JPH0773505B2 - 誘発性プロモーターの制御下にある組換ｄｎａの表現法 - Google Patents
誘発性プロモーターの制御下にある組換ｄｎａの表現法Info
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- JPH0773505B2 JPH0773505B2 JP63179292A JP17929288A JPH0773505B2 JP H0773505 B2 JPH0773505 B2 JP H0773505B2 JP 63179292 A JP63179292 A JP 63179292A JP 17929288 A JP17929288 A JP 17929288A JP H0773505 B2 JPH0773505 B2 JP H0773505B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は誘発性プロモーターの制御下にある組換えDNA
を好適な宿主細胞中で表現するための方法に関する。
を好適な宿主細胞中で表現するための方法に関する。
従来技術 組換DNA−操作により蛋白質の生成における多くの問題
は解決したか、又は著しく容易になつた。この操作にお
いては所望の蛋白質に関してコードするDNA−配列み遺
伝子）を表現ベクター中に挿入し、かつ蛋白質表現を制
御配列、特にプロモーターを介して制御する。
は解決したか、又は著しく容易になつた。この操作にお
いては所望の蛋白質に関してコードするDNA−配列み遺
伝子）を表現ベクター中に挿入し、かつ蛋白質表現を制
御配列、特にプロモーターを介して制御する。
それを用いて同種及び異種蛋白質を高い収率で得ること
のできる特に好適なプロモーターは一般に高く、かつ同
時に制御可能な活性を示す。この種のプロモーターは大
腸菌（E.coli）に関しては天然プロモーター、ハイブリ
ツドプロモーター及びバクテリオフアージプロモータ
ー、例えばlac−、lacuv5−、trp−、tac−、trc−、ra
c−、phoA−、mgl−、λ−PL−、λ−PR−、T5−、T7−
及びSP6−プロモーターである。
のできる特に好適なプロモーターは一般に高く、かつ同
時に制御可能な活性を示す。この種のプロモーターは大
腸菌（E.coli）に関しては天然プロモーター、ハイブリ
ツドプロモーター及びバクテリオフアージプロモータ
ー、例えばlac−、lacuv5−、trp−、tac−、trc−、ra
c−、phoA−、mgl−、λ−PL−、λ−PR−、T5−、T7−
及びSP6−プロモーターである。
このプロモーターの活性は例えば誘発性物質（基質、気
質類似物質）、温度又は利用可能なバクテリオフアージ
−RNA−ポリメラーゼの量により制御される。こうし
て、例えば異種蛋白質は、例えば表現ベクターのために
宿主として使用した微生物の成長期ではなく、発酵の一
定期間のみ表現されることが可能である。この異種蛋白
質が宿主細胞にとつて毒性である場合、この種の制御は
特に有利である。大腸菌のような宿主中での異種蛋白質
の表現のためには、特に、この蛋白質が大腸菌に毒性で
ある場合には、通常プロモーターが抑圧された状態で存
在する成長期の後、好適な誘発物質をプロモーターの完
全な活性化のために添加するというように実施する。プ
ロモーター、従つて異種蛋白質の表現はしばしば好適に
高い細胞密度（バイオマス）の達せられた後宿主細胞の
後期対数的〜初期静止成長期において生産される（Mitz
ukaie等著、Biotech.Lett.第８巻、1986年、第611〜614
頁）。lac−、lacuv5−、tac−、trc−及びrac−プロモ
ーターを使用する場合、誘発物質として、例えばイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を濃度約1m
M（Miller,著、Experiments in Molecular Genetics、C
old Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,N
ew York,1972年）で添加する。高められたlac−リプレ
ツサー合成（lac Iq）を有する菌株中でのlac−オペレ
イター−制御下にある蛋白質の表現は上昇する誘発物質
濃度（IPTG:0.2及び20mM）と共に上昇する（Luck等、DN
A、第５巻、1986年、第21〜28頁）。トリプトフアンに
よるtrp−プロモーターのリプレツシヨンはコリプレツ
サーであるトリプトフアンの除去により（トリプトフア
ン不含培地）及び／又は20〜50mg/の濃度の3,β−イ
ンドリルアクリル酸（IAA）での誘発により中断する（s
mith等著、Gene第32巻、1984年、第321〜327頁;Mostell
er等著、Symp.Quant.Biol.第35巻、1970年、第461〜466
頁）。
質類似物質）、温度又は利用可能なバクテリオフアージ
−RNA−ポリメラーゼの量により制御される。こうし
て、例えば異種蛋白質は、例えば表現ベクターのために
宿主として使用した微生物の成長期ではなく、発酵の一
定期間のみ表現されることが可能である。この異種蛋白
質が宿主細胞にとつて毒性である場合、この種の制御は
特に有利である。大腸菌のような宿主中での異種蛋白質
の表現のためには、特に、この蛋白質が大腸菌に毒性で
ある場合には、通常プロモーターが抑圧された状態で存
在する成長期の後、好適な誘発物質をプロモーターの完
全な活性化のために添加するというように実施する。プ
ロモーター、従つて異種蛋白質の表現はしばしば好適に
高い細胞密度（バイオマス）の達せられた後宿主細胞の
後期対数的〜初期静止成長期において生産される（Mitz
ukaie等著、Biotech.Lett.第８巻、1986年、第611〜614
頁）。lac−、lacuv5−、tac−、trc−及びrac−プロモ
ーターを使用する場合、誘発物質として、例えばイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を濃度約1m
M（Miller,著、Experiments in Molecular Genetics、C
old Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,N
ew York,1972年）で添加する。高められたlac−リプレ
ツサー合成（lac Iq）を有する菌株中でのlac−オペレ
イター−制御下にある蛋白質の表現は上昇する誘発物質
濃度（IPTG:0.2及び20mM）と共に上昇する（Luck等、DN
