JPH0775541B2 - Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 - Google Patents
Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法Info
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- JPH0775541B2 JPH0775541B2 JP61131089A JP13108986A JPH0775541B2 JP H0775541 B2 JPH0775541 B2 JP H0775541B2 JP 61131089 A JP61131089 A JP 61131089A JP 13108986 A JP13108986 A JP 13108986A JP H0775541 B2 JPH0775541 B2 JP H0775541B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/17—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
- C12Y114/17003—Peptidylglycine monooxygenase (1.14.17.3)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 この発明は、ペプチドのＣ末端をアミド化する酵素、及
びその製造法に関する。この酵素はペプチドのＣ末端を
アミド化するために有用である。
びその製造法に関する。この酵素はペプチドのＣ末端を
アミド化するために有用である。
ペプチドのＣ末端がアミド化された過程は、プロホルモ
ンの活性化において最も重要な工程の１つである。この
アミド化に関与する酵素が、Bradburyらにより、ブタ下
垂体中に存在することが初めて報告された。彼らは、基
質として合成ペプチドＤ−Tyr−Val−Glyを用い、これ
らがＤ−Tyr−Val−NH2に変換されること、及びＣ末端
の−GlyがアミドのＮの供与体として必須であることを
示した（Bradbury,A.F.等;Nature298 686−688,198
2）。組織における、ペプチドＣ端アミド化の機構を明
らかにすることの重要性に加えて、近年、組み換えDNA
技術を用いて作り出されるペプチドのＣ末端をアミド化
する手段としても、この活性を有する酵素が注目され、
酵素の生化学的解析や精製物理化学的解析が試みられ
た。Eipperらは、下垂体のα−アミド化酵素活性には銅
イオンとアスコルビン酸が必要であると報告した（Pro
c.Natl.Acad.Sci.,US,80 5144−5148,1983）。この報告
も含め、ペプチドのＣ末端α−アミド化酵素の精製が試
みられたが、充分に精製された酵素が得られた例はこれ
までにない。（Husain,I,等FEBS Lett.152227−281,198
3;Kizer,J.S.等、PNAS 81 3228−3232,1984等）。最
近、Murthyらは、牛の下垂体よりＣ末端アミド化酵素を
分精製した結果、分子量、電荷の異なる複数の型が存在
することを示した（Murthy,A.S.N等、J.Biol.Chem.261
1815−1822）が、いずれの型の酵素についても、単一で
純粋な状態にまで精製されていない。
ンの活性化において最も重要な工程の１つである。この
アミド化に関与する酵素が、Bradburyらにより、ブタ下
垂体中に存在することが初めて報告された。彼らは、基
質として合成ペプチドＤ−Tyr−Val−Glyを用い、これ
らがＤ−Tyr−Val−NH2に変換されること、及びＣ末端
の−GlyがアミドのＮの供与体として必須であることを
示した（Bradbury,A.F.等;Nature298 686−688,198
2）。組織における、ペプチドＣ端アミド化の機構を明
らかにすることの重要性に加えて、近年、組み換えDNA
技術を用いて作り出されるペプチドのＣ末端をアミド化
する手段としても、この活性を有する酵素が注目され、
酵素の生化学的解析や精製物理化学的解析が試みられ
た。Eipperらは、下垂体のα−アミド化酵素活性には銅
イオンとアスコルビン酸が必要であると報告した（Pro
c.Natl.Acad.Sci.,US,80 5144−5148,1983）。この報告
も含め、ペプチドのＣ末端α−アミド化酵素の精製が試
みられたが、充分に精製された酵素が得られた例はこれ
までにない。（Husain,I,等FEBS Lett.152227−281,198
3;Kizer,J.S.等、PNAS 81 3228−3232,1984等）。最
近、Murthyらは、牛の下垂体よりＣ末端アミド化酵素を
分精製した結果、分子量、電荷の異なる複数の型が存在
することを示した（Murthy,A.S.N等、J.Biol.Chem.261
1815−1822）が、いずれの型の酵素についても、単一で
純粋な状態にまで精製されていない。
本発明は、充分に精製されたペプチドＣ末端アミド化酵
素と、その製造法を提供しようとするものである。
素と、その製造法を提供しようとするものである。
本発明者らは、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）
の体皮で、Ｃ末端アミド化ペプチドであるTRH（Thyrotr
opin Releasing Hormone）やセルレイン（caerulein）
が生合成されている事に着目し、この体皮に目的とする
ペプチドＣ末端アミド化酵素が存在する事を認識し，こ
こから本発明の酵素を抽出・精製した。又、本発明にお
ける酵素活性の測定法として、〔125I〕−Ac−Tyr−Phe
−Glyを基質として用いる簡便かつ高感度の測定法を開
発し、これを用いた。
の体皮で、Ｃ末端アミド化ペプチドであるTRH（Thyrotr
