ＥＬＩＳＡ用の
市販の96穴マイクロプレートにウェル当り 50μlずつ分
注し、２時間以上４℃で静置し、ウェルに吸着させる。
水で３回洗浄後 0.5%BSA-0.025M EDTA- 0.15M NaCl-10m
M リン酸緩衝液pH7.5(BEPBS)でウェルを満たし１時間以
上室温で静置する。続いて 0.05% Tween 20-0.15 M NaC
l-10mM リン酸緩衝液 pH7.5（TPBS）と水で３回ずつプ
レートを洗浄した後よく水を切って -20 ℃で使用直前
まで保存する。測定する血清を 1ウェル当り50μl ずつ
タンパク質固定化プレートに分注し、１時間室温で反応
後TPBSと水で３回ずつ洗浄した後、50μl ずつ400倍に
0.05%Tween 20-BEPBS (TBPBS)で希釈した西洋わさびペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体溶液を分
注する。続いて１時間室温で静置後同様にプレートを洗
浄しよく水を切った後、50μl ずつ各ウェルに0.25mg/m
l ABTS(2,2'-アシ゛ノ-ヒ゛ス(3-エチルヘ゛ンソ゛チアソ゛リン-6-スルホン酸)-0.
0025%H2O2-0.1M クエン酸緩衝液（pH4.2）を加え発色
反応を行なう。反応は0.5%のSDS水溶液 150μl を加え
ることで停止させ、405nm の吸収増加をコロナ社のマイ
クロプレートリーダーで測定し、プレートに残存してい
るマウスガンマグロブリンを定量する。この方法によ
り、ＬＥＫに対する抗体のみを検出でき、ＬＥＫ部分に
対して動物が免疫感作されているかを知ることができ
る。なお、ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫで免疫感作する場合、
ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫを用いて同様に行うことができ
る。
ＬＥＫ抗体の力価測定を以下の方法で行う。ｅｃＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫを、0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液 pH9.5で 1
-10μg/mlの濃度に希釈する。これを、ＥＬＩＳＡ用の
市販の96穴マイクロプレートにウェル当り 50μlずつ分
注し、２時間以上４℃で静置し、ウェルに吸着させる。
水で３回洗浄後 0.5%BSA-0.025M EDTA- 0.15M NaCl-10m
M リン酸緩衝液pH7.5(BEPBS)でウェルを満たし１時間以
上室温で静置する。続いて 0.05% Tween 20-0.15 M NaC
l-10mM リン酸緩衝液 pH7.5（TPBS）と水で３回ずつプ
レートを洗浄した後よく水を切って -20 ℃で使用直前
まで保存する。測定する血清を 1ウェル当り50μl ずつ
タンパク質固定化プレートに分注し、１時間室温で反応
後TPBSと水で３回ずつ洗浄した後、50μl ずつ400倍に
0.05%Tween 20-BEPBS (TBPBS)で希釈した西洋わさびペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体溶液を分
注する。続いて１時間室温で静置後同様にプレートを洗
浄しよく水を切った後、50μl ずつ各ウェルに0.25mg/m
l ABTS(2,2'-アシ゛ノ-ヒ゛ス(3-エチルヘ゛ンソ゛チアソ゛リン-6-スルホン酸)-0.
