JPH0775599A - 標的核酸の検出方法およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 標的核酸を含む検査試料を変性して核酸を１
本鎖化し、その核酸の十鎖と一鎖とを、プローブ核酸或
いはプライマー核酸が固定化された固体担体を使用して
固−液分離により分離し、分離された１本鎖ＤＮＡを、
そのＤＮＡがハイブリダイズするハイブリッド形成領域
を有するクロマトグラフ媒体に展開させて標的核酸の有
無を検知することによる標的核酸の検出方法およびその
ためのキット。 【効果】 検査試料中の標的核酸の有無を、高感度、短
時間に且つ簡便に検出することができる。特に本発明は
ＰＣＲ法と組合せることによりその効果が確実に達成さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検査試料中の核酸の検
出方法およびそのためのキットに関するものである。さ
らに詳しくは、検査試料中の微量の核酸をクロマトグラ
フ法によって簡便迅速かつ高感度に検出する方法および
そのためのキットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】検査試料中の特定遺伝子の検出方法とし
ては、従来、遺伝子ＤＮＡのクローニング法、サザンブ
ロッティング法、遺伝子増幅法およびハイブリダイゼー
ション法などの数々の方法が知られている。しかしこれ
らの方法はそれぞれ実用上いくつかの問題点を有してい
る。

【０００３】すなわち、遺伝子ＤＮＡのクローニング法
は、主として新しい遺伝子ＤＮＡの分離および検出に用
いられるが、多段階の複雑な実験手法を必要とする。サ
ザンブロッティング法は、既知の遺伝子ＤＮＡの検出に
主として用いられているが、この方法は塩基配列の相補
性を利用して遺伝子ＤＮＡを検出する方法であり、電気
泳動により長さの異なるＤＮＡ断片を予め分離する必要
があり、実用上煩雑な操作を経なければならない。最
近、検出感度が高い方法として遺伝子増幅法が提案され
広く利用されている。この方法はポリメラーゼチェーン
リアクション法（Polymerase Chain Reaction Method;
以下“ＰＣＲ法”と略称する）とも称され、試料中の標
的ＤＮＡの特定部位を数時間で数百万倍に増幅し検出す
る方法である。しかしこのＰＣＲ法は標的ＤＮＡの増幅
は短時間で可能であるが、増幅されたＤＮＡ断片の検出
は、電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド染色法
または螢光発色法などにより実施されるため操作が複雑
で検出するまでにさらに数時間を要する。

【０００４】またハイブリダイゼーション法は標的核酸
の存在を検出するための方法として行われてきた技術で
ある。この方法は標的核酸を熱処理またはアルカリ処理
により変性させて１本鎖とした後、固体担体上に固定化
し、続いて固定化された標的核酸に対して相補的な塩基
配列をもつ標識プローブを加えて、ハイブリダイズさせ
る方法である（例えば米国特許第４,３５８,５３５号明
細書参照）。この方法では、洗浄により該標的核酸に該
プローブがハイブリダイズした複合体と、ハイブリダイ
ズしない遊離状態のプローブとの分離を行ない、遊離プ
ローブを除去する。そして、該標的核酸にハイブリダイ
ズした該標識プローブは、前記固体担体において検出さ
れる。この場合の標識プローブの標識物質としては、放
射性物質、螢光物質、化学または生物発光物質、酵素お
よび生物学的親和性物質などが使用されている。このハ
イブリダイゼーション法は、標識プローブのハイブリダ
イズ、遊離標識プローブの除去、および標識物質の取り
扱いの煩雑さから、標的核酸の検出には多段階の煩雑な
操作並びにそのために長時間を要する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】かくして本発明の第１
の目的は、前記した従来の欠点のない検査試料中の標的
核酸の検出方法を提供することにある。本発明の第２の
目的は、簡単な操作で且つ短時間に検査試料中の標的核
酸を検出する方法を提供することにある。本発明の第３
の目的は、正確で且つ高感度に検査試料中の標的核酸を
検出する方法を提供することにある。本発明の他の目的
は、ＰＣＲ法等の核酸増幅法を用い、その利点を利用し
て一層簡便な標的核酸を検出する方法を提供することに
ある。本発明のさらに他の目的は、標的核酸の検出のた
めの実用性が高いキットを提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、前記本
発明の目的の一部は（１）標的核酸の十鎖或いは一鎖と
ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列が固定化された
ハイブリッド形成領域を有するクロマトグラフ媒体を準
備し、（２）また標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイブリ
ダイズ可能な１本鎖のプローブ核酸或いはプライマー核
酸が固定化された水不溶性固体担体（以下、単に「固体
担体」という。）を準備し、（３）検査試料を変性し、
含有されている標的核酸またはその断片を１本鎖化し、
前記（２）の固体担体と接触させ、必要に応じてこれを
増幅し、次いで該固体担体を固−液分離することによっ
て標的核酸、その断片またはその増幅産物の十鎖および
一鎖を互いに分離し、（４）前記（３）で分離された十
鎖または一鎖を前記（１）のクロマトグラフ媒体に展開
させ、そして（５）そのクロマトグラフ媒体の予め決め
られたハイブリッド形成領域においてハイブリダイズさ
れた標的核酸の有無を検知する、ことを特徴とする検査
試料中の標的核酸の検出方法によって達成される。

【０００７】また本発明によれば、前記本発明の他の目
的は、（１）標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイブリダイ
ズ可能なヌクレオチド配列が予め決められた位置に固定
化されたハイブリッド形成領域を有するシート状クロマ
トグラフ媒体であって、該クロマトグラフ媒体は前記ハ
イブリッド形成領域が表示されており、且つ検査試料を
供給するための位置が設けられたシート状クロマトグラ
フ媒体および（２）標的核酸の十鎖或いは一鎖またはそ
れらの断片とハイブリダイズ可能な１本鎖プローブ核酸
或いはプライマー核酸が固定化された固体担体、を含む
検査試料中の標的核酸を検出するためのキットによって
達成される。

【０００８】かかる本発明は、簡略に云えば、クロマト
グラフ媒体の所定の位置（ハイブリッド形成領域）に、
標的核酸と相補性を有しハイブリダイズ可能なヌクレオ
チド配列を予め固定化しておき、一方、一本鎖状態で分
離された標的核酸（またはその断片）を含む試料を上記
クロマトグラフ媒体の一端より毛細管現象を利用して展
開させ、その所定の位置においてハイブリダイゼーショ
ンを行ない、標的核酸を捕獲して検出する方法である。
この本発明は、クロマトグラフ媒体の利用により、前記
試料の展開および標的核酸の検出は極めて短い時間で行
うことができ、後述する好ましい実施態様によれば５分
以内の短い時間で標的核酸の存在を確認することが可能
である。しかもその確認は、視覚的に行うこともでき極
めて簡単である。

【０００９】本発明のための検査試料としては、標的核
酸を含んでいるか或いは含むことが予想される試料であ
れば特に制限されることはない。例えば血液、リンパ
液、羊水などの体液、排泄物或いは組織ホモジネートな
どの臨床検査に通常使用されている試料であつてもよ
い。

【００１０】臨床検査のための試料を使用する場合、常
法に従って予め核酸を抽出し、次いで、例えば熱または
アルカリ処理して１本鎖状態にする必要がある。標的核
酸の長さは特に限定されないが、数十万塩基数以上の場
合、そのまま本発明においてクロマトグラフ媒体で展開
すると、展開に長時間を要する恐れがあるため、アルカ
リ変性により、或いは制限酵素の処理により、核酸を３
０,０００塩基数またはそれ以下の断片に調製しておく
ことが好ましい。本発明の検出方法においては、検査試
料中の核酸（またはその断片）を１本鎖化して、その後
十鎖と一鎖を分離することが必要である。この分離のた
めに、本発明においては標的核酸の十鎖または一鎖とハ
イブリダイズ可能な１本鎖のプローブ核酸或いはプライ
マー核酸が固定化された固体担体を予め準備しておく必
要がある。この予め準備された前記固体担体を使用し
て、前記した１本鎖状態にされた核酸の十鎖と一鎖とを
分離する。すなわち、固体担体に固定化されたプローブ
核酸或いはプライマー核酸に、検査試料中の十鎖または
一鎖の核酸（またはその断片もしくはその増幅産物）を
ハイブリダイズさせて、濾過または遠心分離などの固−
液分離操作により、十鎖と一鎖とを分離する。

【００１１】前記固体担体に固定化されるプローブ核酸
或いはプライマー核酸は、天然の核酸をそのまま使用し
てもよく、また合成ヌクレオチド配列を利用してもよ
い。その長さは通常５塩基数〜２０００塩基数、好まし
くは１０塩基数〜２００塩基数である。固定化されるプ
ローブ核酸或いはプライマー核酸はその一方の末端が固
体担体表面に固定化されることが望ましい。またその固
定化はスペーサーを介して行うこともできる。

【００１２】プローブ核酸或いはプライマー核酸を固体
担体に固定化する方法は、種々の方法が採用される［例
えば千畑一郎他著「実験と応用、アフィニティクロマト
グラフ」第１６〜第１０６頁（講談社サイエンティフィ
ク社発行）参照］。例えばビオチンアビジン反応を利用
する方法または塩基配列中のアミノ基、水酸基などの反
応性基を使用して固体担体表面に固定化する方法を採用
することができる。

【００１３】その際使用される固体担体としては、その
形状は特に制限を受けない。例えばメンブレン状、粒子
状などが挙げられる。１本鎖化された核酸とのハイブリ
ダイゼーションの効率を考慮すると、粒子状であるのが
好ましい。粒子状担体としては、無機粒子、セラミック
ス粒子、金属またはその酸化物粒子、ゲル状粒子、合成
高分子粒子などが挙げられるが、核酸との親和性、粒子
の分散安定性の点で特に合成高分子粒子、例えばラテッ
クス粒子が好ましい。

【００１４】なお、前記固体担体として着色した粒子を
使用して、増幅後の核酸（またはその断片もしくはその
増幅産物）の十鎖或いは一鎖を固−液分離し、固体粒子
をクロマトグラフ媒体に展開すると、クロマトグラフ媒
体におけるハイブリッド形成領域において、標的核酸が
存在した場合には、その存在を着色した粒子の集合によ
る発色によって視覚的に直接確認できるという利点が得
られる。この着色した粒子としては、目視で識別しうる
色で着色した合成高分子粒子、例えばラテックス粒子が
特に好ましい。

【００１５】なお、この場合の粒子の大きさは、クロマ
トグラフ媒体中を展開し移動しうる大きさであること、
つまりクロマトグラフ媒体中の組織の隙間よりも小さい
ものであることが必要である。この粒子の大きさはクロ
マトグラフ媒体の種類によって左右されるが、一般に平
均粒径が０.０１μｍ〜３０μｍ、好ましくは０.１μｍ
〜１０μｍの範囲である。

【００１６】本発明では、前記の如くして分離された十
鎖または一鎖の核酸（またはその断片）をクロマトグラ
フ媒体に展開させるが、検査試料中の標的核酸の含有量
が少ない場合は、その核酸を鋳型にしてＰＣＲ法に従っ
て増幅し、得られた核酸（またはその断片）を１本鎖化
して、前記した固体担体を使用して十鎖と一鎖に分離し
た後、クロマトグラフ媒体に展開させることができる。

【００１７】本発明において、試料中の核酸の増幅に使
用されるＰＣＲ法は、それ自体よく知られた方法であ
る。すなわちＰＣＲ法は、核酸のゲノム上の或る領域を
酵素を用いて増幅する方法であり、増幅したい領域のセ
ンスおよびアンチセンスストランドの５'端の配列を有
する２種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば１０
〜３０塩基数）を用意し、ゲノムＤＮＡを変性した後、
上記２種のオリゴヌクレオチドプライマーを過剰に加え
てアニーリングさせ、これにＤＮＡポリメラーゼを作用
させて、ＤＮＡ鎖を合成し、この操作を数十サイクル繰
返すことによって数十万〜数百万倍にＤＮＡの増幅を行
なう方法である。

【００１８】本発明において核酸の増幅を行なう場合、
前記したＰＣＲ法による限り、その改良法であってもよ
い。例えば好熱性細菌のＤＮＡポリメラーゼを使用する
方法であってもよく、また具体的には市販のＰＣＲ増幅
装置を使用して増幅させる方法でもよい。これらのＰＣ
Ｒ法については例えば下記文献に紹介されている。Mull
is KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vi
tro via apolymerase-catalysed chain reaction.Metho
ds in Enzymology, 1987; 155 335-350.

【００１９】本発明における検出方法は、前記ＰＣＲ法
と組合せて実施することにより、単に試料中の核酸の増
幅による利点以外に、さらに下記に説明するような操作
の簡便性、検出操作の容易性、検出の正確性などの優れ
た効果がもたらされる。すなわち、検査試料中の核酸を
ＰＣＲ法により増幅する場合に、使用する２種のプライ
マー核酸のうち、一方のプライマー核酸として、その一
方のプライマー核酸における伸長方向と反対側のプライ
マー末端が固体担体に固定化されたものを使用すると、
増幅した後、その固体担体を固−液分離することによ
り、核酸の十鎖および一鎖を分離することが容易とな
る。

【００２０】前記ＰＣＲ法において、一方のプライマー
核酸を固定する固体担体としては、ＰＣＲ法の反応効率
の点から前記固体担体と同様の粒子状であることが好ま
しい。プライマー核酸をこれら固体担体に固定化する方
法は、前記したようにプローブ核酸を固定化する方法お
よび手段と実質的に同じである。なおプライマー核酸を
固体担体に固定化する際、通常のＰＣＲ法におけるプラ
イマーの長さよりも１塩基数〜２０塩基数長くすること
或いはスペーサーを介在させることは、プライマーのア
ニーリングを効率的に行うために好ましいことである。
かくして本発明によれば、ＰＣＲ法を利用した下記
（１）〜（４）の工程よりなる標的核酸の検出方法が提
案される。（１）標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイブリ
ダイズ可能なヌクレオチド配列が固定化されたハイブリ
ッド形成領域を有するクロマトグラフ媒体を準備し、
（２）検査試料を変性し、含有されている標的核酸を一
本鎖化し、ＰＣＲ法により該核酸またはその或る領域を
増幅し、その際、該ＰＣＲ法は、一方のプライマー核酸
における伸長方向と反対側のプライマー末端が固体担体
に固定化されたプライマー核酸を使用し、且つ増幅した
後その固体担体を固−液分離することにより標的核酸ま
たはその或る領域の十鎖および一鎖を互いに分離し、
（３）前記（２）で分離された十鎖或いは一鎖を前記
（１）のクロマトグラフ媒体に展開させ、そして（４）
そのクロマトグラフ媒体の予め決められたハイブリッド
形成領域においてハイブリダイズされた標的核酸または
その或る領域の有無を検知する。

【００２１】本発明におけるクロマトグラフ媒体は、分
離された核酸（またはその断片もしくはその増幅産物）
の十鎖或いは一鎖またはこれらが固定化された粒子が安
定にまた良好にクロマトグラフ的に移動して十分な展開
がなされ、ハイブリッド形成領域に確実に到達し得るよ
うな大きさのポアサイズを有することが必要であり、具
体的には例えばガラス、シリカなどの無機繊維からなる
濾紙をクロマトグラフ媒体として使用することができ
る。またニトロセルロースのような変性セルロースから
なる濾紙も使用することができる。

【００２２】本発明において、前記したＰＣＲ法により
核酸を増幅する際、粒子に固定化されたプライマー核酸
を使用した場合にも、分離した粒子がクロマトグラフ的
に展開、移動しうるポアサイズを有するクロマトグラフ
媒体を使用することが必要となる。

【００２３】一方、本発明のクロマトグラフ媒体は、予
め決められたハイブリッド形成領域を有しており、この
領域には標的核酸（またその断片もしくはその増幅産
物）の十鎖または一鎖のハイブリダイズ可能な、すなわ
ち捕捉用のヌクレオチド配列が固定化されている。この
ハイブリッド形成領域に固定化されるヌクレオチド配列
は、天然の核酸を分離してその十鎖または一鎖の片方の
みをそのまま利用しても良いし、合成ＤＮＡを利用して
も良い。その長さは５塩基数〜２,０００塩基数、好ま
しくは１０塩基数〜２００塩基数である。この補捉用の
ヌクレオチド配列はそのまま直接クロマトグラフ媒体に
固定しても良いが、別の固体支持体上に固定化してから
クロマトグラフ媒体に再度固定しても良い。明確なシグ
ナルを得るためには、後者の方が好ましい。

【００２４】ここで使用される固体支持体としてはクロ
マトグラフ媒体に塗布しやすいことから、粒子状である
ものが好ましい。このクロマトグラフ媒体に固定化され
る粒子状固体支持体は試料展開液の流れに流されること
を防ぐために、粒径をクロマトグラフ媒体中の組織の間
隙より大きくすることが必要であり、具体的には０.１
μｍ〜３０μｍ、好ましくは０.２μｍ〜１５μｍの範
囲から適宜選択する。なお、ヌクレオチド配列を固定化
した固体支持体をクロマトグラフ媒体上に固定するには
通常の附着現象に基づいて行なうことができる。例え
ば、その支持体の分散液をクロマトグラフ媒体上に滴下
し、附着させても良いし、また窒素ガスの如き不活性ガ
スの気流と共にクロマトグラフ媒体に吹きつけて附着さ
せても良い。

【００２５】本発明において、前記クロマトグラフ媒体
に、検査試料から分離された標的核酸（またはその断片
もしくはその増幅産物）の十鎖または一鎖を展開させる
にはハイブリダイゼーション法として通常知られた条件
が採用される。つまり核酸を含む展開液の塩濃度は、塩
化ナトリウム０.０１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０.１Ｍ〜
０.５Ｍの範囲が適当である。また温度は５℃〜８０
℃、通常は室温下で充分である。また分離された核酸
（またはその断片もしくはその増幅産物）の十鎖または
一鎖を精製することなく、そのままクロマトグラフ媒体
に展開させることができる。展開を促進するために水溶
性高分子、界面活性剤などの添加剤を添加することは好
ましいことである。これら添加剤の例としては、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン
グリコール、フィコール、アルブミン、ドデシル硫酸ナ
トリウム、カゼイン、アラビアゴム、デキストラン、ゼ
ラチン、ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエ
チレンエーテルなどがある。

【００２６】本発明において検査試料から分離された標
的核酸（またはその断片もしくはその増幅産物）の十鎖
または一鎖のいずれか一方をクロマトグラフ媒体に展開
させた後、予め決められたハイブリッド形成領域におい
て標的核酸の有無を検知するには種々の方法が用いられ
る。その１つとしては、検査試料から分離された標的核
酸（またはその断片もしくはその増幅産物）の十鎖また
は一鎖が固体担体（例えば粒子）に固定化されていない
場合には、展開後、クロマトグラフ媒体を、例えば１重
量％エチジウムブロマイド液に１〜２秒浸し紫外線照射
下に発色の有無を判定することにより行なうことができ
る。

【００２７】また前記したＰＣＲ法により増幅し、しか
もその場合、粒子状固体担体に固定化されたプライマー
核酸を使用した場合には、固−液分離された粒子状固体
担体側について展開してもよく或いは液体側について展
開してもよい。前者の粒子状固体担体側について展開し
た場合、その粒子状固体担体が着色されている時にはハ
イブリッド形成領域において着色された色を目視で直接
判定することにより簡便に標的核酸の有無を検知するこ
とができる。一方、粒子状固体担体が着色されていない
場合は、前記エチジウムブロマイド液にクロマトグラフ
媒体を浸し紫外線照射で発色を調べればよい。さらに前
記液体側を用いてクロマトグラフ媒体に展開することも
可能であり、その場合には、展開後、同様にエチジウム
ブロマイド液にクロマトグラフ媒体を浸し、紫外線照射
して発色の有無を観察すればよい。

【００２８】本発明によれば、前記検出方法を実施する
ために、（１）標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイブリダ
イズ可能なヌクレオチド配列が予め決められた位置に固
定化されたハイブリッド形成領域を有するシート状クロ
マトグラフ媒体であって、該クロマトグラフ媒体は前記
ハイブリッド形成領域が表示されており、且つ検査試料
を供給するための位置が設けられたシート状クロマトグ
ラフ媒体および（２）標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイ
ブリダイズ可能な１本鎖プローブ核酸或いはプライマー
核酸が固定化された固体担体を含む検査試料中の標的核
酸を検出するためのキットが提供される。またこのキッ
トの好ましい態様は、前記（１）のシート状クロマトグ
ラフ媒体および（３）標的核酸またはその或る領域をＰ
ＣＲ法により増幅することが可能な２種のプライマー、
ただしその一方のプライマーはその伸長方向と反対側の
末端に固体担体を固定化し、その固体担体は前記クロマ
トグラフ媒体中を移動しうる大きさの粒子であるを含む
検査試料中の標的核酸を検出するためのキットであるこ
とができる。

【００２９】前記本発明のキットにおいて、クロマトグ
ラフ媒体、それに設けられるハイブリッド形成領域、プ
ローブ核酸或いはプライマー核酸、これら核酸が固定化
された固体担体などについては、前記検出方法における
説明と同様のものを使用することができ、同様の方法で
調製することができる。

【００３０】

【実施例】以下、実施例を掲げて本発明を説明するが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。な
お、ここで％は重量％を示す。 ＜プローブ核酸、プライマー核酸またはハイブリダイズ
用ヌクレオチド配列の調整＞標的核酸としてはＨＩＶを
選択した。プローブ核酸およびプライマー核酸としては
Perkin-Elmer社のGene Amplimer HIV-1,2の中からプロ
ーブSK102、その相補鎖、プライマーSK145およびプライ
マーSK431の塩基配列をアプライドバイオシステム社の
ＤＮＡ合成機３８１Ａ型を用いて合成した。またハイブ
リダイズ用ヌクレオチド配列は、プローブ核酸と同じも
のを使用した。前記プローブ核酸およびプライマー核酸
の塩基配列を次に示す。 （ａ）プローブSK102 d(GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAA
TGGGAT) （ｂ）プローブSK102の相補鎖 （ｃ）プライマーSK145 d(AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCAT
GCAAAT) （ｄ）プライマーSK431 d(TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCT
CT) また、上記塩基配列をもつプローブ核酸およびプライマ
ー核酸のそれぞれの５'末端に、ビオチンアミダイト、
アミノリンク２（Aminolink-2:アプライドバイオシステ
ム社製）、ｄ（Ａ）₁₀、ｄ（Ｃ）₁₀およびｄ（Ｇ）₁₀の
それぞれをリンカーとして導入したもの［合計２０種
（４×５）］を合成した。その際ビオチンアミダイト導
入品は、メーカーマニュアルに従って精製し、５'末端
ｄ（Ａ）₁₀、ｄ（Ｃ）₁₀およびｄ（Ｇ）₁₀、導入品の場
合、それぞれの５'末端のＡ、ＣおよびＧはＦＯＤグレ
ード品を使用し、リンカー以外のプローブ核酸およびプ
ライマー核酸の本体部分は通常のβ−シアノエチルアミ
ダイドを使用した。合成後アンモニア水で切り出した
後、５５℃で１時間放置し、ｄ（Ａ）₁₀、ｄ（Ｇ）₁₀お
よびｄ（Ｇ）₁₀部分のアミノ基部分のデプロテクション
を行った。 ＜ラテックスの固定化＞ （１）１０％ラテックス分散液２ｍｌ［日本合成ゴム
（株）製“L0101”粒径１μｍ］および１０％着色（赤
色）ラテックス分散液２ｍｌ［日本合成ゴム（株）製；
“G0303CR”粒径０.３μｍ］にそれぞれストレプトアビ
ジン（和光純薬製）３ｍｇを入れ、３７℃で２時間イン
キュベートし、ラテックスをストレプトアビジンで処理
した１０％ラテックス分散液と引き続いてＴＥ緩衝液
（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、１ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸からなる緩衝液）で３回遠心洗浄し、
チューブ１および２のそれぞれに前記L0101の分散液を
１ｍｌ、チューブ３および４のそれぞれに前記G0303CR
の分散液１ｍｌを加えた。上述のようにして合成した前
記５'末端にビオチンアミダイトを導入したプローブSK1
02、その相補鎖およびプライマーSK431のそれぞれを１
０ｎＭを取り、順次前記チューブ１、２、３および４に
加え、室温にて１時間インキュベートした後、ＴＥ緩衝
液で２回遠心洗浄し、１０％分散液を調製した。 （２）上記プローブSK102、その相補鎖およびプライマ
ーSK431の５'末端にそれぞれアミノリンク２、ｄ（Ａ）
₁₀、ｄ（Ｃ）₁₀およびｄ（Ｇ）₁₀をリンカーとして導入
したプローブ核酸およびプライマー核酸それぞれ１０ｍ
Ｍを（１）で処理したL0101およびG0303CRの１０％ラテ
ックス分散液１ｍｌにそれぞれ５ｍｇの１−エチル−３
−（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド
とともに加え、５０℃で３時間反応させた。反応終了
後、遠心分離により上澄を２５％アンモニア水に置換
し、５５℃で７時間静置し、各配列のリンカー以外の部
位のアミノ基部分のデプロデクションを行った。続いて
ＴＥ緩衝液で遠心洗浄を５回繰り返し、ｐＨを８にもど
ったことを確認してからそれぞれ１０％分散液とした。

【００３１】＜クロマトグラフ媒体の調整＞前記（１）
および（２）の如くして得たプローブSK102を固定化し
たL0101の１０％分散液の５種類をそれぞれＴＥ緩衝液
で１％に再調整し、薄層クロマトグラフ用サンプリング
装置リノマートＩＶ（カマグ社）のシリンジに採取し
た。クロマトグラフ媒体としてガラス繊維濾紙GB100RN
（東洋濾紙）を選び、１ｃｍ×１０ｃｍに切断し、前記
シリンジによって１μｌ／１ｃｍの塗布量で窒素雰囲気
中でリンカーの異なる５種類のプローブSK102を固定化
したラテックスL0101をそれぞれ５枚の濾紙に展開位置
から約３ｃｍの部位に塗布し、自然乾燥させた。得られ
たクロマトグラフ媒体を窒素雰囲気下、ビニル袋に密封
した。プローブSK102の相補鎖を固定化したL0101の１０
％の分散液についても同様な操作を行なった。

【００３２】実施例１ ＜標的核酸の抽出および検出＞ＨＩＶの遺伝子が組み込
まれているプラスミドｐＢＲ３２２を標的核酸とし濃度
を１μｇ／ｍｌ（１０¹¹コピー／ｍｌ）に調製し、この
溶液の中にアルカリ処理したＣＡＬＦ ＤＮＡ（数十塩
基数から数万塩基数まで）を０.５ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに添加し、牛胎児血清および牛血清アルブミン（Sigm
a社製）をそれぞれ １ｍｇ／ｍｌとなるように添加し
た。この溶液５０ｍｌを９０℃のウォーターバス中１０
分間静置した後、０℃の氷水に冷したものを５つ用意し
た。続いて前記＜ラテックスの固定化＞（１）および
（２）の如くして得たプローブSK102を固定化したラテ
ックスL0101の１０％分散液５μｌをそれぞれに入れ５
Ｍの塩化ナトリトウム溶液を５ｍｌ添加し、４０℃で５
分間インキュベーションし、続いて１０,０００ｒｐｍ
×５分で遠心分離し、ラテックスを回収した。回収した
ラテックスを０.２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２回洗浄
し、最終的に１０μｌの蒸留水に分散させ９０℃で５分
間静置後、０℃の氷水に冷し、１０,０００ｒｐｍ×１
分間遠心分離した。ここで得た１０μｌの上澄を２５０
μｌの０.２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に添加し、クロ
マトグラフ媒体のハイブリダイズ用ヌクレオチド配列の
固定化されている側の展開位置より展開、移動させた。
３分後、クロマトグラフ媒体を展開液から引き離し、
０.１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に１秒
間浸した後、３０５ｎｍの紫外線照射下でハイブリッド
形成領域での発色の有無を目視により判定した。また濃
度１μｇ／ｍｌの標的核酸を蒸留水で希釈し、１０ｎｇ
／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｆｇ／
ｍｌおよび０.１ｆｇ／ｍｌの濃度としたものについ
て、前記と同様に実験を行なった。結果は表１にまとめ
て示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】実施例２ ＜標的核酸のＰＣＲ法による増幅産物の検出＞前記＜ラ
テックスの固定化＞（１）および（２）の如くして得た
プライマーSK431をラテックスG0303CRに固定化した１０
％のラテックス分散液１μｌ（プライマー核酸１００ｐ
Ｍ相当）を取り、さらに固定化されていない遊離のプラ
イマーSK145の２０μＭ溶液を１μｌ取り、それぞれを
ＰＣＲ用チューブに入れた。一方蒸留水２８μｌ、１０
×ＰＣＲ反応緩衝液［１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.
０）、５００ｍＭ塩化カリウム、１５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、０.０１％ゼラチン］を５μｌ、ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（いずれも宝酒造製）の
当量混合物（最終濃度１μＭ）を１０μｌ、Thermus aq
uaticus 由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）の
５ユニット／μｌ溶液を０.２５μｌおよび実施例１と
同じ標的核酸（１ｐｇ／ｍｌ）５μｌを、それぞれ同一
のＰＣＲ用チューブに入れ、ＰＣＲ法による増幅反応を
PERKIN ELMER CETUS社のＰＣＲ装置ＰＪ２０００を使っ
て行なった。このＰＣＲ法による増幅反応は、９４℃に
１分、５５℃にて１.５分および７２℃にて３分のイン
キュベーションを３０回繰返し、最後は７２℃にて１０
分間の条件で行った。ＰＣＲ反応終了後、反応チューブ
を９０℃に５分間静置後、０℃の氷水で冷した。続い
て、１０,０００ｒｐｍ×５分間遠心分離し、上澄と沈
澱分を分けて、沈澱分をＴＥ緩衝液で２回洗浄後、０.
２Ｍ塩化ナトリウム、０.１％アルブミン、０.１％ポリ
ビニルピロリドンおよび０.１％Tween 80（ポリオキシ
エチレンソルビタン）を含有するＴＥ緩衝液２００μｌ
に再分散した。次いで、前記プローブSK102を固定した
クロマトグラフ媒体の展開位置より、上記沈澱分の再分
散液を展開、移動させた。５分後クロマトグラフ媒体を
引き上げ、前記ハイブリダイズ形成領域に赤色の有無を
目視判定した。

【００３５】一方、ＰＣＲ反応終了後の上澄５０μｌを
０.２５Ｍ塩化ナトリウム２００μｌに入れ、前記プロ
ーブSK102の相補鎖を固定化したクロマトグラフ媒体に
展開させ、５分後引き上げて、０.１μｇ／ｍｌのエチ
ジウムブロマイド溶液で１秒間浸し３０５ｎｍの紫外線
照射下で発色の有無を目視判定した。

【００３６】以上のようにして、リンカーの異なる五種
類のプライマーSK431を用いて実験を行なった。また、
標的核酸の濃度を蒸留水で希釈して、下記表２のように
調整し、同様な実験を行なった。それらの結果を表２に
まとめた。尚、リンカーの異なる五種類のプライマー核
酸を用いたが、同様な結果が得られたので、表２にはｄ
（Ｃ）₁₀リンカーを介して結合させたプライマー核酸の
結果のみを示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】実施例３ ＜陽性検体の検出＞ＨＩＶ陽性検体３例と陰性検体３例
につき、実施例２と同様にプライマー核酸としてプライ
マーSK431を用いＰＣＲ増幅法を行った。次いで、その
増幅産物をクロマトグラフ媒体を用いて検出した。これ
らの結果を表３にまとめて示した。リンカーの異なる５
種類のいずれの固定プライマーを用いても同様の結果が
得られた。

【００３９】

【表３】

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば検査試料中の標的核酸の
有無を、高感度、短時間且つ簡便に検出することができ
る。特に本発明はＰＣＲ法を組合わせることによりその
効果が確実に達成される。さらに本発明によれば標的核
酸の検出を実施する実用性の高いキットを提供できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイ
   ブリダイズ可能なヌクレオチド配列が固定化されたハイ
   ブリッド形成領域を有するクロマトグラフ媒体を準備
   し、（２）また標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイブリダ
   イズ可能な１本鎖のプローブ核酸或いはプライマー核酸
   が固定化された水不溶性固体担体を準備し、（３）検査
   試料を変性し、含有されている標的核酸またはその断片
   を１本鎖化し、前記（２）の水不溶性固体担体と接触さ
   せ、必要に応じてこれを増幅し、次いで該水不溶性固体
   担体を固−液分離することによって標的核酸、その断片
   またはその増幅産物の十鎖および一鎖を互いに分離し、
   （４）前記（３）で分離された十鎖または一鎖を前記
   （１）のクロマトグラフ媒体に展開させ、そして（５）
   そのクロマトグラフ媒体の予め決められたハイブリッド
   形成領域においてハイブリダイズされた標的核酸の有無
   を検知する、ことを特徴とする検査試料中の標的核酸の
   検出方法。
2. 【請求項２】 （１）標的核酸の十鎖或いは一鎖とハイ
   ブリダイズ可能なヌクレオチド配列が予め決められた位
   置に固定化されたハイブリッド形成領域を有するシート
   状クロマトグラフ媒体であって、該クロマトグラフ媒体
   は前記ハイブリッド形成領域が表示されており、且つ検
   査試料を供給するための位置が設けられたシート状クロ
   マトグラフ媒体および（２）標的核酸の十鎖或いは一鎖
   とハイブリダイズ可能な１本鎖プローブ核酸或いはプラ
   イマー核酸が固定化された水不溶性固体担体、を含む検
   査試料中の標的核酸を検出するためのキット。