opin Releasing Hormone）やセルレイン（caerulein）
が生合成されている事に着目し、この体皮に目的とする
ペプチドＣ末端アミド化酵素が存在する事を認識し，こ
こから本発明の酵素を抽出・精製した。又、本発明にお
ける酵素活性の測定法として、〔125I〕−Ac−Tyr−Phe
−Glyを基質として用いる簡便かつ高感度の測定法を開
発し、これを用いた。
以下、本発明を詳細に説明する。
（酵素の性質） （１） 作用・基質特異性 Ｃ末端にグリシン残基を有するペプチドを基質とし、Ｃ
末端グリシンが欠失しかつＣ末端がα−アミド化された
ペプチドを与える。即ち、 で示される変換に関与する酵素である。（Ｉ）で示され
る−Glyは必須で、これが（II）で示されるＣ末端アミ
ドのＮの供与体となる。
末端グリシンが欠失しかつＣ末端がα−アミド化された
ペプチドを与える。即ち、 で示される変換に関与する酵素である。（Ｉ）で示され
る−Glyは必須で、これが（II）で示されるＣ末端アミ
ドのＮの供与体となる。
（２） 分子量 SDSゲル電気泳動法により測定した分子量は約39,000で
ある。
ある。
（３） 至適pH 至適pHは６〜７である。
（４） 各種物質に対する酵素活性の応答 Cu++イオン酵素活性発現に必須である。また、0.1m
M EDTAによって阻害されるが、これに0.12mM以上のCuSO
4を添加すると酵素活性は回復する。
M EDTAによって阻害されるが、これに0.12mM以上のCuSO
4を添加すると酵素活性は回復する。
1mMジチオスレイトールによって阻害される。チオ
ール化合物により阻害された酵素活性は1.2mM CuSO4又
は5mM N−エチルマレイミドによって回復する。
ール化合物により阻害された酵素活性は1.2mM CuSO4又
は5mM N−エチルマレイミドによって回復する。
反応液中にアスコルビン酸が存在しないと酵素活性
は低下する。
は低下する。
（５） アミノ酸配列 Ｎ末端にSer−Leu−Ser…の配列を有する。
（製造方法） この発明の酵素を抽出するための組織としてアフリカツ
メガエルの体皮が挙げられる。
メガエルの体皮が挙げられる。
この発明の酵素を、この体皮から抽出するには、まず、
この体皮を適当な緩衝液を用いて洗浄した後物理的手段
を用いて破砕して酵素を溶出させ、この溶出液から常法
に従い酵素を回収・精製する。例えば、酵素溶出液を遠
心分離して不溶物を除去し、得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを添加し、80％飽和として酵素を塩析した後、遠
心分離により沈澱物として回収する。この沈澱を適当な
溶媒に溶解して透析後、DEAEセルロースDE−52カラムク
ロマトグラフィーのリン酸ナトリウムバッファー直線濃
度勾配で溶出する。次に溶出液の活性画分をアフィジェ
ルブルーカラムによるアフィニティークロマトグラフィ
ーにおいてNaCl直線濃度勾配により溶出する。活性画分
をセファクリルＳ−300でゲル濾過した後、ヒドロキシ
ルアパタイトにより精製すると２つの活性画分を得られ
る。このうち、主活性画分（第３図中、Ｉの画分）をさ
らにハイパフォーマンスヒドロキシルアパタイトで精製
した後、Superose12によりゲル濾過して、本発明の酵素
であるＣ末端アミド化酵素AE−Ｉの最終精製製品が得ら
れる。
この体皮を適当な緩衝液を用いて洗浄した後物理的手段
を用いて破砕して酵素を溶出させ、この溶出液から常法
に従い酵素を回収・精製する。例えば、酵素溶出液を遠
心分離して不溶物を除去し、得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを添加し、80％飽和として酵素を塩析した後、遠
心分離により沈澱物として回収する。この沈澱を適当な
溶媒に溶解して透析後、DEAEセルロースDE−52カラムク
ロマトグラフィーのリン酸ナトリウムバッファー直線濃
度勾配で溶出する。次に溶出液の活性画分をアフィジェ
ルブルーカラムによるアフィニティークロマトグラフィ
ーにおいてNaCl直線濃度勾配により溶出する。活性画分
をセファクリルＳ−300でゲル濾過した後、ヒドロキシ
ルアパタイトにより精製すると２つの活性画分を得られ
る。このうち、主活性画分（第３図中、Ｉの画分）をさ
らにハイパフォーマンスヒドロキシルアパタイトで精製
した後、Superose12によりゲル濾過して、本発明の酵素
であるＣ末端アミド化酵素AE−Ｉの最終精製製品が得ら
れる。
上述のヒドロキシアパタイト処理で得られる２つの活性
画分のうち、副活性画分（第３図中のIIの画分）につい
て同様に精製を進め、Superose12カラム処理すると、SD
Sゲル電気泳動（SDS−PAGE）で分子量約34,000と約39,0
00を示す２つの物質が得られる（第５図参照）。これら
も先の本発明酵素（AE−Ｉ）と同様にペプチドＣ末端ア
ミド化活性を示す。
画分のうち、副活性画分（第３図中のIIの画分）につい
て同様に精製を進め、Superose12カラム処理すると、SD
Sゲル電気泳動（SDS−PAGE）で分子量約34,000と約39,0
00を示す２つの物質が得られる（第５図参照）。これら
も先の本発明酵素（AE−Ｉ）と同様にペプチドＣ末端ア
ミド化活性を示す。
（酵素活性の測定方法） この発明のα−アミド化酵素の活性は、合成したペプチ
ド〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Glyを基質として用いて測
定する。1pmoleの基質（70,000〜150,000cpm）を、0.2M
トリス−塩酸バッファー〔２μM CuSO4,0.25mMアスコル
ビン酸、25μｇカタラーゼ（Boehringer社製）及び0.1
％ルブロール（Type PX）（半井化学薬品（株）社製）
を含む、pH7.0〕250μ中で被験酵素液と37℃、１〜４
時間反応させる。これに1Mトリス塩酸バッファー（pH7.