0025%H2O2-0.1M クエン酸緩衝液（pH4.2）を加え発色
反応を行なう。反応は0.5%のSDS水溶液 150μl を加え
ることで停止させ、405nm の吸収増加をコロナ社のマイ
クロプレートリーダーで測定し、プレートに残存してい
るマウスガンマグロブリンを定量する。この方法によ
り、ＬＥＫに対する抗体のみを検出でき、ＬＥＫ部分に
対して動物が免疫感作されているかを知ることができ
る。なお、ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫで免疫感作する場合、
ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫを用いて同様に行うことができ
る。
【００２４】ハイブリドーマの作成は、細胞融合はKohl
erとMilsteinの方法に従って行うことができる。実施例
では、３回目の免疫感作を行ったマウスのうちＥＬＩＳ
Ａで抗ＬＥＫ活性が強く検出された１匹について、３回
目の感作後３週間目に尾静脈内に17μg のＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫを含む生理食塩水0.1mlを注射し免疫系を刺激した
後４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は分散化した脾臓
細胞とマウス骨髄種細胞ｘ63・Ag8・653株とを5:1の割合
で混合し、50 % PEG-RPMI 1ml中で細胞融合を行った。
融合後細胞分散液は 695個のウェルに100μlずつ分注し
RPMI-HAT-15%FCS培地でハイブリドーマの選択を行っ
た。ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行った。
erとMilsteinの方法に従って行うことができる。実施例
では、３回目の免疫感作を行ったマウスのうちＥＬＩＳ
Ａで抗ＬＥＫ活性が強く検出された１匹について、３回
目の感作後３週間目に尾静脈内に17μg のＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫを含む生理食塩水0.1mlを注射し免疫系を刺激した
後４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は分散化した脾臓
細胞とマウス骨髄種細胞ｘ63・Ag8・653株とを5:1の割合
で混合し、50 % PEG-RPMI 1ml中で細胞融合を行った。
融合後細胞分散液は 695個のウェルに100μlずつ分注し
RPMI-HAT-15%FCS培地でハイブリドーマの選択を行っ
た。ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行った。
【００２５】クローニングしたハイブリドーマがＬＥＫ
に対する抗体を産生しているかの有無は、ｅｃＤＨＦＲ
−ＬＥＫを固定化した上記ＥＬＩＳＡに準じて行なう。
ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫをウェルに吸着させ、３回洗浄
後、測定するものとして、ハイブリドーマの細胞培養液
を用いる。
に対する抗体を産生しているかの有無は、ｅｃＤＨＦＲ
−ＬＥＫを固定化した上記ＥＬＩＳＡに準じて行なう。
ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫをウェルに吸着させ、３回洗浄
後、測定するものとして、ハイブリドーマの細胞培養液
を用いる。
【００２６】モノクローナル抗体のグロブリンクラス同
定に用いたＥＬＩＳＡは、ザイメッド社の免疫グロブリ
ンクラス同定用抗体キットを用い処方に従って行なうこ
とができる。また、抗ＬＥＫモノクローナル抗体のＬＥ
Ｋ認識部位を調べるために行った各種ペプチドに対する
免疫交差活性測定のためのＥＬＩＳＡは以下のように行
なう。ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク質100μg/ml
で固定化処理したマイクロプレートの各ウェルに、20μ
g/mlの抗ＬＥＫモノクローナル抗体50μlとTBPBSで段階
希釈した濃度のペプチド溶液50μlを分注し、２時間室
温で反応後、TPBSと水でプレート洗浄を行い、西洋わさ
びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体溶液
を用い前述のごとくプレートに残存した抗ＬＥＫモノク
ローナル抗体量を発色定量する。本発明の実施例では、
最終的に、２種類のＬＥＫに対するモノクローナル抗体
が得られ、本発明の方法が有効であることが確かめられ
た。
定に用いたＥＬＩＳＡは、ザイメッド社の免疫グロブリ
ンクラス同定用抗体キットを用い処方に従って行なうこ
とができる。また、抗ＬＥＫモノクローナル抗体のＬＥ
Ｋ認識部位を調べるために行った各種ペプチドに対する
免疫交差活性測定のためのＥＬＩＳＡは以下のように行
なう。ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク質100μg/ml
で固定化処理したマイクロプレートの各ウェルに、20μ
g/mlの抗ＬＥＫモノクローナル抗体50μlとTBPBSで段階
希釈した濃度のペプチド溶液50μlを分注し、２時間室
温で反応後、TPBSと水でプレート洗浄を行い、西洋わさ
びペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体溶液
を用い前述のごとくプレートに残存した抗ＬＥＫモノク
ローナル抗体量を発色定量する。本発明の実施例では、
最終的に、２種類のＬＥＫに対するモノクローナル抗体
が得られ、本発明の方法が有効であることが確かめられ
た。
【００２７】
【実施例】次に本発明の実施例をしめす。 実施例１ ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク質の調製 枯草菌または大腸菌のＤＨＦＲの遺伝子にＬＥＫを暗号
化した遺伝子を連結させて作製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ遺
