JPH0775585A - Ｃ型肝炎ウイルス関連オリゴヌクレオチドならびにｃ型肝炎 ウイルス遺伝子型判定方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス関連オリゴヌクレオチドならびにｃ型肝炎 ウイルス遺伝子型判定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法、新たに見いださ
れた遺伝子型であるＶ型を含めたＨＣＶ遺伝子型判定方
法、ならびにこれに使用するオリゴヌクレオチドを提供
することを目的とする。 【構成】配列番号１ないし３記載のオリゴヌクレオチ
ド、これらと部分置換を有し、またはこれらと相補的な
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの発明であり、こ
れらのオリゴヌクレオチドを用い、さらに配列番号４な
いし１０記載のオリゴヌクレオチドを併用するＣ型肝炎
ウイルス遺伝子の検出方法、遺伝子型判定方法の発明で
ある。 【効果】ＨＣＶの遺伝子の検出、遺伝子型の簡便、迅
速、正確な型判定によるＨＣＶ肝炎の診断、予防、治
療、薬物治療の適性判定等に応用できる。
れた遺伝子型であるＶ型を含めたＨＣＶ遺伝子型判定方
法、ならびにこれに使用するオリゴヌクレオチドを提供
することを目的とする。 【構成】配列番号１ないし３記載のオリゴヌクレオチ
ド、これらと部分置換を有し、またはこれらと相補的な
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの発明であり、こ
れらのオリゴヌクレオチドを用い、さらに配列番号４な
いし１０記載のオリゴヌクレオチドを併用するＣ型肝炎
ウイルス遺伝子の検出方法、遺伝子型判定方法の発明で
ある。 【効果】ＨＣＶの遺伝子の検出、遺伝子型の簡便、迅
速、正確な型判定によるＨＣＶ肝炎の診断、予防、治
療、薬物治療の適性判定等に応用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）の検出方法およびＣ型肝炎ウ
イルスに存在する遺伝子型を簡便に判定する方法ならび
に、これに用いるオリゴヌクレオチドに関する。
下「ＨＣＶ」と略記する）の検出方法およびＣ型肝炎ウ
イルスに存在する遺伝子型を簡便に判定する方法ならび
に、これに用いるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】肝炎を引き起こすウイルスとしては、従
来よりＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎，Ｅ型肝炎が知ら
れていたが、これらのいずれの型にも属さない別の肝炎
ウイルスの存在が推測されていた。日本に於いてはＢ型
肝炎ウイルスに対する検査が輸血血液スクリーニングに
導入されてからはＢ型肝炎の発生は格段に減少したが、
それでも年間２８万例のウイルス性肝炎の発症が推定さ
れており、これらの多くは上記の別型の肝炎ウイルスに
よって引き起こされていると考えられていた。
来よりＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎，Ｅ型肝炎が知ら
れていたが、これらのいずれの型にも属さない別の肝炎
ウイルスの存在が推測されていた。日本に於いてはＢ型
肝炎ウイルスに対する検査が輸血血液スクリーニングに
導入されてからはＢ型肝炎の発生は格段に減少したが、
それでも年間２８万例のウイルス性肝炎の発症が推定さ
れており、これらの多くは上記の別型の肝炎ウイルスに
よって引き起こされていると考えられていた。
【０００３】１９８８年に米国カイロン社は、従来知ら
れているいずれの肝炎ウイルスにも属さない新しい肝炎
ウイルス遺伝子のクローン化に成功し、これをＣ型肝炎
ウイルスと命名、一部の遺伝子配列を発表した。また、
この遺伝子情報に基づいて抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体の測
定法ならびにキットが開発され一般に使用されるように
なった。しかし、カイロン社によって開発されたＣ型肝
炎ウイルス抗体キットを使用したものではウイルスキャ
リアならびに慢性肝炎の捕捉率は７０％にすぎず、急性
肝炎の急性期では抗体検出がてきない等の問題が明らか
となり、いまだ検査法は未完成であり、今後の発展が求
められていた。
れているいずれの肝炎ウイルスにも属さない新しい肝炎
ウイルス遺伝子のクローン化に成功し、これをＣ型肝炎
ウイルスと命名、一部の遺伝子配列を発表した。また、
この遺伝子情報に基づいて抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体の測
定法ならびにキットが開発され一般に使用されるように
なった。しかし、カイロン社によって開発されたＣ型肝
炎ウイルス抗体キットを使用したものではウイルスキャ
リアならびに慢性肝炎の捕捉率は７０％にすぎず、急性
肝炎の急性期では抗体検出がてきない等の問題が明らか
となり、いまだ検査法は未完成であり、今後の発展が求
められていた。
【０００４】その後、いくつかの研究機関により、それ
ぞれ独自にクローニングしたＨＣＶ株の部分的あるいは
全遺伝子配列が発表され、その遺伝子配列の特徴が解明
された。その結果、カイロン社により発表された遺伝子
配列とこれら新たに報告された遺伝子配列の間には配列
上の相違点が多々見られた。したがって、突然変異が頻
繁に生じていることが推測され、従って単一株の遺伝子
配列によってＨＣＶ遺伝子配列を特徴付けることはでき
ないことが判明してきた。
ぞれ独自にクローニングしたＨＣＶ株の部分的あるいは
全遺伝子配列が発表され、その遺伝子配列の特徴が解明
された。その結果、カイロン社により発表された遺伝子
配列とこれら新たに報告された遺伝子配列の間には配列
上の相違点が多々見られた。したがって、突然変異が頻
繁に生じていることが推測され、従って単一株の遺伝子
配列によってＨＣＶ遺伝子配列を特徴付けることはでき
ないことが判明してきた。
【０００５】上記の事実は、より完全な診断法ならびに
治療法の確立には数多くのＨＣＶ株の遺伝子配列を調
べ、相互の比較よりその遺伝的多様性を明らかにするこ
とが必要であり、これを前提に遺伝特性を明確にしなけ
れば、Ｃ型肝炎ウイルスの特性に合せた診断法・治療法
が確立されないことを示唆している。
治療法の確立には数多くのＨＣＶ株の遺伝子配列を調
べ、相互の比較よりその遺伝的多様性を明らかにするこ
とが必要であり、これを前提に遺伝特性を明確にしなけ
れば、Ｃ型肝炎ウイルスの特性に合せた診断法・治療法
が確立されないことを示唆している。
【０００６】輸血スクリーニングを目的とした抗体検査
薬では感染血の発見を目的とすることから各株間に共通
な遺伝子配列に基づく抗原を利用した検査が望まれてお
り、既に本発明者によるものを含め、幾つかの特異抗原
が報告されている。また、遺伝子によるウイルスの検出
検査に於いては検出率を高める為にはやはり各株に共通
な遺伝子配列を検出対象とすることが必要であるが、本
発明者によって５’末端側の非翻訳領域の保存性の高い
領域を対象とした検査法が開発、確立され、これは既に
広く実用化されているところである。
薬では感染血の発見を目的とすることから各株間に共通
な遺伝子配列に基づく抗原を利用した検査が望まれてお
り、既に本発明者によるものを含め、幾つかの特異抗原
が報告されている。また、遺伝子によるウイルスの検出
検査に於いては検出率を高める為にはやはり各株に共通
な遺伝子配列を検出対象とすることが必要であるが、本
発明者によって５’末端側の非翻訳領域の保存性の高い
領域を対象とした検査法が開発、確立され、これは既に
広く実用化されているところである。
【０００７】本発明者は、ＨＣＶが遺伝子配列の相同性
から４つに大きく分類され、コア領域と呼ばれる遺伝子
領域に型特異的な遺伝子配列が存在していることを究明
しこれは既に公表されている。更に、本発明者はコア領
域内の型共通配列と型特異的配列を有するオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして利用した遺伝子増幅法によ
り、ＨＣＶの４つの遺伝子型を簡便に分類する方法を発
明済である（特願平３−３０７２９６、４−９３９６
０、４−２７６５０２）。しかしその後、世界各地のＣ
型肝炎感染患者の血液から分離された核酸を対象にこれ