A、第５巻、1986年、第21〜28頁）。トリプトフアンに
よるtrp−プロモーターのリプレツシヨンはコリプレツ
サーであるトリプトフアンの除去により（トリプトフア
ン不含培地）及び／又は20〜50mg/の濃度の3,β−イ
ンドリルアクリル酸（IAA）での誘発により中断する（s
mith等著、Gene第32巻、1984年、第321〜327頁;Mostell
er等著、Symp.Quant.Biol.第35巻、1970年、第461〜466
頁）。
しかしながら、この方法がすべての同種及び異種蛋白質
に関して所望の特性、例えば、溶解性、天然の形及び場
合により生物学的活性を有する蛋白質の十分な量に導び
かないということが示された。多くの酵素的活性蛋白
質、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、
クロランフエニコールアセチルトランスフエラーゼ、
（CAT）クレアチナーゼ、ペニシリナシクラーゼに関し
ては大腸菌中での表現により溶解性及び高い酵素活性が
得られるが、他の蛋白質においては同じ条件及び同じプ
ロモーターの適用下に非常に僅かな量の蛋白質もしくは
非溶解性蛋白質又は生物学的に非活性の生成物が表現さ
れる。この種の効果は例えばα−グルコシダーゼ、プロ
キシモン、抗体の重い鎖及び軽い鎖、イムノグロブリ
ン、ウロキナーゼ、ｔ−PA、インターフエロン、成長ホ
ルモン、β−ガラクトシダーゼとHIV−抗原とからの融
合蛋白質もしくは人インシュリン−ポリペプチドにおい
て観察される（Marston著、Biochem.J.、第240巻、1986
年、第１〜12頁）。
に関して所望の特性、例えば、溶解性、天然の形及び場
合により生物学的活性を有する蛋白質の十分な量に導び
かないということが示された。多くの酵素的活性蛋白
質、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、
クロランフエニコールアセチルトランスフエラーゼ、
（CAT）クレアチナーゼ、ペニシリナシクラーゼに関し
ては大腸菌中での表現により溶解性及び高い酵素活性が
得られるが、他の蛋白質においては同じ条件及び同じプ
ロモーターの適用下に非常に僅かな量の蛋白質もしくは
非溶解性蛋白質又は生物学的に非活性の生成物が表現さ
れる。この種の効果は例えばα−グルコシダーゼ、プロ
キシモン、抗体の重い鎖及び軽い鎖、イムノグロブリ
ン、ウロキナーゼ、ｔ−PA、インターフエロン、成長ホ
ルモン、β−ガラクトシダーゼとHIV−抗原とからの融
合蛋白質もしくは人インシュリン−ポリペプチドにおい
て観察される（Marston著、Biochem.J.、第240巻、1986
年、第１〜12頁）。
これらの蛋白質が相応する細胞抽出物中に多量に存在し
ていても、不溶性であり、又は／かく全く生物学的活性
を示さないということが示された。
ていても、不溶性であり、又は／かく全く生物学的活性
を示さないということが示された。
溶解性で、特に活性の蛋白質の大腸菌中での僅かな表現
の原因としては、例えば外来蛋白質の不応体（封入
体）、すなわち不溶性蛋白質凝集体への変性、並びに細
胞自体のプロテアーゼによる外来遺伝子生成物の蛋白質
分解が挙げられる（Carrievrs等著、Trends in Biotech
nology第１巻（1983年）、第109〜113頁）。この困難を
除くために、ミツカミー（Mitzukamie）等（Biotech.Le
tt.第８巻、1986年、第605〜610頁）はtrp−プロモータ
ーの制御下に大腸菌中でのインターフエロン−βの表現
のために、発酵を20℃で実施することを提案する、それ
というのもこの温度で活性IFN−βの収率は上昇するた
めである。しかしながら、この方法の欠点は、この処置
が報いられるような活性を得るためには、少なくとも４
日間の発酵時間が必要とされることである。
の原因としては、例えば外来蛋白質の不応体（封入
体）、すなわち不溶性蛋白質凝集体への変性、並びに細
胞自体のプロテアーゼによる外来遺伝子生成物の蛋白質
分解が挙げられる（Carrievrs等著、Trends in Biotech
nology第１巻（1983年）、第109〜113頁）。この困難を
除くために、ミツカミー（Mitzukamie）等（Biotech.Le
tt.第８巻、1986年、第605〜610頁）はtrp−プロモータ
ーの制御下に大腸菌中でのインターフエロン−βの表現
のために、発酵を20℃で実施することを提案する、それ
というのもこの温度で活性IFN−βの収率は上昇するた
めである。しかしながら、この方法の欠点は、この処置
が報いられるような活性を得るためには、少なくとも４
日間の発酵時間が必要とされることである。
更に、遺伝子生成物の分解に関与する蛋白質分解システ
ムが欠けている宿主細胞を使用することも提案されてい
る。例えば、大腸菌のlon−突然変異体を宿主細胞とし
て使用することができる。この種の突然変異体は野生型
中に存在するプロテアーゼの１つが欠けているのであ
る。しかしながら、大腸菌中には少なくとも７つの更な
るプロテアーゼが存在する（Swamy等著、J.Bacteriol,
第149巻、1982年、第1027〜1033頁）ので、表現すべき
蛋白質がこれら他のプロテアーゼにより切断されない場
合のみ、この方法は好適である。更に、好適な宿主細胞
の選択は非常に限定される。
ムが欠けている宿主細胞を使用することも提案されてい
る。例えば、大腸菌のlon−突然変異体を宿主細胞とし
て使用することができる。この種の突然変異体は野生型
中に存在するプロテアーゼの１つが欠けているのであ
る。しかしながら、大腸菌中には少なくとも７つの更な
るプロテアーゼが存在する（Swamy等著、J.Bacteriol,
第149巻、1982年、第1027〜1033頁）ので、表現すべき
蛋白質がこれら他のプロテアーゼにより切断されない場
合のみ、この方法は好適である。更に、好適な宿主細胞
の選択は非常に限定される。
表現ベクターのコピー数を高めることにより表現を上昇
させ、プロテアーゼが多量の生じた蛋白質によりあふ
れ、これによりその作用が蛋白質の比較的僅かなパーセ
ンエージにおいてのみ展開するようにすることも提案さ
れた。しかしながら、この方法の欠点は、表現がわずか
１〜２世代において著しく上昇しなければならず、かつ
長時間実施することができない（Trends in Biotechnol
ogy、第１巻、1983等、第109〜113頁）という点であ
る。
させ、プロテアーゼが多量の生じた蛋白質によりあふ
れ、これによりその作用が蛋白質の比較的僅かなパーセ