伝子を有するプラスミドを含有する大腸菌を遺伝子操作
により調製した（特許公告平１−４８７５４、特許公告
平３−５５１０８）。これら大腸菌についてそれぞれ液
体培養を行い、得られた菌体を超音波処理、ＤＥＡＥ−
トヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラフィー及び
トヨパールＨＷ５５ゲルクロマトグラフィーでＤＨＦＲ
−ＬＥＫタンパク質分画を精製純化し、ＳＤＳ電気泳動
で均一なバンドを示す枯草菌及び大腸菌ＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ融合タンパク質を得た。
化した遺伝子を連結させて作製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ遺
伝子を有するプラスミドを含有する大腸菌を遺伝子操作
により調製した（特許公告平１−４８７５４、特許公告
平３−５５１０８）。これら大腸菌についてそれぞれ液
体培養を行い、得られた菌体を超音波処理、ＤＥＡＥ−
トヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラフィー及び
トヨパールＨＷ５５ゲルクロマトグラフィーでＤＨＦＲ
−ＬＥＫタンパク質分画を精製純化し、ＳＤＳ電気泳動
で均一なバンドを示す枯草菌及び大腸菌ＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ融合タンパク質を得た。
【００２８】実施例２ ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タン
パク質の免疫感作 マウス１匹当りｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ50μg投与群３匹
と10μg投与群３匹の３回免疫感作後の血清を分離しそ
の抗体価を測定した。ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫをプレート
に固定化して行ったＥＬＩＳＡでは血清中の抗体価に両
群の差はみられなかったが、ＬＥＫをＢＳＡにグルタル
アルデヒド法で結合させて調製したＢＳＡ−ＬＥＫに対
しては50μg投与群のマウス２匹の血清にのみＬＥＫ結
合活性の存在が認められた。このことは１）ｂｓＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫの３回投与により抗ＬＥＫ抗体を発現させる
ためにはｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ 50μg（ＬＥＫ含量：
約1.4μg） をマウスに投与すれば、ＤＨＦＲ１分子に
１分子のＬＥＫが結合した融合タンパク質でもＬＥＫに
対する抗体の産生を惹起できること。２）ＤＨＦＲはカ
ルボキシル末端に遺伝子操作で元来抗原活性のない低分
子量ペプチドを結合させることにより抗原性を付与でき
る有用な担体になりうることを示唆している。
パク質の免疫感作 マウス１匹当りｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ50μg投与群３匹
と10μg投与群３匹の３回免疫感作後の血清を分離しそ
の抗体価を測定した。ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫをプレート
に固定化して行ったＥＬＩＳＡでは血清中の抗体価に両
群の差はみられなかったが、ＬＥＫをＢＳＡにグルタル
アルデヒド法で結合させて調製したＢＳＡ−ＬＥＫに対
しては50μg投与群のマウス２匹の血清にのみＬＥＫ結
合活性の存在が認められた。このことは１）ｂｓＤＨＦ
Ｒ−ＬＥＫの３回投与により抗ＬＥＫ抗体を発現させる
ためにはｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ 50μg（ＬＥＫ含量：
約1.4μg） をマウスに投与すれば、ＤＨＦＲ１分子に
１分子のＬＥＫが結合した融合タンパク質でもＬＥＫに
対する抗体の産生を惹起できること。２）ＤＨＦＲはカ
ルボキシル末端に遺伝子操作で元来抗原活性のない低分
子量ペプチドを結合させることにより抗原性を付与でき
る有用な担体になりうることを示唆している。
【００２９】実施例３ 抗体産生ハイブリドーマ細胞の
調製 ３回目の免疫感作を行ったマウスのうちＥＬＩＳＡで抗
ＬＥＫ活性が強く検出された１匹について、３回目の感
作後３週間目に尾静脈内に17μg のｂｃＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋを含む生理食塩水0.1mlを注射し免疫系を刺激した後
４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は分散化した脾臓細
胞とマウス骨髄種細胞ｘ63・Ag8・653株とを5:1の割合で
混合し、50 % PEG-RPMI 1ml中で細胞融合を行った。融
合後細胞分散液は 695個のウェルに100μlずつ分注しRP
MI-HAT-15%FCS培地でハイブリドーマの選択を行った。
ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行った。695
個のウェルに分散させた細胞分散液より、ＨＡＴ選択に
より146個のウェルでハイブリドーマによるコロニーの
形成が観察された。ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫを96穴マイク
ロプレートに固定化して行ったＥＬＩＳＡの結果146個
のウェルのうち11個のウェルの培養液にｂｓＤＨＦＲ−
ＬＥＫ結合活性が認められた。これらのウェルについて
クローニングを行いハイブリドーマを純化して得た10株
について、ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫでプレートを固定化し
て行ったＥＬＩＳＡにより 3株（NO.36，NO.74, NO.11
3）がＬＥＫに対して抗体結合活性を有していることが