まで以上の数の株の分離・遺伝子配列の研究がなされ、
ＨＣＶの遺伝的多様性に関する情報が集積された結果、
これまでの４つの遺伝子型には分類されない新しい型の
存在も示唆されるようになった。
から４つに大きく分類され、コア領域と呼ばれる遺伝子
領域に型特異的な遺伝子配列が存在していることを究明
しこれは既に公表されている。更に、本発明者はコア領
域内の型共通配列と型特異的配列を有するオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして利用した遺伝子増幅法によ
り、ＨＣＶの４つの遺伝子型を簡便に分類する方法を発
明済である（特願平３−３０７２９６、４−９３９６
０、４−２７６５０２）。しかしその後、世界各地のＣ
型肝炎感染患者の血液から分離された核酸を対象にこれ
まで以上の数の株の分離・遺伝子配列の研究がなされ、
ＨＣＶの遺伝的多様性に関する情報が集積された結果、
これまでの４つの遺伝子型には分類されない新しい型の
存在も示唆されるようになった。
【０００８】ＨＣＶの遺伝子型を判定することは次のよ
うな診断・治療、予防上の利点がある。 垂直感染（母児間感染）、水平感染における感染経路
の解明ができる。 型別の肝炎の進行状況、症状の特色を知ることでこれ
を予後予測、治療指針情報として活用することにより正
確な病態の把握ができ、かつ効果的な治療方針が採用で
きる。 型別の薬剤感受性の違いを利用して、治療効果の推
定、あるいは選択薬剤の判定に使用することができ、有
効な治療、予防が可能になる。 これらの効果を十分発揮するためには正確に遺伝子型を
判定できることが必要である。
うな診断・治療、予防上の利点がある。 垂直感染（母児間感染）、水平感染における感染経路
の解明ができる。 型別の肝炎の進行状況、症状の特色を知ることでこれ
を予後予測、治療指針情報として活用することにより正
確な病態の把握ができ、かつ効果的な治療方針が採用で
きる。 型別の薬剤感受性の違いを利用して、治療効果の推
定、あるいは選択薬剤の判定に使用することができ、有
効な治療、予防が可能になる。 これらの効果を十分発揮するためには正確に遺伝子型を
判定できることが必要である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
報告されてきた４つの遺伝子型に分類されない新しい遺
伝子型、すなわちＶ型に特徴的な遺伝子配列を有するオ
リゴヌクレオチドと、これらオリゴヌクレオチドを用い
たＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法または遺伝子型判
定方法を提供することである。
報告されてきた４つの遺伝子型に分類されない新しい遺
伝子型、すなわちＶ型に特徴的な遺伝子配列を有するオ
リゴヌクレオチドと、これらオリゴヌクレオチドを用い
たＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法または遺伝子型判
定方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、現在広く
用いられている５’−非翻訳領域（以下「５’−ＮＣ」
と略記する）を対象としたＨＣＶ−ＲＮＡ検出法によっ
てウイルスの存在が確認されているにもかかわらず、本
発明者により開発されたＨＣＶに存在する４つの遺伝子
型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ならびにＩＶ型判定方法ではいず
れの型にも判別できない例があることを発見し、このこ
とから従来報告されていない新しい型のＨＣＶ株がある
ことを推定した。
用いられている５’−非翻訳領域（以下「５’−ＮＣ」
と略記する）を対象としたＨＣＶ−ＲＮＡ検出法によっ
てウイルスの存在が確認されているにもかかわらず、本
発明者により開発されたＨＣＶに存在する４つの遺伝子
型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ならびにＩＶ型判定方法ではいず
れの型にも判別できない例があることを発見し、このこ
とから従来報告されていない新しい型のＨＣＶ株がある
ことを推定した。
【００１１】本発明者らは、従来の４つの遺伝子型に分
類されないＨＣＶ株を検索した。まず、ＨＣＶ−ＲＮＡ
検査によりウイルスの存在が証明されているにもかかわ
らず従来の遺伝子型判定方法では型分類ができない患者
を検索し、血清を採取した。つぎに遺伝子配列の特性を
知るためにそれぞれの患者血清よりＨＣＶゲノムのＲＮ
Ａを単離し、それぞれの株の５’末端側の非翻訳領域の
一部、コア領域、エンベロープ領域ならびに非構造領域
１の一部を含む領域の塩基配列と３’末端側の非構造領
域５（ＮＳ５）の一部と非翻訳領域の塩基配列を決定し
た。
類されないＨＣＶ株を検索した。まず、ＨＣＶ−ＲＮＡ
検査によりウイルスの存在が証明されているにもかかわ
らず従来の遺伝子型判定方法では型分類ができない患者
を検索し、血清を採取した。つぎに遺伝子配列の特性を
知るためにそれぞれの患者血清よりＨＣＶゲノムのＲＮ
Ａを単離し、それぞれの株の５’末端側の非翻訳領域の
一部、コア領域、エンベロープ領域ならびに非構造領域
１の一部を含む領域の塩基配列と３’末端側の非構造領
域５（ＮＳ５）の一部と非翻訳領域の塩基配列を決定し
た。
【００１２】次に、それぞれの株の塩基配列を比較し相
同性を調べた。その結果、今回調べた株間の遺伝子配列
は９５％以上の相同性を有することを確認し、１つの遺
伝子型に分類されることが判明した。
同性を調べた。その結果、今回調べた株間の遺伝子配列
は９５％以上の相同性を有することを確認し、１つの遺
伝子型に分類されることが判明した。
【００１３】新しい１つの型に分類されることが判明し
た４株の遺伝子配列を、従来よりその存在が知られてい
た遺伝子型Ｉ〜ＩＶのそれぞれの対応領域の遺伝子配列
と比較した。その結果、今回配列が判明し１つの型に分
類されることが判明した配列と従来の遺伝子型株の遺伝
子配列との間には全配列では６９〜７４％の相同性しか
存在しないことが判明した。このことから、今回配列が
判明した株は従来の遺伝子型ではない新しい型に分類さ
れることが分かり、これをＶ型と命名した。
た４株の遺伝子配列を、従来よりその存在が知られてい
た遺伝子型Ｉ〜ＩＶのそれぞれの対応領域の遺伝子配列
と比較した。その結果、今回配列が判明し１つの型に分
類されることが判明した配列と従来の遺伝子型株の遺伝
子配列との間には全配列では６９〜７４％の相同性しか
存在しないことが判明した。このことから、今回配列が
判明した株は従来の遺伝子型ではない新しい型に分類さ
れることが分かり、これをＶ型と命名した。
【００１４】ＨＣＶの遺伝子配列は、遺伝子がもつ情報
の種類によって幾つかの領域に分類されているが、各領
域毎にＶ型ＨＣＶと他遺伝子型ＨＣＶの相同性について
調べた。５’−ＮＣ領域は８９〜９４％と最も高い相同
性を持つことが判明し、各型を通じて保存された領域で
あることが確認された。一方３’−ＮＣでは相同性は３
５〜６５％で低いことが判明した。
の種類によって幾つかの領域に分類されているが、各領
域毎にＶ型ＨＣＶと他遺伝子型ＨＣＶの相同性について
調べた。５’−ＮＣ領域は８９〜９４％と最も高い相同
性を持つことが判明し、各型を通じて保存された領域で
あることが確認された。一方３’−ＮＣでは相同性は３
５〜６５％で低いことが判明した。
【００１５】本発明者は、上記の見解に基づきＶ型に属
する各株の遺伝子配列中で保存されている領域を特定
し、その領域を増幅するのに最も適したプライマーとな
るオリゴヌクレオチドを発明した。このオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして利用したポリメラーゼチェイン
リアクション法（以下「ＰＣＲ法」と略記）を用いるこ
とでＶ型に特異的な増幅が生じ、増幅の有無よりＶ型の
判定ができる。
する各株の遺伝子配列中で保存されている領域を特定
し、その領域を増幅するのに最も適したプライマーとな
るオリゴヌクレオチドを発明した。このオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして利用したポリメラーゼチェイン
リアクション法（以下「ＰＣＲ法」と略記）を用いるこ
とでＶ型に特異的な増幅が生じ、増幅の有無よりＶ型の
判定ができる。
【００１６】すなわち、本発明は配列番号１ないし３記
載のオリゴヌクレオチドの発明であり、これらオリゴヌ
クレオチドと部分置換を有し、またはその一部を構成す
るオリゴヌクレオチド、これらと相補的な塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドの発明である。
載のオリゴヌクレオチドの発明であり、これらオリゴヌ
クレオチドと部分置換を有し、またはその一部を構成す
るオリゴヌクレオチド、これらと相補的な塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドの発明である。
【００１７】さらに、本発明は本発明の上記オリゴヌク
レオチドを用いるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法ま
たはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定方法の発明であり、
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法またはＣ型
肝炎ウイルス遺伝子型判定方法では、配列番号４ないし
１０記載のオリゴヌクレオチドを併用し、またポリメラ
ーゼチェインリアクション法によりｃＤＮＡを増幅する
ことができ、該遺伝子の検出または遺伝子型の判定は、
増幅されたｃＤＮＡの分子長を測定することによって行
うことができる。
レオチドを用いるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法ま
たはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定方法の発明であり、
本発明のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法またはＣ型
肝炎ウイルス遺伝子型判定方法では、配列番号４ないし
１０記載のオリゴヌクレオチドを併用し、またポリメラ
ーゼチェインリアクション法によりｃＤＮＡを増幅する
ことができ、該遺伝子の検出または遺伝子型の判定は、
増幅されたｃＤＮＡの分子長を測定することによって行
うことができる。
【００１８】ｃＤＮＡの増幅に際しては、オリゴヌクレ
オチド＃１０４および／または＃１０４Ｖをセンスプラ
イマーとして用い、オリゴヌクレオチド＃２９６、＃１
３３、＃１３４、＃１３５、＃３３９から選択される１
種以上をアンチセンスプライマーとして用いることがで
きる。オリゴヌクレオチド＃２５６および／または＃２
５６Ｖをセンスプライマーとして用い、＃１８６をアン
チセンスプライマーとして用いて、第一段階増幅を行っ
た後に、第二段階の増幅として、前記ｃＤＮＡの増幅を
行えば、遺伝子の検出または遺伝子型の判定を正確かつ
効率的に行うことができる。また、前記遺伝子の検出ま
たは遺伝子型の判定にあたっては、オリゴヌクレオチド
＃１０４、＃１０４Ｖ、＃２９６、＃１３３、＃１３
４、＃１３５ならびに＃３３９からなるオリゴヌクレオ
チド混合液を用い、１度の増幅操作により行うことも可
能である。
オチド＃１０４および／または＃１０４Ｖをセンスプラ
イマーとして用い、オリゴヌクレオチド＃２９６、＃１
３３、＃１３４、＃１３５、＃３３９から選択される１
種以上をアンチセンスプライマーとして用いることがで
きる。オリゴヌクレオチド＃２５６および／または＃２
５６Ｖをセンスプライマーとして用い、＃１８６をアン
チセンスプライマーとして用いて、第一段階増幅を行っ
た後に、第二段階の増幅として、前記ｃＤＮＡの増幅を
行えば、遺伝子の検出または遺伝子型の判定を正確かつ
効率的に行うことができる。また、前記遺伝子の検出ま
たは遺伝子型の判定にあたっては、オリゴヌクレオチド
＃１０４、＃１０４Ｖ、＃２９６、＃１３３、＃１３
４、＃１３５ならびに＃３３９からなるオリゴヌクレオ
チド混合液を用い、１度の増幅操作により行うことも可
能である。
【００１９】本発明のオリゴヌクレオチドは、公知の方
法によって合成することができる。本発明のオリゴヌク
レオチドは、その１種以上を含有するＣ型肝炎ウイルス
遺伝子検出用またはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定用キ
ッドとすることができる。
法によって合成することができる。本発明のオリゴヌク
レオチドは、その１種以上を含有するＣ型肝炎ウイルス
遺伝子検出用またはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定用キ
ッドとすることができる。
【００２０】また本発明者は、５つの遺伝子型の判定に
利用している型特異領域の近傍の遺伝子配列を調べ、各
型に共通な遺伝子配列を特定することで、配列番号１記
載のオリゴヌクレオチドを選定し、このオリゴヌクレオ
チトを利用したＰＣＲ法によって、全ての遺伝子型につ
いて型特異領域を含む共通領域を増幅する方法を開発し
た。
利用している型特異領域の近傍の遺伝子配列を調べ、各
型に共通な遺伝子配列を特定することで、配列番号１記
載のオリゴヌクレオチドを選定し、このオリゴヌクレオ
チトを利用したＰＣＲ法によって、全ての遺伝子型につ
いて型特異領域を含む共通領域を増幅する方法を開発し
た。
【００２１】本発明者は上記の発明を組み合わせて、ま
ず第一段階として各型に共通な配列を有するオリゴヌク
レオチドを使用し型特異領域を含む各型共通領域の増幅
を行い、次に第二段階としてそれぞれの型特異的配列を
有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して型別の
増幅を行い、ＨＣＶの存在を検出するとともに増幅の有
無ならびに増幅遺伝子の長さから型判別を行う方法を開
発した。
ず第一段階として各型に共通な配列を有するオリゴヌク
レオチドを使用し型特異領域を含む各型共通領域の増幅
を行い、次に第二段階としてそれぞれの型特異的配列を
有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して型別の
増幅を行い、ＨＣＶの存在を検出するとともに増幅の有
無ならびに増幅遺伝子の長さから型判別を行う方法を開
発した。
【００２２】本発明者は上記の発明に於ける型特異オリ
ゴヌクレオチドプライマーによる型別増幅において、各
型特異オリゴヌクレオチドプライマーが全て同一反応液
中に存在する状態で増幅を行い、増幅された遺伝子の長
さから１度の操作によって型判定が可能な方法を開発し
た。
ゴヌクレオチドプライマーによる型別増幅において、各
型特異オリゴヌクレオチドプライマーが全て同一反応液
中に存在する状態で増幅を行い、増幅された遺伝子の長
さから１度の操作によって型判定が可能な方法を開発し
た。
【００２３】本発明の方法にて従来の型の株を含めた５
つの型株を判定した結果、Ｉ〜ＩＶの各型の株は従来の
型と同一に判定されるとともに、Ｖ型は電気泳動、液体
クロマトグラフィー等により、Ｉ〜ＩＶ型とは異なる長
さのバンドとして現れ容易にＶ型と判定された。
つの型株を判定した結果、Ｉ〜ＩＶの各型の株は従来の
型と同一に判定されるとともに、Ｖ型は電気泳動、液体
クロマトグラフィー等により、Ｉ〜ＩＶ型とは異なる長
さのバンドとして現れ容易にＶ型と判定された。
【００２４】本発明の判定方法は、ＨＣＶ遺伝子の型を
確実・容易に分類することから、型別の疾患特異現象の
把握を容易にし、水平・垂直感染経路の特定にも非常に
有用である。
確実・容易に分類することから、型別の疾患特異現象の
把握を容易にし、水平・垂直感染経路の特定にも非常に
有用である。
【００２５】本発明のＨＣＶ遺伝子型判定キットは、配
列番号１ないし３のオリゴヌクレオチドの全部または一
部を必要構成要素とし、このほかにＨＣＶ遺伝子型判定
に利用可能な配列番号４ないし１０のオリゴヌクレオチ
ドの全部または一部を含み、また必要に応じて遺伝子増
幅および増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、
ｄＮＴＰ、減菌水等を含んだものとして構成される。
列番号１ないし３のオリゴヌクレオチドの全部または一
部を必要構成要素とし、このほかにＨＣＶ遺伝子型判定
に利用可能な配列番号４ないし１０のオリゴヌクレオチ
ドの全部または一部を含み、また必要に応じて遺伝子増
幅および増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、
ｄＮＴＰ、減菌水等を含んだものとして構成される。
【００２６】
【作用】本発明の検出方法はＨＣＶ遺伝子を容易に検出
でき、本発明の判定方法はＨＣＶ遺伝子型を容易、迅速
かつ確実に判定することができる。本発明の方法はＨＣ
Ｖ遺伝子型別の治療効果の推定、ならびに評価に利用で
きる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に
おいて、アンチセンスプライマーまたはセンスプライマ
ーとして使用することができる。
でき、本発明の判定方法はＨＣＶ遺伝子型を容易、迅速
かつ確実に判定することができる。本発明の方法はＨＣ
Ｖ遺伝子型別の治療効果の推定、ならびに評価に利用で
きる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に
おいて、アンチセンスプライマーまたはセンスプライマ
ーとして使用することができる。
【００２７】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれら実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００２８】実施例１：Ｖ型増幅用オリゴヌクレオチド
の特定 （１）ＲＮＡ抽出 ＨＣＶ遺伝子の５’−ＮＣを対象としたＨＣＶ−ＲＮＡ
検出法（特開平５−２３２００）にて陽性の結果を得な
がら、ＨＣＶ遺伝子のコア領域を対象とした遺伝子型判
定方法（特願平３−３０７２９６、４−０９３９６０、
４−２７６５０２）ではいずれの型にも分類できなかっ
たヒト血清または血漿より次のようにＲＮＡを抽出し
た。血清または血漿に１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．
０）を等量加え、９０×１０３ｒｐｍで１５分間遠心分
離した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ
を含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）を加
え、６０℃で１時間加温し、フェノール／クロロフォル
ムにて抽出した後、エタノールにて沈澱させ、ＲＮＡを
得た。
の特定 （１）ＲＮＡ抽出 ＨＣＶ遺伝子の５’−ＮＣを対象としたＨＣＶ−ＲＮＡ
検出法（特開平５−２３２００）にて陽性の結果を得な
がら、ＨＣＶ遺伝子のコア領域を対象とした遺伝子型判
定方法（特願平３−３０７２９６、４−０９３９６０、
４−２７６５０２）ではいずれの型にも分類できなかっ
たヒト血清または血漿より次のようにＲＮＡを抽出し
た。血清または血漿に１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．
０）を等量加え、９０×１０３ｒｐｍで１５分間遠心分
離した。得られたペレットに２００ｍＭ ＮａＣｌ、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ
を含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）を加
え、６０℃で１時間加温し、フェノール／クロロフォル
ムにて抽出した後、エタノールにて沈澱させ、ＲＮＡを
得た。
【００２９】（２）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法による５’−ＮＣ領域のＲＮＡの検出 実施例１−（１）で得られたＲＮＡを７０℃で１分間加
熱変性させ、これを鋳型として合成プライマー＃２９９
（５’−ＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧ−
３’：アンチセンスプライマー）と逆転写酵素 Ｓｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＢＲＬ社：アメリカ）とを用いてｃ
ＤＮＡを合成しＰＣＲに供した。ＰＣＲ増幅はＤＮＡサ
ーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｅｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）とＡｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｅｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い通常の方法（Ｓａｉｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８８）にて行った。ＰＣＲ増幅は１段
階目の増幅では＃３２Ａ（５’−ＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡ
ＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ−３’：センスプライマー）と＃
２９９のプライマーの組合せを使用し、第二段目の増幅
は＃３３（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣ
ＴＡＧ−３’：センスプライマー）と＃４８（５’−Ｇ
ＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３’：アン
チセンスプライマー）の組合せを使用し、２段階ＰＣＲ
法にて実施した。反応条件は第一段階増幅は９４℃１分
間の変性、５５℃１分３０秒のプライマーアニーリング
および７２℃３分間のプライマー伸長よりなる反応サイ
クルを３５回繰り返した。第二段階増幅の反応条件は第
一段階増幅した検体５μｌをサンプルとして９４℃、１
分の変性、５５℃１分３０秒のアニーリング、７２℃、
２分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０回繰り返
した。
（ＰＣＲ）法による５’−ＮＣ領域のＲＮＡの検出 実施例１−（１）で得られたＲＮＡを７０℃で１分間加
熱変性させ、これを鋳型として合成プライマー＃２９９
（５’−ＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧ−
３’：アンチセンスプライマー）と逆転写酵素 Ｓｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＢＲＬ社：アメリカ）とを用いてｃ
ＤＮＡを合成しＰＣＲに供した。ＰＣＲ増幅はＤＮＡサ
ーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｅｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）とＡｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｅｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い通常の方法（Ｓａｉｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８８）にて行った。ＰＣＲ増幅は１段
階目の増幅では＃３２Ａ（５’−ＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡ
ＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴ−３’：センスプライマー）と＃
２９９のプライマーの組合せを使用し、第二段目の増幅
は＃３３（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣ
ＴＡＧ−３’：センスプライマー）と＃４８（５’−Ｇ
ＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣ−３’：アン
チセンスプライマー）の組合せを使用し、２段階ＰＣＲ
法にて実施した。反応条件は第一段階増幅は９４℃１分
間の変性、５５℃１分３０秒のプライマーアニーリング
および７２℃３分間のプライマー伸長よりなる反応サイ
クルを３５回繰り返した。第二段階増幅の反応条件は第
一段階増幅した検体５μｌをサンプルとして９４℃、１
分の変性、５５℃１分３０秒のアニーリング、７２℃、
２分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０回繰り返
した。
【００３０】（３）従来の遺伝子型判定方法による遺伝
子型の確認 実施例１−（２）においてＨＣＶ−ＲＮＡ陽性を確認さ
れた検体について、以下の方法を用いて遺伝子型判定を
行った。陽性検体より（１）の方法と同様にしてＲＮＡ
を抽出し、次に（２）と同様にしてｃＤＮＡを合成し
た。ただし、ｃＤＮＡの合成では型分類に用いるコア領
域特異プライマーとして＃１８６（５’−ＧＣＣＧＡＣ
ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３’：アンチセンスプ
ライマー：配列番号５）を使用した。次に第一段階増幅
として各遺伝子型共通領域の増幅を実施した。この反応
ではプライマーとして各遺伝子型に共通な配列を有する
＃２５６（５’−ＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣ
ＴＴＣ−３’：センスプライマー：配列番号４）プライ
マーならびに＃１８６プライマーを使用した。反応条件
は９４℃、１分間の変性、５５℃、１分３０秒のアニー
リング、７２℃、２分間のプライマー伸長からなる反応
サイクルを３５回繰り返した。
子型の確認 実施例１−（２）においてＨＣＶ−ＲＮＡ陽性を確認さ
れた検体について、以下の方法を用いて遺伝子型判定を
行った。陽性検体より（１）の方法と同様にしてＲＮＡ
を抽出し、次に（２）と同様にしてｃＤＮＡを合成し
た。ただし、ｃＤＮＡの合成では型分類に用いるコア領
域特異プライマーとして＃１８６（５’−ＧＣＣＧＡＣ
ＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３’：アンチセンスプ
ライマー：配列番号５）を使用した。次に第一段階増幅
として各遺伝子型共通領域の増幅を実施した。この反応
ではプライマーとして各遺伝子型に共通な配列を有する
＃２５６（５’−ＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣ
ＴＴＣ−３’：センスプライマー：配列番号４）プライ
マーならびに＃１８６プライマーを使用した。反応条件
は９４℃、１分間の変性、５５℃、１分３０秒のアニー
リング、７２℃、２分間のプライマー伸長からなる反応
サイクルを３５回繰り返した。
【００３１】得られた増幅産物の５０分の１量を用い
て、各遺伝子型の特異増幅段階である第二段階目の増幅
を実施した。使用したプライマーはセンスプライマーと
して各遺伝子型共通プライマーとして＃１０４（５’−
ＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣ−３’：配
列番号６）を、各遺伝子型特異アンチセンスプライマー
として＃２９６（５’−ＡＧＧＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣ
ＣＴＡＴＣＣ−３’：Ｉ型特異：配列番号７）、＃１３
３（５’−ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＣ
−３’：ＩＩ型特異：配列番号８）、＃１３４（５’−
ＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＴＴＧＧ−３’：Ｉ
ＩＩ型特異：配列番号９）、＃１３５（５’−ＣＴＣＴ
ＧＴＡＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＧＧＴ−３’：ＩＶ型特
異：配列番号１０）の各プライマーが等量含まれるプラ
イマー混合液を用い、９４℃、１分間の変性、６０℃、
１分のアニーリング、７２℃、１分３０秒間のプライマ
ー伸長からなる反応サイクルを３５回繰り返し増幅を行
った。得られた反応生成物を２．０％ＮｕＳｉｅｖｅ、
２．０％ＳｅａＫｅｍ（いずれもＦ ＭＣ ＢｉｏＰｒ
ｏｄｕｃｔｓ社、アメリカ）の混合アガロースゲルで電
気泳動した後、臭化エチジウム染色し、紫外線照射下に
て泳動バンドの確認を行い、上記のいずれのプライマー
によって増幅されたものであるかを泳動バンドの位置
（増幅された遺伝子断片の長さに対応する）より判定
し、これに基づいて型の特定を行った。
て、各遺伝子型の特異増幅段階である第二段階目の増幅
を実施した。使用したプライマーはセンスプライマーと
して各遺伝子型共通プライマーとして＃１０４（５’−
ＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣ−３’：配
列番号６）を、各遺伝子型特異アンチセンスプライマー
として＃２９６（５’−ＡＧＧＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＣ
ＣＴＡＴＣＣ−３’：Ｉ型特異：配列番号７）、＃１３
３（５’−ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＣ
−３’：ＩＩ型特異：配列番号８）、＃１３４（５’−
ＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＴＴＧＧ−３’：Ｉ
ＩＩ型特異：配列番号９）、＃１３５（５’−ＣＴＣＴ
ＧＴＡＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＧＧＴ−３’：ＩＶ型特
異：配列番号１０）の各プライマーが等量含まれるプラ
イマー混合液を用い、９４℃、１分間の変性、６０℃、
１分のアニーリング、７２℃、１分３０秒間のプライマ
ー伸長からなる反応サイクルを３５回繰り返し増幅を行
った。得られた反応生成物を２．０％ＮｕＳｉｅｖｅ、
２．０％ＳｅａＫｅｍ（いずれもＦ ＭＣ ＢｉｏＰｒ
ｏｄｕｃｔｓ社、アメリカ）の混合アガロースゲルで電
気泳動した後、臭化エチジウム染色し、紫外線照射下に
て泳動バンドの確認を行い、上記のいずれのプライマー
によって増幅されたものであるかを泳動バンドの位置
（増幅された遺伝子断片の長さに対応する）より判定
し、これに基づいて型の特定を行った。
【００３２】（４）ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性、ＨＣＶ遺伝子
型判定不能株の５’端領域ならびに３’端領域の遺伝子
配列の決定 実施例１−（３）において、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であり
ながら従来のＨＣＶ遺伝子判定方法では型判定できなか
ったＨＣＶ株（ＮＺＬ１、Ｔｈ８５、ＵＳ１１４、なら
びにＨＥＭ２６）についてその遺伝子配列を明らかにす
る目的で従来より型特異配列を示す５’端側の領域と
３’端側の領域の遺伝子配列を決定した。各領域は図１
に示す様に、ａ、ｂ、ｃならびにｄの亜領域に分け、各
々の領域に特異的な配列を有するプライマーを用いてｃ
ＤＮＡ合成、第一段階増幅、ならびに必要に応じて第二
段階増幅を実施した後、それらの遺伝子配列を決定し
た。ａ領域とｂ領域は一部が重なりあう様に選定されて
おり、ｂ領域とｃ領域ともａ／ｂとは反対側で重なりあ
う様に選定されており、ａ，ｂ，ｃ領域の各配列より
５’端側の全域配列を知ることができる。配列決定に使
用したプライマーは表１に示した。
型判定不能株の５’端領域ならびに３’端領域の遺伝子
配列の決定 実施例１−（３）において、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であり
ながら従来のＨＣＶ遺伝子判定方法では型判定できなか
ったＨＣＶ株（ＮＺＬ１、Ｔｈ８５、ＵＳ１１４、なら
びにＨＥＭ２６）についてその遺伝子配列を明らかにす
る目的で従来より型特異配列を示す５’端側の領域と
３’端側の領域の遺伝子配列を決定した。各領域は図１
に示す様に、ａ、ｂ、ｃならびにｄの亜領域に分け、各
々の領域に特異的な配列を有するプライマーを用いてｃ
ＤＮＡ合成、第一段階増幅、ならびに必要に応じて第二
段階増幅を実施した後、それらの遺伝子配列を決定し
た。ａ領域とｂ領域は一部が重なりあう様に選定されて
おり、ｂ領域とｃ領域ともａ／ｂとは反対側で重なりあ
う様に選定されており、ａ，ｂ，ｃ領域の各配列より
５’端側の全域配列を知ることができる。配列決定に使
用したプライマーは表１に示した。
【００３３】
【表１】
【００３４】遺伝子の配列は反応生成物をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造）で処理後、Ｍ１３ ｍｐ１９ファージベクタ
ーに挿入しクローン化した。塩基配列はｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法により、Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔｖｅ
ｒ．２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）， あるいはＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ）を用いて実施した。表２に今回遺伝子配列を決定
した４株の各領域毎の遺伝子配列の相同性を％で示し
た。その結果、領域毎に相同性の程度に違いがあるが、
全配列での比較ではいずれの株間でも相同性が９５％以
上ときわめて高いことが判明した。
レオチドキナーゼ（宝酒造）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造）で処理後、Ｍ１３ ｍｐ１９ファージベクタ
ーに挿入しクローン化した。塩基配列はｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法により、Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔｖｅ
ｒ．２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）， あるいはＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ）を用いて実施した。表２に今回遺伝子配列を決定
した４株の各領域毎の遺伝子配列の相同性を％で示し
た。その結果、領域毎に相同性の程度に違いがあるが、
全配列での比較ではいずれの株間でも相同性が９５％以
上ときわめて高いことが判明した。
【００３５】
【表２】
【００３６】表３に、従来の遺伝子型に分類される株の
遺伝子配列との比較を示した。その結果最も遺伝子配列
が保存されていると言われる５’−ＮＣ領域においても
今回の株と従来の遺伝子型のいずれの株との間でも相同
性は９４％以下であり、今回の４つの株の間の９９％の
相同性に比べ低いことが判明した。また、５’−ＮＣ領
域以外での従来型との相同性は更に低く３５％−ないし
８４％で、いずれの領域でも今回調べた４株間の相同性
に比べ有意に低いことが判明した。４株間相同性−従来
型間との相同性は次のとおりである。 コア領域；［９８％］−［８１−８４］ エンベロープ領域；［９４−９６％］−［５７−６６
％］ Ｅ２／ＮＳ１領域；［８５−８８％］−［５７−６８
％］ ＮＳ５領域；［９６−９７％］−［６８−７２％］ ３’−ＮＣ領域；［９５−１００％］−［３５−６５
％］
遺伝子配列との比較を示した。その結果最も遺伝子配列
が保存されていると言われる５’−ＮＣ領域においても
今回の株と従来の遺伝子型のいずれの株との間でも相同
性は９４％以下であり、今回の４つの株の間の９９％の
相同性に比べ低いことが判明した。また、５’−ＮＣ領
域以外での従来型との相同性は更に低く３５％−ないし
８４％で、いずれの領域でも今回調べた４株間の相同性
に比べ有意に低いことが判明した。４株間相同性−従来
型間との相同性は次のとおりである。 コア領域；［９８％］−［８１−８４］ エンベロープ領域；［９４−９６％］−［５７−６６
％］ Ｅ２／ＮＳ１領域；［８５−８８％］−［５７−６８
％］ ＮＳ５領域；［９６−９７％］−［６８−７２％］ ３’−ＮＣ領域；［９５−１００％］−［３５−６５
％］
【００３７】
【表３】
【００３８】以上の結果より、今回遺伝子配列を調べた
４つのＨＣＶ−ＲＮＡ陽性／遺伝子型判定不能株は同一
の遺伝子型に分類され、かつ従来の遺伝子型のいずれに
も属さない新しい遺伝子型であることを見いだした。こ
の型は暫定的にＶ型あるいはグループＩＶと呼ばれる型
と対応可能な配列での類似性が最も高いことからＶ型と
命名した。
４つのＨＣＶ−ＲＮＡ陽性／遺伝子型判定不能株は同一
の遺伝子型に分類され、かつ従来の遺伝子型のいずれに
も属さない新しい遺伝子型であることを見いだした。こ
の型は暫定的にＶ型あるいはグループＩＶと呼ばれる型
と対応可能な配列での類似性が最も高いことからＶ型と
命名した。
【００３９】（５）Ｖ型判定に使用可能なオリゴヌクレ
オチド配列の特定。実施例１−（４）で特定したＶ型の
遺伝子配列より、次の基準に合致する領域を探索した： ａ）Ｖ型各株に共通の配列を有する。 ｂ）他の遺伝子型とは相同性が低く、他の遺伝子型を増
幅することがない配列である。 ｃ）従来の遺伝子型判定に使用している遺伝子領域内の
配列である。 従来の遺伝子型判定方法にて使用しているプライマーに
ついて、対応するＶ型での遺伝子配列をまず比較検討し
た（図２ならびに３）。その結果、共通増幅用のプライ
マーに関しては、１）＃２５６ではミスマッチが見ら
れ、Ｖ型の増幅には必ずしも適当でない、２）＃１８６
は全域にて相同であることからそのままの使用が可能、
と判断した。次に、型特異増幅段階で使用するプライマ
ーについて検討したところ、１）共通センスプライマー
＃１０４の領域では多くのミスマッチが見られ、Ｖ型の
増幅には必ずしも適当でない、２）特異的アンチセンス
プライマーではいずれの型のプライマー領域でもミスマ
ッチが３カ所から５カ所存在することから、これらのプ
ライマーでＶ型が増幅されることはない、と判断され
た。
オチド配列の特定。実施例１−（４）で特定したＶ型の
遺伝子配列より、次の基準に合致する領域を探索した： ａ）Ｖ型各株に共通の配列を有する。 ｂ）他の遺伝子型とは相同性が低く、他の遺伝子型を増
幅することがない配列である。 ｃ）従来の遺伝子型判定に使用している遺伝子領域内の
配列である。 従来の遺伝子型判定方法にて使用しているプライマーに
ついて、対応するＶ型での遺伝子配列をまず比較検討し
た（図２ならびに３）。その結果、共通増幅用のプライ
マーに関しては、１）＃２５６ではミスマッチが見ら
れ、Ｖ型の増幅には必ずしも適当でない、２）＃１８６
は全域にて相同であることからそのままの使用が可能、
と判断した。次に、型特異増幅段階で使用するプライマ
ーについて検討したところ、１）共通センスプライマー
＃１０４の領域では多くのミスマッチが見られ、Ｖ型の
増幅には必ずしも適当でない、２）特異的アンチセンス
プライマーではいずれの型のプライマー領域でもミスマ
ッチが３カ所から５カ所存在することから、これらのプ
ライマーでＶ型が増幅されることはない、と判断され
た。
【００４０】遺伝子型判定における型共通領域増幅（第
一段階増幅）に用いるセンスプライマーとして、従来の
＃２５６に対し、Ｖ型の遺伝子型配列との相同性を高め
るために３カ所の塩基を変更した＃２５６Ｖ（配列番号
１）を特定した。次に、型特異増幅段階（第二段階増
幅）に用いる各型共通のセンスプライマーとして、従来
の＃１０４に変更を加え、Ｖ型増幅に適した＃１０４Ｖ
（配列番号２）を特定した。また、型特異増幅段階（第
二段階増幅）で使用する型特異プライマーについてはＶ
型増幅用アンチセンスプライマーとして、＃３３９（配
列番号３）を特定した。
一段階増幅）に用いるセンスプライマーとして、従来の
＃２５６に対し、Ｖ型の遺伝子型配列との相同性を高め
るために３カ所の塩基を変更した＃２５６Ｖ（配列番号
１）を特定した。次に、型特異増幅段階（第二段階増
幅）に用いる各型共通のセンスプライマーとして、従来
の＃１０４に変更を加え、Ｖ型増幅に適した＃１０４Ｖ
（配列番号２）を特定した。また、型特異増幅段階（第
二段階増幅）で使用する型特異プライマーについてはＶ
型増幅用アンチセンスプライマーとして、＃３３９（配
列番号３）を特定した。
【００４１】（６）オリゴヌクレオチドの合成 実施例１−（５）で特定されたオリゴヌクレオチド＃２
５６Ｖ、＃１０４Ｖ、＃３３９、および配列番号４ない
し１０記載のオリゴヌクレオチド＃２５６、＃１８６、
＃１０４、＃２９６、＃１３３、＃１３４ならびに＃１
３５を、Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成機を用
いて常法により合成した。
５６Ｖ、＃１０４Ｖ、＃３３９、および配列番号４ない
し１０記載のオリゴヌクレオチド＃２５６、＃１８６、
＃１０４、＃２９６、＃１３３、＃１３４ならびに＃１
３５を、Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成機を用
いて常法により合成した。
【００４２】実施例２：＃２５６Ｖ、＃１０４Ｖならび
に＃３３９をプライマーとして用いた場合の各遺伝子型
ＨＣＶの型判定。実施例１で得られた各オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、ＨＣＶ遺伝子型判定を行
った。各型のＨＣＶとしては、それぞれ型が既に判明し
ている株を使用した。Ｉ型としてはＨＣ−Ｊ１、ＩＩ型
としてＨＣ−Ｊ４／８３、ＩＩＩ型としてＨＣ−Ｊ６、
ＩＶ型としてＨＣ−Ｊ８、Ｖ型としてＮＺＬ１、Ｔｈ８
５、ＵＳ１１４、ならびにＨＥＭ２６を用いた。
に＃３３９をプライマーとして用いた場合の各遺伝子型
ＨＣＶの型判定。実施例１で得られた各オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、ＨＣＶ遺伝子型判定を行
った。各型のＨＣＶとしては、それぞれ型が既に判明し
ている株を使用した。Ｉ型としてはＨＣ−Ｊ１、ＩＩ型
としてＨＣ−Ｊ４／８３、ＩＩＩ型としてＨＣ−Ｊ６、
ＩＶ型としてＨＣ−Ｊ８、Ｖ型としてＮＺＬ１、Ｔｈ８
５、ＵＳ１１４、ならびにＨＥＭ２６を用いた。
【００４３】＃１８６をプライマーとして使用し、常法
によりｃＤＮＡを作製したのち、各型共通領域の増幅で
ある第一段階増幅を＃２５６と＃２５６Ｖをセンスプラ
イマーとして使用し、アンチセンスプライマーとして＃
１８６を使用して行った。反応条件は９４℃，１分の変
性と５５℃、１分のアニーリング、７２℃、１分３０秒
の伸長からなる反応サイクルを３５回実施し、その後７
２℃、７分の伸長を行った。得られた増幅産物を用い
て、型特異増幅である第二段階増幅をセンスプライマー
として＃１０４ならびに＃１０４Ｖを、アンチセンスプ
ライマーとして＃２９６、＃１３３、＃１３４、＃１３
５、ならびに＃３３９を用い実施した。各プライマーは
一つの液に等量混合した状態にして使用した。反応条件
は９４℃，３０秒の変性と６０℃、３０秒のアニーリン
グ、７２℃、３０秒の伸長からなる反応サイクルを３０
回実施し、その後７２℃、７分の伸長を行った。得られ
た反応生成物を２．０％ＮｕＳｉｅｖｅ、２．０％Ｓｅ
ａＫｅｍの混合アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏ
ｄｕｃｔｓ社）の電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色
後、紫外線照射により増幅バンドの有無、位置を確認し
た（図５）。
によりｃＤＮＡを作製したのち、各型共通領域の増幅で
ある第一段階増幅を＃２５６と＃２５６Ｖをセンスプラ
イマーとして使用し、アンチセンスプライマーとして＃
１８６を使用して行った。反応条件は９４℃，１分の変
性と５５℃、１分のアニーリング、７２℃、１分３０秒
の伸長からなる反応サイクルを３５回実施し、その後７
２℃、７分の伸長を行った。得られた増幅産物を用い
て、型特異増幅である第二段階増幅をセンスプライマー
として＃１０４ならびに＃１０４Ｖを、アンチセンスプ
ライマーとして＃２９６、＃１３３、＃１３４、＃１３
５、ならびに＃３３９を用い実施した。各プライマーは
一つの液に等量混合した状態にして使用した。反応条件
は９４℃，３０秒の変性と６０℃、３０秒のアニーリン
グ、７２℃、３０秒の伸長からなる反応サイクルを３０
回実施し、その後７２℃、７分の伸長を行った。得られ
た反応生成物を２．０％ＮｕＳｉｅｖｅ、２．０％Ｓｅ
ａＫｅｍの混合アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏ
ｄｕｃｔｓ社）の電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色
後、紫外線照射により増幅バンドの有無、位置を確認し
た（図５）。
【００４４】その結果、Ｉ〜ＩＶ型の株は従来通りの型
に判定されるとともに、新たに加わったＶ型株について
は選定したプライマーより推定される増幅遺伝子の長さ
（８８ｂｐ）に対応する位置のバンドとして泳動される
ことが確認され、バンドの位置より容易にＶ型であるこ
とが判定できることが確認された。また、各株において
他の型のプライマーによる増幅への干渉は認められず、
偽反応は生じていないことも確認され、本発明の判定方
法が正確性の上からも十分に使用可能であることが示さ
れた。
に判定されるとともに、新たに加わったＶ型株について
は選定したプライマーより推定される増幅遺伝子の長さ
（８８ｂｐ）に対応する位置のバンドとして泳動される
ことが確認され、バンドの位置より容易にＶ型であるこ
とが判定できることが確認された。また、各株において
他の型のプライマーによる増幅への干渉は認められず、
偽反応は生じていないことも確認され、本発明の判定方
法が正確性の上からも十分に使用可能であることが示さ
れた。
【００４５】
【発明の効果】本発明の方法はＨＣＶ遺伝子を簡易に検
出でき、また本発明のＨＣＶ遺伝子型判定方法は、ＨＣ
Ｖ遺伝子の型を簡便、迅速かつ正確に判定することがで
きる。このため、ＨＣＶの型判別、あるいは型別のヌク
レオチド検出が可能になり、ＨＣＶの型別の病態研究・
治療効果推測・判定に使用できる。また、重複感染、垂
直感染、水平感染等感染経路の特定や感染状態の把握に
も応用でき、ＨＣＶの研究に広く応用することができ
る。
出でき、また本発明のＨＣＶ遺伝子型判定方法は、ＨＣ
Ｖ遺伝子の型を簡便、迅速かつ正確に判定することがで
きる。このため、ＨＣＶの型判別、あるいは型別のヌク
レオチド検出が可能になり、ＨＣＶの型別の病態研究・
治療効果推測・判定に使用できる。また、重複感染、垂
直感染、水平感染等感染経路の特定や感染状態の把握に
も応用でき、ＨＣＶの研究に広く応用することができ
る。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２５６Ｖ） ＣＧＣＧＣＧＡＣＧＣ ＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣ ２０
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１０４Ｖ） ＣＧＴＡＡＡＡＣＴＴ ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣ ２０
【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃３３９） ＧＣＴＧＡＧＣＣＣＡ ＧＧＡＣＣＧＧＴＣＴ ２０
【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２５６） ＣＧＣＧＣＧＭＣＮＡ ＧＧＡＡＲＲＣＴＴＣ ２０ （ＭはＡまたはＣ。ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧ。ＲはＡま
たはＧ。）
たはＧ。）
【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１８６） ＡＹＧＴＡＣＣＣＣＡ ＹＧＡＧＲＴＣＧＧＣ ２０ （ＹはＴまたはＣ。ＲはＧまたはＡ。）
【００５１】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１０４） ＡＧＲＡＡＲＲＣＴＴ ＣＳＧＡＧＣＧＲＴＣ ２０ （ＲはＧまたはＡ。ＳはＣまたはＧ。）
【００５２】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２９６） ＧＧＡＴＡＧＧＣＴＧ ＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴ ２０
【００５３】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３３） ＧＡＲＣＣＡＷＣＣＴ ＧＣＣＣＡＹＣＣＹＡ ２０ （ＲはＧまたはＡ。ＷはＴまたはＡ。ＹはＣまたは
Ｔ。）
Ｔ。）
【００５４】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３４） ＣＣＡＡＲＡＧＧＧＡ ＣＧＧＧＡＲＣＣＴＣ ２０ （ＲはＧまたはＡ。）
【００５５】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３５） ＲＣＣＹＴＣＧＴＴＴ ＣＣＲＴＡＣＡＧＲＧ ２０ （ＲはＧまたはＡ。ＹはＣまたはＴ。）
【図１】Ｖ型株の５’末端および３’末端側遺伝子領域
配列決定の方法。
配列決定の方法。
【図２】遺伝子型共通増幅で用いるプライマー＃２５６
ならびに＃１８６の各相当領域のプラス鎖配列とＶ型株
遺伝子配列の比較。
ならびに＃１８６の各相当領域のプラス鎖配列とＶ型株
遺伝子配列の比較。
【図３】遺伝子型特異増幅で用いる共通プライマー＃１
０４ならびに型特異プライマー＃２９６、＃１３３、＃
１３４、＃１３５の各相当領域のプラス鎖配列とＶ型株
遺伝子配列の比較。
０４ならびに型特異プライマー＃２９６、＃１３３、＃
１３４、＃１３５の各相当領域のプラス鎖配列とＶ型株
遺伝子配列の比較。
【図４】Ｖ型特異プライマー＃３３９相当領域のプラス
鎖配列と、Ｉ〜Ｖ型株の遺伝子配列の対比。
鎖配列と、Ｉ〜Ｖ型株の遺伝子配列の対比。
【図５】本発明によるオリゴヌクレオチドを用いたＨＣ
Ｖ遺伝子型判定方法による各遺伝子型株の遺伝子型判定
結果を表す電気泳動写真。レーン１はＨＣ−Ｊ１株（Ｉ
型）、レーン２はＨＣ−Ｊ４／８３株（ＩＩ型）、レー
ン３はＨＣ−Ｊ６株（ＩＩＩ型）、レーン４はＨＣ−Ｊ
８株（ＩＶ型）、レーン５、６、７、８はそれぞれＮＺ
Ｌ１株、Ｔｈ８５株、ＵＳ１１４株、ならびにＨＥＭ２
６株（Ｖ型）の泳動パターン。
Ｖ遺伝子型判定方法による各遺伝子型株の遺伝子型判定
結果を表す電気泳動写真。レーン１はＨＣ−Ｊ１株（Ｉ
型）、レーン２はＨＣ−Ｊ４／８３株（ＩＩ型）、レー
ン３はＨＣ−Ｊ６株（ＩＩＩ型）、レーン４はＨＣ−Ｊ
８株（ＩＶ型）、レーン５、６、７、８はそれぞれＮＺ
Ｌ１株、Ｔｈ８５株、ＵＳ１１４株、ならびにＨＥＭ２
６株（Ｖ型）の泳動パターン。
Claims (14)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド＃２５６Ｖ。 - 【請求項２】配列番号２記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド＃１０４Ｖ。 - 【請求項３】配列番号３記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド＃３３９。 - 【請求項４】請求項１ないし３記載のオリゴヌクレオチ
ドと部分置換を有し、またはその一部を構成するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項５】請求項１ないし４記載のオリゴヌクレオチ
ドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】請求項１ないし５記載のオリゴヌクレオチ
ドを用いるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法。 - 【請求項７】請求項１ないし５記載のオリゴヌクレオチ
ドを用いるＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定方法。 - 【請求項８】配列番号４ないし１０記載のオリゴヌクレ
オチド＃２５６、＃１８６、＃１０４、＃２９６、＃１
３３、＃１３４、＃１３５から選択される１種以上のオ
リゴヌクレオチドを併用する請求項６記載のＣ型肝炎ウ
イルス遺伝子の検出方法または請求項７記載のＣ型肝炎
ウイルス遺伝子型判定方法。 - 【請求項９】ポリメラーゼチェインリアクション法によ
りｃＤＮＡを増幅することを特徴とする、請求項６ない
し８記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法またはＣ
型肝炎ウイルスの遺伝子型判定方法。 - 【請求項１０】オリゴヌクレオチド＃１０４および／ま
たは＃１０４Ｖをセンスプライマーとして用い、オリゴ
ヌクレオチド＃２９６、＃１３３、＃１３４、＃１３
５、＃３３９から選択される１種以上をアンチセンスプ
ライマーとして用いることを特徴とする、請求項６ない
し９記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法またはＣ
型肝炎ウイルス遺伝子型判定方法。 - 【請求項１１】オリゴヌクレオチド＃２５６および／ま
たは＃２５６Ｖをセンスプライマーとして用い、＃１８
６をアンチセンスプライマーとして用いて第一段階増幅
を行った後に、第二段階として請求項１０記載の増幅を
行う請求項６ないし９記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の
検出方法またはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定方法。 - 【請求項１２】オリゴヌクレオチド＃１０４、＃１０４
Ｖ、＃２９６、＃１３３、＃１３４、＃１３５ならびに
＃３３９からなるオリゴヌクレオチドプライマー混合液
を用い、１度の増幅操作により遺伝子の検出または遺伝
子型判定を行うことを特徴とする、請求項６ないし１１
記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法またはＣ型肝
炎ウイルス遺伝子型判定方法。 - 【請求項１３】増幅されたｃＤＮＡの分子長を測定する
請求項５ないし１０記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検
出方法またはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定方法。 - 【請求項１４】請求項１ないし５記載のオリゴヌクレオ
チドのうち、１種以上を含有するＣ型肝炎ウイルス遣伝
子検出用またはＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定用キッ
ト。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP17975393A JPH0775585A (ja) | 1993-06-14 | 1993-06-14 | Ｃ型肝炎ウイルス関連オリゴヌクレオチドならびにｃ型肝炎 ウイルス遺伝子型判定方法 |
| CA002125727A CA2125727A1 (en) | 1993-06-14 | 1994-06-13 | Hcv related oligonucleotides and determination system of hcv genotypes, methods of determining the hcv genotype of a hcv strain, methods for detecting hcv in a sample, and test kits for determining hcv genotype or for detecting hcv |
| EP94304237A EP0633321A1 (en) | 1993-06-14 | 1994-06-13 | HCV related oligonucleotides and uses thereof in methods for detecting and genotyping of HCV, and kits used in these methods |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP17975393A JPH0775585A (ja) | 1993-06-14 | 1993-06-14 | Ｃ型肝炎ウイルス関連オリゴヌクレオチドならびにｃ型肝炎 ウイルス遺伝子型判定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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-
1994
- 1994-06-13 CA CA002125727A patent/CA2125727A1/en not_active Abandoned
- 1994-06-13 EP EP94304237A patent/EP0633321A1/en not_active Withdrawn
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