ンエージにおいてのみ展開するようにすることも提案さ
れた。しかしながら、この方法の欠点は、表現がわずか
１〜２世代において著しく上昇しなければならず、かつ
長時間実施することができない（Trends in Biotechnol
ogy、第１巻、1983等、第109〜113頁）という点であ
る。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は、前記の従来技術の欠点を回避
し、可溶性で、特に生物学的に活性の蛋白質の製造を可
能にすることである。
し、可溶性で、特に生物学的に活性の蛋白質の製造を可
能にすることである。
課題を解決するための手段 この課題は誘発性プロモーターの制御下にある組換DNA
を好適な宿主細胞中で表現するための方法により解決
し、この方法は通常の遺伝子工学的製造条件下に不溶性
の形で生じる蛋白質を溶解性の形で製造するために、プ
ロモーターの誘発を標準システムと比較して最大誘発の
10％より小さく限定し、蛋白質をコーするDNAのmRNAへ
の転写を相応して限定することを特徴とする。
を好適な宿主細胞中で表現するための方法により解決
し、この方法は通常の遺伝子工学的製造条件下に不溶性
の形で生じる蛋白質を溶解性の形で製造するために、プ
ロモーターの誘発を標準システムと比較して最大誘発の
10％より小さく限定し、蛋白質をコーするDNAのmRNAへ
の転写を相応して限定することを特徴とする。
プロモーターの誘発の限定により、不応体の形成を十分
に回避し、かつそのかわりに溶解性で、特に活性の蛋白
質が多量に生じる。表現速度のこのような限定のない、
完全な誘発は蛋白質の非常に速い形成に導びくが、この
蛋白質は不応体の形で、又は不活性蛋白質又は蛋白質フ
ラグメントとして存在する。
に回避し、かつそのかわりに溶解性で、特に活性の蛋白
質が多量に生じる。表現速度のこのような限定のない、
完全な誘発は蛋白質の非常に速い形成に導びくが、この
蛋白質は不応体の形で、又は不活性蛋白質又は蛋白質フ
ラグメントとして存在する。
有利な実施形は請求項２以降に記載されている。本発明
による方法においては、プロモーターの誘発を標準シス
テムと比較して有利に最大誘発の５％より僅かに、特に
有利に１％より僅かに限定する。
による方法においては、プロモーターの誘発を標準シス
テムと比較して有利に最大誘発の５％より僅かに、特に
有利に１％より僅かに限定する。
標準システムとしては、１つには表現すべき外来遺伝子
をこのシステム（同じ宿主細胞）においては溶解性で活
性の蛋白質を表現する他の異種又は同種遺伝子に代えた
ベクターが好適であり、この際この“標準遺伝子”はも
ちろん外来遺伝子と同じプロモーターの制御下になけれ
ばならない。可能な標準遺伝子は例えばβ−ラクタマー
ゼ、CAT又はレアクチナーゼである。もう１つの標準シ
ステムとしては、宿主細胞が標準遺伝子を使用予定プロ
モーターの比較可能な制御下にすでに染色体挿入して含
有する場合この宿主細胞自体（ベクターなし）も好適で
ある（例2a参照、天然に存在するlac−オペロン中の大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）。
をこのシステム（同じ宿主細胞）においては溶解性で活
性の蛋白質を表現する他の異種又は同種遺伝子に代えた
ベクターが好適であり、この際この“標準遺伝子”はも
ちろん外来遺伝子と同じプロモーターの制御下になけれ
ばならない。可能な標準遺伝子は例えばβ−ラクタマー
ゼ、CAT又はレアクチナーゼである。もう１つの標準シ
ステムとしては、宿主細胞が標準遺伝子を使用予定プロ
モーターの比較可能な制御下にすでに染色体挿入して含
有する場合この宿主細胞自体（ベクターなし）も好適で
ある（例2a参照、天然に存在するlac−オペロン中の大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）。
誘発可能なプロモーターの制御下にある組換DNAの表現
がその中で可能であるすべての宿主細胞が組換DNAの表
現に好適である。大腸菌、特に有利にlac Iqを有する大
腸菌株中で表現を実施するのが有利である。このための
例はプラスミドpePA119（DSM3691P）で形質変換された
大腸菌、DSM2102である。この菌株を以降ED82−Iqとす
る。この際誘発は有利に刺激的成長期に行なわれる。プ
ロモーターとしては本発明による方法においては大腸菌
中に天然の、ハイブリツド−又はバクテリオフア−ジプ
ロモーターが好適である。有利にlac−、lacuv5−、trp
−、tac−、trc−、rac−、phoA−、mg1−、λ−PL -、
λ−PR−、T5−、T7−又はSP6−プロモーターを使用す
る。
がその中で可能であるすべての宿主細胞が組換DNAの表
現に好適である。大腸菌、特に有利にlac Iqを有する大
腸菌株中で表現を実施するのが有利である。このための
例はプラスミドpePA119（DSM3691P）で形質変換された
大腸菌、DSM2102である。この菌株を以降ED82−Iqとす
る。この際誘発は有利に刺激的成長期に行なわれる。プ
ロモーターとしては本発明による方法においては大腸菌
中に天然の、ハイブリツド−又はバクテリオフア−ジプ
ロモーターが好適である。有利にlac−、lacuv5−、trp
−、tac−、trc−、rac−、phoA−、mg1−、λ−PL -、
λ−PR−、T5−、T7−又はSP6−プロモーターを使用す
る。
大腸菌野性型細胞（lacI+Z+Y+）中のβ−ガラクトシダ
ーゼの最大誘発は誘発物質濃度0.1〜1mM IPTGで達せら
れる（Knippers、R.著:Molekulare Genctik,Georg Thim
e Verlag社、Stuttgart、New York.1985年）。完全なラ
クト−スペルミアーゼ（lacY+）の存在においてIPTGは
活発に細胞中に輸送され、そこで50倍以上に富化し、5m
M以上の誘発物質濃度で細胞内的に存在する（Miller
著、Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring
Harbor Laboratory、Cold Spring Harbour、Now York、
1972年）。
ーゼの最大誘発は誘発物質濃度0.1〜1mM IPTGで達せら
れる（Knippers、R.著:Molekulare Genctik,Georg Thim
e Verlag社、Stuttgart、New York.1985年）。完全なラ
クト−スペルミアーゼ（lacY+）の存在においてIPTGは
活発に細胞中に輸送され、そこで50倍以上に富化し、5m
M以上の誘発物質濃度で細胞内的に存在する（Miller
著、Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring
Harbor Laboratory、Cold Spring Harbour、Now York、
1972年）。
本発明の有利な実施形によれば、作用点（細胞内）での
効果的な誘発物質濃度を前記のような標準システムと比
較して10％より低く、有利に５％より低く、特に１％よ
り低く下げることにより制限された誘発が生じる。最大
誘発は、誘発物質濃度を２倍にすることにより標準の比
酵素活性が15％より少なく増大する時達せられる。
効果的な誘発物質濃度を前記のような標準システムと比
較して10％より低く、有利に５％より低く、特に１％よ
り低く下げることにより制限された誘発が生じる。最大
誘発は、誘発物質濃度を２倍にすることにより標準の比
酵素活性が15％より少なく増大する時達せられる。
誘発の制限は例えば誘発物質の限定した添加により生じ
る。lac−プロモーター又はこれから誘導したプロモー
ターを使用する際、誘発物質としてIPTGを、有利に0.01
mMより低い濃度で添加する。
る。lac−プロモーター又はこれから誘導したプロモー
ターを使用する際、誘発物質としてIPTGを、有利に0.01
mMより低い濃度で添加する。
更なる有利な実施形によれば、細胞膜を介する誘発物質
の活性な輸送を制限することにより誘発の制限を行な
う。不完全な輸送系は、例えば大腸菌のラクトース−ペ
ルミアーゼ遺伝子（loc Y）中に突然変異を持ち込むこ
とにより得られる。この場合、誘発物質としては、例え
ばIPTG又はラクトースが好適である。不完全な輸送系に
おいては細胞内IPTG−濃度は細胞外濃度に相応する（Mi
ller著、Experiments in Molecular Genetics、Cold Sp
ring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New Yo
rk.1972年）。ラクトースは不完全なラクトースペルミ
アーゼにもかかわらず、チオメチルガラクトシダーゼＩ
及びアラビノース輸送系を介して僅かな量で細胞中に取
り込まれる。（Rotman等著、J.Mol.Blol第36巻、第247
〜260頁（1968年）;Messer著、J.Bacteriol.第120巻、
第266〜272頁（1974年）） lac−又はこれから誘導されたプロモーターをこのラク
トースペルミアーゼ遺伝子（lac Y）中に突然変異を有
する宿主細胞中で使用するのが有利である。
の活性な輸送を制限することにより誘発の制限を行な
う。不完全な輸送系は、例えば大腸菌のラクトース−ペ
ルミアーゼ遺伝子（loc Y）中に突然変異を持ち込むこ
とにより得られる。この場合、誘発物質としては、例え
ばIPTG又はラクトースが好適である。不完全な輸送系に
おいては細胞内IPTG−濃度は細胞外濃度に相応する（Mi
ller著、Experiments in Molecular Genetics、Cold Sp
ring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New Yo
rk.1972年）。ラクトースは不完全なラクトースペルミ
アーゼにもかかわらず、チオメチルガラクトシダーゼＩ
及びアラビノース輸送系を介して僅かな量で細胞中に取
り込まれる。（Rotman等著、J.Mol.Blol第36巻、第247
〜260頁（1968年）;Messer著、J.Bacteriol.第120巻、
第266〜272頁（1974年）） lac−又はこれから誘導されたプロモーターをこのラク
トースペルミアーゼ遺伝子（lac Y）中に突然変異を有
する宿主細胞中で使用するのが有利である。
不完全ラクトース−ペルミアーゼ遺伝子及び付加的にla
c−Iq遺伝子を含有する宿主細胞として、特にlac−Iq遺
伝子を有するプラスミドDSM 3691Pで形質変換した大腸
菌ED82−Iq株、DSM2102を使用するのが特に有利であ
る。誘発のためにラクトースを１％より低い濃度で培地
に添加する。培地中に存在するラクトースはほとんど代
謝されないが、プロモーターの誘発のためには十分であ
る。
c−Iq遺伝子を含有する宿主細胞として、特にlac−Iq遺
伝子を有するプラスミドDSM 3691Pで形質変換した大腸
菌ED82−Iq株、DSM2102を使用するのが特に有利であ
る。誘発のためにラクトースを１％より低い濃度で培地
に添加する。培地中に存在するラクトースはほとんど代
謝されないが、プロモーターの誘発のためには十分であ
る。
同様に、誘発の限定は発酵において代謝され、こうして
その誘発作用を失なう誘発物質の添加によつて達せられ
る。
その誘発作用を失なう誘発物質の添加によつて達せられ
る。
本発明方法における、その他の誘発限定の実施形は、プ
ロモーターの活性をエフエクター／プロモーター相互作
用の影響により制御することである。この際、作用点で
の誘発物質の濃度は重要ではなく、リプレツサーに対す
るその親和性又はその逆が重要なのである。誘発物質／
リプレツサー相互作用の低下は例えば変化したリプレツ
サー／誘発物質結合定数を有するリプレツサー蛋白質を
コードするリプレツサー突然変異体遺伝子を有する微生
物を使用することにより達せられる。そのような方法に
おいてlac−プロモーター並びにlac−リプレツサー突然
変異体−遺伝子（lac Is）を有する微生物を使用するの
が有利である。もう１つの可能性は、例えばCAP−位を
有するプロモーターの使用であり、この際、カタボライ
ト−アクチベーター−蛋白質のプロモーターへの親和性
は低下する。
ロモーターの活性をエフエクター／プロモーター相互作
用の影響により制御することである。この際、作用点で
の誘発物質の濃度は重要ではなく、リプレツサーに対す
るその親和性又はその逆が重要なのである。誘発物質／
リプレツサー相互作用の低下は例えば変化したリプレツ
サー／誘発物質結合定数を有するリプレツサー蛋白質を
コードするリプレツサー突然変異体遺伝子を有する微生
物を使用することにより達せられる。そのような方法に
おいてlac−プロモーター並びにlac−リプレツサー突然
変異体−遺伝子（lac Is）を有する微生物を使用するの
が有利である。もう１つの可能性は、例えばCAP−位を
有するプロモーターの使用であり、この際、カタボライ
ト−アクチベーター−蛋白質のプロモーターへの親和性
は低下する。
mRNA形成、又はプロモーターの誘発の限定の本発明によ
る効果は付加的な処置により上昇し、この処置は発酵に
おける細胞の成長及び誘発物質の添加時点に該当する。
こうして、可溶性の活性α−グルコシダーゼの表現はac
−プロモーターの著しくゆつくりとした誘発及び成長に
影響を与える、付加的な上昇処置により達せられる。
る効果は付加的な処置により上昇し、この処置は発酵に
おける細胞の成長及び誘発物質の添加時点に該当する。
こうして、可溶性の活性α−グルコシダーゼの表現はac
−プロモーターの著しくゆつくりとした誘発及び成長に
影響を与える、付加的な上昇処置により達せられる。
細胞の成長速度は例えば培地の種類（完全培地及び最少
培地、例えばDYT、LB、MgCAA及びMg）、Ｃ−源（例えば
糖、グリセリン及びペプトン）、Ｎ−源（例えば（N
H4）2SO4、アミノ酸及びペプトン）、培地のpH値、温
度、使用可能な酸素量、並びに菌株背景（突然変異）の
影響をうける。変化した成長は多くの優れた効果により
生じる。こうして、例えば発酵性Ｃ−源の分解により培
地を強く酸性とし（pH4.8）、これにより成長はゆつく
りとなる。
培地、例えばDYT、LB、MgCAA及びMg）、Ｃ−源（例えば
糖、グリセリン及びペプトン）、Ｎ−源（例えば（N
H4）2SO4、アミノ酸及びペプトン）、培地のpH値、温
度、使用可能な酸素量、並びに菌株背景（突然変異）の
影響をうける。変化した成長は多くの優れた効果により
生じる。こうして、例えば発酵性Ｃ−源の分解により培
地を強く酸性とし（pH4.8）、これにより成長はゆつく
りとなる。
実施例 次に、実施例及び図面につき本発明を詳細に説明する。
例 大腸菌中でのα−グルコシダーゼの表現： DNAの操作のために標準法（この方法はManiatis等によ
り1982年、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor La
boratory、Cold Spring Harbor、Now York 11724に記
載されている）を使用した。使用した分子生物学的試薬
を製造者の記載に従つて使用した。
り1982年、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor La
boratory、Cold Spring Harbor、Now York 11724に記
載されている）を使用した。使用した分子生物学的試薬
を製造者の記載に従つて使用した。
例 １ α−グルコシダーゼPI−表現ベクターの構造（pKK177−
3/GLUCPI） パン酵母からのα−グルコシダーゼPIの構造遺伝子（第
１図）はアダプター（プロモーターとＮ−末端との間の
正確な結合）及びプラスミドYRpGLUCPI、DSM4173Pのα
−グルコシダーゼをコードするDNA−フラグメント２つ
によつて構成される（第２図）。酵母からのα−グルコ
シダーゼの３′−非転写域がこの際25bpまで除去され
る。
3/GLUCPI） パン酵母からのα−グルコシダーゼPIの構造遺伝子（第
１図）はアダプター（プロモーターとＮ−末端との間の
正確な結合）及びプラスミドYRpGLUCPI、DSM4173Pのα
−グルコシダーゼをコードするDNA−フラグメント２つ
によつて構成される（第２図）。酵母からのα−グルコ
シダーゼの３′−非転写域がこの際25bpまで除去され
る。
このためにはプラスミドYRp/GLUCPIをEco RI及びBcl I
で消化し、Bcl I/Eco RI−フラグメント（1.7kb）並び
にEco RI−フラグメント（約0.3kb）を単離する。Eco R
I−フラグメントをFnu DIIで後切断し、Eco RI/Fnu DII
−フラグメント（0.13kb）を単離する。
で消化し、Bcl I/Eco RI−フラグメント（1.7kb）並び
にEco RI−フラグメント（約0.3kb）を単離する。Eco R
I−フラグメントをFnu DIIで後切断し、Eco RI/Fnu DII
−フラグメント（0.13kb）を単離する。
ベクターpKK177−３、DSM3062をEco RI及びSma Iで切断
する。この際生じたベクターフラグメント（2.8 5kb）
中にBcl I/Eco RI−フラグメント、Eco RI/Fnu DII−フ
ラグメント並びに合成DNA−フラグメント ５′−AATTCCATGACTATTTCT −３′ ３′ GGTACTGATAAAGACTAG−５′ が結合される。
する。この際生じたベクターフラグメント（2.8 5kb）
中にBcl I/Eco RI−フラグメント、Eco RI/Fnu DII−フ
ラグメント並びに合成DNA−フラグメント ５′−AATTCCATGACTATTTCT −３′ ３′ GGTACTGATAAAGACTAG−５′ が結合される。
所望の構造を５−ブロム−４−クロル−インドリル−α
−Ｄ−グルコピラノシド−指示プレート（α×Gl、40mg
/）及びIPTG 1mM上でED82−Iq中のわずかなα−グル
コシダーゼ活性につき同定し、単離する。
−Ｄ−グルコピラノシド−指示プレート（α×Gl、40mg
/）及びIPTG 1mM上でED82−Iq中のわずかなα−グル
コシダーゼ活性につき同定し、単離する。
制限分析によりα−GLUCPI−遺伝子の正確な構成を確認
した。プラスミドをpKK−177−3/GLUKPIと呼ぶ。宿主菌
株ED 82−Iqは試験条件下に全くα−グルコシダーゼ活
性を有さない。
した。プラスミドをpKK−177−3/GLUKPIと呼ぶ。宿主菌
株ED 82−Iqは試験条件下に全くα−グルコシダーゼ活
性を有さない。
例 ２ 標準条件下での大腸菌中での酵母αグルコシダーゼpIの
表現 酵母からのα−グルコシダーゼpIの異種表現のためにベ
クターpKK177−3/GLUCPIを含有する大腸菌Ｋ−12−種ED
82−Iqを使用した。実験をローラー培地（培地5mlを有
する20ml試験管）においてアンピシリン40mg/を含有
するLB−培地（Maniatis等著、Molecular Cloning、Col
d Spring Harbor Laboratory、1982年）中37℃で実施す
る。この培地を１夜培地50μで接種し、OD550の細胞
密度0.5〜0.6が達せられた際に、IPTG（最終濃度5mM）
で。２〜３時間室温で恒温保持した後、培地の試料（0.
5ml）を取り、遠心分離し、10mM燐酸塩緩衝液pH6.8で細
胞ケーキを洗浄し、貯蔵のために急冷冷凍する。
表現 酵母からのα−グルコシダーゼpIの異種表現のためにベ
クターpKK177−3/GLUCPIを含有する大腸菌Ｋ−12−種ED
82−Iqを使用した。実験をローラー培地（培地5mlを有
する20ml試験管）においてアンピシリン40mg/を含有
するLB−培地（Maniatis等著、Molecular Cloning、Col
d Spring Harbor Laboratory、1982年）中37℃で実施す
る。この培地を１夜培地50μで接種し、OD550の細胞
密度0.5〜0.6が達せられた際に、IPTG（最終濃度5mM）
で。２〜３時間室温で恒温保持した後、培地の試料（0.
5ml）を取り、遠心分離し、10mM燐酸塩緩衝液pH6.8で細
胞ケーキを洗浄し、貯蔵のために急冷冷凍する。
α−グルコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの測定 細胞ペースト状物を10mM燐酸塩緩衝液、pH6.8及び1mM E
DTA0.25mlで再懸濁し、細胞を超音波処理により砕解す
る。遠心分離後、上澄中の活性α−グルコシダーゼを0.
1M燐酸塩緩衝液pH6.8中の2mM p−ニトロフエニル−２−
Ｄ−グルコピラノシド（PNPG）を添加することにより25
℃で測光法により測定する（405nm）。
DTA0.25mlで再懸濁し、細胞を超音波処理により砕解す
る。遠心分離後、上澄中の活性α−グルコシダーゼを0.
1M燐酸塩緩衝液pH6.8中の2mM p−ニトロフエニル−２−
Ｄ−グルコピラノシド（PNPG）を添加することにより25
℃で測光法により測定する（405nm）。
比活性の計算をマイクロビンレツト（Microbinret）法
（Methods Enzymol.、第３巻、1957年、第696〜704頁参
照）に相応して標準として牛血清アルブミンを用いて行
なつた。比活性は１分間及び蛋白質1mgあたり加水分解
される基質ナノモルとして示される。
（Methods Enzymol.、第３巻、1957年、第696〜704頁参
照）に相応して標準として牛血清アルブミンを用いて行
なつた。比活性は１分間及び蛋白質1mgあたり加水分解
される基質ナノモルとして示される。
β−ガラクトシダーゼの活性は基質としてPNPGのかわり
に２−ニトロフエニル−β−ガラクトピラノシドを用い
てα−グルコシダーゼ−テストと同様に測定する。ED82
−Iq中で染色体にコードされたβ−ガラストチダーゼは
lac−オペロンの誘発過程を制御するために働く。
に２−ニトロフエニル−β−ガラクトピラノシドを用い
てα−グルコシダーゼ−テストと同様に測定する。ED82
−Iq中で染色体にコードされたβ−ガラストチダーゼは
lac−オペロンの誘発過程を制御するために働く。
例 ３ ａ）誘発時間及びIPTG−誘発物質濃度に応じて活性蛋白
質（α−グルコシダーゼpI及びβ−ガラクトシダーゼ）
の収率の存在 例２に記載した条件下に実施し、この際誘発物質（IPT
G）濃度及び培養時間を変化させた。結果を第１表に示
した。
質（α−グルコシダーゼpI及びβ−ガラクトシダーゼ）
の収率の存在 例２に記載した条件下に実施し、この際誘発物質（IPT
G）濃度及び培養時間を変化させた。結果を第１表に示
した。
結果は、β−ガラクトシダーゼの比活性（内部制御）は
上昇する誘発物質濃度及び上昇する誘発時間と共に増大
することを示す。β−ガラクトシダーゼと異なりα−グ
ルコシダーゼの比活性はIPTG0.01mMの誘発濃度において
最大値を達する。
上昇する誘発物質濃度及び上昇する誘発時間と共に増大
することを示す。β−ガラクトシダーゼと異なりα−グ
ルコシダーゼの比活性はIPTG0.01mMの誘発濃度において
最大値を達する。
ｂ）ラクトース−誘発物質濃度に応じる活性蛋白質（α
−グルコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ）の収率の
依存 例２に記載した条件下に実施するが、この際誘発物質濃
度（ラクトース）を変化させた。結果を第２表に示す。
−グルコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ）の収率の
依存 例２に記載した条件下に実施するが、この際誘発物質濃
度（ラクトース）を変化させた。結果を第２表に示す。
この結果は、β−ガラクトシダーゼ（内部制御）がラク
トース濃度２％により完全に誘発されることを示す。こ
れと異なり、α−グルコシダーゼは同じ誘発物質濃度に
おいて最高達成可能な比酵素活性のわずか５％の比活性
のみが達せられる。
トース濃度２％により完全に誘発されることを示す。こ
れと異なり、α−グルコシダーゼは同じ誘発物質濃度に
おいて最高達成可能な比酵素活性のわずか５％の比活性
のみが達せられる。
例 ４ pH値及び誘発物質濃度IPTGへの活性蛋白質（α−グルコ
シダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ）の収率の依存性 例２に記載した条件下に実施するが、この際誘発の時点
のpH値をトリス/HCl−もしくは燐酸塩緩衝剤（最終濃度
0.1M）の添加により調節し、かつ誘発物質濃度0.01mM I
PTG（第3a表）もしくは0.5％ラクトース（第3b表）を使
用した。結果を第3a表及び第3b表中に示した。
シダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ）の収率の依存性 例２に記載した条件下に実施するが、この際誘発の時点
のpH値をトリス/HCl−もしくは燐酸塩緩衝剤（最終濃度
0.1M）の添加により調節し、かつ誘発物質濃度0.01mM I
PTG（第3a表）もしくは0.5％ラクトース（第3b表）を使
用した。結果を第3a表及び第3b表中に示した。
大腸菌培養に最適なpH値（7.0〜7.5）において、意外に
も活性蛋白質の最少収率が得られるということが示され
た。最適なpH域は4.8〜5.6並びに7.5〜8.5である。更
に、この酵素活性はラクトース（0.5％）での単独誘発
に対して約８倍上昇する。（第3b表、第２欄の末行に対
して第２表、第２欄の下から３行）。
も活性蛋白質の最少収率が得られるということが示され
た。最適なpH域は4.8〜5.6並びに7.5〜8.5である。更
に、この酵素活性はラクトース（0.5％）での単独誘発
に対して約８倍上昇する。（第3b表、第２欄の末行に対
して第２表、第２欄の下から３行）。
例 ５ 培養温度への活性蛋白質（α−グルコシダーゼ及びβ−
ガラクトシダーゼ）の収率の依存 例２に記載した条件下に実施し、その際温度及び誘発物
質IPTG（0.01mM）もしくはラクトース（0.5％）を変化
させた。結果を第４表に表示する。
ガラクトシダーゼ）の収率の依存 例２に記載した条件下に実施し、その際温度及び誘発物
質IPTG（0.01mM）もしくはラクトース（0.5％）を変化
させた。結果を第４表に表示する。
結果はβ−ガラクトシダーゼの比活性（内部制御）が培
養温度により影響をうけないことを示す。α−グルコシ
ダーゼの比活性が低い培養温度で上昇するのは意外であ
る。
養温度により影響をうけないことを示す。α−グルコシ
ダーゼの比活性が低い培養温度で上昇するのは意外であ
る。
例 ６ 培地及び培養時間に応じて活性蛋白質（α−グルコシダ
ーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ）の収率の依存 例２に記載した条件下に実施するが、この際培地を変化
させ、かつ誘発物質として0.5％ラクトースを使用した
（第５表）。
ーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ）の収率の依存 例２に記載した条件下に実施するが、この際培地を変化
させ、かつ誘発物質として0.5％ラクトースを使用した
（第５表）。
例 ７ Ｃ−源に応じる活性蛋白質（α−グルコシダーゼ及びβ
−ガラクトシダーゼ）の収率の依存 例２に記載した各件下に実施するが、この際Ｃ−源（最
終濃度２％）及び誘発物質（ラクトース0.5％）を誘発
の時点に添加した。2.5及び６時間後に、α−グルコシ
ダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの比活性を測定した
（第６表参照）。
−ガラクトシダーゼ）の収率の依存 例２に記載した各件下に実施するが、この際Ｃ−源（最
終濃度２％）及び誘発物質（ラクトース0.5％）を誘発
の時点に添加した。2.5及び６時間後に、α−グルコシ
ダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの比活性を測定した
（第６表参照）。
例 ８ 活性α−グルコシダーゼの有利な培養条件 活性α−グルコシダーゼの合成のためにプラスミコード
されたα−グルコシダーゼを有するED82−IqをLB−培地
もしくは最少培地で37℃でOD5500.4〜0.6まで培養し
た。その後、培地を冷却し（20〜30℃）、ラクトース
（最終濃度0.5％）で誘発し、Ｃ−源（最終濃度１〜２
％；有利にグリセリン及び／又はマルス）を添加する
か、又はpH値を燐酸塩緩衝液（0.1M）でpH4.8〜5.5に下
げ、かつ細胞を20〜30℃で細胞密度OD5503〜５まで培養
する（第７表参照）。
されたα−グルコシダーゼを有するED82−IqをLB−培地
もしくは最少培地で37℃でOD5500.4〜0.6まで培養し
た。その後、培地を冷却し（20〜30℃）、ラクトース
（最終濃度0.5％）で誘発し、Ｃ−源（最終濃度１〜２
％；有利にグリセリン及び／又はマルス）を添加する
か、又はpH値を燐酸塩緩衝液（0.1M）でpH4.8〜5.5に下
げ、かつ細胞を20〜30℃で細胞密度OD5503〜５まで培養
する（第７表参照）。
添付図面の第１図はヌクレオチド配列及びこれから誘導
されるα−グルコシダーゼpIのアミノ酸配列を示す図で
あり、第２図は大腸菌中で表現するためのα−グルコシ
ダーゼpIプラスミドpKK177−3/GLUCPIの構造を示す図で
ある。
されるα−グルコシダーゼpIのアミノ酸配列を示す図で
あり、第２図は大腸菌中で表現するためのα−グルコシ
ダーゼpIプラスミドpKK177−3/GLUCPIの構造を示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，1985〔128〕Ｐ. 1268−1273 ＤＮＡ，1986〔５〕Ｐ．21−28
Claims (12)
- 【請求項１】常用の遺伝子工学的製造条件下に不溶性の
形で生じる蛋白質を可溶性の形で製造するために、プロ
モーターの誘発を標準システムと比較して最高誘発の10
％より低く限定し、蛋白質をコードするDNAのmRNAへの
転写速度を相応して限定することを特徴とする、好適な
宿主細胞中での誘発性プロモーターの制御下にある組換
DNAの表現法。 - 【請求項２】プロモーターの誘発を最高誘発の５％よ
り、特に１％より低く限定する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】表現をlac Iq−遺伝子を含有する大腸菌株
中で実施する請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】表現を大腸菌、DSM2102中で実施する請求
項３記載の方法。 - 【請求項５】誘発を対数的成長期に実施する請求項１か
ら４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】大腸菌中での表現においてプロモーターと
して天然の、公知のハイブリッド−又はバクテリオファ
ージプロモーターの１つを使用する請求項３記載の方
法。 - 【請求項７】lac−、lacuv5−、trp−、tac−、trc−、
rac−、phoA−、mg1−、λ−PL−、λ−PR−、T5−、T7
−又はSP6−プロモーターを使用する請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】プロモーターの誘発の限定を誘発性物質の
制限した添加により行う請求項１から７までのいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項９】lac−プロモーター、又はこれから誘導し
たプロモーター及び誘発性物質としてイソプロピル−β
−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（IPTG）を0.01mMより
低い濃度で使用する請求項１から８までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項１０】誘発物質としてラクトースを１％より低
い濃度で使用する請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】プラスミドDSM3691Pを含有する大腸菌ED
82−Iq−株、DSMS2102の細胞を宿主細胞として使用する
請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】相応する発酵条件及び誘発物質の添加時
点により細胞成長を制御することにより、更に付加的に
誘発を制限する処置により可溶性の蛋白質の生成を上げ
る請求項１から１までのいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3723992.9 | 1987-07-20 | ||
| DE19873723992 DE3723992A1 (de) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Verfahren zur herstellung von proteinen in loeslicher form |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6443195A JPS6443195A (en) | 1989-02-15 |
| JPH0773505B2 true JPH0773505B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=6331970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63179292A Expired - Lifetime JPH0773505B2 (ja) | 1987-07-20 | 1988-07-20 | 誘発性プロモーターの制御下にある組換ｄｎａの表現法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6284484B1 (ja) |
| EP (1) | EP0300425B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0773505B2 (ja) |
| AT (1) | ATE91717T1 (ja) |
| DE (2) | DE3723992A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR920703789A (ko) * | 1989-12-19 | 1992-12-18 | 모리따 가쓰라 | 인체 염기성 fgf 뮤테인의 제조방법 |
| DE19604583C2 (de) * | 1996-02-08 | 1999-11-18 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Synthese von löslichen, rekombinanten Proteinen aus Bakterienzellen |
| JP4463198B2 (ja) * | 2003-03-05 | 2010-05-12 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 大腸菌における異種蛋白質の製造方法 |
| CN100480848C (zh) * | 2003-07-11 | 2009-04-22 | 株式会社可乐丽 | 叠层片和其设计方法以及背面投影型屏幕及其制造方法 |
| KR20070100307A (ko) | 2004-12-22 | 2007-10-10 | 제넨테크, 인크. | 가용성 다중 막관통 단백질의 생산 방법 |
| US20190300575A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Deetex, LLC | Lytic peptide biosensor and methods of making and using the same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3585170D1 (de) * | 1984-03-06 | 1992-02-27 | Lilly Co Eli | Expressionsvektoren fuer rinderwachstumshormonderivate. |
| US4659568A (en) * | 1985-02-27 | 1987-04-21 | American Cyanamid Company | Process for solubilization, purification and characterization of protein from insoluble protein aggregates or complexes and compositions of matter therefrom |
-
1987
- 1987-07-20 DE DE19873723992 patent/DE3723992A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-07-19 DE DE8888111602T patent/DE3882455D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-19 AT AT88111602T patent/ATE91717T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-07-19 EP EP88111602A patent/EP0300425B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-20 JP JP63179292A patent/JPH0773505B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-27 US US07/725,943 patent/US6284484B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８５〔１２８〕Ｐ．１２６８−１２７３ |
| ＤＮＡ，１９８６〔５〕Ｐ．２１−２８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0300425B1 (de) | 1993-07-21 |
| JPS6443195A (en) | 1989-02-15 |
| EP0300425A2 (de) | 1989-01-25 |
| DE3882455D1 (de) | 1993-08-26 |
| EP0300425A3 (de) | 1991-08-07 |
| ATE91717T1 (de) | 1993-08-15 |
| DE3723992A1 (de) | 1989-02-02 |
| US6284484B1 (en) | 2001-09-04 |
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