判明した。このことはＤＨＦＲが抗ＬＥＫ抗体調製用担
体として有用であることを裏付けている。
調製 ３回目の免疫感作を行ったマウスのうちＥＬＩＳＡで抗
ＬＥＫ活性が強く検出された１匹について、３回目の感
作後３週間目に尾静脈内に17μg のｂｃＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋを含む生理食塩水0.1mlを注射し免疫系を刺激した後
４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は分散化した脾臓細
胞とマウス骨髄種細胞ｘ63・Ag8・653株とを5:1の割合で
混合し、50 % PEG-RPMI 1ml中で細胞融合を行った。融
合後細胞分散液は 695個のウェルに100μlずつ分注しRP
MI-HAT-15%FCS培地でハイブリドーマの選択を行った。
ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行った。695
個のウェルに分散させた細胞分散液より、ＨＡＴ選択に
より146個のウェルでハイブリドーマによるコロニーの
形成が観察された。ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫを96穴マイク
ロプレートに固定化して行ったＥＬＩＳＡの結果146個
のウェルのうち11個のウェルの培養液にｂｓＤＨＦＲ−
ＬＥＫ結合活性が認められた。これらのウェルについて
クローニングを行いハイブリドーマを純化して得た10株
について、ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫでプレートを固定化し
て行ったＥＬＩＳＡにより 3株（NO.36，NO.74, NO.11
3）がＬＥＫに対して抗体結合活性を有していることが
判明した。このことはＤＨＦＲが抗ＬＥＫ抗体調製用担
体として有用であることを裏付けている。
【００３０】実施例４ 得られたモノクローナル抗体の
サブクラスの同定。 ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ結合活性が認められた10株（ｅｃ
ＤＨＦＲ−ＬＥＫとの結合活性を示した３株を含む）に
ついて、産生しているガンマグロブィンクラス同定のた
めにＥＬＩＳＡで判別したところ、10株のうち 7株がIg
G1кタイプであること、残り 3株がIgMを産生している
ことがわかった。
サブクラスの同定。 ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ結合活性が認められた10株（ｅｃ
ＤＨＦＲ−ＬＥＫとの結合活性を示した３株を含む）に
ついて、産生しているガンマグロブィンクラス同定のた
めにＥＬＩＳＡで判別したところ、10株のうち 7株がIg
G1кタイプであること、残り 3株がIgMを産生している
ことがわかった。
【００３１】 実施例５ 得られたモノクローナル抗体、ｂｓＤＨＦＲ
−ＬＥＫ−３６及び−７４抗体、の免疫交差活性 ＬＥＫの対するモノクローナル抗体の免疫交差性を調べ
るため種々のペプチド及びタンパク質についてＥＬＩＳ
Ａを行った。その結果、ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ−３６及
び−７４抗体は、ＬＥＫに対し１０−７Ｍから１０−４
Ｍの濃度範囲で用量反応曲線を示し、ＩＣ５０はそれぞ
れ３．７４×１０−６Ｍ及び４．６６×１０−６Ｍであ
った。なおｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ−Ｎｏ．１１３抗体に
ついては検討していない。このことはｂｓＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫを用いた定量用ＥＬＩＳＡの可能性を示唆してい
る。両抗体の主要なＬＥＫ認識部位は、両抗体がロイシ
ンの代わりにメチオニンをカルボキシル末端に持つメチ
オニンエンケファリンに対して弱い免疫交差活性を示し
た一方、ＬＥＫ−ＮＨ２やアミノ末端側にＬＥＫのアミ
ノ酸配列を有するα−ｎｅｏｅｎｄｒｏｐｈｉｎに対し
て全く交差活性を示さなかったことから、カルボキシル
末端側にあるロイシン残基の側鎖部分及びカルボキシル
基であることが示された。また、両抗体はＤ−，Ｌ−ロ
イシン及びＤ−Ａｌａ２，Ｄ−Ｌｅｕ５−ｅｎｋｅｐｈ
ａｌｉｎに対しても交差活性を示さなかったのは、ロイ
シン残基の不斉性を認識しているとともにＬＥＫの他の
部位にも認識部位が存在していることを示唆している。
このことは１位のチロシン残基をスルホン化したＴｙｒ
（Ｓｕｌ）１−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎに対する交差活性
が両抗体で異なっていたことからも支持される。さら
に、ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫに対して免疫交差活性を示し
た反面、ＬＥＫをカルボキシル末端に結合していないｂ
ｓＤＨＦＲもしくはｅｃＤＨＦＲとは反応しなかったこ
とから、両抗体はｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫのＬＥＫ部分を
特異的に認識している抗体であることが明らかになっ
た。
−ＬＥＫ−３６及び−７４抗体、の免疫交差活性 ＬＥＫの対するモノクローナル抗体の免疫交差性を調べ
るため種々のペプチド及びタンパク質についてＥＬＩＳ
Ａを行った。その結果、ｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ−３６及
び−７４抗体は、ＬＥＫに対し１０−７Ｍから１０−４
Ｍの濃度範囲で用量反応曲線を示し、ＩＣ５０はそれぞ
れ３．７４×１０−６Ｍ及び４．６６×１０−６Ｍであ
った。なおｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫ−Ｎｏ．１１３抗体に
ついては検討していない。このことはｂｓＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫを用いた定量用ＥＬＩＳＡの可能性を示唆してい