0）0.75mlと、酢酸エチル／蒸留水混合液の有機溶媒層2
mlとを加え強く撹拌した後、3000rpm、３分間遠心分離
して有機溶媒層と水層を分離する。ここで未反応基質
（〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Gly）の98％以上が水層
に、本発明の酵素によりＣ末端がアミド化された基質
（〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Gly）の98％以上が有機溶
媒層に移項するため両者を容易に分離することができ
る。Ｃ末端アミド化生成物への変換率は、総放射能活性
に対する有機溶媒層の放射能活性の比から求めることが
できる。この測定において、１時間当り〔125I〕−Ac−
Tyr−Phe−Glyが〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−NH2に50％変
換する酵素量を１ユニットと定義する。比験酵素液とし
て、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）体皮の粗抽
出物を用いた場合の酢酸エチル層の放射能活性は、マイ
クロボンダパックＣ−18（μBondapak C−18,Waters
社）の逆相HPLCを用いて溶出した画分について測定す
る。溶出は10mMギ酸アンモニウム（pH4.0）の、10〜50
％CH3CN直線濃度勾配で行なう（流速2.0ml/分、40
分、）（第１図参照）。第１図の放射能活性のピーク
は、同じ条件で溶出されるAc−Tyr−Phe−NH2構造をも
つ標準ペプチドと同一の位置に現われ、本発明の酵素に
より〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Glyが〔125I〕−Ac−Tyr
−Phe−NH2に変換されていることが認められる。
ド〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Glyを基質として用いて測
定する。1pmoleの基質（70,000〜150,000cpm）を、0.2M
トリス−塩酸バッファー〔２μM CuSO4,0.25mMアスコル
ビン酸、25μｇカタラーゼ（Boehringer社製）及び0.1
％ルブロール（Type PX）（半井化学薬品（株）社製）
を含む、pH7.0〕250μ中で被験酵素液と37℃、１〜４
時間反応させる。これに1Mトリス塩酸バッファー（pH7.
0）0.75mlと、酢酸エチル／蒸留水混合液の有機溶媒層2
mlとを加え強く撹拌した後、3000rpm、３分間遠心分離
して有機溶媒層と水層を分離する。ここで未反応基質
（〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Gly）の98％以上が水層
に、本発明の酵素によりＣ末端がアミド化された基質
（〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Gly）の98％以上が有機溶
媒層に移項するため両者を容易に分離することができ
る。Ｃ末端アミド化生成物への変換率は、総放射能活性
に対する有機溶媒層の放射能活性の比から求めることが
できる。この測定において、１時間当り〔125I〕−Ac−
Tyr−Phe−Glyが〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−NH2に50％変
換する酵素量を１ユニットと定義する。比験酵素液とし
て、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）体皮の粗抽
出物を用いた場合の酢酸エチル層の放射能活性は、マイ
クロボンダパックＣ−18（μBondapak C−18,Waters
社）の逆相HPLCを用いて溶出した画分について測定す
る。溶出は10mMギ酸アンモニウム（pH4.0）の、10〜50
％CH3CN直線濃度勾配で行なう（流速2.0ml/分、40
分、）（第１図参照）。第１図の放射能活性のピーク
は、同じ条件で溶出されるAc−Tyr−Phe−NH2構造をも
つ標準ペプチドと同一の位置に現われ、本発明の酵素に
より〔125I〕−Ac−Tyr−Phe−Glyが〔125I〕−Ac−Tyr
−Phe−NH2に変換されていることが認められる。
実施例1.アフリカツメガエルからＣ末端アミド化酵素の
抽出・精製 アフリカツメガエル（Xenopus laevis）８匹の体皮48g
を、20μM CuSO4を含む10mMトリス塩酸バッファー（pH
7.0）１でポリトロンホモジナイザーを用いて破砕し
た後、30,000×ｇ、30分間遠心分離して上清を得た。沈
澱物は、さらに同バッファー600mlでポリトロンホモジ
ナイザーを用いて破砕・遠心分離し、得られた上清を先
の上清と合わせ粗抽出液とした。この粗抽出液に、硫酸
アンモニウム80％飽和となる様加えることにより塩析
し、生成した不溶物を、2mMリン酸ナトリウムバッファ
ー（20μM CuSO4を含む、pH8.6）120mlに懸濁し、同バ
ッファーに対して透析した。透析内液を、同バッファー
で平衡化したDEAEセルロースDE52を充填したカラム（４
×32cm）に吸着せしめた。吸着物を2mM〜250mMリン酸ナ
トリウムバッファー（pH8.6）を用いる直線濃度勾配法
により溶出し、既述の方法によりＣ末端アミド化酵素活
性を測定して活性画分を得た。この活性画分に、硫酸ア
ンモニウム80％飽和となる様に加えて塩析し、生成した
不溶物を少量の5mMトリス塩酸バッファー（２μM CuSO4
を含む、pH7.0）に溶解し、同バッファーに対して透析
する事により濃縮した。透析内液を、同バッファーで平
衡化したアフィジェルブルー（バイオラッド社製）を充
填したカラム（4.0×32cm）に吸着せしめた。吸着物
を、NaCl濃度を０〜1.0Mとした同バッファー溶液を用い
る直線濃度勾配法により溶出した（流速40ml/時）（第
２図）。活性画分を、YM−10メンブラン（アミコン社
製）を用いる限外濾過により濃縮した。この濃縮内液
を、50mMトリス塩酸（0.1M NaCl,2μM CuSO4を含む、pH
7.0）で平衡化したセファクリルＳ−300を充填したカラ
ム（3.0×140cm）にかけ、同溶液により溶出し（流速40
ml/時）活性画分をYM−10メンブラン（先述）で濃縮し
た後、10mMリン酸カリウムバッファー〔10mM CaCl2,0.1
％ルブロール（半井化学社製）を含む、pH6.8〕で平衡
化したヒドロキシアパタイトを充填したカラムに吸着せ
しめた。10mM〜400mMリン酸カリウムバッファー（10mM
CaCl2,0.1％ルブロールを含む、pH6.8）を用いる直線濃
度勾配法により溶出し（流速12ml/時）２つの活性画分
を得た（第３図）。このうち、大きなピークの活性画分
（第３図中Ｉの画分）をAE−Ｉ画分、小さなピークの活
性画分をAE−II画分とした。AE−Ｉ画分を蒸留水で３倍
希釈した後、高力価のヒドロキシルアパタイト（バイオ
ラッド社製）を充填したカラムに吸着せしめ、0.01〜0.
35Mリン酸ナトリウムバッファー（10μM CaCl2,0.1％ル
ブロールを含む、pH6.8）を用いた直線濃度勾配法によ
り溶出した。活性画分を、Superose12（ファルマシア社
製）ゲルを充填したカラム（1.6×50cm）に付し、10mM
トリス塩酸バッファー（0.1M NaCl,0.1％ルブロールを
含む、pH7.0）を用いて溶出した（流速1.5ml/分）。精
製酵素AE−Ｉを得た（第４図）。一方、AE−II画分につ
いて、先述のAE−Ｉの場合と同様に精製を進め、精製酵
素AE−IIを得た。AE−I,AE−IIについて、12.5mMジチオ
スレイトール（DTT）存在下及び非存在下、不連続緩衝
液系（discontinuous buffer system）を用いたSDS−PA
GEにかけ、銀染色法により蛋白の染色を行った。その結
果を第５図に示す。DTTの有無にかかわらずAE−Ｉは分
子量約39,000に相当する位置に１本のバンドが得られ、
AE−IIは分子量約34,000及び約39,000に相当する位置に
各１本のバンドが得られた。AE−Ｉ酵素の精製度につい
て更に、ハイポアRP−304（バイオラッド社製）による
逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分析
した。即ちAE−I 2μｇをハイポアRP−304を充填したカ
ラムに吸着せしめ、10〜60％CH3CNの0.1％トリフルオロ
酢酸溶液を用いた直線濃度勾配法により溶出したところ
（流速1.5ml/分）（第６図）、単一のピークを示す酵素
画分を得た。表１には各精製工程での総蛋白量、Ｃ末端
α−アミド化酵素活性および、比活性、収率、精製倍率
を示す。
抽出・精製 アフリカツメガエル（Xenopus laevis）８匹の体皮48g
を、20μM CuSO4を含む10mMトリス塩酸バッファー（pH
7.0）１でポリトロンホモジナイザーを用いて破砕し
た後、30,000×ｇ、30分間遠心分離して上清を得た。沈
澱物は、さらに同バッファー600mlでポリトロンホモジ
ナイザーを用いて破砕・遠心分離し、得られた上清を先
の上清と合わせ粗抽出液とした。この粗抽出液に、硫酸
アンモニウム80％飽和となる様加えることにより塩析
し、生成した不溶物を、2mMリン酸ナトリウムバッファ
ー（20μM CuSO4を含む、pH8.6）120mlに懸濁し、同バ
ッファーに対して透析した。透析内液を、同バッファー
で平衡化したDEAEセルロースDE52を充填したカラム（４
×32cm）に吸着せしめた。吸着物を2mM〜250mMリン酸ナ
トリウムバッファー（pH8.6）を用いる直線濃度勾配法
により溶出し、既述の方法によりＣ末端アミド化酵素活
性を測定して活性画分を得た。この活性画分に、硫酸ア
ンモニウム80％飽和となる様に加えて塩析し、生成した
不溶物を少量の5mMトリス塩酸バッファー（２μM CuSO4
を含む、pH7.0）に溶解し、同バッファーに対して透析
する事により濃縮した。透析内液を、同バッファーで平
衡化したアフィジェルブルー（バイオラッド社製）を充
填したカラム（4.0×32cm）に吸着せしめた。吸着物
を、NaCl濃度を０〜1.0Mとした同バッファー溶液を用い
る直線濃度勾配法により溶出した（流速40ml/時）（第
２図）。活性画分を、YM−10メンブラン（アミコン社
製）を用いる限外濾過により濃縮した。この濃縮内液
を、50mMトリス塩酸（0.1M NaCl,2μM CuSO4を含む、pH
7.0）で平衡化したセファクリルＳ−300を充填したカラ
ム（3.0×140cm）にかけ、同溶液により溶出し（流速40
ml/時）活性画分をYM−10メンブラン（先述）で濃縮し
た後、10mMリン酸カリウムバッファー〔10mM CaCl2,0.1
％ルブロール（半井化学社製）を含む、pH6.8〕で平衡
化したヒドロキシアパタイトを充填したカラムに吸着せ
しめた。10mM〜400mMリン酸カリウムバッファー（10mM
CaCl2,0.1％ルブロールを含む、pH6.8）を用いる直線濃
度勾配法により溶出し（流速12ml/時）２つの活性画分
を得た（第３図）。このうち、大きなピークの活性画分
（第３図中Ｉの画分）をAE−Ｉ画分、小さなピークの活
性画分をAE−II画分とした。AE−Ｉ画分を蒸留水で３倍
希釈した後、高力価のヒドロキシルアパタイト（バイオ
ラッド社製）を充填したカラムに吸着せしめ、0.01〜0.
35Mリン酸ナトリウムバッファー（10μM CaCl2,0.1％ル
ブロールを含む、pH6.8）を用いた直線濃度勾配法によ
り溶出した。活性画分を、Superose12（ファルマシア社
製）ゲルを充填したカラム（1.6×50cm）に付し、10mM
トリス塩酸バッファー（0.1M NaCl,0.1％ルブロールを
含む、pH7.0）を用いて溶出した（流速1.5ml/分）。精
製酵素AE−Ｉを得た（第４図）。一方、AE−II画分につ
いて、先述のAE−Ｉの場合と同様に精製を進め、精製酵
素AE−IIを得た。AE−I,AE−IIについて、12.5mMジチオ
スレイトール（DTT）存在下及び非存在下、不連続緩衝
液系（discontinuous buffer system）を用いたSDS−PA
GEにかけ、銀染色法により蛋白の染色を行った。その結
果を第５図に示す。DTTの有無にかかわらずAE−Ｉは分
子量約39,000に相当する位置に１本のバンドが得られ、
AE−IIは分子量約34,000及び約39,000に相当する位置に
各１本のバンドが得られた。AE−Ｉ酵素の精製度につい
て更に、ハイポアRP−304（バイオラッド社製）による
逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分析
した。即ちAE−I 2μｇをハイポアRP−304を充填したカ
ラムに吸着せしめ、10〜60％CH3CNの0.1％トリフルオロ
酢酸溶液を用いた直線濃度勾配法により溶出したところ
（流速1.5ml/分）（第６図）、単一のピークを示す酵素
画分を得た。表１には各精製工程での総蛋白量、Ｃ末端
α−アミド化酵素活性および、比活性、収率、精製倍率
を示す。
実施例2.酵素AE−Ｉのアミノ酸配列同定 上記HPLCで得られた酵素画分について、Applied Biosys
tems社製のProtein Sequencer 470Aを用い、常法に従い
アミノ酸配列を調べた結果、Ｎ末端のアミノ酸配列は、
Ser−Leu−Ser…であった。
tems社製のProtein Sequencer 470Aを用い、常法に従い
アミノ酸配列を調べた結果、Ｎ末端のアミノ酸配列は、
Ser−Leu−Ser…であった。
実施例3. 基質としてTyr−Gly−Gly−Phe−Met−Arg−Arg−Val−
Gly 4nmolを用い、0.2Mトリス塩酸バッファー（２μM C
uSO4,0.25Mアスコルビン酸、25μｇカタラーゼ、0.1％
ルブロールを含む、pH7.0）中実施例１で得たＣ末端ア
ミド化酵素AE−I0.1μｇと37℃、24時間インキュベート
した。１％トリフルオロ酢酸250μを加えることによ
り反応を停止させた後、この溶液を、TSK ODS−120A
（東洋曹達社製）を充填したカラム（0.4×25cm）にか
け、12〜60％CH3CNの0.1トリフルオロ酢酸溶液を用い
て、直線濃度勾配法により溶出した（流速1.5ml/分）。
溶出液の210nmにおける吸光度を測定することによりペ
プチドの溶出画分を分析したところ、基質として用いた
ペプチドのＣ末端のGlyが欠失しかつＣ末端のα−アミ
ド化されたアドレノルフィンとして知られるペプチド
（Try−Gly−Gly−Phe−Met−Arg−Arg−Val−NH2）の
標品と一致する位置のみに単一のピークが得られた（第
７図中１で示した。第７図中ａの矢印はアドレノルフィ
ン標品の溶出ピークの位置を、ｂの矢印は基質標品の溶
出ピークの位置を、各々示している）。第７図より、…
Val−Gly体の75〜80％が、…Val−NH2体に変換されてい
ることがわかる。第７図中１の画分をとって6M塩酸存在
下で110℃、24時間反応させることにより、ペプチドを
加水分解した後、アミノ酸分析機を用いて、アミノ酸組
成を分析した。このアミノ酸組成並びに、サーモライシ
ン消化後の薄層クロマト（TLC）によるＣ末端アミドの
分析、およびHPLCでのペプチド標品との保持時間の比較
から、第７図に示したピークｂは、アドレノルフィンで
あると同定された。
Gly 4nmolを用い、0.2Mトリス塩酸バッファー（２μM C
uSO4,0.25Mアスコルビン酸、25μｇカタラーゼ、0.1％
ルブロールを含む、pH7.0）中実施例１で得たＣ末端ア
ミド化酵素AE−I0.1μｇと37℃、24時間インキュベート
した。１％トリフルオロ酢酸250μを加えることによ
り反応を停止させた後、この溶液を、TSK ODS−120A
（東洋曹達社製）を充填したカラム（0.4×25cm）にか
け、12〜60％CH3CNの0.1トリフルオロ酢酸溶液を用い
て、直線濃度勾配法により溶出した（流速1.5ml/分）。
溶出液の210nmにおける吸光度を測定することによりペ
プチドの溶出画分を分析したところ、基質として用いた
ペプチドのＣ末端のGlyが欠失しかつＣ末端のα−アミ
ド化されたアドレノルフィンとして知られるペプチド
（Try−Gly−Gly−Phe−Met−Arg−Arg−Val−NH2）の
標品と一致する位置のみに単一のピークが得られた（第
７図中１で示した。第７図中ａの矢印はアドレノルフィ
ン標品の溶出ピークの位置を、ｂの矢印は基質標品の溶
出ピークの位置を、各々示している）。第７図より、…
Val−Gly体の75〜80％が、…Val−NH2体に変換されてい
ることがわかる。第７図中１の画分をとって6M塩酸存在
下で110℃、24時間反応させることにより、ペプチドを
加水分解した後、アミノ酸分析機を用いて、アミノ酸組
成を分析した。このアミノ酸組成並びに、サーモライシ
ン消化後の薄層クロマト（TLC）によるＣ末端アミドの
分析、およびHPLCでのペプチド標品との保持時間の比較
から、第７図に示したピークｂは、アドレノルフィンで
あると同定された。
更に、基質としてTyr−Phe−Gly,Ac−Tyr−Phe−Gly,D
−Tyr−Val−Gly,D−Tyr−Gly−Gly,Tyr−Gly−Gly−Ph
e−Met−Arg−Arg−Val、及びBAM−12P（Tyr−Gly−Gly
−Phe−Met−Arg−Arg−Val−Gly−Arg−Pro−Glu）、
を用いAE−Ｉの存在下、Ｃ末端アミド化体への変換率を
求めた。結果を第８図に示した。Ｃ末端にGly残基を有
するペプチドはいずれもＣ末端アミド化物に経時的に変
換されたが、Ｃ末端にGlyを有さない基質は48時間後に
おいても、Ｃ末端アミド化体への変換は見られず、本発
明の酵素が、Ｃ末端にGly残基を有するペプチドを特異
的にアミド体に変換する有用な酵素であることが確認さ
れた。
−Tyr−Val−Gly,D−Tyr−Gly−Gly,Tyr−Gly−Gly−Ph
e−Met−Arg−Arg−Val、及びBAM−12P（Tyr−Gly−Gly
−Phe−Met−Arg−Arg−Val−Gly−Arg−Pro−Glu）、
を用いAE−Ｉの存在下、Ｃ末端アミド化体への変換率を
求めた。結果を第８図に示した。Ｃ末端にGly残基を有
するペプチドはいずれもＣ末端アミド化物に経時的に変
換されたが、Ｃ末端にGlyを有さない基質は48時間後に
おいても、Ｃ末端アミド化体への変換は見られず、本発
明の酵素が、Ｃ末端にGly残基を有するペプチドを特異
的にアミド体に変換する有用な酵素であることが確認さ
れた。
AE−ＩのかわりにAE−IIを用いて同様に活性を見たとこ
ろ、上述と同様の結果が得られた。
ろ、上述と同様の結果が得られた。
第１図は、この発明のα−アミド化酵素AE−Ｉによりア
ミド化された基質（ペプチド）の、マイクロボンダパッ
クＣ−18を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーにお
ける溶出経過を示す。 第２図は、アファジェルブルーを用いるカラムクロマト
グラフィーにおける溶出経過を示す。 第３図は、ヒドロキシルアパタイトを用いるカラムクロ
マトグラフィーにおける溶出経過を示す。 第４図は、この発明の酵素AE−Ｉの、Superose12ゲルを
用いるカラムクロマトグラフィーにおける溶出経過を示
す。 第５図は、この発明の酵素AE−Ｉを、ジチオスレイトー
ルの存在下（図中（＋）で示す）および非存在下（図中
（−）で示す）でSDS−PAGEにかけた結果を示す。 第６図は、この発明の酵素AE−Ｉの、ハイポアRP−304
を用いたカラムクロマトグラフィーにおける溶出経過を
示す。 第７図はTSK ODS−120Aを用いたカラムクロマトグラフ
ィーを示し、は、基質として用いたTyr−Gly−Gly−P
he−Met−Arg−Arg−Val−Glyの反応０時の溶出パター
ンを、はで用いた基質と発明の酵素AE−Ｉとを24時
間作用させ得られた反応生成物の溶出パターンを示す。 また、のa,bの矢印は、標準のアドレノルフィンおよ
びTyr−Gly−Gly−Phe−Met−Arg−Arg−Val−Glyが溶
出される位置を示す。の１の位置はのａの矢印の位
置と、２はｂの矢印の位置と一致する。 第８図は、この発明の酵素AE−Ｉによる各種基質のＣ末
端α−アミド化体への変換率を示すグラフである。
ミド化された基質（ペプチド）の、マイクロボンダパッ
クＣ−18を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーにお
ける溶出経過を示す。 第２図は、アファジェルブルーを用いるカラムクロマト
グラフィーにおける溶出経過を示す。 第３図は、ヒドロキシルアパタイトを用いるカラムクロ
マトグラフィーにおける溶出経過を示す。 第４図は、この発明の酵素AE−Ｉの、Superose12ゲルを
用いるカラムクロマトグラフィーにおける溶出経過を示
す。 第５図は、この発明の酵素AE−Ｉを、ジチオスレイトー
ルの存在下（図中（＋）で示す）および非存在下（図中
（−）で示す）でSDS−PAGEにかけた結果を示す。 第６図は、この発明の酵素AE−Ｉの、ハイポアRP−304
を用いたカラムクロマトグラフィーにおける溶出経過を
示す。 第７図はTSK ODS−120Aを用いたカラムクロマトグラフ
ィーを示し、は、基質として用いたTyr−Gly−Gly−P
he−Met−Arg−Arg−Val−Glyの反応０時の溶出パター
ンを、はで用いた基質と発明の酵素AE−Ｉとを24時
間作用させ得られた反応生成物の溶出パターンを示す。 また、のa,bの矢印は、標準のアドレノルフィンおよ
びTyr−Gly−Gly−Phe−Met−Arg−Arg−Val−Glyが溶
出される位置を示す。の１の位置はのａの矢印の位
置と、２はｂの矢印の位置と一致する。 第８図は、この発明の酵素AE−Ｉによる各種基質のＣ末
端α−アミド化体への変換率を示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】次の性質： Ｃ末端にグリシン残基をもったペプチドを該グリシ
ン残基が欠失したＣ末端α−アミド体に変換する； SDSゲル電気泳動法により測定した分子量が約39,00
0である； Ｎ末端のアミノ酸配列が、Ser−Leu−Ser…で表わ
される； 至適pHは６〜７である；並びに 各種物質に対する酵素活性の応答 （ａ）Cu++イオンが酵素活性発現に必須である、 （ｂ）酵素活性は1mMジチオスレイトールによって阻害
されるが1.2mM CuSO4又は5mM N−エチルマレイミドによ
って回復する、及び （ｃ）反応液中にアスコルビン酸が存在しないと酵素活
性は低下する； を有するＣ末端アミド化酵素。 - 【請求項２】次の性質： Ｃ末端にグリシン残基をもったペプチドを該グリシ
ン残基が欠失したＣ末端α−アミド体に変換する； SDSゲル電気泳動法により測定した分子量が約39,00
0である； Ｎ末端のアミノ酸配列が、Ser−Leu−Ser…で表わ
される； 至適pHは６〜７である；並びに 各種物質に対する酵素活性の応答 （ａ）Cu++イオンが酵素活性発現に必須である、 （ｂ）酵素活性は1mMジチオスレイトールによって阻害
されるが1.2mM CuSO4又は5mM N−エチルマレイミドによ
って回復する、及び （ｃ）反応液中にアスコルビン酸が存在しないと酵素活
性は低下する； を有するＣ末端アミド酵素の製造方法において、上記酵
素活性を有するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）
の体皮から該酵素を抽出・精製することを特徴とする方
法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61131089A JPH0775541B2 (ja) | 1986-06-07 | 1986-06-07 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
| EP87304994A EP0249412B1 (en) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal alpha-amidating enzyme and process for production and use thereof |
| DE8787304994T DE3781832T2 (de) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal-alpha-amidierendes enzym und verfahren zu dessen herstellung und verwendung. |
| ES87304994T ES2044928T3 (es) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | Enzima alfa-amidante en terminal c y procedimiento para la produccion y el uso del mismo. |
| US07/058,919 US4921797A (en) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal alpha-amidating enzyme and process for production and use thereof |
| AT87304994T ATE80911T1 (de) | 1986-06-07 | 1987-06-05 | C-terminal-alpha-amidierendes enzym und verfahren zu dessen herstellung und verwendung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61131089A JPH0775541B2 (ja) | 1986-06-07 | 1986-06-07 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62289184A JPS62289184A (ja) | 1987-12-16 |
| JPH0775541B2 true JPH0775541B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=15049719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61131089A Expired - Lifetime JPH0775541B2 (ja) | 1986-06-07 | 1986-06-07 | Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4921797A (ja) |
| EP (1) | EP0249412B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0775541B2 (ja) |
| AT (1) | ATE80911T1 (ja) |
| DE (1) | DE3781832T2 (ja) |
| ES (1) | ES2044928T3 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6319685B1 (en) | 1984-09-27 | 2001-11-20 | Unigene Laboratories, Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| JP2598050B2 (ja) * | 1987-07-17 | 1997-04-09 | サントリー株式会社 | Ｃ−末端α−アミド化酵素 |
| US5789234A (en) * | 1987-08-14 | 1998-08-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| JP2653820B2 (ja) * | 1988-03-14 | 1997-09-17 | 壽之 松尾 | アミド化酵素及びその製造方法 |
| JP2845468B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1999-01-13 | サントリー株式会社 | ヒト甲状腺由来Ｃ―末端α―アミド化酵素 |
| JP2535398B2 (ja) * | 1989-01-17 | 1996-09-18 | サントリー株式会社 | アミド化ペプチドの製造方法 |
| ATE130368T1 (de) * | 1990-06-01 | 1995-12-15 | Japat Ltd | Peptdidylhydroxylglycine n-c lyase und dns dafür kodierend. |
| US5580751A (en) * | 1990-09-14 | 1996-12-03 | Carlsberg A/S | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4708934A (en) * | 1984-09-27 | 1987-11-24 | Unigene Laboratories, Inc. | α-amidation enzyme |
| GB8515630D0 (en) * | 1985-06-20 | 1985-07-24 | Celltech Ltd | Enzyme purification |
-
1986
- 1986-06-07 JP JP61131089A patent/JPH0775541B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-05 AT AT87304994T patent/ATE80911T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-05 DE DE8787304994T patent/DE3781832T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 EP EP87304994A patent/EP0249412B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 ES ES87304994T patent/ES2044928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-05 US US07/058,919 patent/US4921797A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3781832D1 (de) | 1992-10-29 |
| US4921797A (en) | 1990-05-01 |
| EP0249412A2 (en) | 1987-12-16 |
| EP0249412B1 (en) | 1992-09-23 |
| DE3781832T2 (de) | 1993-04-01 |
| ES2044928T3 (es) | 1994-01-16 |
| EP0249412A3 (en) | 1989-02-22 |
| JPS62289184A (ja) | 1987-12-16 |
| ATE80911T1 (de) | 1992-10-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |