JPH0773508B2 - Ｌ―アスパラギンのアミド結合の水解方法及び試薬 - Google Patents

Ｌ―アスパラギンのアミド結合の水解方法及び試薬

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JPH0773508B2
JPH0773508B2 JP1297450A JP29745089A JPH0773508B2 JP H0773508 B2 JPH0773508 B2 JP H0773508B2 JP 1297450 A JP1297450 A JP 1297450A JP 29745089 A JP29745089 A JP 29745089A JP H0773508 B2 JPH0773508 B2 JP H0773508B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合を少な
くとも１個有するペプチド鎖を持つ物質におけるＬ−ア
スパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選択特異的に水
解する方法、及びその水解用試薬に関する。
〔従来の技術〕
ペプチド鎖中に含まれる特定のアミノ酸残基を選択特異
的に認識してそのＮ末端側又はＣ末端側ペプチド結合の
みを加水分解する方法は、タンパク質の構造解析、タン
パク質の修飾を行う上において極めて重要な手段である
〔綱沢進、崎山文夫、続生化学実験講座（日本生化学会
編）、２、第260〜277頁（1987）〕。
従来、この目的のための手段として、生物化学的方法と
してはＬ−リジンのＣ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−
リジンのＮ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−アルギニン
のＣ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−グルタミン酸及び
Ｌ−アスパラギン酸のＣ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ
−アスパラギン酸のＮ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−
プロリンのＣ末端側ペプチド結合の水解が知られてお
り、また有機化学的方法としては、Ｌ−メチオニンのＣ
末端側ペプチド結合の切断、Ｌ−システィンのＮ末端側
ペプチド結合の切断、Ｌ−トリプトファンのＣ末端側ペ
プチド結合の切断が知られている。
〔発明が解決しようとする課題〕
タンパク質工学においては、各種アミノ酸特異的にペプ
チド結合を切断する方法が望まれている。しかしなが
ら、上述した方法以外のアミノ酸に特異的な切断方法は
知られていない。
本発明の目的はＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合
の水解方法及びその試薬を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＬ−アスパ
ラギンのＣ末端側アミド結合を少なくとも１個有するペ
プチド鎖を持つ物質に、Ｌ−アスパラギンのＮ末端側ア
ミド結合を水解することなく、Ｃ末端側アミド結合のみ
を選択特異的に水解する、至適pHが6.0〜7.0のプロテア
ーゼを作用させることを特徴とするＬ−アスパラギンの
Ｃ末端側アミド結合の水解方法に関する。また、本発明
の第２の発明は、Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結
合を少なくとも１個有するペプチド鎖を持つ物質におけ
るＬ−アスパラギンのＮ末端側アミド結合を水解するこ
となく、Ｃ末端側アミド結合のみを選択特異的に水解す
る、至適pHが6.0〜7.0のプロテアーゼを含有しているこ
とを特徴とするＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合
の水解用試薬に関する。
本発明者らは、植物種子中に存在するレクチンや貯蔵タ
ンパク質のＣ末端側アミノ酸がＬ−アスパラギンである
ことにかんがみ、植物種子中にペプチド鎖中のＬ−アス
パラギンのＣ末端側アミド結合のみを選択特異的に水解
するプロテアーゼを検索したところ、タチナタマメ（Ca
navalia ensiformis）種子中よりペプチド鎖中のＬ−ア
スパラギンのＣ末端側アミド結合のみを加水分解するプ
ロテアーゼを単離、精製することに成功し、本発明を完
成させた。
本発明は本酵素の製造方法、酵素の諸性質並びに利用法
について検討を重ね完成されたものである。以下に本発
明を詳細に説明する。
（本酵素の製造方法） 本発明で用いられる酵素は、例えば、市販のジャックビ
ーンミールを適当な還元剤の存在下、pH4〜６の緩衝液
中でホモゲナイズすることにより本酵素を可溶化した
後、不溶物を遠心分離等の手段により除去し、種々のイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法等の精製手段
により精製度を高め、本酵素の特異的阻害物質であるパ
ラメルクリ安息香酸（PMB）をアガロースに固定化した
アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより単一
なタンパク質として単離することができる。
（本酵素の測定方法及び単位） 基質としてはDNP−Ｌ−Pro−Ｌ−Glu−Ｌ−Ala−Asn−N
H2（DNPは2,4−ジニトロフェニル）が用いられる。0.02
mM本基質、5mM DTT、2mM EDTA、酵素及び内部標準物質
としての0.002mM DNP−Ｌ−Serを含む200mM酢酸緩衝液
（pH5.0）からなる反応液を37℃、10〜20分間保温した
のち、終濃度10％となる様にギ酸を添加し反応を停止、
反応液の一部を、例えば、ODS−カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィーにより分析し、生成したDNP−Ｌ
−Pro−Ｌ−Glu−Ｌ−Ala−Ｌ−Asn量を内部標準物質で
あるDNP−Ｌ−Serと比較定量することにより本酵素活性
を測定することができる。本酵素活性の単位は１分間に
１μmoleのDNP−Ｌ−Pro−Ｌ−Glu−Ｌ−Ala−Ｌ−Asn
を生成する酵素量を１単位とした。
（本酵素の基質特異性） ニューロテンシン、β−エンドルフィン、パラサイロイ
ドホルモン（１−34）、バソアクティブインテスティナ
ルペプチド、ペプチドＴ、ボンベシン、酸化インシュリ
ンＢ鎖、フィサラミンを基質として基質（nmol）と酵素
（mU）の比率を50:1とし、pH5.0で37℃、15時間反応を
行った結果Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみ
が加水分解され、他のペプチド結合は全く加水分解され
なかった。第１表に基質として用いた合成ペプチドのア
ミノ酸配列及び加水分解されたアミド結合部位を示し
た。
（本酵素の他の酵素化学的性質） １） 分子量 26550 （東ソー製 G3000SWを用いたゲルろ過法による） ２） 至適pH 6.0〜7.0 DNP−Ｌ−Pro−Ｌ−Glu−Ｌ−Ala−Ｌ−Asn−NH2を基質
として5mM DTT存在下37℃、20分間、各pHの緩衝液中に
て反応。
３） 至適温度 45℃付近 DNP−Ｌ−Pro−Ｌ−Glu−Ｌ−Ala−Ｌ−Asn−NH2を基質
として5mM DTT存在下、pH5.0の緩衝液中にて各温度で2
0分間反応。
４） pH安定性 4.5〜6.5 1mM DTTを含む各pHの緩衝液中で酵素を37℃、６時間保
温した後の残存活性を測定。
５） 温度安定性 1mM DTTを含むpH5.0の緩衝液中
で、55℃、15分間の加熱では失活せず、65℃、15分間の
加熱で90％以上失活する。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ 市販ジャックビーンミール（シグマ社製）500gを1mM D
TT、1mM EDTAを含む20mM酢酸緩衝液（pH5.0）でホモゲ
ナイズし遠心分離により上清を得た。該上清を上記緩衝
液中にて透析後、再び生じた沈殿物を遠心分離により除
去し、SP−トヨパール650M（東ソー製）によるイオン交
換クロマトグラフィーを行った。SP−トヨパール650Mカ
ラムに吸着し、0.5M塩化ナトリウムにて溶出した活性画
分を60％飽和硫安沈殿後、上記緩衝液に対し透析した。
続いて、PMBをアガロースに固定化して作ったアフィニ
ティカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーを
行った。同カラムに吸着し、0.5M塩化ナトリウムにて溶
出した活性画分を再び上記緩衝液に対し透析した。次
に、ロイシルアルギニナールカラム（オルガノ製）によ
るアフィニティクロマトグラフィーを行い、同カラムに
吸着されない活性画分を回収した。同活性画分を排除分
子量10000の限外ろ過膜にて濃縮後トヨパールHW−55S
（東ソー製）によるゲルろ過を行った。こうして得られ
た精製酵素は2.6mg、活性は180mUであり、C4−逆相クロ
マトグラフィーにおいて単一なタンパク質であった。
実施例２ 実施例１で得られた精製酵素を用い、市販可溶性還元リ
ゾチーム（生化学工業社製）の限定加水分解を行った。
反応条件は10mM DTT、1mM EDTAを含む20mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH5.0）中で、基質濃度0.2mM、酵素濃度4m
U/mlにて37℃、15時間反応を行った。終濃度10％となる
ようにギ酸を添加することにより反応を停止後、生成し
たペプチドフラグメントをC4−逆相クロマトグラフィー
（ウォーターズ社製、マイクロボンダスフェアー、3.9
×150nm）にて分離後、各フラグメントについてアミノ
酸組成分析、アミノ酸配列分析を行った。可溶性還元リ
ゾチームのアミノ酸配列を第１図に、C4−逆相クロマト
グラフィーを第２図に、各フラグメントのアミノ酸配列
を第２表に示した。なお、第１図中Cys＊はＳ−３−
（トリメチルアンモニオ）プロピルシスティンを意味す
る。また、第２図は可溶性還元リゾチームを本酵素で消
化した後、C4逆相HPLCにて分画したクロマトグラフィー
を時間（分、横軸）と215nmにおける吸光度（縦軸）と
の関係で示したグラフである。
この結果本酵素は、可溶性還元リゾチームに含まれるＬ
−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを切断するこ
とが確認された。
〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明によりペプチド鎖中
のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合の水解方法及
び水解用試薬が提供された。
また、本発明により、Ｌ−アスパラギンとＬ−アスパラ
ギン酸とを区別することができ、遺伝子工学における生
産物の確認においても有効である。
本発明は、タンパク質の構造解析において極めて重要な
手段として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例２で用いた基質である市販可溶性還元リ
ゾチームのアミノ酸配列を示した図、第２図は可溶性還
元リゾチームを本酵素で消化した後C4逆相HPLCにて分画
したクロマトグラフィーを示した図である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合を
    少なくとも１個有するペプチド鎖を持つ物質に、Ｌ−ア
    スパラギンのＮ末端側アミド結合を水解することなく、
    Ｃ末端側アミド結合のみを選択特異的に水解する、至適
    pHが6.0〜7.0のプロテアーゼを作用させることを特徴と
    するＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合の水解方
    法。
  2. 【請求項２】Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合を
    少なくとも１個有するペプチド鎖を持つ物質におけるＬ
    −アスパラギンのＮ末端側アミド結合を水解することな
    く、Ｃ末端側アミド結合のみを選択特異的に水解する、
    至適pHが6.0〜7.0のプロテアーゼを含有していることを
    特徴とするＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合の水
    解用試薬。
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