る。両抗体の主要なＬＥＫ認識部位は、両抗体がロイシ
ンの代わりにメチオニンをカルボキシル末端に持つメチ
オニンエンケファリンに対して弱い免疫交差活性を示し
た一方、ＬＥＫ−ＮＨ２やアミノ末端側にＬＥＫのアミ
ノ酸配列を有するα−ｎｅｏｅｎｄｒｏｐｈｉｎに対し
て全く交差活性を示さなかったことから、カルボキシル
末端側にあるロイシン残基の側鎖部分及びカルボキシル
基であることが示された。また、両抗体はＤ−，Ｌ−ロ
イシン及びＤ−Ａｌａ２，Ｄ−Ｌｅｕ５−ｅｎｋｅｐｈ
ａｌｉｎに対しても交差活性を示さなかったのは、ロイ
シン残基の不斉性を認識しているとともにＬＥＫの他の
部位にも認識部位が存在していることを示唆している。
このことは１位のチロシン残基をスルホン化したＴｙｒ
（Ｓｕｌ）１−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎに対する交差活性
が両抗体で異なっていたことからも支持される。さら
に、ｅｃＤＨＦＲ−ＬＥＫに対して免疫交差活性を示し
た反面、ＬＥＫをカルボキシル末端に結合していないｂ
ｓＤＨＦＲもしくはｅｃＤＨＦＲとは反応しなかったこ
とから、両抗体はｂｓＤＨＦＲ−ＬＥＫのＬＥＫ部分を
特異的に認識している抗体であることが明らかになっ
た。
【発明の効果】本発明に従えば、抗原活性の極めて低い
化合物に対するモノクローナル抗体の作成を簡単に行う
ことができる。すなわち、動物の免疫に用いる複合蛋白
質と融合細胞のスクリーニングに用いる複合蛋白質とを
変えることによって、免疫感作に用いた目的化合物に結
合するＤＨＦＲに対して多くの種類の抗体が作られてし
まうことに起因するスクリーニングの煩雑さを解消する
ことができる。また、このことは、モノクローナル抗体
を用いた種々の分析に貢献することが大である。
化合物に対するモノクローナル抗体の作成を簡単に行う
ことができる。すなわち、動物の免疫に用いる複合蛋白
質と融合細胞のスクリーニングに用いる複合蛋白質とを
変えることによって、免疫感作に用いた目的化合物に結
合するＤＨＦＲに対して多くの種類の抗体が作られてし
まうことに起因するスクリーニングの煩雑さを解消する
ことができる。また、このことは、モノクローナル抗体
を用いた種々の分析に貢献することが大である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 16/44 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】 抗原性の異なる２種類のジヒドロ葉酸還
元酵素のそれぞれのカルボキシル末端に目的の化合物を
結合して得られた２種類の複合蛋白質のうち、一方の複
合蛋白質を用いて動物を免疫し、得られる免疫細胞と増
殖可能な細胞とを融合させ、次いで、他方の複合蛋白質
を用いて前記融合細胞から目的のモノクローナル抗体を
産生する融合細胞を選出し、得られる融合細胞からモノ
クローナル抗体を産生することを特徴とするモノクロー
ナル抗体の製造方法。 - 【請求項２】 ２種類のジヒドロ葉酸還元酵素が大腸菌
及び枯草菌由来のものである、請求項１記載のモノクロ
ーナル抗体の製造方法。 - 【請求項３】 増殖可能な細胞がマウス骨髄腫細胞であ
る、請求項１記載のモノクローナル抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3350835A JPH0771510B2 (ja) | 1991-12-11 | 1991-12-11 | モノクローナル抗体の作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3350835A JPH0771510B2 (ja) | 1991-12-11 | 1991-12-11 | モノクローナル抗体の作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05236990A JPH05236990A (ja) | 1993-09-17 |
| JPH0771510B2 true JPH0771510B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=18413210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3350835A Expired - Lifetime JPH0771510B2 (ja) | 1991-12-11 | 1991-12-11 | モノクローナル抗体の作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0771510B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6726647B1 (en) | 1998-10-23 | 2004-04-27 | Gambro Ab | Method and device for measuring access flow |
| EP1590018B1 (en) | 2003-01-28 | 2012-09-26 | Gambro Lundia AB | An apparatus for monitoring a vascular access of a patient |
-
1991
- 1991-12-11 JP JP3350835A patent/JPH0771510B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＥＵＲＯＰＥＡＮＪＯＵＲＮＡＬＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，２０〜４！（１９９０）Ｐ．８１９−８２４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05236990A (ja) | 1993-09-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |